葡萄籽萃取物的制备方法及含该萃取物的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物.pdf

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1、10申请公布号CN102006880A43申请公布日20110406CN102006880ACN102006880A21申请号200880105536222申请日20080904102007008927320070904KRA61K36/87200601A61P29/0020060171申请人天主教大学校产学协力团地址韩国首尔申请人HL基因学72发明人闵俊基曹美罗朴美京许维政朴真实金浩渊柳宗铉金玄圭李槿赫74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人谢顺星54发明名称葡萄籽萃取物的制备方法及含该萃取物的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物57摘要本发明提供改进的制备葡萄籽VI。

2、TISVINIFERAPIP萃取物的方法。本发明还提供含所述葡萄籽萃取物作为活性成分的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010030486PCT申请的申请数据PCT/KR2008/0052032008090487PCT申请的公布数据WO2009/031826EN2009031251INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书14页附图13页CN102006893A1/3页21一种葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物的制备方法，该方法包括A在室温下用体积比为112的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过。

3、滤所得溶液；B蒸馏步骤A中制备的滤液以除去丙酮，用氯化钠饱和，然后过滤所得溶液；C用乙酸乙酯萃取步骤B中制备的滤液，然后浓缩所得溶液；以及D向步骤C中制备的浓缩液中加入氯仿，然后通过过滤来沉淀所得溶液。2根据权利要求1所述的方法，其中步骤A所述的混合溶液中丙酮和水的体积比为115。3根据权利要求1所述的方法，其中步骤A和C中所述的萃取重复23次。4根据权利要求1所述的方法，其中步骤B中所述的蒸馏是在50或稍低的温度下减压进行。5根据权利要求1所述的方法，其中步骤B中所述的过滤是将氯化钠的饱和溶液静置23小时后进行。6根据权利要求1所述的方法，其中步骤C中所述的浓缩是将所述萃取液的总体积浓缩至0。

4、407倍。7一种葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物的制备方法，该方法包括A制备第一萃取物I用体积比为351的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；II浓缩步骤I中制备的滤液以除去丙酮，然后过滤所得溶液；III用乙酸乙酯萃取步骤II中制备的滤液；及IV干燥步骤III中制备的萃取液，得到第一萃取物；B制备第二萃取物P用水萃取葡萄籽粉，过滤所得溶液；Q用乙醇萃取步骤P中制备的滤液，然后过滤所得溶液；及R干燥步骤Q中制备的滤液，得到第二萃取物；以及C将所述第一萃取物和所述第二萃取物混合。8根据权利要求7所述的方法，其中步骤I所述的混合溶液中丙酮和水的体积比为41。9根据权利要求7。

5、所述的方法，其中步骤III或Q中所述的萃取重复23次。10根据权利要求7所述的方法，其中步骤III中进一步包括对所得萃取液进行脱水处理。11根据权利要求7所述的方法，其中步骤IV中所述的干燥是通过浓缩步骤III中制备的萃取液除去乙酸乙酯、将浓缩液溶于水中，然后喷雾干燥所得溶液来进行的。12根据权利要求7所述的方法，其中步骤R中所述的干燥通过喷雾干燥步骤Q中制备的滤液来实施。13根据权利要求7所述的方法，其中步骤R中所述的干燥通过浓缩步骤Q中制备的滤液、然后喷雾干燥浓缩液来实施。14根据权利要求7所述的方法，其中所述第一萃取物和所述第二萃取物的混合比例按重量计为10515。15根据权利要求114。

6、任一所述的方法，其中所得到的葡萄籽萃取物具有的原花青素值PCV为80130；儿茶素和表儿茶素为30或更低；以及原花青素为权利要求书CN102006880ACN102006893A2/3页395105。16一种含有葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物作为活性成分的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物及其药用载体。17根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述葡萄籽萃取物通过如下方法获得，该方法包括A在室温下用体积比为112的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；B蒸馏步骤A中制备的滤液以除去丙酮，用氯化钠饱和，然后过滤所得溶液；C用乙酸乙酯萃取步骤B中制备的滤液，然后浓缩。

