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一种双重靶向 DNA 疫苗及其构建方法
    【技术领域】
     本发明涉及生物技术领域中的疫苗及其构建方法， 特别是涉及一种双重靶向 DNA 疫苗及其构建方法。背景技术
     疫苗是防治传染病的有效方法。迄今为止， 世界上 80％以上的儿童均使用白喉、 麻疹、 百日咳、 小儿麻痹、 破伤风以及肺结核等 6 种疫苗， 极大地降低了这些疾病的死亡率。 但是对于很多疾病， 在疫苗的研制和使用过程中还存在很多困难。 以结核病为例， 接种卡介 苗只对 50％ -80％的儿童有保护作用， 对成人的保护力更低。霍乱曾经造成严重大流行， 近年来， 该病例有增加的趋势， 而且常用的霍乱弧菌灭活疫苗的有效期仅 4 个月。此外， 口 蹄疫、 乙型脑炎、 轮状病毒、 志贺氏杆菌、 伤寒、 疟疾、 血吸虫病、 登革热等疫苗研制过程中均 存在很多困难， 需进一步改进疫苗制备方法、 以提高其免疫活性 (WHO.State of the art of new vaccines ： research &development-Initiative for Vaccine Research.World Health OrganizationJanuary2005.http://www.who.int/vaccine research/documents/ stateoftheart/en/index.htmL)。DNA 疫苗的研制为解决疫苗研究存在的困难提供了有力 的手段。 DNA 疫苗是作为免疫原的一种或多种蛋白的编码基因克隆到真核表达载体上， 将构 建的重组质粒直接注入到体内并使外源基因得以表达， 从而激活机体免疫系统， 引发抗体 反应。DNA 疫苗具有传统疫苗不可比拟的优势 ： 1. 能表达天然蛋白抗原并进行准确的折叠 和修饰、 递呈给宿主免疫系统， 诱导更有效的免疫应答。2. 可在体内持久表达， 全方位地调 动机体的免疫系统， 诱发广泛而持久的体液和细胞免疫。 3.DNA 疫苗可直接在宿主体内表达 目的抗原， 省略了传统疫苗复杂的制备、 加工过程， 生产简便、 成本低廉、 稳定性好且贮存方 便。4、 DNA 疫苗是病原体抗原的基因片段， 没有感染病原的危险， 安全性很高。5、 同一表达 载体可同时表达多种抗原， 诱导机体产生针对多种病原体的免疫应答， 可用来制备多价或 多联疫苗。
     研 究 表 明， 作 为 DNA 疫 苗 的 重 组 质 粒 首 先 必 须 被 转 移 到 抗 原 提 呈 细 胞 (Antigenpresentation cell， APC) 内并得到高效表达， 接着表达的抗原表位通过 MHC 分子 的协同作用被提呈到细胞表面， 通过与效应细胞的相互作用， 产生免疫应答。由于质粒 DNA 为生物大分子， 不容易被细胞吸收， 而且很容易被核酸酶类降解， 难以被 APC 摄入、 表达。此 外， 质粒 DNA 本身的免疫原性很低， 其表达产物难以进行抗原提呈， 因而 “裸” DNA 疫苗的免 疫应答较低， 大大限制了其应用范围。
     提高疫苗的免疫活性是 DNA 疫苗研制的关键， 也是目前 DNA 疫苗研究的热点。为 此， 各国的学者尝试采用各种免疫佐剂， 如细胞因子 (Encke J， et al.Geneticvaccination with Flt3-L and GM-CSF as adjuvants ： Enhancement of cellular andhumoral immune responses that results in protective immunity in a murinemodel of hepatitis C virus infection.World J Gastroenterol.2006 ； 12(44) ： 7118-25).、 CpG 基序 (Coban C， et al.Effect of plasmid backbonemodification by different human CpG motifson the immunogenicity of DNAvaccine vectors.J Leukoc Biol.2005 ； 78(3) ： 647-55.) 等， 以提高 DNA 疫苗的免疫活性保护能力， 但增效作用有限。究其原因， 主要是由于这些 佐剂不能防止 DNA 疫苗的降解、 促进 DNA 疫苗在 APC 中的表达， 因而在 DNA 疫苗表达水平 很低的条件下， 即使佐剂能够刺激抗原提呈细胞、 提高抗原提呈的效率， 其作用也是有限 的。近年的研究表明， 树突状细胞 (DC) 在免疫应答中起中心作用。高效、 特异地将 DNA 疫 苗导入到 DC 中并使它得到高效表达是提高 DNA 疫苗免疫活性的根本途径。DNA 运送载 体是将 DNA 疫苗导入 DC 的基本工具。完美的 DNA 运送载体有以下特点 ： DC 靶向性好， 导 入效率高， 负载 DNA 的容量大， 较快建立起持久的保护机制， 可以多疫苗联合使用， 操作简 便。DNA 运送载体分为病毒载体和非病毒载体， 病毒是目前最高效的运送载体， 但容易引起 免疫毒性和遗传毒性， 而且制备方法复杂， 费用较昂贵 (Schweichel D， et al.Evaluation of DNA vaccination with recombinant adenoviruses usingbioluminescence imaging of antigen expression ： impact of application routesand delivery with dendritic cells.J Gene Med.2006 ； 8(10) ： 1243-50)。 以阳离子脂类 (Hattori Y， et al.Enhancement of immune responses by DNA vaccinationthrough targeted gene delivery using mannosylated cationic liposomeformulations following intravenous administration in mice.Biochem BiophysRes Commun.2004 ； 317(4) ： 992-9.)、 聚合物 (Dailey LA， et al.The role ofbranched polyesters and their modifications in the development of modern drugdelivery vehicles.J Control Rel。2005 ； 101(1-3) ： 137-49) 和 纳 米 颗 粒 (BalengaNA.et al.Protective efficiency of dendrosomes as novel nano-sizedadjuvants for DNA vaccination against birch pollen allergy.J Biotechnol.2006 ； 124(3) ： 602-14) 等化合物为代表的非病毒载体生物安全性好， 使用简 单、 费用低， 但基因导入效率较低。以细菌或细胞作为 DNA 载体的研究正受到越来越多的关 注。 红细胞鬼影可高效地将质粒 DNA 导入巨噬细胞， 有可能成为 DNA 疫苗运送载体。 但红细 胞血型匹配问题和血液传播疾病是其推广应用的两个障碍 (Byun H M， et al.Erythrocyte ghost-mediated gene delivery for prolonged and blood-targetedexpression.Gene Therapy 2004， 11 ： 492-496)。减毒细菌作为 DNA 疫苗载体具有导入效率较高、 费用低， 制备方法简便等优点， 是近年 DNA 疫苗研究的热点。减毒鼠伤寒沙门氏菌被用于多种 人畜共患病的 DNA 疫苗载体， 不仅可作为肺炎链球菌、 结核杆菌、 鼠疫耶尔森菌、 牛布氏 杆菌、 炭疽芽孢杆菌等 DNA 疫苗的载体 ( 李文桂， 陈雅棠 . 细菌重组减毒鼠伤寒沙门氏 菌疫苗研究进展 . 