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长效盐酸头孢噻呋注射液及其制备方法
    【技术领域】
     本发明属于动物药品领域，具体涉及一种长效盐酸头孢噻呋混悬注射液及其制备方法。 背景技术 头孢噻呋具有药效持久的特点，它在动物体内可与蛋白质进行可逆性结合，形 成杀菌力库存，其抗菌谱广，对各种革兰氏阴性菌 （如大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆 菌） 及革兰氏阳性菌 （如葡萄球菌、链球菌） 均有显著效力。 头孢噻呋分子结构稳定， 不被 β- 内酰胺酶破坏，因此不易产生抗药性或交叉抗药性，被广泛应用于兽药领域。
     现国内外研究的头孢噻呋剂型有注射用头孢噻呋钠粉针剂、头孢噻呋钠脂质体 等剂型，这些剂型的缺点是作用时间短，其用药方法基本均为每天注射一次，连用 3 ～ 5 天，为减少因头孢噻呋频繁注射给药造成的养殖场人力财力的浪费，并尽量避免多次给 药引起的动物应激反应，因此本发明为我国养殖业提供一种给药方便的头孢噻呋长效制 剂，为临床用药提供便利。
     发明内容
     本发明的目的是提供一种长效盐酸头孢噻呋注射液及其制备方法，将盐酸头孢 噻呋分散于特制的复合溶媒中制成的一类长效制剂，所得药物进入体内后缓慢吸收和释 放，使血液中药物峰浓度降低并延长有效血药浓度的持续时间，从而达到提高疗效，减 少剂量，延长药效 （药物逐渐被吸收），降低副作用的目的。 同时还可减少用药次数， 为规模化养殖户带来很大的便利。
     本发明的技术方案是 ：长效盐酸头孢噻呋注射液，由下述方法制得。
     长效盐酸头孢噻呋注射液的制备方法，包括以下步骤 ： （1） 将盐酸头孢噻呋原料药加入复合溶媒中搅拌，充分混匀得混悬液 ； （2） 将助悬剂加入注射剂溶媒中并在 80℃～ 90℃下溶解得溶解液 ； （3） 将步骤 （2） 的溶解液冷却至室温后加入到步骤 （1） 混悬液中，搅拌均匀得 混合液 ； （4） 再加入抑菌剂于步骤 （3） 的混合液中，加入剩余的注射级溶媒定至全量，搅 拌混匀 ；然后过高速剪切分散机，再过胶体磨，灭菌，制得长效盐酸头孢噻呋注射液 ； 所述盐酸头孢噻呋原料药的加入量为注射液总体积的 5% ～ 10% （g/ml），复合溶 媒为注射级溶媒与聚乙二醇或注射级溶媒与聚乙二醇和司盘的混合液，其中配置成复合 溶媒中注射级溶媒的用量为注射液总体积的 20% ～ 50%。 当复合溶媒为注射级溶媒与聚 乙二醇的混合液时，聚乙二醇的加入量为注射液总体积的 4% ～ 8% （v/v） ；当复合溶 媒为注射级溶媒与聚乙二醇和司盘的混合液，聚乙二醇和司盘混合液的加入量为注射液 总体积的 4% ～ 8% （v/v），聚乙二醇和司盘的体积比为 3:2 ～ 5:2。
     所述注射级溶媒为三乙酸甘油酯、大豆油或橄榄油 （优选三乙酸甘油酯）。所述混悬注射液中助悬剂为氢化蓖麻油和卵磷脂复合物，氢化蓖麻油和卵磷脂 的混合比例 （g/g） 为 2:3 ～ 2:5，助悬剂的加入量为注射液总体积的 0.1% ～ 0.5% （g/ ml）。 所述抑菌剂为三氯叔丁醇、苯甲醇或硫柳汞 （优选三氯叔丁醇），用量为注射液 总体积的 0.1% ～ 0.5% （g/ml）。
     所述高速剪切分散机的速度为 1200 ～ 2000r/min，过高速剪切分散机的时间为 15 ～ 60min，过胶体磨 2 ～ 5h，所述灭菌是通过 1 ～ 6KGY 辐照灭菌。
     本发明将盐酸头孢噻呋直接分散于复合溶媒中制成的一类长效混悬液制剂，通 过高速剪切分散机和胶体磨分别处理后而得的一种混悬液，肌内注射后能够缓慢释放， 以达到延长药物在体内的消除半衰期的作用。