7、所得溶液；以及D向步骤C中制备的浓缩液中加入氯仿，然后通过过滤来沉淀所得溶液。18根据权利要求17所述的药物组合物，其中步骤A所述的混合溶液中丙酮和水的体积比为115。19根据权利要求17所述的药物组合物，其中步骤A和C中所述的萃取重复23次。20根据权利要求17所述的药物组合物，其中步骤B中所述的蒸馏是在50或稍低的温度下减压进行。21根据权利要求17所述的药物组合物，其中步骤B中所述的过滤是将氯化钠的饱和溶液静置23小时后进行。22根据权利要求17所述的药物组合物，其中步骤C中所述的浓缩为浓缩至萃取液总体积的0407倍。23根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述葡萄籽萃取物通过如下方法。

8、获得，该方法包括1制备第一萃取物I用体积比为351的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；II浓缩步骤I中制备的滤液以除去丙酮，然后过滤所得溶液；III用乙酸乙酯萃取步骤II中制备的滤液；及IV干燥步骤III中制备的萃取液，得到第一萃取物；2制备第二萃取物P用水萃取葡萄籽粉，过滤所得溶液；Q用乙醇萃取步骤P中制备的滤液，然后过滤所得溶液；及R干燥步骤Q中制备的滤液，得到第二萃取物；以及3将所述第一萃取物和所述第二萃取物混合。24根据权利要求23所述的药物组合物，其中步骤I所述的混合溶液中丙酮和水的体积比为41。25根据权利要求23所述的药物组合物，其中步骤III或Q中所述的萃取重复。

9、23次。26根据权利要求23所述的药物组合物，其中步骤III中进一步包括对所得萃取液进行脱水处理。27根据权利要求23所述的方法，其中步骤IV中所述的干燥通过浓缩步骤III中制备的萃取液以除去乙酸乙酯，将浓缩液溶于水中，然后喷雾干燥所得溶液。28根据权利要求23所述的药物组合物，其中步骤R中所述的干燥通过喷雾干燥步权利要求书CN102006880ACN102006893A3/3页4骤Q中制备的滤液来实施。29根据权利要求23所述的药物组合物，其中步骤R中所述的干燥通过浓缩步骤Q中制备的滤液、然后喷雾干燥该浓缩液来实施。30根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述第一萃取物和所述第二萃取物的混。

10、合比例按重量计为10515。31根据权利要求1630任一所述的方法，其中所述葡萄籽萃取物具有的原花青素值PCV为80130；儿茶素和表儿茶素为30或更低；以及原花青素为95105。权利要求书CN102006880ACN102006893A1/14页5葡萄籽萃取物的制备方法及含该萃取物的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物技术领域0001本发明涉及葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物的制备方法，及含有所述葡萄籽萃取物作为活性成分的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物。背景技术0002葡萄属GENUSVITIS为攀缘植物，属于鼠李目ORDERRHAMNALES葡萄科FAMILYVI。

11、TACEAE，在全球范围内为自然生长或栽培，赤道地区和纬度50或更高纬度地区除外。葡萄科有11个属700个种。欧洲葡萄VITISVINIFERA、美国葡萄VITISLABRUSCA、河岸葡萄VITISRIPARIA、沙地葡萄VITISRUPESTRIS、冬葡萄VITISBERLADIERI、紫葛葡萄VITISCOIGNETIAE、山葡萄VITISAMURENSIS等都是栽培的水果。0003由葡萄籽SEEDSOFVITISVINIFERA得到的萃取物包括表儿茶素、原花青素PROANTHOCYANIDINB1和B2、儿茶素及它们聚合衍生物的混合物，已知这些是原矢车菊酚PROCYANIDOL或黄烷醇。

12、FLAVANOL低聚物GBA1541469和FRA2092743。上述萃取物已用于治疗循环系统疾病。0004美国专利公开号NO2003/0165589公开了葡萄VITISVINIFERA、尤其是葡萄叶LEAVESOFVITISVINIFERA的提取物，能抑制一氧化氮合酶NO合酶，因此可以用于抑制各种与NO合酶相关的疾病，诸如细胞分化和/或增殖、表皮生长和/或过度增生疾病、细胞降解和凋亡，以及免疫学和/或感染过程。0005同时，美国专利公开号NO2006/0280811公开了用于治疗关节炎的制剂，包括水杨醇或柳杨梅SALIXRUBRA提取物；乳香酸或乳香BOSWELLIASERRATA提取物；来。

