新化合物 III 发明领域 本发明涉及新的式 (I) 化合物，涉及含有这些化合物的药用组合物，涉及它们的 制备方法和涉及作为瘦蛋白受体调节剂模拟物 (mimetics) 的这些化合物在制备对抗与体 重增加、2 型糖尿病和异常脂血症有关的病症的药物中的用途。
背景技术 在工业化社会中，肥胖症的发病率正在不断增加。 典型地，第一线的治疗是提 供患者饮食和生活方式的建议，例如减少他们日常饮食的脂肪含量和增加它们的身体活 动。 然而，某些患者也可能需要经历药物治疗以保持适应前述饮食和生活方式变化所带 来的益处。
瘦蛋白是脂肪细胞中合成的激素，它被认为在下丘脑中起作用，以减少食物 摄 取 和 体 重 ( 参 见， 例 如， Bryson， J.M.(2000)Diabetes， Obesity and Metabolism 2 ： 83-89)。
已经表明，胖人的脑脊髓液中的瘦蛋白与循环瘦蛋白的比率下降 (Koistinen 等， (1998)Eur.J.Clin.Invest.28 ：894-897)。 这表明，在肥胖状态下瘦蛋白转运进入大脑的能 力不足。 事实上，在肥胖症的动物模型 (NZO 小鼠和 Koletsky 大鼠 ) 中，已经表现出瘦蛋 白转运不足，导致下降的大脑瘦蛋白含量 (Kastin， A.J.(1999)Peptides 20 ：1449-1453 ； Banks， W.A. 等， (2002)Brain Res.950 ：130-136)。 在涉及饮食介导的肥胖啮齿动物的 研究中 ( 认为啮齿动物模型更近似地类似于人肥胖症，参见，例如， Van Heek 等 (1997) J.Clin.Invest.99 ：385-390)，表明外周给予过量瘦蛋白不能有效减少食物摄取和体重，而 直接将瘦蛋白注入大脑可有效减少食物摄取和体重。 还已经表明，在具有过量循环瘦蛋 白的胖人中，信号传导系统对瘦蛋白受体的频繁刺激变得不敏感 (Mantzoros，C.S.(1999) Ann.Intern.Med.130 ：671-680)。
Amgen 已用重组甲硫氨酰人瘦蛋白进行临床试验。 这些试验的结果是各种各样 的，例如，即使在瘦蛋白的高血浆浓度的存在下，体重减轻也是变化的，且试验患者组 的平均体重减少相对小 ( 肥胖症战略前景 (Obesity Strategic Perspective)， Datamonitor， 2001)。
自从发现瘦蛋白基因编码序列之后，文献中已经报道发现活性片段的几个尝 试。 一个实例是 Samson 等 (1996)Endocrinol.137 ：5182-5185 描述了 N- 末端 (22-56) 上 的活性片段。 该序列表明当 ICV 注射时，该序列减少食物摄取，而取自 C- 末端的序列 上未表现出具有任何作用。 瘦蛋白片段还公开于国际专利申请 WO 97/46585 中。
考察序列的 C- 末端部分的其它报道报道了 116-130 片段对促黄体生成激素产生 的可能的刺激 (Gonzalez 等， (1999)Neuroendocrinology70 ：213-220) 和给予 GHRH( 片 段 126-140) 后对 GH 产生的作用 (Hanew(2003)Eur.J.Endocrin.149 ：407-412)。
近来，瘦蛋白已经涉及炎症。 已经报道，在细菌感染期间和炎症中，循环瘦 蛋白水平升高 ( 参见 Otero， M 等 (2005)FEBS Lett.579 ：295-301 其中的参考文献 )。
瘦蛋白也可通过促进自炎性细胞释放促炎细胞因子 TNF 和 IL-6，起到增加炎症的作用 (Zarkesh-Esfahani， H. 等 (2001)J.Immunol.167 ：4593-4599)。 这些物质 (agents) 依次 可通过减少胰岛素受体发信号传导效能而有助于常见于肥胖患者的胰岛素抗性 (Lyon， C.J. 等 (2003)Endocrinol.44 ：2195-2200)。 认为持续的低程度炎症与肥胖症 ( 存在或 不存在胰岛素抗性和 II 型糖尿病 ) 有关 (Browning 等 (2004)Metabolism 53 ：899-903， 肥胖妇女血液中的炎性标记升高 ；Mangge 等 (2004)Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes112 ： 378-382，青少年肥胖症与血清炎性标记 C- 反应性蛋白有关 ；Maachi 等 (2004)Int.J.Obes. Relat.Metab.Disord.28 ：993-997，胖人的全身性低程度炎症 )。 通过促进脂质摄取进入巨 噬细胞和内皮功能障碍，从而促进动脉粥样硬化斑块的形成，瘦蛋白也已经涉及动脉粥 样化形成的过程 ( 参见 Lyon， C.J. 等 (2003)Endocrinol.144 ：2195-2200)。
也已经表明，瘦蛋白促进新血管形成 ( 血管生成 )，一种涉及脂肪组织生长的过 程 (Bouloumie A，等 (1998)Circ.Res.83 ：1059-1066)。 血管生成还涉及糖尿病性视网膜 病 (Suganami， E. 等 (2004)Diabetes.53 ：2443-2448)。
还认为血管生成涉及供应异常肿瘤细胞的新血管的生长。 升高的瘦蛋白水平 已经与多种癌症，尤其是人的乳癌、前列腺癌和胃肠道癌有关 (Somasundar P. 等 (2004) J.Surg.Res.116 ：337-349)。 瘦 蛋 白 受 体 激 动 剂 也 可 用 于 促 进 创 伤 愈 合 的 药 物 的 制 备 (Gorden， P. 和 Gavrilova， O.(2003)Current Opinion in Pharmacology 3 ：655-659)。
而且，已经表明，升高大脑中的瘦蛋白信号传导可代表治疗抑郁症的一种途径 (Lu， Xin-Yun 等 (2006)PNAS 103 ：1593-1598)。
发明公开
已经令人惊讶地发现，式 (I) 化合物可有效减少啮齿动物的体重和食物摄取。 然 而不希望囿于理论，认为式 I 化合物调节瘦蛋白受体信号传导通路。
在某些实施方案中，具有瘦蛋白受体激动剂类性质的化合物可用来治疗与瘦蛋白 信号传导有关的疾病以及与体重增加有关的病症，例如肥胖症。 本发明人推测，小分子 CNS 渗透瘦蛋白模拟物应能绕过限定的摄取系统进入大脑。 进一步地，假定这种情况反映 出人的肥胖症，本发明人相信，具有相对长的作用时间的 CNS- 活性类瘦蛋白 (leptinoid) 会 对肥胖状态及其伴随的并发症，尤其是 ( 但不限于 ) 糖尿病进行有效的治疗。