     本发明中加入聚乙二醇可以增加注射剂溶媒对药物的承载力，提高了药物的混 悬附着效果，提高了混悬液的沉降比和重分散性 ；另外本发明将聚乙二醇与司盘合用， 可进一步提高混悬液的稳定性和流动性。
     本发明通过制备一个复合溶媒提高了混悬液的稳定性和重分散性，通过高速剪 切分散机和胶体磨处理能将盐酸头孢噻呋混悬液注射液的粒径控制在 8 ～ 10μm，提高 了混悬液的流动性，解决了以往很多混悬液制剂挂壁的问题 ；另外本发明将成品通过辐 照灭菌避免了头孢噻呋对热敏感的问题并加入了一定的抑菌剂进一步提高了制剂的稳定 性。 本发明制备工艺操作简单，减少了为了达到混悬液所需粒径大小而对制剂中的主要 原粉或辅料进行研磨或超微粉碎等繁琐操作。 申请人意外发现，通过采用复合溶媒可提 高本发明药物的溶解度和稳定性 ；通过高速剪切分散机和胶体磨处理，对制备设备、条 件要求低，得到的混悬注射液均匀、重分散性好、流动性好、沉降慢等特点，猪肌内注 射该制剂后消除半衰期长，可延长药物在体内的有效作用时间，减少用药次数。 附图说明 图 1 ～ 4 分别为空白样品色谱图、盐酸头孢噻呋对照品色谱图、实施例 3 制得的 盐酸头孢噻呋混悬注射液样品及空白中添加药物色谱图 ； 图 5 为实施例 3 除不加药物的空白制剂添加药物浓度 5 ～ 150µg/mL 范围内标准曲线 图； 图 6 为实施例 3 制得的长效盐酸头孢噻呋注射液粒径 40 倍光学显微镜图 ； 图 7 为实施例 3 制得的长效盐酸头孢噻呋注射液和美国辉瑞公司生产的盐酸头孢噻呋 注射液对猪机内注射后血浆中头孢噻呋的浓度 - 时间曲线。
     具体实施方式
     将 5 ～ 10% （g/ml） 盐酸头孢噻呋加入到三乙酸甘油酯或大豆油、橄榄油等注 射级溶媒中的一种或与聚乙二醇或与聚乙二醇和司盘的复合溶媒中，充分混匀，得到含 药混悬液，并不停地搅拌 ；再将 0.1 ～ 0.5% （g/ml） 复合助悬剂氢化蓖麻油 ：卵磷脂 以 2:3 ～ 2:5 （g/g）的比例混合而成的复合物加入到 80℃～ 90℃的注射级溶媒中溶解， 待冷却至室温加入正在搅拌的混悬液中，搅拌均匀，同时加入 0.1 ～ 0.5% （g/ml） 抑菌 剂三氯叔丁醇、苯甲醇或硫柳汞其中的一种，加入剩余的注射级溶媒定至全量，搅拌混 匀，过高速剪切分散机，最后过胶体磨，灭菌，制得乳白色或淡黄色混悬液。上述复合溶媒为注射剂溶媒三乙酸甘油酯或大豆油、橄榄油等注射级溶媒中的 一种与聚乙二醇或体积比为 3:2 ～ 5:2 聚乙二醇和司盘的混合物，用量为混悬注射液总体 积的 4% ～ 8% （v/v），配制成复合溶媒中注射级溶媒的用量为注射液总体积的 20% ～ 50%。
     （注 ：以上 g/ml 均表示加入物的质量 （g） 与所配置的盐酸头孢噻呋注射液总 体积 （ml 数） 的比值，以下类同）。
     下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。
     实施例 1 （1） 将 7.5g 盐酸头孢噻呋加入 40ml 三乙酸甘油酯，磁力搅拌，充分混匀 ； （2） 将 0.3g 复合助悬剂 （氢化蓖麻油 ：卵磷脂 1:2 (g/g） 混合物） 加入到 90℃的 三乙酸甘油酯中溶解 ； （3） 将步骤 （2） 的溶解液待冷却至室温加入正在搅拌的步骤 （1） 混悬液中，搅 拌均匀 ； （4） 再加入 0.5g 抑菌剂三氯叔丁醇于步骤 （3） 的混悬液中，用剩余的三乙酸甘油 酯定至 100ml，充分搅拌 ； （5） 搅拌混匀 30min，过高速剪切分散机 30min，转速为 1200r/min，再过胶体磨 4h，最后将样品 60Co-γ 射线 3KGY 辐照灭菌，制得乳白色或淡黄色混悬液。