13、自葡萄VITISVINIFERA或茶树CAMELLIASINENSIS的原花青素，优选与磷脂、大黄酸或其亲脂性衍生物结合；N乙酰葡萄糖胺；以及葡萄糖醛酸和葡醛内酯。根据美国专利公开号NO2006/0280811，原花青素与环氧合酶COX2协同作用能抑制柳杨梅SALIX和乳香BOSWELLIA提取物中存在的成分。然而，该专利申请没有公开哪个成分明确地作为活性成分用于治疗关节炎。采用GBA1541469和FRA2092743或美国专利NO5,484,594EP348,781中公开的萃取方法能够得到原花青素。0006美国专利NO4,963,527公开了含有葡萄VITISVINIFERA萃取物的磷脂复。

14、合物的化妆品成分，其在FRA2092743即GBA1541469中也有描述。0007根据GBA1541469以及FRA2092743，将含有34体积丙酮和1体积水的丙酮水混合溶液作为第一萃取溶剂，用于萃取低聚物，并通过沉淀除去杂质即部分沉淀物。也就是，用含有34体积丙酮和1体积水的丙酮水混合溶液处理葡萄VITISVINIFERA例如种子，并通过蒸馏除去丙酮。然后，过滤沉淀的杂质，用不溶于水的有机溶剂诸如乙酸乙酯处理水层滤液。然后，除去有机溶剂，并除去残渣。通过加入氯化钠进行沉淀以除去剩余的杂质，用乙酸乙酯和氯仿处理水层滤液。根据GBA1541469，由于当使用说明书CN102006880ACN。

15、102006893A2/14页6过量的水时，不会发生部分沉淀，因此使用过量的水不能有效应用于大量生产。0008GBA1541469中公开的萃取应采用含有过量丙酮的混合溶液作为第一萃取溶剂，在丙酮的沸腾温度约57下进行，过量的丙酮应通过蒸馏除去。因此，该萃取可能由于加热条件和较长的蒸发时间而导致成本增加，且还可能由于使用过量的丙酮而导致环境污染。另外，丙酮可能残留在最终获得的萃取物中。而且，由于采用不溶于水的有机溶剂诸如乙酸乙酯处理，以及在加入氯化钠前必须除去乙酸乙酯，因此可能延长萃取过程。0009美国专利NO5,484,594欧洲专利NO348,781公开了一种可选的萃取方法，采用截留分子量3。

16、000至600的超滤膜；以及采用醚类、或酯类、或者乙酸乙酯和芳香烃的混合物。然而，与GBA1541469中公开的方法相比，由于需要采取更多的萃取步骤，以及需要使用其他的设备诸如超滤设备，因此导致了高的萃取成本。0010同时，韩国专利NO100509119公开了采用包括柱色谱的多步萃取方法，从榆白皮ULMICORTEX中得到的原花青素低聚物儿茶素4间苯三酚，其能抑制基质金属蛋白酶MMP的活性，因此可有效用于预防和治疗疾病，诸如肿瘤迁移、牙周疾病、类风湿性关节炎、炎症、甲状旁腺机能亢进、糖尿病、角膜溃疡、骨质疏松症、胃溃疡、创伤、皱纹、痤疮、艾滋病、烧伤、动脉硬化、骨折。然而，该专利没有公开获得葡。

17、萄VITISVINIFERA萃取物的方法。韩国专利NO100509119仅公开了原花青素低聚物富含于榆白皮ULMICORTEX、葡萄籽、大黄、PLEUROPTERUSMULTIFLORUS、樟脑树CAMPHORTREES、肉桂、侧柏THUJAORIENTALIS、山茶、小米、荞麦、橡树等中，但没有公开葡萄籽萃取物、特别是葡萄VITISVINIFERA萃取物可能与类风湿性关节炎有关。发明内容0011技术问题0012本发明人研究的目的是通过简单的步骤开发改进的制备葡萄VITISVINIFERA萃取物的方法。结果，本发明人发现，采用含有相对少量丙酮的水丙酮混合溶液作为第一萃取溶剂，萃取葡萄籽VITI。