在其它实施方案中，具有瘦蛋白受体拮抗剂样性质的化合物可用于治疗炎症、 动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病和肾病。
在第一个方面，本发明涉及式 (I) 化合物，
或其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物、几何异构体、互变异构体、光学 异构体或 N- 氧化物，其中 ：
A 选自
其中 X1 是 N 或 CH ；
和
其中 X2 是 N(R1)、 CH(R2) 或 O ；
R1 选自氢、 C1-6- 烷基 ( 未取代或任选被独立选自卤素、羟基、氰基和 C1-6- 烷 氧基的一个或多个取代基取代 ) 和 C1-6- 酰基 ( 未取代或任选被独立选自卤素、羟基和 C1-6- 烷氧基的一个或多个取代基取代 ) ；
R2 和 R3 独立选自氢、卤素、羟基、C1-6- 烷基 ( 未取代或任选被独立选自卤素、 羟基和 C1-6- 烷氧基的一个或多个取代基取代 ) 和 C1-6- 烷氧基 ( 未取代或任选被独立选自 卤素、羟基和 C1-6- 烷氧基的一个或多个取代基取代 ) ；
R4 独立选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、 CF3、 C1-6- 烷基和 C1-6- 烷氧基 ；
Y 是 O、 N(R5) 或 CH2 ；
R5 是氢或 C1-4- 烷基 ；
a、 b 和 c 各独立为 1、2 或 3 ；
d 是 0、1 或 2 ；
e 是 1、2 或 3 ；和
f 和 g 各独立为 0、1 或 2，前提是 1≤f+g≤3 ；
和进一步的前提是，所述化合物不是 ：
· 2，3- 二氢 -1-[1- 氧代 -3-(1- 哌嗪基 ) 丙基 ]-1H- 吲哚 ；
· 2，3- 二氢 -3- 甲基 -1H- 吲哚 -1- 羧酸 (1- 丁基 -4- 哌啶基 ) 甲基酯 ；
· 3，4- 二氢 -N-[3-(1- 哌嗪基 ) 丙基 ]-2(1H)- 异喹啉甲酰胺 ；
· N-[3-( 六氢 -1H-1，4- 二氮杂-1- 基 ) 丙基 ]-3，4- 二氢 -2(1H)- 异喹啉甲酰胺 ；
· 2，3- 二氢 -2- 甲基 -1-[3-(4- 甲基 -1- 哌嗪基 )-1- 氧代丙基 ]-1H- 吲哚 ；
· 2，3. 二氢 -N-(2- 哌啶基甲基 )-1H- 吲哚 -1- 甲酰胺 ；或
·1，2，3，4- 四氢 -6，7- 二甲氧基 -2-[1- 氧代 -3-(3- 哌啶基 ) 丙基 ]- 异喹啉。
在本发明的优选实施方案中， Y 是 O。
在另一个优选实施方案中， A 是 R1 优选选自氢、 C1-4- 烷基和 C1-4- 酰基。 在最优选的实施方案中， R1 是氢、甲基、乙基或乙酰基。8
CN 102026993 A CN 102027008 A
说明书4/17 页R2 和 R3 优选独立选自氢和 C1-4- 烷基。 在最优选的实施方案中， R2 和 R3 是氢。 R4 优选独立选自氢、卤素和 C1-4- 烷基。 在一个更优选的实施方案中， R4 独立选自氢、氟代、氯代或甲基，且优选氢。 特别优选的式 (I) 化合物是式 (I′ ) 化合物
其中 X1、 R1、 e、 f 和 g 如式 (I) 中所定义。 特别优选的式 (I) 化合物是选自以下的化合物 ： · 3，4- 二氢异喹啉 -2(1H)- 羧酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲基酯 ； · 3，4- 二氢喹啉 -1(2H)- 羧酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯 ； · 3，4- 二氢异喹啉 -2(1H)- 羧酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯 ； · 二氢吲哚 -1- 羧酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯 ；和 · 1，3- 二氢 -2H- 异吲哚 -2- 羧酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯。 本发明的另一方面是用于治疗的式 (I) 化合物。 在另一个方面，本发明涉及用于治疗或预防本文所述的任何障碍或病症的式 (I)化合物。 在又一个方面，本发明涉及式 (I) 化合物在制备治疗或预防本文所述的任何障碍 或病症的药物中的用途。
在某些实施方案中，所述化合物可用于制备治疗或预防通过选择性作用于瘦蛋 白受体而预防、治疗或改善的病症的药物。
在某些实施方案中，所述化合物可用来制备治疗或预防与体重增加有关的病症 ( 尤其是，代谢性病症 ) 的药物。 与体重增加有关的病症包括肥胖或超重患者中具有增 加的发病率的疾病、障碍或其它病症。 实例包括 ：脂肪营养不良、 HIV 脂肪营养不良、 糖尿病 (2 型 )、胰岛素抗性、代谢综合征、高血糖症、高胰岛素血症、异常脂血症、肝 脏脂肪变性、饮食过多、高血压、高甘油三酯血症、不育症、与体重增加有关的皮肤疾 病、黄斑变性。 在某些实施方案中，所述化合物也可用于维持患者体重减少的药物的制 备。
在某些实施方案中，为瘦蛋白受体激动剂模拟物的式 (I) 化合物也可用于制备促 进创伤愈合的药物。
在某些实施方案中，为瘦蛋白受体激动剂模拟物的式 (I) 化合物也可用于制备 治疗或预防导致循环瘦蛋白浓度下降的病症和随之发生的免疫和生殖系统功能障碍的药 物。 这类病症和功能障碍包括严重体重下降、痛经、闭经、女性不育症、免疫缺陷和与 低睾酮水平有关的病症。
在某些实施方案中，为瘦蛋白受体激动剂模拟物的式 (I) 化合物也可用于制备治
疗或预防由于瘦蛋白缺乏或瘦蛋白或瘦蛋白受体突变的结果而引起的病症的药物。
在某些其它实施方案中，为瘦蛋白受体拮抗剂模拟物的式 (I) 化合物可用于治疗 或预防炎性病症或疾病、与肥胖症有关的低水平炎症和血浆瘦蛋白过量，和用于减少与 肥胖症有关的其它并发症，包括动脉粥样硬化，和用于纠正见于代谢综合征和糖尿病的 胰岛素抗性。