     混悬液性状为乳白色或淡黄色，粒径分布均匀，平均粒径为 8.38μm，大于 12μm 的占 0.14%，沉降体积比 0.92，重分散性较好。 稳定性考察 ：在条件为温度 40 士 2℃，相对湿度为 65 士 5% 的条件下进行加速试验，三个月后，含量测定为投料量的 97.46%。
     实施例 2 （1）将 7.5g 盐酸头孢噻呋加入 40ml 复合溶媒 （36ml 三乙酸甘油酯与 4ml 聚乙二醇 200），磁力搅拌，充分混匀 ； （2） 将 0.3g 复合助悬剂 （氢化蓖麻油 ：卵磷脂 1:2 (g/g） 混合物） 加入到 90℃的 三乙酸甘油酯中溶解 ； （3） 将步骤 （2） 的溶解液待冷却至室温加入正在搅拌的步骤 （1） 混悬液中，搅 拌均匀 ； （4） 再加入 0.2g 抑菌剂苯甲醇于步骤 （3） 的混悬液中，用剩余的三乙酸甘油酯定 至 100ml，充分搅拌 ； （5） 搅拌混匀 30min，过高速剪切分散机 30min，转速为 1200r/min，再过胶体磨 4h，最后将样品 60Co-γ 射线 3KGY 辐照灭菌，制得乳白色或淡黄色混悬液。
     混悬液性状为乳白色或淡黄色，粒径分布均匀，平均粒径为 8.19μm，大于 12μm 的占 0.11%，沉降体积比 0.98，重分散性好。 稳定性考察 ：在条件为温度 40 士 2 ℃，相对湿度为 65 士 5% 的条件下进行加速试验，三个月后，含量测定为投料量的 99.32%。
     实施例 3 （1）将 7.5g 盐酸头孢噻呋加入 40ml 复合溶媒 （36ml 三乙酸甘油酯与 4ml 聚乙二醇 200 ：司盘 80 按 2:1 （v/v） 混合液），磁力搅拌，充分混匀 ；（2） 将 0.3g 复合助悬剂 （氢化蓖麻油 ：卵磷脂 1:2 (g/g） 混合物） 加入到 90℃的 三乙酸甘油酯中溶解 ； （3） 将步骤 （2） 的溶解液待冷却至室温加入正在搅拌的步骤 （1） 混悬液中，搅 拌均匀 ； （4） 再加入 0.5g 抑菌剂苯甲醇于步骤 （3） 的混悬液中，用剩余的三乙酸甘油酯定 至 100ml，充分搅拌 ； （5） 搅拌混匀 30min，过高速剪切分散机 30min，转速为 1200r/min，再过胶体磨 4h，最后将样品 60Co-γ 射线 3KGY 辐照灭菌，制得乳白色或淡黄色混悬液。
     混 悬 液 性 状 为 乳 白 色 或 淡 黄 色， 粒 径 分 布 均 匀 （见 图 6）， 平 均 粒 径 为 8.14μm，大于 12μm 的占 0.1%，沉降体积比 1.0，重分散性好。 稳定性考察 ：在条件为 温度 40 士 2℃，相对湿度为 65 士 5% 的条件下进行加速试验，三个月后，含量测定为投 料量的 99.44%。
     实施例 4 （1） 将 7.5g 盐酸头孢噻呋加入 20ml 大豆油，磁力搅拌，充分混匀 ； （2） 将 0.5g 复合助悬剂 （氢化蓖麻油 ：卵磷脂 1:2 (g/g） 混合物） 加入到 90℃的 三乙酸甘油酯中溶解 ； （3） 将步骤 （2） 的溶解液待冷却至室温加入正在搅拌的步骤 （1） 混悬液中，搅 拌均匀 ； （4） 再加入 0.5g 抑菌剂三氯叔丁醇于步骤 （3） 的混悬液中，用剩余的大豆油定至 100ml，充分搅拌 ； （5） 搅拌混匀 30min，过高速剪切分散机 30min，转速为 1500r/min，再过胶体磨 4h，最后将样品 60Co-γ 射线 3KGY 辐照灭菌，制得乳白色或淡黄色混悬液。 混悬液性状为乳白色或淡黄色，粒径分布均匀，平均粒径为 8.26μm，大于 12μm 的占 0.12%，沉降体积比 0.94，重分散性较好。 稳定性考察 ：在条件为温度 40 士 2℃，相对湿度为 65 士 5% 的条件下进行加速试验，三个月后，含量测定为投料量的 97.29%。