动物医学进展， 2004， 25(2) ： 49-53)， 而且可作为猪肺炎支原体 (Chen AY， et al.Evaluation of theimmunogenicity of the P97R1 adhesin of Mycoplasma hyopneumoniae as a mucosalvaccine in mice.J Med Microbiol.2006 ； 55(Pt 7) ： 923-9、 伪狂犬病毒 (Eo SK， et al.Systemic and mucosal immunity induced by oral somatic transgenevaccination against glycoprotein B of pseudorabies virus using liveattenuated Salmonella typhimurium.FEMS Immunol Med Microbiol.2006 ； 47(3) ： 451-61、 猪生殖呼吸综合症病毒 (Jiang P， et al.Humoral immuneresponse induced by oral administration of S.typhimurium containing a DNAvaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome virus.VetImmunol Immunopathol.2004Dec 8； 102(3) ： 321-8.)， 疟疾 (Wang L， et al.Orallydelivered malaria vaccines ： not toohard to swallow.Expert Opin Biol Ther.2004 ； 4(10) ： 1585-94.) 等 DNA 疫 苗 的 载 体。此外， 减毒产单核细胞李氏杆菌和乳酸菌也被用于运送 HPV(Hussain SF， Paterson Y.What is needed for effectiveantitumor immunotherapy ？ Lessons learned using Listeria monocytogenes as alive vector for HPV-associated tumors.Cancer Immunol Immunother.2005 ； 54(6) ： 577-86.)、 HIV(Paterson Y， Johnson RS.Progress towards the use ofListeria monocytogenes as a live bacterial vaccine vector for the deliveryof HIV antigens.Expert Rev Vaccines.2004 ； 3(4 Suppl) ： S119-34) 及口蹄疫病毒的 (Li YG， et al.Immune responses generated by Lactobacillus as a carrierin DNA immunization against foot-and-mouth disease virus.Vaccine.2007 ； 25(5) ： 902-11).DNA 疫苗。减毒的细菌能够以自然感染的方式进入人体， 更主要的是疫苗 能够口服， 能够在较长时间内刺激免疫 DC， 但也存在毒力逆转的安全隐患 (Vassaux G， et al.Bacterial gene therapy strategies.J Pathol.2006 ； 208(2) ： 290-8.)。
     细菌鬼影 (bacterial ghost， BG， 也译为菌蜕 ) 为 DNA 疫苗的递送效率、 促进 外源性 DNA 疫苗在抗原提呈细胞中表达水平提供了全新的技术平台 (Ebensen T， etal. Bacterial Ghosts Are an Efficient Delivery System for DNA Vaccines.TheJournal of Immunology， 2004， 172 ： 6858-6865.and Palffy R， Gardlik R， HodosyJ， et al.Bacteria in gene therapy ： bactofection versus alternative genetherapy.Gene Therapy 2006， 13 ： 101-105.)。 BG 是将细菌裂解细胞壁、 去除菌体内容物之后形成的细菌空腔。 研究表明， φX174 噬菌体能够表达一种裂解革兰氏阴性菌细胞壁的蛋白 -E 蛋白。E 蛋白由 91 个氨基 酸残基组成的， N 末端的 1/3 处有一个疏水序列， 是细胞壁溶解作用发生的关键部位， C 端的 亲水结构对其在细胞内膜下形成高浓度的寡聚体非常重要。将 E 蛋白的基因构建到可诱导 的表达载体中， 转化革兰氏阴性细菌， 在合适的条件下诱导 E 蛋白表达， 可使宿主菌的内膜 和外膜融合， 形成裂解通道， 在离心洗去细胞内容物后即可制备 BG。这时， 细菌的内膜和外 膜连接在一起形成一个具有完整的细胞膜结构的空腔 ( 图 1， A、 B 分别为完整的细菌及其鬼 影的电镜图 ( 引自 Panthel K， Jechlinger W， Matis A， et al.Generation ofHelicobacter pylori ghosts by PhiX protein E-mediated inactivation and theirevaluation as vaccine candidates.Infect Immun.2003 ； 71 ： 109-16.)， C 为自绘的鬼影模式图。可见细 胞的内膜和外膜相连形成一个完整的空腔 ( 周质腔 )。细菌内容物去除之后， 内膜可以展 开、 周质腔形成大囊泡。)， 这一空腔将是运载 DNA 或其它生物分子的载体。
     研究表明， 人畜共患病原体， 如， 幽门螺旋菌 (Panthel K， et al.Generationof Helicobacter pylori ghosts by PhiX protein E-mediated inactivation andtheir evaluation as vaccine candidates. Infect Immun.2003 ； 71 ： 109-16).、 鼠伤寒沙门氏 菌、 伤寒沙门氏菌 (Weiss J.Transfer of eukaryotic expressionplasmids to mammalian host cells by salmonella spp.Int J Med Microbiol.2003， 293 ： 95-106).、 弗氏志贺氏 菌 (Xu F， et al.Immunogenicity of an HIV-gag DNAvaccine carried by attenuated Shigella.Vaccine 2003， 21 ： 644-648). 和 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 (Enterohemorrhagic Escherichia coli， EHEC， Mayr UB， et al.Bacterial Ghosts as an Oral Vaccine ： a Single Dose of Escherichia coli O157:H7Bacterial Ghosts Protects Mice against Lethal Challenge.Infect Immun.2005 ； 73(8) ： 4810-4817) 等均可以被蛋白 E 裂解， 制备BG)。其中 EHEC 可引起严重腹泻， 常常便血并伴有腹部绞痛， 并有可能发展成溶血性尿毒 症综合征， 导致肾脏严重受损或甚至造成死亡。O157:H7 就属于 EHEC。2006 年 9 月， 美国 发生了与菠菜有关的 O157:H7 大肠杆菌暴发， 有 205 人患病， 31 起肾衰竭病例和 3 例死亡 (WHO.Escherichia coli O157:H7 outbreak in spinach” .World HealthOrganization， International Food Safety Authorities Network(INFOSAN).INFOSAN Information Note No.1， 12Feb， 2007.)。 