在某些实施方案中，为瘦蛋白受体拮抗剂模拟物的本发明化合物可用来治疗 或预防由以下疾病引起或与之相关的炎症 ：癌症 ( 例如白血病、淋巴瘤、癌、结肠 癌、 乳 癌、 肺 癌、 胰 腺 癌、 肝 细 胞 癌、 肾 癌、 黑 瘤、 肝、 肺、 乳 房 和 前 列 腺 转 移， 等 ) ；自身免疫疾病 ( 例如器官移植排斥、红斑狼疮、宿主对移植物的排斥反应 (graft v hostrejection)、同种异体移植排斥、多发性硬化、类风湿性关节炎、 I 型糖尿病包括 胰岛破坏导致糖尿病和糖尿病的炎性结果 ) ；自身免疫损害 ( 包括多发性硬化、格 - 巴 (Guillam Barre) 综合征、重症肌无力 ) ；与不良组织灌注和炎症有关的心血管病症 ( 例如 粥瘤、动脉粥样硬化、中风、缺血 - 再灌注损伤、跛行、脊髓损伤、充血性心力衰竭、 血管炎、失血性休克、蛛网膜下腔出血后的血管痉挛、脑血管意外后的血管痉挛、胸膜 炎、心包炎、糖尿病的心血管并发症 ) ；缺血 - 再灌注损伤、缺血和相关炎症、血管成形 术后再狭窄和炎性动脉瘤 ；癫痫、神经变性 ( 包括阿尔茨海默氏病 )、关节炎 ( 例如类风 湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风性关节炎 )、纤维化 ( 例如肺、皮肤和肝 纤维化 )、多发性硬化、脓毒病、脓毒性休克、脑炎、传染性关节炎、雅里施 - 赫克斯海 默反应 (Jarisch-Herxheimer) 反应、带状疱疹、中毒性休克、脑型疟、莱姆氏 (Lyme’ s) 病、内毒素性休克、革兰氏阴性休克、失血性休克、肝炎 ( 产生于组织损伤或病毒感 染 )、深部静脉血栓形成、痛风 ；与呼吸困难有关的病症 ( 例如慢性阻塞性肺病、阻碍和 阻塞性气道、支气管收缩、肺血管收缩、呼吸受阻、慢性肺炎性疾病、矽肺病、肺肉瘤 病、囊性纤维化、肺动脉高压、肺血管收缩、肺气肿、支气管过敏和 / 或炎症、哮喘、 花粉热、鼻炎、春季结膜炎和成人呼吸窘迫综合征 ) ；与皮肤炎症有关的病症 ( 包括银屑 病、湿疹、溃疡、接触性皮炎 ) ；与肠炎有关的的病症 ( 包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎 和发热 (pyresis)、肠易激惹综合征、炎性肠病 ) ；HIV( 尤其是 HIV 感染 )、脑型疟、细 菌性脑膜炎、骨质疏松症和其它骨再吸收疾病、骨关节炎、因子宫内膜异位所致的不育 症、感染引起的发烧和肌肉痛，和过量抗炎细胞 ( 包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、 巨噬细胞和 T- 细胞 ) 活性介导的其它病症。
在某些实施方案中，为瘦蛋白受体拮抗剂模拟物的式 (I) 化合物可用来治疗或预 防 1 或 2 型糖尿病的大或微血管并发症、视网膜病、肾病、自主神经病变，或缺血或动脉 粥样硬化引起的血管损伤。
在某些实施方案中，为瘦蛋白受体拮抗剂模拟物的式 (I) 化合物可用来抑制血管 生成。 抑制血管生成的化合物可用来治疗或预防肥胖症或与肥胖症有关的并发症。 抑制 血管生成的化合物可用来治疗或预防与炎性糖尿病性视网膜病有关的并发症，或尤其是 乳房、前列腺或胃肠道癌中的肿瘤生长。
在又一个方面，本发明涉及治疗或预防本文所述的任何障碍或病症的方法，它 包括给予患者 ( 例如，有需要的患者，如哺乳动物 ) 有效量的式 I 化合物。
本文描述的方法包括其中的患者被鉴定为需要特殊表述的治疗的那些方法。 鉴别需要这种治疗的患者可能是患者或专业人员卫生保健专业人员的判断，并可能是主观 ( 例如看法 ) 或客观的 ( 例如可通过试验或诊断方法测量 )。
在其它方面，本文的方法包括进一步包含监测患者对治疗实施的响应的那些方 法。 这类监测可包括对作为治疗方案的标记物或指示物的患者组织、液体、标本、细 胞、蛋白、化学标记物、基因材料等进行周期性取样。 在其它方法中，通过对这类治疗 的适用性的相关标记物或指示物的评价，预先筛选或鉴别需要这类治疗的患者。
在一个实施方案中，本发明提供监测治疗进程的方法。 该方法包括确定患有或 易患本文所述的障碍或其症状的患者的诊断标记 ( 标记物 )( 例如，受本化合物调节的本 文所述的任何目标或细胞类型 ) 或诊断测量 ( 例如，筛选、化验 ) 的水平的步骤，其中 已经给予患者足以治疗该疾病或其症状的治疗量的本化合物。 可将本方法中确定的标记 物水平与健康正常对照者或其它疾病患者的标记物的已知水平相比较，确定患者的疾病 状况。 在优选的实施方案中，在晚于确定第一水平的时间点确定患者的标记物的第二水 平，并比较两个水平，以监测疾病过程或治疗功效。 在某些优选的实施方案中，在根据 本发明开始治疗之前，确定患者的标记物的预处理水平 ；然后，可将标记物的这种预处 理水平与治疗开始后的患者的标记物水平相比较，以确定治疗功效。 在某些方法实施方案中，至少确定患者的标记物水平或标记物活性一次。 将 标记物水平与例如先前或随后自相同患者、另一患者或正常受试者得到的标记物水平 的另一个测量值作比较，可用来确定根据本发明的治疗是否具有想要的效果，从而允 许酌情调整剂量水平。 可采用本领域已知或本文所述的任何适用的取样 / 挤出试验 (expressionassay) 方法确定标记物水平。 优选首先自患者移出组织或液体样本。 合适的 样本的实例包括血液、尿、组织、口或颊细胞和含发根的头发样本。 适用的其它样本应 为本领域技术人员所知。 可采用本领域所知的任何适用的技术，包括，但不限于，酶免 疫测定法、 ELISA、放射性标记 / 试验技术、印迹 / 化学发光方法、实时 PCR 等，确定 样本中的蛋白质水平和 / 或 mRNA 水平 ( 例如，标记物水平 )。
在某些实施方案中，如果式 (I) 化合物能渗入中枢神经系统，可能是有利的。 在 其它实施方案中，式 (I) 化合物不能渗入 CNS 可能是有利的。 一般说来，如果为瘦蛋白 受体激动剂模拟物的化合物不能渗入 CNS，就希望这些化合物可特别地用于治疗或预防 肥胖症、胰岛素抗性或糖尿病 ( 尤其是葡萄糖不耐受 )。 本领域的普通技术人员可容易地 确定一种化合物是否可渗入 CNS 中。 可采用的适用方法描述于生物学方法章节中。
可用任何合适的方法测量瘦蛋白受体响应。 可通过体外测量瘦蛋白受体信号传 导进行这种测量。 例如，可测量对瘦蛋白或本发明化合物结合到瘦蛋白受体作出响应 的 Akt、 STAT3、 STAT5、 MAPK、 shp2 或瘦蛋白受体的磷酸化。 例如通过蛋白质印迹 (Western blotting) 或通过 ELISA 可确定 Akt、 STAT3、 STAT5、 MAPK、 shp2 或瘦蛋白受 体的磷酸化的程度。 作为选择，可采用 STAT 报告基因测定，例如 STAT 驱动的荧光素酶 表达。 表达瘦蛋白受体的细胞系可用于这类测定。 可通过确定给予瘦蛋白或本发明化合 物后食物摄取和体重的减少，体内测量瘦蛋白受体响应。