     实施例 5 （1）将 7.5g 盐酸头孢噻呋加入 20ml 复合溶媒 （15ml 大豆油与 5ml 聚乙二醇 200）， 磁力搅拌，充分混匀 ； （2） 将 0.5g 复合助悬剂 （氢化蓖麻油 ：卵磷脂 1:2 (g/g） 混合物） 加入到 90℃的 三乙酸甘油酯中溶解 ； （3） 将步骤 （2） 的溶解液待冷却至室温加入正在搅拌的步骤 （1） 混悬液中，搅 拌均匀 ； （4） 再加入 0.5g 抑菌剂苯甲醇于步骤 （3） 的混悬液中，用剩余的大豆油定至 100ml，充分搅拌 ； （5） 搅拌混匀 30min，过高速剪切分散机 30min，转速为 1500r/min，再过胶体磨 4h，最后将样品 60Co-γ 射线 3KGY 辐照灭菌，制得乳白色或淡黄色混悬液。
     混悬液性状为乳白色或淡黄色，粒径分布均匀，平均粒径为 8.18μm，大于 12μm 的占 0.11%，沉降体积比 0.98，重分散性好。 稳定性考察 ：在条件为温度 40 士
     2 ℃，相对湿度为 65 士 5% 的条件下进行加速试验，三个月后，含量测定为投料量的 99.16%。
     实施例 6 （1） 将 7.5g 盐酸头孢噻呋加入 20ml 复合溶媒 （15ml 大豆油与 5ml 聚乙二醇 200 ： 司盘 80 按 2:1 （v/v） 混合液，磁力搅拌，充分混匀 ； （2） 将 0.5g 复合助悬剂 （氢化蓖麻油 ：卵磷脂 1:2 (g/g） 混合物） 加入到 90℃的 三乙酸甘油酯中溶解 ； （3） 将步骤 （2） 的溶解液待冷却至室温加入正在搅拌的步骤 （1） 混悬液中，搅 拌均匀 ； （4） 再加入 0.5g 抑菌剂硫柳汞于步骤 （3） 的混悬液中，用剩余的大豆油定至 100ml，充分搅拌 ； （5） 搅拌混匀 30min，过高速剪切分散机 30min，转速为 2000r/min，再过胶体磨 4h，最后将样品 60Co-γ 射线 3KGY 辐照灭菌，制得乳白色或淡黄色混悬液。
     混悬液性状为乳白色或淡黄色，粒径分布均匀，平均粒径为 8.16μm，大于 12μm 的占 0.11%，沉降体积比 0.98，重分散性好。 稳定性考察 ：在条件为温度 40 士 2 ℃，相对湿度为 65 士 5% 的条件下进行加速试验，三个月后，含量测定为投料量的 99.25%。 实施例 7 （1） 将 7.5g 盐酸头孢噻呋加入 50ml 橄榄油，磁力搅拌，充分混匀 ； （2） 将 0.1g 复合助悬剂 （氢化蓖麻油 ：卵磷脂 1:2 (g/g） 混合物） 加入到 90℃的 三乙酸甘油酯中溶解 ； （3） 将步骤 （2） 的溶解液待冷却至室温加入正在搅拌的步骤 （1） 混悬液中，搅 拌均匀 ； （4） 再加入 0.5g 抑菌剂三氯叔丁醇于步骤 （3） 的混悬液中，用剩余的三乙酸甘油 酯定至 100ml，充分搅拌 ； （5） 搅拌混匀 30min，过高速剪切分散机 30min，转速为 2000r/min，再过胶体磨 4h，最后将样品 60Co-γ 射线 3KGY 辐照灭菌，制得乳白色或淡黄色混悬液。
     混悬液性状为乳白色或淡黄色，粒径分布均匀，平均粒径为 8.28μm，大于 12μm 的占 0.14%，沉降体积比 0.95，重分散性较好。 稳定性考察 ：在条件为温度 40 士 2℃，相对湿度为 65 士 5% 的条件下进行加速试验，三个月后，含量测定为投料量的 97.67%。
     实施例 8 （1）将 7.5g 盐酸头孢噻呋加入 50ml 复合溶媒 （42ml 橄榄油与 8ml 聚乙二醇 200）， 磁力搅拌，充分混匀 ； （2） 将 0.1g 复合助悬剂 （氢化蓖麻油 ：卵磷脂 1:2 (g/g） 混合物） 加入到 90℃的 三乙酸甘油酯中溶解 ； （3） 将步骤 （2） 的溶解液待冷却至室温加入正在搅拌的步骤 （1） 混悬液中，搅 拌均匀 ； （4） 再加入 0.5g 抑菌剂苯甲醇于步骤 （3） 的混悬液中，用剩余的橄榄油定至