在 2004 年欧洲联盟发病率为每 10 万人口 1.3 例。 在阿根廷发病 率最高， 在 6 至 48 个月儿童中的估计值约为每 10 万儿童 22 例尿毒症。 Mayr 等 (Mayr UB， et al.Bacterial Ghosts as an OralVaccine ： a Single Dose of Escherichia coli O157:H7 Bacterial Ghosts ProtectsMice against Lethal Challenge.Infect Immun.2005 ； 73(8) ： 4810-4817) 将 EHEC 的 BG 注射到受致死剂量 EHEC 感染的小鼠体内， 仅注射一次， 小 鼠在 28 天和 55 天的存活率分别为 93.3％和 86％， 而对照组的成活率仅为 30％和 26.7％， 提示 EHEC 的 BG 具有很强的免疫原性， 对 EHEC 起重要的防治作用。可见， EHEC 鬼影本身也 能够成为一种疫苗， 在对抗人畜共患病的过程中发挥作用。此外， 减毒和灭活弗氏志贺氏 菌在运载 DNA 疫苗的同时还保留免疫原性， 在动物实验中能够对机体产生保护作用 (Xu F， Hong M， Ulmer JB ： Immunogenicity of an HIV-gag DNA vaccinecarried by attenuated Shigella.Vaccine 2003， 21 ： 644-648.)， 因此我们推测各种 BG 均可能作为疫苗对相应的 病原感染产生保护作用。 BG 又是良好的 DNA 运送载体， Ebensen 等 (Ebensen T， et al.Bacterial GhostsAre an Efficient Delivery System for DNA Vaccines.The Journal of Immunology， 2004， 172 ： 6858-6865.) 发现每个 BG 可以装载 2000 拷贝 (5μg/mg 细菌蛋白 )， 具有很大的装载容 量。 由于 BG 保留了完整细菌所有的抗原特性， 宿主免疫识别细胞 ( 主要是 DC) 将 BG 作为是 “危险的入侵者” ， 从而主动识别并将它吞噬， 因而 BG 能够靶向性进入 DC。用装载 pEGFP-N1 质粒的 BG 转染巨噬细胞系 RAW264.7 和原代培养的 DC， 其转染效率分别为 57.6％和 52％， 转染效率远高于脂质体或聚合物载体。 将装载 β- 半乳糖苷酶基因的 BG 经皮下或肌肉注射 到小鼠体内， 免疫应答比裸 DNA 高 1 个数量级， 产生的抗 β- 半乳糖苷酶抗体以 IgG1 亚型为 主 ( 均引自 Ebensen T， et al.Bacterial Ghosts Are an Efficient Delivery System for DNAVaccines.The Journal of Immunology， 2004， 172 ： 6858-6865.)。最近， Jechlinger 等 以 BG 为载体导入 HBV 核心抗原， 取得良好的免疫效果 (Jechlinger W， et al.Comparative immunogenicity of the hepatitis B virus core 149 antigendisplayed on the inner and outer membrane of bacterial ghosts.Vaccine 2005， 23(27) ： 3609-17.)， 说明 BG 还可以作为多肽抗原的载体。BG 不仅可以将 DNA 特异地导向 APC， 而且还是天 然的佐剂， 促进树突状细胞的成熟和激活 (Ebensen T， etal.Bacterial Ghosts Are an Efficient Delivery System for DNA Vaccines.TheJournal of Immunology， 2004， 172 ： 6858-6865.)。与活菌相比， 无生命的 BG 显然是很安全的。虽然， BG 作为 DNA 载体的研究是 近 5 年才开始的， 尚未受到应有的关注， 但这一技术已经显示出很好的潜力， 为提高 DNA 疫 苗的免疫效率提供了一个崭新的技术平台。
     外源性抗原在抗原提呈细胞中表达之后能够能否高效地提呈给效应细胞也是 决定其免疫活性的关键因素。研究表明， 树突状细胞 (dendritic cell， DC) 是抗原提呈 能力最强、 也是唯一能激活初始型 T 细胞的专职抗原提呈细胞 (antigen presentcell，
     APC)， 可将抗原加工成小肽段并与胞质内 MHC-II 类分子形成复合体， 将抗原部位呈递 给 初 始 型 T 细 胞 并 使 之 活 化 (Bancherea J， Briere F， Caux C.et al.Immunobiology of dendritic cells.Annu Rev Immunol， 2000， 18 ： 767.)。MHC-II 的 分 子 伴 侣 恒 定 链 (invariant chain， Ii) 在抗原提呈通路中发挥重要作用。MHC-II 在与多肽结合之前， 抗原结合槽一直被 Ii 链的 CLIP 占据。如果用抗原表位替代 CLIP， 就能够让外源的抗原 表位靶向性地进入 MHC II 的抗原结合槽， 进入抗原提呈通路， 这种方法被称作内源性靶 向 (Nagata T， et al.Immunization with plasmid DNAencoding MHC class II binding peptide/CLIP-replace invariant chain(Ii)induces specific helper T cells in vivo ： the assessment of Ii p31 and p41isoforms as vehicles for immunization. Vaccine， 2002 ； 20 ： 105-114.)。据此， 高明等曾利用 Ii 作为 HCV-NS3 区的 1248-1261 表位 基因疫苗的载体， 构建了基于 Ii 分子的内源性靶向基因疫苗载体 pEGFP-Ii/HCV-NS3-Th1。 在细胞实验中， 该疫苗 mRNA 和蛋白都得以高效表达， 含 NS3 表位的 Ii 突变体在结合 MHC II 分子后能够和野生型 Ii 分子一样到达细胞表面。采用肌肉注射的方法将此疫苗导入 HCV-NS3 荷瘤小鼠， 发现这一内源性靶向基因疫苗在抑制肿瘤生成， 延长成瘤小鼠的生存时 间等方面优于非靶向基因疫苗 (Gao M et al.HCV-NS3 Th1 minigene vaccine based on invariantchain CLIP genetic substitution enhances CD4+Th1 cell responses in vivo.Vaccine， 2006， 24 ： 5491-5497. 及 Gao M et al.Target HCV NS3 CD4+Th1 epitopeto major histocompatibility complex class II pathway.Biotechnol Lett.2006 ； 28(1) ： 3-8.)。在此基础上， 将 pEGFP-Ii/HCV-NS3-Th1 的 mRNA 导入体外培养的小鼠 DC， 发现靶向 d 性疫苗可更有效地刺激 DC 成熟， 增加其表面协同刺激分子 CD80、 CD86、 I-A 的表达， 诱导 DC 分泌 IL-12、 IFN-γ， 有效的刺激 CD4+T 细胞增殖， 并诱导其向 Th1 方向分化 ( 高明等， 基于 Ii 分子的 HCV-NS3 内源性靶向基因疫苗的构建及免疫应答研究。 中华微生物学和免疫学杂 志； 2007， 27(3) ： 242-246)。 以上结果初步证明， 内源性靶向 DNA 疫苗在激活 DC 及诱发免疫 反应过程中的免疫活性明显优于非靶性疫苗， 有可能是对抗 HCV 相关疾病的良好疫苗。