以下的生物学方法描述可用来确定本发明化合物是瘦蛋白受体激动剂模拟物还 是瘦蛋白受体拮抗剂模拟物的试验和方法。
可以与或不与其它治疗剂一起给予式 (I) 化合物。 例如，如果想要减轻炎症，可
与抗炎剂 ( 例如，疾病修饰抗风湿药物例如氨甲喋呤、柳氮磺吡啶和细胞因子失活剂、 类固醇、NSAIDs、大麻素类、速激肽调节剂或缓激肽调节剂 ) 一起给予所述化合物。 如 果想要提供抗肿瘤作用，可与细胞毒剂 ( 例如，氨甲喋呤，环磷酰胺 ) 或另一种抗肿瘤药 一起给予式 (I) 化合物。
针对体外或体内应用，例如受体替代研究或受体成像，式 (I) 化合物可被放射标 记 ( 例如用氚或放射性碘 )。
本发明的又一个方面涉及如上所述的式 (I) 化合物的制备方法。 该方法包括 ：
(a) 使式 (II) 化合物 ：
其中 X1、 R1、 R2、 a、 d 和 e 如式 (I) 中所定义，与氯甲酸 4- 硝基苯基酯或双 -(4- 硝酸苯基 ) 碳酸酯在合适的碱 ( 例如 DIPEA 或 NMM) 的存在下，在合适的溶剂 ( 例如 DCM) 中于 -10 至 40℃下反应，生成式 (III) 化合物 ：
(b) 使式 (III) 化合物与式 (IV) 化合物 ：其中 R3、 R4、 b、 c、 f 和 g 如式 (I) 中所定义，
在合适的碱 ( 例如 DIPEA) 的存在下，在合适的溶剂 ( 例如 DMF) 中于 -10 至 40℃下反应，得到式 (I) 化合物 ；和
(c) 任选地，在一个或几个步骤中，使式 (I) 化合物转化为另一种式 (I) 化合物。
定义
以下定义适用于整个说明书和所附权利要求书。
除非另有说明或指出，术语 “C1-6- 烷基” 指具有 1-6 个碳原子的直链或支链烷 基。 所述 C1-6- 烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁
基、叔丁基，及直链和支链戊基和己基。 对于 “C1-6- 烷基”范围内的各部分，包括其所 有亚组，例如 C1-5- 烷基、 C1-4- 烷基、 C1-3- 烷基、 C1-2- 烷基、 C2-6- 烷基、 C2-5- 烷基、 C2-4- 烷基、 C2-3- 烷基、 C3-6- 烷基、 C4-5- 烷基等。
除非另有说明或指出，术语 “C1-6- 酰基” 指通过其碳原子连接氢原子 ( 即，甲 酰基 ) 或连接直链或支链 C1-5- 烷基的羰基，其中烷基如以上定义。 所述 C1-6- 酰基的实 例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、正丁酰基、2- 甲基丙酰基和正戊酰基。 对于 “C1-6- 酰 基”范围内的各部分，包括其所有亚组，例如 C1-5- 酰基、C1-4- 酰基、C1-3- 酰基、C1-2- 酰 基、 C2-6- 酰基、 C2-5- 酰基、 C2-4- 酰基、 C2-3- 酰基、 C3-6- 酰基、 C4-5- 酰基等。 如果 C1-6- 酰基任选被独立选自卤素、羟基和 C1-6- 烷氧基的一个或多个取代基所取代，所述取 代基不能连接羰基碳原子。
除非另有说明或指出，术语 “C1-6- 烷氧基” 指具有 1-6 个碳原子的直链或支链 烷氧基。 所述 C1-6- 烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧 基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基，及直链和支链戊氧基和己氧基。 对于 “C1-6- 烷 氧基” 酚的各部分，包括其所有亚组，例如 C1-5- 烷氧基、 C1-4- 烷氧基、 C1-3- 烷氧基、 C1-2- 烷氧基、 C2-6- 烷氧基、 C2-5- 烷氧基、 C2-4- 烷氧基、 C2-3- 烷氧基、 C3-6- 烷氧基、 C4-5- 烷氧基等。
“卤素” 指氟、氟、溴或碘。
“羟基” 指 -OH 基团。
“硝基” 指 -NO2 基团。
“氰基” 指 -CN 基团。
“任选的” 或 “任选地” 指，随后描述的事件或情况可能但并不必然发生，且 该描述包括其中事件或情况发生的例子和其中并未发生的例子。
术语 “哺乳动物” 包括生物体，其包括小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、兔子、山 羊和马、猴、狗、猫，并优选人。 患者可能是人患者或非人动物，尤其是驯养家畜，例 如狗。
“药学上可接受的” 指制备药用组合物中有用，通常是安全、无毒和既非生物 学上又非其它方面不受欢迎的，且包括对兽医应用及人药应用使有用的。
如本文所用的那样， “治疗” 包括预防所列举的障碍或病症，或一旦已经确 定，就缓解或清除障碍。
“有效量” 指对所治疗的患者产生疗效 ( 例如，治疗、控制、改善、预防、延 缓疾病、障碍，或病症或其症状的起病或降低发生疾病、障碍，或病症或其症状的风险 ) 的化合物的量。 疗效可为客观的 ( 即，可经某些试验或标记物测定 ) 或主观的 ( 即，患 者出现效果的迹象或感觉 )。
“前药” 指可在生理学条件下或通过溶剂分解作用转化为生物活性的式 (I) 化 合物的化合物。 当给予有需要的患者时，前药可以是无活性的，但在体内转化为活性 的式 (I) 化合物。 例如通过在血液中水解，前药典型地在体内快速转变，生成母体化合 物。 前药化合物通常在哺乳动物的有机体内提供溶解性、组织兼容性或延缓释放的优点 ( 参见 Silverman， R.B.，药物设计和药物作用的有机化学，第 2 版， Elsevier Academic Press(2004)，第 498-549 页 )。 可通过以这样的一种方式修饰官能团，例如存在于式 (I)化合物中的羟基、氨基或巯基，制备前药，所述修饰或在常规操作中或在体内被裂解为 母体化合物。 前药的实例包括，但不限于，羟基官能团的乙酸酯、甲酸酯或琥珀酸酯衍 生物或氨基官能团的氨基甲酸苯酯衍生物。