     100ml，充分搅拌 ； （5） 搅拌混匀 30min，过高速剪切分散机 30min，转速为 2000r/min，再过胶体磨 4h，最后将样品 60Co-γ 射线 3KGY 辐照灭菌，制得乳白色或淡黄色混悬液。
     混悬液性状为乳白色或淡黄色，粒径分布均匀，平均粒径为 8.15μm，大于 12μm 的占 0.11%，沉降体积比 0.98，重分散性好。 稳定性考察 ：在条件为温度 40 士 2 ℃，相对湿度为 65 士 5% 的条件下进行加速试验，三个月后，含量测定为投料量的 99.22%。
     实施例 9 （1） 将 7.5g 盐酸头孢噻呋加入 50ml 复合溶媒 （42ml 橄榄油与 8ml 聚乙二醇 200 ： 司盘 80 按 2:1 （v/v） 混合液，磁力搅拌，充分混匀 ； （2） 将 0.1g 复合助悬剂 （氢化蓖麻油 ：卵磷脂 1:2 (g/g） 混合物） 加入到 90℃的 三乙酸甘油酯中溶解 ； （3） 将步骤 （2） 的溶解液待冷却至室温加入正在搅拌的步骤 （1） 混悬液中，搅 拌均匀 ； （4） 再加入 0.1g 抑菌剂硫柳汞于步骤 （3） 的混悬液中，用剩余的橄榄油定至 100ml，充分搅拌 ； （5） 搅拌混匀 30min，过高速剪切分散机 30min，转速为 2000r/min，再过胶体磨 4h，最后将样品 60Co-γ 射线 3KGY 辐照灭菌，制得乳白色或淡黄色混悬液。 混悬液性状为乳白色或淡黄色，粒径分布均匀，平均粒径为 8.14μm，大于 12μm 的占 0.11%，沉降体积比 0.99，重分散性好。 稳定性考察 ：在条件为温度 40 士 2 ℃，相对湿度为 65 士 5% 的条件下进行加速试验，三个月后，含量测定为投料量的 99.31%。
     以上实施例说明采用注射级溶媒三乙酸甘油酯、大豆油或橄榄油作为溶媒研制 盐酸头孢噻呋注射液，其各项考察指标均能符合要求 , 但三乙酸甘油酯、大豆油或橄榄 油中的一种与聚乙二醇或与聚乙二醇和司盘的混合物作为盐酸头孢噻呋注射液的复合 溶媒时，所制备的混悬注射液的稳定性更好，加速试验三个月后含量测定为投料量的 99% 以上，与单独用三乙酸甘油酯、大豆油或橄榄油做溶媒时含量测定差异极显著 （P ＜ 0.01），且沉降体积比均达到 0.98 以上，粒径小于 8.2μm。 差异显著 （P ＜ 0.05）。 该结果进一步说明聚乙二醇和司盘的加入，与注射级溶媒以适宜的比例混合作为盐酸头 孢噻呋混悬注射液的复合溶媒能提高盐酸头孢噻呋注射液的稳定性。
     盐酸头孢噻呋注射液含量测定方法学研究 1 试验材料 1.1 主要试剂 盐酸头孢噻呋标准品 ：白色或淡黄色粉末，纯度 87.5%，源自于中国兽药监察所 长效盐酸头孢噻呋注射液 ：武汉回盛生物科技有限公司自制 N 一 N 二甲基甲酰胺 分析纯 四氢呋喃 色谱纯 甲醇 色谱纯 醋酸铵 分析纯
     2.1.2 主要仪器 KQ-3200E 超声波清洗机 ( 江苏昆山超声仪器 ) XW-80A 旋涡混合器 ( 上海青浦沪西仪器厂 ) 电子天平 ( 北京赛多利斯天平有限公司 ) TGL-16GB 台式高速离心机 ( 上海安亭科学仪器厂 ) XMT-9017 药物稳定性试验箱 ( 重庆市永生实验仪器厂 ) DHG-9070A 电热恒温鼓风干燥箱 ( 上海精宏实验设备有限公司 ) 1.2 试验方法 1.2.1 色谱条件 色谱柱 : Agilent SB-C18 柱 （150mm×4.6mm，5µm） 流动相 ：四氢呋喃 ：甲醇 ：四丁基氢氧化铵 ：0.5mol/L 醋酸铵 ( 含 0.1% 三乙胺， 0.1% 冰醋酸 (10:25:5:65) ； 流速 ：1mL/min ；柱温 ：35℃ ；紫外检测波长 ：254nm ；进样量 ：20μL。