     由于 DNA 疫苗必须在抗原提呈细胞中得到高效表达并将表达的抗原提呈给免疫 效应细胞 ( 如分泌抗体的 B 淋巴细胞， 杀伤病原体的细胞毒性的 T 细胞及 T 辅助细胞等 )， 因此我们认为将 BG 及 MHC-II 的分子伴侣恒定链 Ii 结合起来构建的新型疫苗的免疫反应 水平将优于仅采用单项技术构建的疫苗， 这时因为采用 BG 技术 ( 外源性靶向技术 ) 虽可大 大提高 DNA 疫苗在抗原提呈细胞中的表达水平， 从而增加抗原提呈的机会， 但如果抗原提 呈的整体水平不高， 则其提高免疫应答水平的作用还是有限的 ； 反之， 将 DNA 疫苗构建到 Ii 的 CLIP 区虽可提高抗原提呈水平， 但若 DNA 疫苗无法进入抗原提呈细胞， 则内源性靶向机 制根本上无法发挥作用 ； 可见只有将两种技术结合起来， 就可以利用 BG 的外源性靶向作用 将构建到 Ii 分子 CLIP 区域的 DNA 疫苗高效导入抗原提呈细胞， 同时高效表达的抗原又可 以直接与 MHC-II 分子结合、 将抗原直接提呈到细胞表面， 才 DNA 疫苗发挥更大的功效。
     本发明的核心就是将上述两种技术结合起来， 提出一种新的双重靶向的 DNA 疫苗 制备技术。这一设想是在充分研究 DNA 疫苗的抗原提呈机理及现有的疫苗设计策略的基础 上提出的。 此前， 仅有文献或专利分别进行内源性靶向和外源性靶向研究， 并没有将两种策 略联系起来。究其原因， 可能是相关学者只注重自己的研究领域、 研究策略， 而没有很好地 借鉴不同领域的研究策略。本发明是根据 DNA 疫苗的作用机理的不同环节， 将内源性靶向技术和外源性靶向技术是结合起来， 而非仅将两种策略简单叠加在一起， 因而是一种全新 的疫苗设计思路， 有可能为提高疫苗的免疫活性提供全新的思路和有效地技术手段。 发明内容
     本发明的目的之一是提供了一种免疫应答水平较高的双重靶向 DNA 疫苗。
     为解决上述技术问题， 本发明采取以下技术方案 ： 一种双重靶向 DNA 疫苗， 是以 BG 作为疫苗 DNA 运送载体， 且所述疫苗 DNA 携带有 MHC-II 的分子伴侣恒定链 (invariant chain， Ii) 基因的 DNA 疫苗。
     所述 Ii 基因位于真核表达载体中， 包括所有能够在真核细胞中表达的载体， 如 pDSRed-N1、 pcDNA3.1、 pEGFP-N1、 pSV2 或 pLXSN 等。本发明中仅列举以 pDSRed-N1 为出发 载体构建的携带 Ii 基因的重组表达载体 pDSRed-mIi， 具有序列表中序列 1 的核苷酸序列， 而在实际应用中， 可将 Ii 基因构建在任何可作为 DNA 疫苗载体的真核表达载体中。
     本发明双重靶向 DNA 疫苗的应用范围是广泛的， 可制成口蹄疫、 乙型肝炎、 丙型肝 炎、 艾滋病、 肿瘤及其它任何疾病的双重靶向 DNA 疫苗。
     在 本 发 明 实 施 例 中， 以 针 对 FMDV 的 疫 苗 提 供 了 一 种 具 体 的 双 重 靶 向 口 蹄 疫 DNA 疫 苗， 是 将 质 粒 pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160) 和 / 或 pDSRed-mIi-FMDV(141-160+200-213) 装载于 BG 中得到。 本发明的第二个目的是提供一种本发明双重靶向 DNA 疫苗的制备方法。
     本发明双重靶向 DNA 疫苗的制备方法， 可包括以下步骤 ：
     1) 构建携带优势抗原表位和 Ii 基因的真核表达载体 ： 将 Ii 基因的 CLIP 区基因 片段用优势抗原表位基因替代， 再将该基因片段连接入真核表达载体中 ；
     2) 将步骤 1) 构建的携带优势抗原表位和 Ii 基因的真核表达载体导入 BG 中， 得到 双重靶向 DNA 疫苗。
     以针对口蹄疫病毒的所述双重靶向 DNA 疫苗制备为例， 是将步骤 1) 中的 Ii 基因 的 CLIP 区基因片段的 80-130aa 片段切除， 用 Ii80-89aa-FMDV-VP1-Ii99-130aa 替代。
     所述优势抗原表位 FMDV-VP1 片段优选为 21-40+141-160 片段或 141-160+200-213 片段。
     为使两个抗原之间具有柔性， 利于形成正确的抗原表位， 在构建双表位序列时， 将 21-40 和 141-160 之间及 141-160 和 200-213 之间分别加入了甘氨酸 (Glycine) 作为连接 物。
     其中， 以 pDSRed-mIi 为出发载体， 构建的携带有 21-40+141-160 片段和 Ii 基因的 真核表达载体为 pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)， 携带有 141-160+200-213 片段和 Ii 基 因的真核表达载体为 pDSRed-mIi-FMDV(141-160+200-213)。
     所述步骤 2) 将携带优势抗原表位和 Ii 基因的真核表达载体导入 BG 的具体过程 为： 将 10mg/mL 携带优势抗原表位和 Ii 基因的真核表达载体和 6.2mg/mL BG 混匀在包被缓 冲液中， 28℃水浴 90min ； 再加入膜囊 (2mg/mL) 和 25mM CaCl2 封闭 BG， 37℃孵育过夜。
     本发明以上技术方案提供了一种双重靶向 DNA 疫苗及其构建方法。本发明首次提 出了以细菌鬼影 (BG) 为载体制备双重靶向 DNA 疫苗的技术构思与实施方案。发明人综合 研究总结出 ： 首先， BG 是高效的 DNA 导入载体， 能够将 DNA 疫苗靶向性的抗原提呈细胞、 并
     获得高效表达 ( 外源性靶向作用 )。BG 具有理想的 DNA 载体所要求的其它所有特性 ： 如以 DC 为特异性靶， 能够使 DNA 在 DC 中高效表达并将抗原递送给 MHC-II 分子， 负载 DNA 的容 量大 ； 能够较快建立起保护机制并具有长期有效的保护作用， 能够多疫苗联合使用， 使用简 单、 可操作性强、 价格低廉， 安全性好等。同时 BG 本身也能对本身的病原体产生保护作用。 这是因为 BG 保留了细菌较为完整的细胞壁结构， 因而基本保留了细菌完整的免疫特性， 因 而既能够靶向地将携带的 DNA 疫苗导入 APC 细胞， 而且可以刺激抗原递呈细胞、 刺激机体 的免疫应答水平。与活菌相比， 作为细菌空壳的 BG 是不会出现毒性逆转现象的， 因而其安 全性高于减毒细菌。其次， 将作为疫苗的 DNA 片段构建在 Ii 载体中， 可内源靶向性地递交 给 MHC-II 分子， 进一步发挥其高效的抗原提呈优势 ( 内源性靶向作用 )。通过利用本发明 的技术策略， 既可以防止 DNA 疫苗降解、 增加疫苗 DNA 编码序列在抗原提呈细胞中的表达水 平， 又可以进一步将表达的抗原高效提呈给免疫效应细胞， 从而大大提高 DNA 疫苗的免疫 活性。本发明将在新型疫苗的研制 ( 以提高现有 DNA 疫苗和未来 DNA 疫苗的免疫活性 ) 及 未来疾病的防治中发挥重要作用， 应用前景广阔。 附图说明 图 1 为细菌及其形成的鬼影结构
     图 2E 基因裂解盒的核苷酸序列
     图 3 为 DH5α-pHH43 细菌在不同条件下的 OD600 值
     图 4 为荧光共聚焦显微镜观察细菌鬼影 (1000×)
     图 5 为细菌及其 BG 样品的 DNA 琼脂糖凝胶电泳图
     图 6 为 PCR 扩增的 mIi 编码基因的琼脂糖凝胶电泳图
     图 7 为 pDSRed-N1 真核表达载体的物理图谱
     图 8 为内源性靶向 FMDV-VP1 载体的构建示意图
     图 9 为 PCR 扩增检测内源性靶向 FMDV-VP1 载体的琼脂糖凝胶电泳图
     图 10 为 BG 装载核酸片段装载效率的激光共聚焦显微镜检测结果
     图 11 为 BG 装载核酸片段装载效率的流式细胞术检测结果
     图 12 为 BG 浓度和质粒载体的装载效率关系图
     图 13 为使用 BG 装载的 pDsred-N1 质粒转染 RAW264.7 细胞 24 小时后使用荧光显 微镜观察细胞内的荧光水平
     图 14 为流式细胞仪检测 BG 装载的 pDsred-N1 质粒转染 24 小时后 RAW264.7 细胞 的荧光强度
     图 15 为基因转染 24h 后 RAW264.7 细胞中 FMDV mRNA RT-PCR 扩增产物的电泳图 谱
     图 16 为采用 BG 装载的 FMDV 疫苗免疫小鼠后小鼠血清中的 FMDV 抗体表达水平的 测定结果
     图 17 为 FMDV 抗原刺激后小鼠脾脏淋巴细胞中 IL-2 和 IFN-γ 水平的 ELISA 法检 测结果