在整个说明书或所附权利要求书中，给出的化学式或名称还将囊括其所有的 盐、水合物、溶剂合物、 N- 氧化物和前药形式。 进一步地，所给出的化学式或名称将 囊括所有的互变异构体及其立体异构体形式。 立体异构体包括对映异构体和非对映异构 体。 对映异构体可以其纯形式或作为两种对映异构体的外消旋 ( 等量 ) 的或不等量的混 合物存在。 非对映异构体可以其纯形式或作为非对映异构体混合物出现。 非对映异构体 还包括几何异构体，它可以其纯的顺式或反式或作为它们的混合物存在。
式 (I) 化合物可原样使用，或者合适时可作为其药理学上可接受的盐 ( 酸或碱 加成盐 ) 使用。 下述的药理学上可接受的加成盐意欲包括化合物能够形成的治疗活性的 无毒的酸和碱加成盐形式。 可通过用适当的酸处理碱形式，将具有碱性的化合物转化为 其药学上可接受的酸加成盐。 示例的酸包括无机酸，例如氯化氢、溴化氢、碘化氢、 硫酸、磷酸 ；和有机酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、丙酮酸、乙醇酸、马 来酸、丙二酸、草酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、三氟乙酸、富马酸、琥珀酸、苹果 酸、酒石酸、柠檬酸、水杨酸、对氨基水杨酸、双羟萘酸、苯甲酸、抗坏血酸等等。 例 如，示例的碱加成盐形式有钠、钾、钙盐和与药学上可接受的胺例如，氨、烷基胺、苄 星和氨基酸，例如精氨酸和赖氨酸所成的盐。 如本文所用的术语加成盐还包括化合物及 其盐能够形成的溶剂合物，例如，水合物、醇合物等。
组合物
为了临床应用，可将本发明化合物配制成针对各种给药方式的药物制剂。 应意 识到，可与生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂一起给予所述化合物。 可通过任何 适当的途径，优选经口、直肠、鼻、局部 ( 包括口腔和舌下 )、舌下、透皮、鞘内、透黏 膜或胃肠外 ( 包括皮下、肌内、静脉内和皮内 ) 给药，给予药用组合物。
其它制剂可便利地以单位剂型，例如，片剂和缓释胶囊剂和呈脂质体出现，并 可通过制药领域所熟知的任何方法制备。 通常通过使活性物质或其药学上可接受的盐 与常规的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合，制备药物制剂。 赋形剂的实例有 水、明胶、阿拉伯树胶、乳糖、微晶纤维素、淀粉、羟乙酸淀粉钠、磷酸氢钙、硬脂酸 镁、滑石、胶态二氧化硅等。 这类制剂还可含有其它药理学上的活性试剂和常规添加 剂，例如稳定剂、湿润剂、乳化剂、矫味剂、缓冲剂等。 活性化合物的量通常介于制剂 的 0.1-95％重量之间，在胃肠外使用的制剂中优选介于 0.2-20％重量之间和在口服制剂 中更优选介于 1-50％重量之间。
可进一步通过已知方法，例如颗粒化、压缩、微胶囊化、喷雾包衣等，制备制 剂。 可通过常规方法，制备呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂、混悬剂、栓剂或 注射剂剂型的制剂。 可通过在水或其它适用赋形剂中溶解或悬浮活性物质，制备液体制 剂。 可以常规方式对片剂或颗粒剂包衣。 为在延长的时间段保持治疗有效的血药浓度， 可使本发明化合物掺入缓释剂型中。
特定化合物的剂量水平和用药次数将随包括所用特定化合物的效能、该化合物 的代谢稳定性和作用时间、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药方式和次数、排泄率、联合用药的情况、要治疗的病症的严重性和患者经历的治疗在内的各 种因素而变化。 例如，日剂量可介于约 0.001mg 至约 100mg 每公斤体重，以一定的剂量 一次或多次给药，例如每次约 0.01mg 至约 25mg。 这样的剂量口服给予，但也可选择胃 肠外给药。
本发明化合物的制备
可通过常规方法或与之类似的方法，制备以上式 (I) 化合物。 中央尿烷或脲连接 剂的形成是制备式 (I) 化合物中的关键合成步骤。 多种活化试剂可用于尿烷或脲连接剂的 形成，例如，形成醇的氯甲酸酯的光气，或形成咪唑羧酸酯的羰基二咪唑 (CDI)。 典型 地，可掺入式 (I) 化合物的尿烷连接剂可利用氯甲酸 4- 硝基苯基酯或双 -(4- 硝酸苯基 ) 碳酸酯作为活化试剂合成。可通过以下流程 1，具体阐明根据本发明的实施例的中间体和 化合物的制备。 本文的流程中的结构中的可变项 (variables) 的定义与本文所述的结构式 中的相应位置中的那些相符。
流程 1. 式 (I) 化合物合成的概要
其中 X1、 R1-R4 和 a-g 如式 1 中所定义。
典型地，通过活化醇部分，合成式 (I) 化合物。 在碱 ( 例如 DIPEA 或 NMM) 的存在下，用氯甲酸 4- 硝基苯基酯或双 -(4- 硝酸苯基 ) 碳酸酯处理醇 (II)，生成相应的 4- 硝基苯基碳酸酯衍生物 (III)。 在随后的步骤中，在碱 ( 例如 DIPEA) 的存在下，用适 当的稠合双环胺 (IV) 处理活化的碳酸酯 (III)，导致想要的式 (I) 化合物的形成。
作为选择，可在碱的存在下，通过用氯甲酸 4- 硝基苯基酯或双 -(4- 硝酸苯基 ) 碳酸酯处理，活化稠合双环胺 (IV)，形成相应的氨基甲酸酯衍生物。 再在碱的存在下， 用适当的醇部分 (II) 处理氨基甲酸酯中间体，得到式 (I) 化合物。
尿烷的形成典型地为两步骤工艺，但这也可通过原位形成活化的中间体，以一
釜法 (one-pot) 反应进行。
制备式 (I) 化合物的必需原料或者为商业途径可得到的或者可通过本领域已知的 方法制备。
可进行以下实验章节中描述的工艺，得到呈游离碱形式或作为酸加成盐的化合 物。 可根据自碱化合物制备酸加成盐的常规程序，通过将游离碱溶解于适用的有机溶剂 中，并用酸处理该溶液，得到药学上可接受的酸加成盐。 上面介绍过形成加成盐的酸的 实例。
式 (I) 化合物可拥有一个或多个手性碳原子，从而，它们可呈光学异构体形式， 例如，作为纯对映异构体或作为对映异构体的混合物 ( 外消旋体 ) 或作为含有非对映异 构体的混合物而被得到。 为得到纯对映异构体而分离光学异构体的混合物为本领域所熟 知，并可，例如，通过用光学活性 ( 手性 ) 酸分步结晶或通过在手性柱上层析分离实现。