18、SVINIFERASEEDS，蒸馏除去丙酮，然后直接用氯化钠处理所得的水层，该萃取步骤可以在室温约25进行，还可以简化蒸馏操作。另外，还发现由于无需采用不溶于水的有机溶剂进行萃取的步骤，因此可以简化所述萃取过程。0013本发明人还发现改进的制备所述萃取物的方法。该方法包括分别制备第一萃取物和第二萃取物，然后将它们混合。也就是，通过采用丙酮水混合溶液进行萃取，然后采用乙酸乙酯进行萃取来制备第一萃取物；通过仅用水作为萃取溶剂进行萃取，然后用乙醇进行萃取来制备第二萃取物；以及将所述第一萃取物和第二萃取物混合的方法制备所述萃取物。根据该方法，可以减少丙酮的用量，由于不需要氯化钠饱和及氯仿萃取从而简化萃。

19、取步骤，以及将因使用有机溶剂所致的环境污染最小化。特别是，所述萃取物的产量可以增加约10倍。0014本发明人对葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物的各种药理作用进行了研究，发现葡萄籽萃取物具有很强的预防和治疗类风湿性关节炎的作用。令人惊讶的是葡萄萃取物可能与类风湿性关节炎存在关联尚未见报道。0015因此，本发明提供改进的制备葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物的方法。0016本发明还提供含有葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物作为活性成分的用于预说明书CN102006880ACN102006893A3/14页7防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物。0017技术方案0018。

20、本发明的一个方面是提供葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物的制备方法，该方法包括A在室温下用体积比为112的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；B蒸馏步骤A中制备的滤液以除去丙酮，用氯化钠饱和，然后过滤所得溶液；C用乙酸乙酯萃取步骤B中制备的滤液，然后浓缩所得溶液；以及D向步骤C中制备的浓缩液中加入氯仿，然后通过过滤来沉淀所得溶液。0019步骤A的混合溶液中丙酮和水的体积比可以是115。步骤A和C中的萃取可以重复23次。步骤B中的蒸馏可以在50或稍低的温度下减压进行，步骤B中的过滤是将氯化钠的饱和溶液静置23小时后进行。步骤C中的浓缩为浓缩至萃取液总体积的0407倍。00。

21、20本发明的另一方面是提供葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物的制备方法，该方法包括A制备第一萃取物I用体积比为351的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；II浓缩步骤I中制备的滤液以除去丙酮，然后过滤所得溶液；III用乙酸乙酯萃取步骤II中制备的滤液；及IV干燥步骤III中制备的萃取液，得到第一萃取物；B制备第二萃取物P用水萃取葡萄籽粉，过滤所得溶液；Q用乙醇萃取步骤P中制备的滤液，然后过滤所得溶液；及R干燥步骤Q中制备的滤液，得到第二萃取物；以及C将第一萃取物和第二萃取物混合。0021步骤I的混合溶液中丙酮和水的体积比可以是41。步骤III或Q中的萃取可以重复23次。。

22、步骤III中可以进一步包括对所得萃取液进行脱水处理。步骤IV中的干燥可以通过浓缩步骤III中制备的萃取液以除去乙酸乙酯，将浓缩液溶于水中，然后喷雾干燥所得溶液。步骤R中的干燥可以通过喷雾干燥步骤Q中制备的滤液或者通过浓缩步骤Q中制备的滤液，然后喷雾干燥浓缩液来实施。第一萃取物和第二萃取物的混合比例按重量计可以是10515。0022优选地，通过上述方法得到的葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物，具有的原花青素值PROCYANIDOLICVALUE，PCV为80130；儿茶素和表儿茶素为30或更低；以及原花青素为95105。0023本发明的另一方面提供含有葡萄籽VITISVINIFERAP。

23、IP萃取物作为活性成分的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物及其药用载体。优选地，根据上述方法制备所述葡萄籽萃取物。更优选地，所述葡萄籽萃取物具有的原花青素值PCV为80130；儿茶素和表儿茶素为30或更低；以及原花青素为95105。0024有益效果0025本发明的方法采用丙酮含量相对较小的水丙酮混合溶液作为第一萃取液来进行萃取。因此，丙酮可以通过简单地蒸馏除去，使残余溶液最少。而且，由于萃取可以在室温约25进行，所以不需要加热的步骤，且在加入氯化钠前不需要采用不溶于水的有机溶剂萃取。因此，本发明葡萄籽萃取物的制备方法简单，节约成本，适于工业化大量生产。0026另外，通过分别制备第一萃取物。