     1.2.2 样品预处理 量取样品 5 mL 置 25mL 量瓶中，用 N-N 二甲基甲酰胺 - 正丁醇 (1 ：1) 溶解并稀释 至刻度，摇匀，精密量取 1mL，加乙腈 - 水 (1 ：1)10mL，正己烷 5mL，振摇 2 分钟，离 心，精密量取下层溶液 1mL，再用乙腈 - 水 (1 ：1) 定容至 10mL，摇匀，取 20μL 注入液 相色谱仪，记录色谱图 ；另取盐酸头孢噻呋标准品适量，置 10mL 量瓶中，加二甲基甲 酰胺 - 正丁醇 (1 ：1)1mL，用乙腈 - 水 (1 ：1) 溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取 1mL， 再用乙腈 - 水 (1 ：1) 定容至 10mL，摇匀，取 20μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。 由 于盐酸头孢噻呋混悬注射液粘稠，不易精密测定体积，所以另取盐酸头孢噻呋混悬注射 液测定相对密度，将盐酸头孢噻呋混悬注射液重量换算成 mL 数，采用外标法计算盐酸头 孢噻呋的含量。
     1.2.3 杂质干扰试验 按处方配比加入各辅料配置成空白混悬液 ( 与盐酸头孢噻呋混悬液相比，仅不含盐 酸头孢噻呋，其余成分相同 ) 然后分别配置盐酸头孢噻呋空白混悬液和盐酸头孢噻呋混 悬液，按样品预处理方法处理后进行 HPLC 测定。
     2.2.4 线性关系 精密称取盐酸头孢噻呋标准品适量于 10mL 容量瓶中，加入适量 N-N 二甲基甲酰 胺 - 正丁醇 (1 ：1) 超声 5min 使之完全溶解，再用乙腈 - 水 (1 ：1) 定容至 10mL，超声 摇匀，精密量取 1mL，再用乙腈 - 水 (1 ：1) 定容至 10mL，得 0.15mg/mL 标准液，取标 准液用流动相稀释成 0.05、0.01、0.02、0.05、0.1、0.15mg/mL 溶液，以乙腈 - 水作为空 白，经 0.45µm 滤膜过滤，取 20µL 进行测定，记录色谱图。
     1.2.5 回收率测定 精密称取空白混悬液 5mL 于 25mL 容量瓶中，共取 6 份，再分别加入盐酸头孢噻呋 标准品使含盐酸头孢噻呋浓度为 5、50、150µg/mL，分别混匀，按样品处理方法处理， 进行 HPLC 测定，根据药物色谱峰面积，从回归方程中算得盐酸头孢噻呋的浓度，计算 测定值并换算为制得样品实测浓度。 按下式计算回收率 ： 回收率 =( 制得样品实测浓度 / 理论浓度 )×100%。1.2.6 精密度测定 分别准确量取混悬液适量，每批取样 3 份，共 3 批，按 “样品预处理” 方法处理， 处理后再进行 HPLC 测定，计算批内及批间变异系数。
     1.2.7 样品测定 准确量取样品混悬液 5mL，按 “样品预处理”方法处理，取 20µL 进行 HPLC 测定， 记录色谱峰面积。
     2 试验结果 2.1 色谱行为 空白样品色谱图、盐酸头孢噻呋 （盐酸 CEF）、对照品溶液色谱图、盐酸 CEF 混悬 注射液样品及空白中添加药物色谱图分别见图 1、2、3、4。
     2.2 标准曲线 由行为图谱可知，样品中杂质分离良好，无明显干扰峰。 在空白中添加浓度为 5 ～ 150µg/mL 范围内色谱峰面积与浓度呈线性相关。 其线性方程为 :Y=1.4245X-0.2373， r=0.9999，线性关系好，说明盐酸噻呋注射液在该方法下检测稳定性良好，见图 5。
     由样品色谱图可知，样品中杂质分离良好，无明显干扰峰。 盐酸头孢噻呋在 5 ～ 150µg/mL 添加水平时，平均回收率为 96.34% ～ 98.62%，日间变异系数为 2.9% ～ 3.4%，日内变异系数为 2.7% ～ 3.2%，结果见表 2-1。