     图 18 为小鼠脾脏淋巴细胞中的 T 淋巴细胞增殖实验结果
     图 19 为 BG 或 BG 装载质粒注射小鼠的血清与 BG 反应的水平
     具体实施方式
     下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
     实施例 1、 大肠杆菌细菌鬼影 (BG) 的制备与鉴定
     1、 构建热诱导表达噬菌体 E 蛋白表达质粒
     将 PhiX174 噬 菌 体 的 E 蛋 白 基 因 连 接 入 pHH43(H K， etal.Therecombinant Azotobacter vinelandii mannuronan C-5-epimerase AlgE4epimerizes alginate by a nonrandom attack mechanism.JBiol Chem 1999 ； 274 ： 12316-12322)， 具体方法如下 ：
     将裂解基因盒 (E-box)( 包括温度敏感性转录调控区 (cI857)、 λ 启动子区、 E 基因 区 ) 串联后分别在上游和下游添加 kpn I 和 EcoR V 酶切位点， 然后和表达型载体 pHH43 酶 切后连接， 鉴定和测序正确。E 基因裂解盒序列见图 2。具体方法 ： 以 kpn I 和 EcoRV 分别 对 E-box 片段和原核表达载体 pHH43 进行双酶切， 酶切片段进行 1％琼脂糖胶电泳 (100V， 30min)， 在紫外灯下切下所需的 DNA 片段， 采用 DNA 胶回收试剂盒回收酶切后载体及 E-box 片段。将回收的载体和片段按 1 ∶ 3 的摩尔比混合， 加入 T4DNA 连接酶室温反应 30min。 取 2μl 重组质粒加入到 100μl DH5α 感受态菌液中， 冰浴 30min， 42℃水浴热休克 90s， 冰 浴 2min。加入 100μl 不含抗生素的 LB 培养液， 28℃、 90r/min 培养 1h。4℃， 5000×g 离心 5min， 弃去上清。 菌体重悬于 500μl LB 培养基中， 取 50μl 菌液涂布于含氯霉素 (CatGC+， 50mg/L) 的 LB 平板上， 28℃过夜培养。待长出菌落之后， 挑取平板上分隔良好的单菌落接 + 种于 5mL CatGC LB 培养液中， 28℃、 200r/min 过夜培养。采用质粒小量提取试剂盒提取质 粒， 使用 kpn I 和 EcoRV 进行酶切， 酶切产物进行 1％琼脂糖胶电泳 (100V， 30min)， 获得约 1.4kbp 的片段， 提示 E-box 构建到了 pHH43 载体中， 命名为 pHH43-E， 经测序证实获得了插 入位置及序列均正确的重组质粒。
     2、 诱导 E 蛋白表达， 裂解宿主菌
     将步骤 1 构建的重组表达载体 pHH43-E 导入到大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中， 接 种于氯霉素抗性 (150μg/mL) 的 LB 平板上， 三线法划平板， 28℃恒温培养过夜 ； 挑单克隆 接种于 3mL 氯霉素抗性 (150μg/mL) 的 LB 液体培养基中， 28℃、 200r/min 过夜培养 ； 次日， 转接于 100mL 氯霉素抗性 (150μg/mL) 的 LB 液体中， 28℃、 200r/min 培养至 OD600 值为 0.5 时， 留取 1mL 菌液用于裂解率的计算， 摇床温度升至 42℃， 诱导细菌的裂解 ； 每 30min 测定 OD600 值， 并留取 1mL 菌液， 培养 4 ～ 5h， 直至 OD600 值基本保持平稳。同时设置非诱导组作为 对照。 研究结果如图 3 所示 ( 将重组菌命名为 DH5α-pHH43-E)， 随着菌体的裂解， 培养基变 得较为澄清， OD600 值显著下降， 在 2h 左右降到最低值 0.4 左右， 并在培养 4.5h 之后维持在 1.1 以下， 而对照组则随着培养时间的延长， 菌体密度不断上升， 菌体密度不断上升， OD600 值 超过 3.8。研究结果显示， 在 42℃诱导后大肠杆菌开始裂解。
     3、 细菌鬼影 (BG) 的制备与鉴定
     将 DH5α-pHH43-E 菌种接种于 LB 培养基中并于 28℃扩大培养 ； 待 OD600 值为 0.5 将菌液转至无菌离心管中， 离心收集菌体 (4℃， 时， 42℃诱导细菌裂解 ； OD600 值降至 0.3 时， 6000×g， 10min)， 用 PBS 反复洗涤 3 次， 清洗 BG 的内容物， 得到 DH5α 大肠杆菌 BG( 可冻干 保存 )。采用线粒体染料 Mito Tracker 对 BG 的外壁进行染色 ( 绿色 )， 37℃， 染色 15min，使用荧光共聚焦显微镜观察 BG 的形态。结果如图 4 所示， 菌体形成空壳 ( 即 BG)
     取制备好的 BG 20μl 进行琼脂糖电泳， 同样取 1mL 对照菌液裂解去除蛋白后的 上清液 20μl 作为对照， 进行 1 ％琼脂糖胶电泳 (100V， 30min)， BIO-RAD GelDoc2000 凝 胶成像系统观察电泳结果。检测结果如图 5 所示 (1 为裂解后的大肠杆菌 ； 2 为 Marker DL2000plus ； 3 为 BG)， 发现对照组有明显的、 大小不一的 DNA 条带， 提示这是细菌本身基因 组 DNA， 相反， BG 组则检测不到 DNA 信号， 提示 BG 内 DNA 已随着细胞质内容物被洗去。
     4、 裂解率的计算
     将上述经 42℃诱导 4.5h 的菌液及稀释了 105 倍的非诱导对照组菌液分别涂布在 LB 平板中， 37℃培养过夜， 观察细菌的集落形成数目， 计算集落形成单位 (CFU)。以下列公 式计算诱导组的裂解率＝ (1- 裂解后 CFU/ 裂解前 CFU)×100％。 经三次试验， 取平均值， 得 出细菌裂解率为 97.8％。
     通过上述实验， 将 PhiX174 噬菌体的裂解基因 (E 蛋白基因 ) 构建到温控诱导载体 并转化大肠杆菌 DH5α， 在 42℃成功地诱导菌体裂解， 裂解率可达 97.8％。 采用离心法收集 BG， 激光共聚焦显微镜证实其确为中空大肠杆菌 ghost 的形态， 通过 DNA 电泳实验证实菌体 内不含 DNA， 提示我们成功制备了大肠杆菌的 BG， 为下一步实验奠定基础。 BG 比灭活的细菌或减毒活菌更为安全。例如， 采用甲醛化学物质制备的灭活菌 作为载体， 其制备过程非常简单， 但是残留的甲醛等化学物质可能对人体造成潜在的危害。 因此， BG 的制备方法与减毒或灭活细菌一样简单， DNA 装载能力和装载效率及免疫活性也 非常相似， 但 BG 的安全性却明显高于减毒或灭活细菌。当然， 有人会质疑说， 在制备 BG 的 过程中， 菌体的裂解并未达到 100％， 因而残存的活菌会对疫苗施用对象造成危害。在现 实中， 有几种方法可以克服这一问题 ： 1. 采用减毒菌制备 BG， 这样即使有少数活菌也不会 对施用对象造成危害。2. 将核酸酶基因与 E 基因共同转化细菌 (Ebensen T， Paukner S， et al.Bacterial Ghosts Are an EfficientDelivery System for DNA Vacc ines.The Journal of Immunology， 2004， 172 ： 6858-6865.)， 这样的细菌裂解的同时， 菌体内的 DNA 也 被降解， 确保未裂解的细菌因其 DNA 被降解而成为灭活细菌。3. 未裂解的细菌可以通过加 入抗生素等方式使细菌得到完全的灭活。
     实施例 2、 构建小鼠恒定链 (mIi) 的真核表达载体
     以 质 粒 pQE31-mIi(Bischof F ， et al.Melms A.Specific treatment ofautoimmunity with recombinant invariant chains in which CLIP is replaced byself-epitopes.Proc Natl Acad Sci U S A.2001 ； 98(21) ： 12168-73) 为模板， 采用 PCR 方法获得 mIi 编码基因 ( 设计 PCR 引物序列时分别在上游和下游引物的 5’ 端引入 Xho I 和 EcoR I 酶切位点， 具体序列为