本文所述的合成途径中所用的化学品可包括，例如，溶剂、试剂、催化剂和保 护基和去保护基试剂。 保护基的实例有叔丁氧基羰基 (Boc)、苄基和三苯甲基 ( 三苯 基甲基 )。 上述方法还可在本文具体描述的各步骤之前或之后，另外包括加上或去除 适用保护基的步骤，以最终合成所述化合物。 另外，可在作为选择的程序中进行各种 合成步骤以生成想要的化合物。 用于合成适用的化合物的合成化学转化和保护基方法 ( 保护和去保护 ) 为本领域所知并包括，例如，描述于 R.Larock，综合有机转化， VCH Publishers(1989) ；T.W.Greene 和 P.G.M.Wuts，有机合成中的保护基，第 3 版，John Wiley 和 Sons(1999) ；L.Fieser 和 M.Fieser，有机合成的 Fieser 和 Fieser 氏试剂， John Wiley 和 Sons(1994) ；和 L.Paquette，编辑，有机合成试剂百科全书，John Wiley 和 Sons(1995) 及 其随后的各版本中。
已经采用以下缩写词 ： Boc 叔丁氧基羰基 DCM 二氯甲烷 DIPEA N， N- 二异丙基乙胺 DMF N， N- 二甲基甲酰胺 + ES 电喷雾 EtOAc 乙酸乙酯 HIV 人免疫缺陷病毒 HPLC 高效液相色谱法 ICV 脑室内 LCMS 液相色谱质谱法 M 摩尔 + [MH] 质子化分子离子 NMM N- 甲基吗啉 RP 反相 tert 叔 TFA 三氟乙酸 THF 四氢呋喃参考附图，在以下实施例中描述本发明的实施方案，其中 ：
图 1 为表示分别在夜晚 (dark) 和白天 (light phases) 的小鼠体重增加和体重减轻 的示意图。 该图说明夜间的大体重增加与相对小的整个 24 小时的体重变化。
图 2 表示在夜晚开始和白天开始之间 ( 下午至上午 )，实施例 2 对小鼠体重的影 响。
图 3 表示在夜晚开始和白天开始之间 ( 下午至上午 )，实施例 4 对小鼠体重的影 响。
图 4 表示在夜晚开始和白天开始之间 ( 下午至上午 )，实施例 5 对小鼠体重的影 响。
图 5 表示对于瘦蛋白， JEG-3 细胞掺入 [3H]- 胸腺嘧啶核苷呈浓度依赖性增加。
在本文可变项的任何定义中对所列化学基团的叙述包括作为所列基团的任何单 一基团或组合的那个可变项的定义。 本文的实施方案的叙述包括作为任何单一实施方案 或与任何其它实施方案或其部分组合的那个实施方案。
现在将通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。 应理解，以下特定的实施 例仅仅视为说明而决不以任何方式限制本公开的其余部分。 无需进一步细化，相信本领 域的技术人员，能根据本文的描述，最大限度地利用本发明。 本文引用的所有参考文献 和出版物都通过全文引用结合于本文。
实施例和中间体化合物
实验方法
所有试剂都为商用级别并都按来样使用，无需进一步纯化，除非另有说明。 在 惰性气氛下进行的反应采用通过商业途径得到的无水溶剂。 除非另有说明，在所有其他 情况下都采用试剂级的溶剂。 在连接 Agilent 1100HPLC 系统的 Waters ZQ 质谱仪上进行 LCMS 分析。 在 Agilent 1100 系统上进行 HPLC 分析。 在连接 Agilent 1100HPLC 系统的 Agilent MSD-TOF 上得到高分辨率质谱 (HRMS)。 在需要时，在分析期间，通过两次质 量 (two masses) 和自动校正检查校准。 以正电喷雾方式得到光谱。 所得质量范围为 m/ z 100-1100。 采用质量峰的图形检测。 在装有 Strata SI-1 硅 gigatubes 的 Flash Master 个 人系统上进行快速色谱。 在装配有 Merck RP-18(40-63μm)460x 26mm 柱 (30mL/min) 的 Gilson 系统上，在甲醇在水中的梯度液中，进行反相色谱法。 采用 ACD 6.0 或 8.0 自动命名化合物。 用以下系统得到 HPLC 分析数据 ：
系统 A ：Phenomenex Synergi Hydro RP， (150x 4.6mm，4μm)，梯度 5-100 ％ CH3CN(+0.085 ％ TFA)， 在 H2O(+0.1 ％ TFA) 中，1.5mL/min， 梯 度 时 间 为 7min， 200-300nm，30℃。
用以下系统得到 LCMS 分析数据 ：
系 统 B ：Phenomenex Synergi Hydro RP(30x 4.6mm，4μm)， 梯 度 5-100 ％ CH3CN， H2O 中 (+0.1％ HCO2H)，1.5mL/min，梯度时间为 1.75min，30℃ ；或
系 统 C ：Phenomenex Synergi Hydro RP(150x 4.6mm，4μm)， 梯 度 0-20 ％ CH3CN， H2O 中， (+0.1％ HCO2H)，1mL/min，梯度时间为 8min，25℃。
中间体 1
碳酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲基酯 4- 硝基苯基酯使 4- 哌 啶 甲 醇 (10.0g，86.8mmol) 溶 解 于 DCM(200mL)。 加 入 DIPEA(15.0mL，86.6mmol) 和分批加入二碳酸二叔丁基酯 (18.95g，86.8mmol)。 室温 下搅拌反应混合物 19 小时。 反应混合物经 2M HCl 水溶液 (150mL)、1M Na2CO3 水溶液 (150mL) 洗涤并干燥 (MgSO4)。 真空浓缩所生成的有机相，得到作为白色固体的 4-( 羟 基甲基 ) 哌啶 -1- 羧酸叔丁基酯 (16.1g，87％ )。
分析 LCMS ：( 系统 B， RT ＝ 1.80min)， ES+ ：216.3[MH]+.
氩 气 下， 将 4-( 羟 基 甲 基 ) 哌 啶 -1- 羧 酸 叔 丁 基 酯 (1.94g，9.0mmol) 的 THF(15.0mL) 溶液逐滴加至 1M LiAlH4 的 THF(13.5mL，13.5mmol) 溶液中。 室温下搅拌 反应混合物 17 小时，再冷却至 0℃。 逐滴加入 THF 和水的混合物 (1 ∶ 1 比率，1.5mL)。 形成胶状白色固体。 逐滴加入 4M NaOH 水溶液 (0.6mL)。 加入水 (2mL) 并在室温下搅 拌所生成的混合物 2 小时。 过滤除去白色固体。 将滤液装至 Isolute HM-N 液 - 液萃取 柱上，并用 EtOAc(200mL) 洗脱。 真空浓缩所生成的有机相，得到呈黄色油的 (1- 甲基 哌啶 -4- 基 ) 甲醇 (1.02g，88％ )。
分析 LCMS ：纯度约 90％ ( 系统 C， RT ＝ 1.88min)， ES+ ：129.8[MH]+.