     表 2-1 空白混悬液添加盐酸头孢噻呋的方法学考察结果 （n=3）长效盐酸头孢噻呋注射液在猪体内的药物动力学研究 1 试验材料 1.1 仪器设备 Agilent1100 高效液相色谱仪，美国 Agilent 公司 ； JY2002 型电子天平，上海市精密科学仪器有限公司 ； BP211D 型分析天平，德国 Sartoraus 公司 ； KQ-100B 型超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司 ； TGL-16G 台式离心机，上海安亭科技仪器厂 ； YKH 性液体快速混合器，江西医疗机械厂。
     1.2 药品与试剂 去呋喃甲酰基头孢噻呋标准品 （98.0%）， Sigma 公司 ； 长效盐酸头孢噻呋注射液 （7.5%），含量 ：103.25%，武汉回盛生物科技有限公司 生产，批号 ：20090608 ； 盐酸头孢噻呋混悬注射液 （5%），美国辉瑞公司生产，批号 ：0A3YW ； 二硫赤鲜醇，纯度 >99%，美国 ACROS 生物公司 ； 碘乙酰胺，纯度 >98%，美国 ACROS 生物公司 ；甲醇 ：分析纯，国药集团化学试剂有限公司 ； 磷酸二氢钾 ：分析纯，国药集团化学试剂有限公司 ； 氯化钾 ：分析纯，国药集团化学试剂有限公司 ； 乙腈 ：分析纯，国药集团化学试剂有限公司 ； 四硼酸钠 ：分析纯，上海试一化学试剂有限公司 ； 氢氧化钾 ：分析纯，国药集团化学试剂有限公司 ； 三氟乙酸 ：色谱纯，美国 Tedia 公司。
     1.3 实验动物 试验动物 ：健康大白 × 长白二元杂交猪 12 头，体重 25±2kg，购于湖北建丰牧业有 限公司革新猪场。
     饲料 ：试验期间按常规饲养，自由饮水和采食，饲料为不含抗菌药物的全价日 粮。
     1.4 主要溶液配制 去呋喃甲酰基头孢噻呋标准贮备液 (200μg/mL) ：准确称取 0.0204g 去呋喃甲酰基头 孢噻呋 (DFC) 标准品于 100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，在 -20℃保存备用。 去呋喃甲酰基头孢噻呋标准工作液 ：分别移取适量的标准储备液添加于 100 mL 容量瓶中，用三蒸水稀释定容，配制成 0.05、0.1、0.5、2、5、10、20μg/mL 的标准工 作液，4℃保存。
     硼酸盐缓冲液 (pH 9) ：准确称取四硼酸钠 19.00g，氯化钾 3.70g，加水约 700mL 后用盐酸调节 pH 至 9.0，定容至 1000mL。
     磷酸盐缓冲液 (pH 7) ：准确称取 3.40g 磷酸二氢钾，加水约 700mL 后用氢氧化 钾调节 pH 至 7.0，定容至 1000mL。
     提取液 ：称取 0.04g 二硫赤鲜醇，用硼酸盐缓冲液溶解并稀释至 100 mL，现配 现用。
     碘乙酰胺溶液 ：称取 1.40g 碘乙酰胺，用磷酸盐缓冲液 100 mL 溶解，现配现 用。
     1.5 色谱检测条件 流动相及紫外检测波长见表 1-1。
     表 1-1 高效液相色谱法检测盐酸头孢噻呋流动相组成及检测波长
     时间 （min） 0 0-20 20-250.1% 三氟乙酸溶液 100% 70% 100%乙腈 0 30% 0色谱柱 ：Sapphire C18(4.6×250mm，5µm) 检测波长 ：254nm ；流速 ：1 mL/min ；柱温 ：30 ℃ ；进样量 ：50μL。