     P1 ： 5’ -GCGCTCGAGATGACGGATCCGCATGCGAGCT-3’ 和
     P2 ： 5’ -CGCGAATTCGCAGGGTGACTTGACCCAG-3’ )。
     方法为 ： 在 50μl 的 反 应 体 系 中， 将 引 物 ( 正 向、 及 反 向 引 物 各 1μl)、 模板 (1μl)、 高保真 DNA 聚合酶 (0.25μl)， dNTP(2.5mM， 4μl)， 10× 扩增缓冲液 (5μl) 和去 离子水 (36.75μl) 振荡混匀， 离心处理后， 94℃预变性 5min， 94℃变性 30s， 60℃退火 30s， 72 ℃延伸 100s， 35 个循环， 反应完毕后取 5μl 反应物， 1.0 ％琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 效 果。扩增结束后， 对 PCR 扩增产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳检测， 检测结果如图 6 所示 ( 泳
     道 1 为 DNA Marker， 泳道 2 为 PCR 扩增产物 )， 表明获得 417bp 的目的片段， 与预期结果相 符。
     将 mIi 基因插入 pDSRed-N1 真核表达载体中 ( 物理图谱见图 7) 多克隆位点的 Xho I 和 EcoR I 酶切位点之间。具体方法为 ： 以 Xho I 和 EcoR I 分别对 mIi 片段和编码红色荧 光蛋白的 pDSRed-N1 进行双酶切， 酶切片段进行 1％琼脂糖胶电泳 (100V， 30min)， 在紫外灯 下切下所需的 DNA 片段， 采用 DNA 胶回收试剂盒回收酶切后载体及 mIi 片段。 将回收的载体 和片段按 1 ∶ 3 的摩尔比混合， 加入 T4DNA 连接酶室温反应 30min。取 2μl 重组质粒加入 到 100μl DH5α 感受态菌液中， 冰浴 30min， 42℃水浴热休克 90s， 冰浴 2min。加入 100μl 不含抗生素的 LB 培养液， 37℃、 90r/min 培养 1h。4℃、 5000×g 离心 5min， 弃去上清。菌体 + 重悬于 500μl LB 培养基中， 取 50μl 菌液涂布于含卡那霉素 (Kan ， 50mg/L) 的 LB 平板上， 37℃过夜培养。待长出菌落之后， 挑取平板上分隔良好的单菌落接种于 5mL Kan+LB 培养液 中， 37℃、 200r/min 过夜培养。 采用质粒小量提取试剂盒提取质粒， 使用 Xho I 和 EcoR I 进 行酶切， 酶切产物进行 1％琼脂糖胶电泳 (100V， 30min)， 获得约 500bp 的片段， 提示 mIi 构 建到了含 RED 标签的真核表达载体上， 命名为 pDSRed-mIi， 经测序证实获得了插入位置及 序列均正确的重组质粒， 如序列表中序列 1 的核苷酸序列。 实施例 3、 构建内源性靶向的 FMDV-VP1 载体
     1、 选择、 合成口蹄疫病毒 (FMDV) 的优势抗原表位
     FMDV 是一种单股正链 RNA 病毒， 其结构蛋白 VP1 上有多个 B 细胞和 T 细胞抗原表 位， 能够诱导强烈的免疫反应 ； 其中以 VP1 蛋白 21-40、 141-160、 200-213 的抗原表位的抗原 性最强， 而且各种血清性的 FMDV 均具有此表位， 因而是非常重要的 DNA 疫苗候选序列。拟 采用 21-40+141-160 和 141-160+200-213 序列为靶标， 构建相应的表达载体。
     2、 构建载体
     如 图 8 所 示， 以 pDSRed-mIi 为 真 核 表 达 载 体 ( 实 施 例 2 构 建 的 )， 使用 21-40+141-160、 141-160+200-213 序列去替换 mIi 的 CLIP 区， 构建表达 VP1 的真核表达 载体。理论上 VP1 基因片段在 DC 细胞中表达之后应靶向性地与 MHC 分子结合， 提高提呈 效率。在构建双表位序列 21-40+141-160 和 141-160+200-213 时 ； 两片段之间加入甘氨 酸 (Glycine) 为连接物， 使两个抗原之间具有柔性， 利于形成正确的抗原表位。在构建载 体时， 将 mIi 的 CLIP 区的 80-130aa 片段切除， 用 mIi80-89aa-FMDV-VP1-mIi99-130aa 替 代。在两个质粒 ( 分别命名为 pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)( 序列表中序列 2) 和 pDSRed-mIi-FMDV(141-160+200-213)( 序 列 表 中 序 列 3)) 构 建 完 成 后， 转 化 大 肠 杆 菌， 挑 取 阳 性 克 隆， 进 行 PCR 扩 增 ( 扩 增 pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160) 的 引 物 序 列 为 P1 ： 5’ -gcgctcgagatggaaacacagatccagagg-3’ 和 P2 ： 5’ -cgcgaattcaggcagcgtccgtgcca c-3’ ， 扩 增 pDSRed-mIi-FMDV(141-160+200-213) 的 引 物 序 列 为 P1 ： 5’ -gcgctcgagatggt gcccaacttgagaggt-3’和 P2 ： 5’ -cgcgaattccaaagtctgtttcaccgg-3’ )， 结果如图 9 所示 ( 泳道 1 为 DNA Marker， 泳道 2-12 为挑起的单克隆菌落后进行的 PCR 鉴定 )， 分别获得 240bp(FMDV(21-40+141-160) 片段 ) 和 220bp(FMDV(141-160+200-213) 片段 )2 个片段， 与 预期结果相符， 提示上述抗原表位已经构建到带红色荧光标记的内源性靶向载体上。
     实验 1 ： 以核酸片段和质粒 DNA 检测 BG 的装载效率
     为检测 BG 装载效率， 将核酸片段 ( 该核酸片段为带有 CY5 荧光标记的核酸片段，
     由随机合成的 36 个碱基组成， TaKaRa 公司合成 ) 和质粒 DNA pDSRed-N1( 购自 BDClontech 公司 ) 分别用 CY5 及 PI( 均为红色荧光 ) 标记， 而 BG 则采用绿色荧光染料 MitoTracker 标 记。将终浓度为 66 ～ 264μg/mL 的核酸片段与终浓度为 2mg/mL 的 BG， 28 ℃水浴 90min ； 用 DH5α 膜囊 (2mg/mL)) 和 CaCl2(25mM) 封闭 BG， 37℃孵育过夜。由于质粒浓度较高， 保持 质粒的浓度不变， 将 BG 设置为不同浓度 0 ～ 100mg/mL， 28℃水浴 90min ； 同样加入膜囊和 CaCl2 封闭 BG， 37℃孵育过夜 ； 次日， MitoTracker 染料 37℃染色 15min， 室温， 20000×g， 离 心 20min 收集 BG。首先用激光共聚焦显微镜检测 BG 装载核酸片段的效率， 结果如图 10 所 示 ( 左图， CY5 标记的核酸片段在激发光下显示红色荧光 ； 中图， MitoTracker 染色的 BG 在 激发光下的形态 ； 右图， 拟合后可见包被了核酸片段的 BG 呈现黄色。)， 发现在很多绿色荧 光标记的 BG 中均可检测到红色荧光信号， 表明该 BG 中已经装载了 CY5 红色荧光标记的核 酸片断。
     采用流式细胞仪同时检测 BG 内的红色荧光和绿色荧光信号， 结果如图 11 所示 ( 横、 纵坐标分别代表红色和绿色荧光的强度 )， 发现大多 BG 同时可以检测到红色和绿色荧 光信号， 表明这些 BG 已成功装载了核酸片段。研究结果显示， 核酸片段的装载效率与其浓 度密切相关， 当核酸片段的浓度为 66μg/mL 时， 红色荧光和绿色荧光双阳性的 BG 的比例为 70％， 提示这时 70％的 BG 内装有核酸片段， 而当核酸片段浓度增加到 264μg/mL 时， 双阳 BG 的比例逐渐增加至 94.89％。可见， 在保持 BG 浓度不变 (2mg/mL) 的情况下， 装载的效率 和核酸片段的浓度成正比， 继续增加核酸片段的浓度， 装载的效率逐步增加， 直到 95％的水 平。