将 DCM(50mL) 中 的 (1- 甲 基 哌 啶 -4- 基 ) 甲 醇 (2.50g，19.3mmol) 加 至 碳 酸 双 -4- 硝 基 苯 基 酯 (7.06g，23.21mmol) 的 DCM(100mL) 溶 液 中， 接 着 加 入 NMM(1.70mL，15.5mmol)。 搅拌反应混合物 90 小时，然后顺序用多份 1M Na2CO3 水溶 液的等分液洗涤，直到含水层变为无色。 有机层被干燥 (MgSO4) 并真空浓缩，得到呈黄 色固体的碳酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲基酯 4- 硝基苯基酯 (4.18g，73％ )。
分析 LCMS ：( 系统 B， RT ＝ 1.59min)， ES+ ：295.1(100％ )[MH]+.
中间体 2
碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯 4- 硝基苯基酯
向搅拌的 1-(2- 羟基乙基 ) 哌嗪 (26.0g，0.2mol) 的 DMF(200mL) 溶液中加入 甲酸 (752mL，0.2mol) 和甲醛 (16.2g，0.2mol，37％水溶液 )。 于 100℃下小心加热反应 混合物 2 小时，再于室温下彻夜搅拌。 真空除去溶剂。 再重复该程序另外 3 次，得到约 100g 产物。 约 74℃下，合并粗产物，并于真空下蒸馏，得到呈无色液体的 2-(4- 甲基哌 嗪 -1- 基 ) 乙醇 (51g，44％ )。
分析 LCMS ：( 系统 B， RT ＝ 0.70min)， ES+ ：145.1(100％ )[MH]+.
使氯甲酸 4- 硝基苯基酯 (9.85g，49mmol) 溶解于 DCM(200mL) 并冷却至 0℃。 加入 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙醇 (7.2g，50mmol) 和 NMM(6mL)，和经 16 小时逐渐加
热反应混合物至室温。 反应混合物经 1MNa2CO3 水溶液洗涤。 有机相经干燥 (MgSO4)、 过滤并真空浓缩，得到呈放置就固化的黄色油的碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯 4- 硝 基苯基酯 (10.7g，71％ )。
分析 LCMS ：纯度约 80％ ( 系统 B， BT ＝ 1.70min)， ES+ ：310.4[MH]+.
实施例 1
3，4- 二氢异喹啉 -2(1H)- 羧酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲基酯
使 碳 酸 (1- 甲 基 哌 啶 -4- 基 ) 甲 基 酯 4- 硝 基 苯 基 酯 ( 中 间 体 1 ；4.10g， 13.9mmol) 溶解于 DMF(60mL)。 加入 DIPEA(3.64mL，20.9mmol) 和 1，2，3，4- 四氢 异喹啉 (1.74g，3.93mmol)。 室温下搅拌反应混合物 18h，再真空浓缩。 使残余物溶解 于 EtOAc(300mL)，再相继用饱和 NaHCO3 水溶液 (8x 200mL) 和盐水 (50mL) 洗涤。 溶 液经干燥 (MgSO4) 和真空浓缩。 残余物经反相层析法纯化 ( 用水中的 MeOH 梯度洗脱， 各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 使所生成的残余物溶解于 DCM(70ml)，与固体 K2CO3 一起搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到呈浅黄色油的 3，4- 二氢异喹啉 -2(1H)- 羧酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲基酯 (0.374g，9.3％ )。
分析 HPLC ：纯度 99.2％ ( 系统 A， RT ＝ 4.36min) ；分析 LCMS ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 5.26min)，ES+ ：289.4[MH]+.C17H24N2O2 的 HRMS 计算值 ：288.1838，实 测值 288.1852。
实施例 2
3，4- 二氢喹啉 -1(2H)- 羧酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯
使 4- 硝 基 苯 基 碳 酸 2-(4- 甲 基 哌 嗪 -1- 基 ) 乙 基 酯 ( 中 间 体 2 ；2.76g， 8.91mmol) 溶 解 于 DMF(30mL)。 加 入 DIPEA(1.55mL，9.32mmol) 和 1，2，3，4- 四 氢喹啉 (1.17mL，9.32mmol)，室温下搅拌反应混合物 48 小时，再真空浓缩反应混合 物。 先后经正相层析法 ( 先后用 DCM、90 ∶ 10 的 DCM ∶ MeOH 混合物、80 ∶ 20 的 DCM ∶ MeOH 混合物洗脱 ) 和反相层析法 ( 用水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％ 甲酸，0-20％ ) 纯化残余物。 使所生成的残余物溶解于 DCM(50mL)，与固体 K2CO3 一起
搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到呈黄色油的 3，4- 二氢喹啉 -1(2H)- 羧酸 2-(4- 甲 基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯 (236mg，9.0％ )。
分析 HPLC ：纯度 99.8％ ( 系统 A， RT ＝ 3.72min) ；分析 LCMS ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 7.19min)，ES+ ：304.5[MH]+.C17H25N3O2 的 HRMS 计算值 ：303.1947，实 测值 303.1957。
实施例 33，4- 二氢异喹啉 -2(1H)- 羧酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯使 4- 硝 基 苯 基 碳 酸 2-(4- 甲 基 哌 嗪 -1- 基 ) 乙 基 酯 ( 中 间 体 2 ；2.00g， 6.47mmol) 溶 解 于 DMF(30mL)。 加 入 DIPEA(1.69mL，9.71mmol) 和 1，2，3，4- 四 氢异喹啉 (0.81mL，6.47mmol)，室温下搅拌反应混合物 18 小时，再真空浓缩反应混合 物。 使所生成的残余物溶解于乙酸乙酯 (300mL)，用 1M Na2CO3 水溶液 (5x 200mL) 和 盐水 (50mL) 洗涤。 溶液经干燥 (MgSO4) 和真空浓缩。 残余物经反相层析法 ( 用水中 的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1 ％甲酸，0-30 ％ ) 纯化。 使所生成的残余物溶解于 DCM(60mL)，与固体 K2CO3 一起搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到呈浅黄色油的 3， 4- 二氢异喹啉 -2(1H)- 羧酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯 (834mg，42.9％ )。