     1.6 试验动物分组、给药及血样采集 1.6.1 实验动物分组和给药 将试验动物随机分成两组，每组 6 头，第一组肌内注射 5% 盐酸头孢噻呋混悬注射液 给药组 ( 辉瑞研制 )，第二组肌内注射 7.5% 长效盐酸头孢噻呋注射剂 ( 回盛研制 )。 肌内 注射的给药方式均为颈部肌内一次性注射头孢噻呋注射液。 给药前对每只猪进行称重，经过预试，根据药物在体内吸收、分布及消除规律确定采样时间点及肌内注射的间隔时 间，以 5mg/kg 体重剂量颈部肌内注射 5% 盐酸头孢噻呋混悬注射液和长效盐酸头孢噻呋 注射液。
     1.6.2 血样采集 猪只仰卧保定，从前腔静脉采血，给药前每只猪分别采集一次空白血样，给药后于 不同时间点分别对每只猪进行采血，其中，给药动物采血时间点为 0.13、0.25、0.5、1、 2、4、5、6、8、12、24、48、72、96、120、144、168h。 每次采血量约 5mL，采集完毕 后立即移入加有抗凝剂的离心管中，1500r/min 离心 15min 分离血浆，置于 -20℃冰箱保 存，待测定。
     1.7 血浆样品前处理 准确吸取血浆样品 2mL，置于 15mL 具塞塑料离心管中，加入 7mL 血浆药物提取 液，涡旋 1min ；50 ℃水浴 15min，水浴时每隔 3min 涡旋 10s。 振荡涡旋后立即放入水 浴中，20min 后置于室温，待冷却至室温时加入碘乙酰胺 1.5mL 涡漩 1~2min 混匀，室温 避光衍生 2h，每隔 10min 涡漩混匀一次。 衍生完毕后加入 5% 磷酸 2.5mL 调节 pH 值至 2.5 ～ 3.0 后，10000r/min 离心 20min，取上清液进行 SPE 净化。 Bond Elut C18 固相萃取 小柱分别用甲醇 3mL、水 3mL 活化，样品上柱，5% 甲醇水溶液 3mL 淋洗，用真空固相 萃取装置抽干后，甲醇 3mL 洗脱，收集洗脱液，35℃氮气吹干至 0.2mL 以下，用 0.5mL 三蒸水定容，9000r/min 离心 10min 后取 100μL 进行 HPLC 检测。 1.8 建立标准曲线 分别取浓度为 0.05、0.1、0.5、2、5、10、20μg/mL 的标准工作溶液各 100μL 进 HPLC 分析。 以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并求出回归方程和相关 系数。
     1.9 方法学验证 1.9.1 灵敏度 ( 检测限和定量限的确定 ) 最低检测限 ：以仪器能测定的三倍信噪比 (S/N) 时的进样药物量为最低检测限，所 对应的药物在生物样品中的浓度为其最低检测浓度。
     最低定量限 ：以仪器能测定的十倍信噪比时的进样药物量为最低定量限。
     1.9.2 回收率和变异系数的考察 将高、中、低三个浓度的 DFC 标准贮备液添加到空白猪血浆中，充分混匀，以获 得 DFC 分别为 5.0、1.0 和 0.05μg/mL 的血浆，按血浆样品前处理方法进行处理，进行 HPLC 检测，每个浓度设置 5 份样品，1d 内测定 5 次，以考察日内变异系数续重，5d 内 连复测定 5 次，每天 1 次，以考察日间变异系数，并考察方法的绝对回收率。
     1.9.3 数据分析 使用 Excel、3p97 药动学软件等统计学及药物动力学软件对试验数据进行分析。
     2 试验结果 2.1 血浆中药 - 时数据 长效盐酸头孢噻呋注射液和辉瑞盐酸头孢噻呋注射液给药后血浆中头孢噻呋的浓 度 - 时间曲线见附图 7，从图中可知本发明的长效缓释制剂和辉瑞的盐酸头孢噻呋注射液 相比具有较长的半衰期，有效血药浓度维持时间延长。
     2.2 药物动力学数据分析 给猪分别肌内注射长效盐酸头孢噻呋注射液和辉瑞盐酸头孢噻呋注射液后，药物动 力学参数见表 1-2。 见过房室模型分析，两种制剂其血药浓度 - 时间数据均符合一级吸收 二室开放模型。
     表 2-2 两种制剂的药物动力学参数