     DNA 疫苗一般是以质粒 DNA 的形式存在的， 因此研究 BG 装载质粒 DNA 的方法更为 重要。由于质粒 DNA 的分子量比核酸片段要大很多， 因而装载的难度更大。在试验中发现， 要达到和装载核酸片段同样的效率， 质粒 DNA 的浓度要远远高于核酸片段的浓度， 因此在 实验中， 将质粒 pDSred-N1 设置较高的浓度 (10mg/mL 以上 ) 并保持该浓度不变， 将 BG 的 浓度设成不同的梯度， 在保持质粒 pDSred-N1 浓度不变的情况下， 装载效率和 BG 浓度的关 系图如图 12 所示， 发现在质粒浓度一定的情况下， 装载的效率与 BG 的浓度成反比， 装载效 率最高达到 91.98％， 并且不再随着 BG 浓度的降低而增加， 推测已经到达极限 ； 说明不同 的质粒应该会有不同的最佳装载效率以及不同的装载浓度比例， 这应该和质粒的分子量有 关， 分子量越大应该越难用于装载， 寡核苷酸片段的装载效率高于质粒 DNA 也许就是这个 原因。
     实施例 4、 双重靶向 DNA 疫苗的制备
     以口蹄疫疫苗为例， 用本发明的方法制备双重靶向 DNA 疫苗， 具体方法为 ：
     1) 取实例 3 中构建的内源性靶向的 FMDV 疫苗质粒
     pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160) ；
     对照质粒的制备 ： 设计引物 P1 ： 5’ -gcgctcgagatggaaacacagatccagagg-3’ 和 P2 ： 5’ -cgcgaattcaggcagcgtccgtgccac-3’ 进行 PCR 扩增 FMDV 片段， 经酶切后连接到真核表达 载体 pDSred-N1 中， 构建非内源性靶向的 FMDV 疫苗质粒 pDSRed-FMDV(21-40+141-160)( 对 照 )。
     2) 取实例 1 中制备得到的 BG， 按照实例 3 中摸索的最佳装载方法 ： 将 10mg/mL 携 带优势抗原表位和 Ii 基因的真核表达载体和 6.2mg/mL BG 混匀在包被缓冲液 (HBS 缓冲液： 氯化钠 100mmol/L， 乙酸钠 10mmol/L， HEPES 10mmol/L， pH7.0) 中， 28℃水浴 90min ； 再 加入膜囊 ( 将与 BG 同种的大肠杆菌超声裂解后， 经超高速离心收集的细菌菌膜结构 )(2mg/ mL) 和 25mM CaCl2 封闭 BG， 37℃孵育过夜， 分别将质粒 pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160) 和 pDSRed-FMDV(21-40+141-160) 装载入 BG， 得到 FMDV 疫苗 BG+Ii-FMDV 和对照 FMDV 疫苗 BG+FMDV。
     实验 2、 BG 装载质粒的转染及转染效率检测
     靶向性的 DNA 疫苗载体能够将疫苗靶向性的导入抗原递呈细胞， 是提高核酸疫苗 免疫原性的有效方法。RAW264.7 细胞是巨噬细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合而成的， 具有与普 通巨噬细胞相似的特性， 也具有抗原递呈的功能， 因此将 BG 装载的质粒 pDSred-N1( 实施例 2) 转染到 RAW264.7 细胞， 初步验证 BG 是否具备将 DNA 靶向性地导入抗原提呈细胞的能力。
     BG 装载 ： 将 pDSred-N1 质粒装载于 BG 中， 将质粒溶解于包被缓冲液中 ( 质粒终浓 度 10mg/mL)， 和 BG(6.2mg/mL)， 28℃孵育 1.5 小时。加入终浓度为 2mg/mL 的膜囊， 终浓度 为 25mM 的氯化钙， 37℃孵育过夜。20000g 离心 20 分钟， 用 PBS 重悬装载质粒 DNA 的 BG。
     转染 ： 在转染前一天， 收集 RAW264.7 细胞， 将细胞浓度调整为 1.0×106 细胞 /mL， 将 0.5mL 的细胞种植于 24 孔板中， 于 CO2 培养箱 37℃孵育过夜。在转染时， 将细胞培养基 换成无血清和抗生素的培养基， 然后加入 BG 装载的质粒 DNA(BG 终浓度为 0.5mg/mL) 于细 胞中， 充分混匀， 2h 后吸去培养基， 加入含 10％血清的培养基， 于 CO2 培养箱 37℃培养过夜。
     定性检测： 转 染 24h 后， 用 荧 光 显 微 镜 观 察 RAW264.7 细 胞 中 绿 色 荧 光 (MitoTracker 标记的 BG) 及红色荧光蛋白 (Dsred 表达产物 )， 结果如图 13 所示 (A. 绿色 荧光视野， B. 红色荧光视野， C. 图片 A 和图片 B 重叠 )， 发现在大部分细胞中同时可观察到 绿色荧光和红色荧光两种信号， 提示 Mito Tracker 标记的 BG 成功地将装载的 pDSRed-N1 质粒导入到 RAW264.7 细胞中， 并成功的表达了外源的红色荧光蛋白。
     定量检测 ： 为检测 BG 介导的 pDSRed-N1 质粒在 RAW264.7 细胞中表达水平， 在转 6 染 24h 后， 收集细胞并调整细胞数为 1.0×10 细胞 /mL， 流式细胞仪检测绿色荧光和红色荧 光。结果如图 14 所示 ( 上面两图 (control) 分别为未转染细胞的红色荧光和绿色荧光水 平， 下面两图分别为 BG 装载的 pDSRed-N1 质粒转染细胞的红色荧光和绿色荧光水平 )， 发 现未转染细胞中绿色荧光和红色荧光蛋信号很弱， 均为低于 1％， 而转染细胞的绿色荧光和 红色荧光的检出率分别为 54.70％和 67.94％， 提示大约 MitoTracker 标记的 BG 进入大约 67.94％的 RAW264.7 细胞中， 而表达外源红色荧光蛋白基因的细胞大约为 54.70％。 检测的 基因表达水平高于体外转染试剂。
     实验 3、 转染细胞中 FMDV 片段的表达水平检测
     将 RAW264.7 细胞浓度调整为 1.0×106 细胞 /mL， 吸取 0.5mL 的细胞种植于 24 孔板中， 于 CO2 培养箱中 37 ℃培养过夜。在转染前， 将实验分为 ： BG 组， Ii 质粒组， FMDV 质 粒 组， Ii-FMDV 组， BG+FMDV 组 和 BG+Ii-FMDV 组 ( 实 例 4 制 备 得 到 ) 六 组。 其 中 BG 组 在 装 载 过 程 中 不 加 DNA ； Ii 质 粒 组、 FMDV 质 粒 组 和 Ii-FMDV 组 分 别 加 入 pDSRed-mIi 质 粒， pDSRed-FMDV(21-40+141-160)( 实 例 4 制 备 得 到 ) 和 pDSRed-Ii/FMDV 质 粒 (pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160)) 但不加入 BG， 而 BG+FMDV 组和 BG+Ii-FMDV 组， 则使 用 BG 装载 pDSRed-FMDV 和 DSRed-Ii/FMDV 质粒， 质粒 DNA 和 / 或 BG 的浓度同前。在装载 后， 取 10μl 装载产物加入到 24 孔板中， CO2 培养箱中 37℃培养过夜。24h 后， 收集细胞， 用Trizol 试剂盒提取总 RNA， 逆转录合成 cDNA， 并使用 FMDV 引物 ( 引物序列为 P1 ： 5’ -gcgctc gagatggaaacacagatccagagg-3’ 和 P2 ： 5’ -cgcgaattcaggcagcgtccgtgccac-3’ ) 及 β-actin 引物 ( 引物序列为 ctc catcct ggc ctc gct gt 和 gct gtc acc ttc acc gtt cc) 进行 PCR 扩增。扩增结束后， 对 PCR 产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳检测并利用紫外凝胶成像系统 照相。结果如图 15 所示 (1.Ii ； 2.BG ； 3.FMDV ； 4.Ii-FMDV ； 5.BG+FMDV ； 6.BG+Ii-FMDV)， 未 装载质粒的 BG 对照组及未使用 BG 装载的 Ii， FMDV 和 Ii-FMDV 组均未扩增出 FMDV 基因片 段， 说明裸质粒很难进入 RAW264.7 细胞， 因而不可能在其中表达， 从而无法扩增相应的基 因片段。而 BG+FMDV 和 BG+Ii-FMDV 组均扩增出 FMDV 条带， 提示 BG 成功地将 DSRed-FMDV 和 DSRed-Ii/FMDV 质粒导入 RAW264.7 细胞中， 使外源的 FMDV 抗原的 mRNA 得以表达。实验 提示 BG 是良好 DNA 疫苗载体， 能够使外源 FMDV 基因片段在巨噬细胞系 RAW264.7 细胞 ( 抗 原提呈细胞 ) 中高效表达。同时， DSRed-FMDV 和 DSRed-Ii/FMDV 两种质粒导入后， FMDV 的 表达水平没有显著的差异， 提示内源性靶向载体本身并不能增加外源基因在抗原提呈细胞 中的表达水平。