分析 HPLC ：纯度 99.7％ ( 系统 A， RT ＝ 3.67min) ；分析 LCMS ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 4.45min)，ES+ ：304.4[MH]+.C17H25N3O2 的 HRMS 计算值 ：303.1947，实
测值 303.1956。
实施例 4
二氢吲哚 -1- 羧酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯
使 4- 硝 基 苯 基 碳 酸 2-(4- 甲 基 哌 嗪 -1- 基 ) 乙 基 酯 ( 中 间 体 2 ；2.77g， 8.96mmol) 溶解于 DMF(30mL)。加入 DIPEA(1.56mL，9.42mmol) 和二氢吲哚 (1.05mL， 9.37mmol)，室温下搅拌反应混合物 48 小时，再真空浓缩反应混合物。 使残余物溶解于 EtOAc(300mL)，经 1M Na2CO3 水溶液 (5x 200mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 和真空浓缩。 残余物经反相层析法纯化 ( 用水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 使所生成的残余物溶解于 DCM(50mL)，与固体 K2CO3 一起搅拌 20 分钟，过滤并真空浓 缩，得到呈黄色油的二氢吲哚 -1- 羧酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯 (1.88g，73.0％ )。
分析 HPLC ：纯度 99.4％ ( 系统 A， RT ＝ 3.67min) ；分析 LCMS ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 4.80min)ES+ ：290.4[MH]+.C16H23N3O2 的 HRMS 计算值 ：289.1790，实测 值 289.1804。
实施例 5
1，3- 二氢 -2H- 异吲哚 -2- 羧酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯
使 4- 硝 基 苯 基 碳 酸 2-(4- 甲 基 哌 嗪 -1- 基 ) 乙 基 酯 ( 中 间 体 2 ；2.76g， 8.94mmol) 溶 解 于 DMF(30mL)。 加 入 DIPEA(1.55mL，9.35mmol) 和 异 二 氢 吲 哚 (1.06mL，9.34mmol)，室温下搅拌反应混合物 15 小时，再真空浓缩反应混合物。 使残余 物溶解于 EtOAc(300mL)，经 1MNa2CO3 水溶液 (5x 200mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 和真空 浓缩。 残余物经反相层析法 ( 用水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ ) 纯化。 使所生成的残余物溶解于 DCM(50mL)，与固体 K2CO3 一起搅拌 20 分钟，过滤并 真空浓缩，得到放置就固化的黄色油。 固体自庚烷再结晶，得到呈白色固体的 1，3- 二 氢 -2H- 异吲哚 -2- 羧酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙基酯 (990mg，38.3％ )。
分析 HPLC ：纯度 100 ％ ( 系统 A， RT ＝ 3.52min) ；分析 LCMS ：纯度 100 ％ ( 系统 A，RT ＝ 4.76min)，ES+ ：290.4[MH]+.C16H23N3O2 的 HRMS 计算值 ：289.1790，实 测值 289.1800。
生物学方法
雄性 C57bl/6 小鼠的过夜体重变化的测定
为使效果窗最大化，该模型研究化合物在下午至上午期间对体重增加的作用。 如图 1 中表示的那样，典型地，在夜晚期间小鼠增加约 1g 重量，然后在白天期间失去该 体重增加的大部分。 经任何 24 小时时间段的体重差别是极小的，尽管在夜晚断黑开始和 白天天亮开始之间 ( 傍晚 (pm) 至黎明 (am)) 的体重差别是最大的。
整晚测量体重变化是重要的。 如果连续两天给予小鼠活性化合物，纪录第一次 给药后 48 小时的体重变化，当时未观察到显著的作用。 然而，如果仅仅考虑晚间的体重 变化，那么可看到显著和强烈的作用。 这是因为小鼠在白天反弹，弥补了晚间的体重增 加的缺乏。 活性持续很长的化合物也可消除这种反弹，经 48 小时减少体重。
经连续给药数日 C57bl\6 雄性小鼠的体重变化 ：
连续 2 天，在夜晚开始和白天开始 ( 下午至上午 ) 之间的体重变化大于所测量的 下午和下午之间的体重变化。 因此，为最大化效果窗口，研究化合物对下午至上午的差 别的作用。
将 C57b1/6 小鼠分组 ( 每笼 5 只 ) 并放置 5 天以适应环境。 正好在天黑前给予 单次腹膜内 (ip) 给药剂量 (60mg/kg)。 使化合物或溶于水或溶解于至多 3％乳浮 ( 这种 情况下，溶媒也含有乳浮 )。 根据化合物的性质，调节 pH 自最小 5.5 至最大 8。
如图 2-4 中所示的那样，用式 (I) 化合物减少小鼠的体重。
非重组系统中的瘦蛋白试验
尽管在重组系统 ( 例如 ObRb- 转染 HEK293 细胞 ) 中已很好表达，其中瘦蛋白 引起 STAT3 磷酸化的非常显著的增加，但这些系统往往不能提供针对瘦蛋白受体的测试 化合物的活性的准确测量。 似乎在大部分情况下，受体过表达 ( 以及不同的药物对受与 其受体相关的瘦蛋白触发的信号传导通道不同部分的作用的可能性 ) 导致测试的药物缺 乏活性。
非重组系统中的瘦蛋白受体表达经常是波动的，必须注意鉴别其中信号稳定性 仍保留在实验中的系统。 采用这样的系统，瘦蛋白受体拮抗剂模拟物可通过评价比较它 们对瘦蛋白的作用 ( 见下文 ) 来鉴别。
瘦蛋白主要产自脂肪细胞，但在人体中， mRNA 编码瘦蛋白也出现在胎盘中。在这里，瘦蛋白可在微血管中起到重要的增殖作用。 评价在天生细胞系中采用这种假说 的可能性。
JEG-3 方案
在 JEG-3 细胞 ( 绒毛膜癌细胞系 ) 中，瘦蛋白能刺激增殖至多 3 倍 (Biol.Reprod. (2007)76 ：203-10)。 瘦蛋白也引起 JEG-3 细胞中的 [3H]- 胸腺嘧啶核苷掺入的浓度依赖 性增加 ( 图 5，在 100nM 作用最大 (EC50 ＝ 2.1nM))。 细胞掺入的放射性是其增殖活性 的指标，并用液体闪烁 β 计数器以每分钟计数 (CPM) 测量。
这一发现可用来测试化合物是否能复制瘦蛋白对细胞增殖的作用 ( 瘦蛋白受体 激动剂模拟物 )( 即，给定化合物将引起细胞掺入的 [3H]- 胸腺嘧啶核苷的增加 ) 或是否能 通过预防瘦蛋白介导的 [3H]- 胸腺嘧啶核苷掺入的增加抑制瘦蛋白的作用 ( 拮抗作用 )。
这种方法具有采用非重组系统的优点并具有合理的再现性和可靠性。
脑渗透测量
通常经静脉 (IV) 或经口 (PO) 途径，给予测试物种 ( 啮齿动物 ) 大剂量的被研究 的底物。 在适当的时间点，取血样，提取所得到的血浆，分析底物浓度，且在需要时， 分析代谢物浓度。 在相同的时间点，处死另一组动物，分离大脑，清洗脑表面。 然后将 脑试样匀浆化、提取，并分析底物浓度，且在需要时，分析代谢物浓度。 作为选择，将 微量渗析探针 (microdialysis probes) 植入测试物种的一个或多个脑区域，于适当的时间点 收集试样用于随后的分析。 该方法具有仅测量细胞外底物浓度的优点。 通过比较各个时 间点的平均浓度或通过计算浓度时间图的曲线下的面积 (AUC)，比较血药浓度和脑药浓 度并计算比率。