     实验 4、 动物实验
     一、 采用 BG 装载的 FMDV 疫苗免疫小鼠后小鼠血清中的 FMDV 抗体表达水平的测定 取 70 只 5-6 周龄、 雌性 Balb/c 小鼠， 分为 7 组， 各组中每只小鼠分别注射以下液 体： 1. 阴性组， 100μl 生理盐水 ； 2.BG 组， 含 35μg BG 的 PBS 100μl ； 3 ～ 5 组分别为 Ii 组， FMDV 和 Ii-FMDV 组， 分别将 50μg 的 pDSRed-mIi 质粒， pDSRed-FMDV(21-40+141-160) 质 粒 和 pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160) 质 粒 溶 解 于 100μl 的 PBS 中。6 和 7 组 为 BG+FMDV 组 和 BG+Ii-FMDV 组 ( 实 施 例 4 制 备 得 到 )， 分 别 使 用 35μg BG 装 载 50μg 的 pDSRed-FMDV(21-40+141-160) 质粒和 pDSRed-mIi-FMDV(21-40+141-160) 质粒， 最后溶于 100μl PBS 中。采用肌肉注射法免疫， 每两周免疫一次， 共免疫 6 次。从第二次免疫开始尾 静脉采血， 离心后取上清， 以化学合成的 FMDV141-160 为抗原， 采用间接 ELISA 的方法检测 小鼠血清中的抗体水平。
     结果如图 16 所示， 在 6 次免疫之后， 阴性组， BG 组及不含 FMDV 基因的 Ii 组这 3 个对照组中血清中 FMDV 抗体滴度均很低， 而 FMDV、 Ii-FMDV、 BG+FMDV 和 BG+Ii-FMDV 四组 均检出高滴度的抗 FMDV 抗体， 其中， BG+Ii-FMDV 组的 FDMV 抗体滴度超过 10240。采用吸 引析因设计方差分析对各组数据进行分析， 发现四个实验组与 3 个对照组有显著差异 (p ＜ 0.01)， 而四个实验组之间也有差异 (p ＜ 0.05)， 抗体效价由低到高排列顺序为 ： FMDV 组 ＜ Ii-FMDV 组＜ BG+FMDV 组＜ BG+Ii-FMDV 组， 提示 BG 装载确实能够增加 FMDV DNA 疫苗的 免疫原性， 表现为 BG+Ii-FMDV 组的抗体滴度高于 Ii-FMDV 组， BG+FMDV 组的抗体滴度高于 FMDV 组 ； 同时 Ii 分子能够显著增强抗原提呈能力， 进一步增强 DNA 疫苗的免疫原， 表现为 Ii-FMDV 组的抗体滴度高于 FMDV 组， BG+Ii-FMDV 的抗体滴度高于 BG+FMDV 组。实验结果提 示， 双重靶向的 DNA 疫苗的免疫原性优于单靶向疫苗， 而单靶向疫苗的效果优于非靶向疫 苗。由于内源性靶向载体本身并不能增加外源基因在抗原提呈细胞中的表达水平， 因此可 以推测内源性表达载体主要是通过提高抗原提呈效率来提高 DNA 疫苗的免疫反应水平。
     二、 淋巴细胞增殖及细胞因子检测
     处死小鼠， 摘取小鼠脾脏， 研磨后洗涤， 取上清， 用淋巴细胞分离液分离脾脏细胞 6 中的淋巴细胞， 以 4-6×10 /mL 的浓度种于 96 孔板中， 在 5％ CO2 中， 37℃培养 24 小时， 加
     入 ConA(5μg/mL， 阳性对照 )， FMDV 合成抗原 (3μg/mL) 以及单纯的 1640 培养基 ( 阴性对 照 )。刺激 48 小时候后， 取细胞上清 100μl， 使用 IL-2， IFN-γ 检测试剂盒检测上清的细 胞因子水平。细胞采用 PROMEGA 公司单溶液细胞增殖检测试剂盒检测 T 细胞的增殖能力。 在加入检测试剂并于 37℃孵育 4h 后， 检测 450nm 的吸光度。
     在细胞因子检测实验中， IL-2、 IFN-γ 均采用 ELISA 法检测。结果如图 17 所示， FMDV 刺激后， 可见各组中均有 IL-2， IFN-γ 分泌， 除 Ii 组外， 其它各组相对于阴性对照的 差异具统计学意义 (P ＜ 0.05)。而在四个实验组中， BG 装载组分离的脾脏淋巴中的细胞因 子水平高于其对应的非装载组， 而在同等条件下内源靶向组的细胞因子水平明显高于非内 源性靶向组， 而双重靶向组优于单靶向组。值得指出的是， BG 组的细胞因子水平也很高， 这 可能是由于 BG 本身也能够刺激非特异性的免疫反应， 导致细胞因子整体水平升高。
     T 细胞增殖的检测结果如图 18 所示 (ConA 为非特异刺激的阳性对照组， 1640 为 阴性对照组， FMDV 为特异性刺激实验组。)， 四个实验组均可见到 FMDV 特异性刺激引起 的 T 细胞增殖， 相对于阴性对照及阳性对照组 (Con A) 均有显著性差异 (P ＜ 0.05)。其 中， BG+Ii-FMDV 组的 T 细胞增殖能力高于 Ii-FMDV 组， BG+FMDV 组的 T 细胞增殖能力高于 FMDV 组， 提示 BG 装载确实能够提高 FMDV 疫苗的免疫原性， 刺激特异性的 T 细胞增殖反应 ； 同时 Ii 分子能够显著增强 FMDV 疫苗的抗原提呈能力， 进一步增强疫苗的免疫原， 表现为 Ii-FMDV 组的 T 细胞增殖活力高于 FMDV 组， BG+Ii-FMDV 组的 T 细胞增殖活力高于 BG+FMDV 组。上述实验结果说明本发明的双重靶向疫苗的免疫原性明显高于单靶向， 单靶向组又高 于非靶向组。
     三、 针对 BG 的的抗体滴度的检测
     取各组小鼠血清， 用大肠杆菌 BG 检测血清中抗 BG 抗体的滴度， 以观察以 BG 为载 体的疫苗是否会产生针对 BG 的抗体。具体方法为 ： 将血清样品分别稀释 1、 10、 20、 40、 80 倍 后取 5μl 与适量等体积 BG 混匀， 37℃孵育 1h。6000×g 离心， PBS 洗涤 2 次。加入 HRP 标 记的羊抗鼠抗体 3μl， 37℃孵育 30min。PBS 洗涤 2 次， 定溶至 500μl， 流式细胞仪检测。
     检测结果显示 ( 图 19， 与血清反应的 BG 阳性率越高， 说明血清中抗体滴度越高 )， 阴性对照， 裸质粒注射组的血清均可在一定程度上与 BG 发生反应， 但只能抗体与 17.3％以 下的 BG 发生反应， 而且当血清稀释 80 倍以上时， 仅 1.5％在 BG 表面检测到抗体的信号， 提 示小鼠体内存在抗大肠杆菌的抗体， 但是抗体的滴度很低。相反， 在 BG 组或装载质粒的 BG 组中， 血清抗体与 BG 反应的程度很高， 当血清稀释 80 倍时， 仍可以使 80％左右的 BG 显示阳 性信号， 说明在以 BG 或 BG+ 质粒免疫动物之后， 可在体内产生高滴度的抗 BG 抗体， 这些动 物有可能对大肠杆菌产生较强的抗性。实验提示， BG 在作为载体的同时， 其本身还有可能 作为疫苗， 对相应的疾病产生免疫保护作用。
     以上实施例以获得双重靶向 FMDV 疫苗为例， 说明了以 BG 作为疫苗 DNA 运送载体， 并携带有 MHC-II 的分子伴侣恒定链 Ii 基因制备得到的双重靶向 DNA 疫苗。可以确知的 是， 病毒不限于 FMDV， 可用本发明方法制备针对任何疾病的疫苗， 包括但不限于口蹄疫、 乙 型肝炎、 丙型肝炎、 艾滋病、 肿瘤等疾病的疫苗 ； 另一方面， 实施例 2 中所用出发载体也不限 于 pDSRed-N1， 还可以同类的 pcDNA3.1、 pEGFP-N1、 pSV2、 pLXSN 以及其它任何可在真核细胞 内表达载体作为出发载体， 这些变化对于本领域技术人员而言均是常规技术， 因此， 这些常 规变换所得到的双重靶向 DNA 疫苗也理应归属本发明。