24、和第二萃取物、并将其混合来制备葡萄籽萃取物的方法，可以减少丙酮的用量，由于不需要氯化钠饱和及氯仿萃取，可以简化萃取步骤，将因使用有机溶剂所致的环境污染最小化。特别是，所述萃取物的产量可增加约10倍。说明书CN102006880ACN102006893A4/14页80027此外，根据本发明方法制备的葡萄籽萃取物，作为一种天然的萃取物，具有非常好的安全性，并显示出很强的预防和治疗类风湿性关节炎的效果，例如对胶原蛋白诱发关节炎CIA的动物模型具有很好的效果。附图说明0028图1示出胶原蛋白诱发关节炎CIA动物的关节炎得分，对CIA动物连续5次腹膜内注射100MG/KG葡萄籽VITISVINIFERA。

25、PIP萃取物GSPE，对CIA动物连续5次腹膜内注射生理盐水，观察10周。0029图2示出CIA动物和正常动物处死前的关节区照片，其中对CIA动物注射葡萄籽萃取物。0030图3示出通过组织染色的CIA动物和正常动物处死后的关节和软骨组织的破坏度，其中对CIA动物各注射50MG/KG和10MG/KG葡萄籽萃取物。0031图4示出注射100MG/KG葡萄籽萃取物的CIA动物、注射生理盐水的CIA动物和正常动物的血清中II型胶原蛋白特异性抗体抗CIIIGG1和抗CIIIGG2A的量。0032图5示出采用酶联免疫法ELISA测量的培养物上清液中IL17和TNF的量，该培养物上清液通过以101的比例对胸。

26、腺CD4T细胞和脾CD11C树突状细胞共培养3天制备得到，其中胸腺CD4T细胞和脾CD11C树突状细胞从注射100MG/KG葡萄籽萃取物的CIA动物或注射生理盐水的CIA动物中获得。0033图6示出采用ELISA法测量的培养物上清液中IL17和IL4的量，该培养物上清液通过与图5中所述相同的方式获得的细胞，在未增补或增补用抗CD3激发的含10G/ML和20G/ML葡萄籽萃取物的培养基中，共培养3天制备得到。0034图7示出采用实时转录酶聚合酶式链反应PCR，来自引流区淋巴结DLN的IL17MRNA的表达度，该DLN从分别注射50MG/KG和10MG/KG葡萄籽萃取物或者生理盐水的CIA动物中获。

27、得，并在未增补或增补用抗CD3、CII和脂多糖LPS激发的含10G/ML葡萄籽萃取物培养基中培养3天。0035图8和9分别示出采用荧光激活细胞分类器FACS测量的胸腺CD4T细胞和脾CD11C树突状细胞共培养的结果，上述细胞从CIA动物模型和自身免疫关节炎动物模型IL1RA/中得到，以101的比例在未增补或增补用抗CD3、CPG或CII激发的含10G/ML葡萄籽萃取物的培养基中培养6天。0036图10示出通过腹膜内注射生理盐水、塞来昔布或10DMSO或者灌胃给予葡萄籽萃取物的CIA动物的关节炎得分。0037图11示出用苏木精和曙红染色的CIA动物的关节切片，其中对CIA动物通过腹膜内注射生理盐。

28、水、塞来昔布或10DMSO或者灌胃给予葡萄籽萃取物。0038图1213分别示出通过腹膜内注射生理盐水或灌胃给予葡萄籽萃取物的CIA动物的总IGG抗体的亚型。0039图1416分别示出通过腹膜内注射生理盐水、塞来昔布或10DMSO，或者灌胃给予葡萄籽萃取物的CIA动物的IL17、TNF和IL1的量。说明书CN102006880ACN102006893A5/14页9具体实施方式0040本发明包括葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物的制备方法，该方法包括A在室温下用体积比为112的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液；B蒸馏步骤A中制备的滤液以除去丙酮，用氯化钠饱和，然后过滤所得。

29、溶液；C用乙酸乙酯萃取步骤B中制备的滤液，然后浓缩所得溶液；以及D向步骤C中制备的浓缩液中加入氯仿，然后通过过滤使所得溶液沉淀。0041葡萄籽粉可以通过如下方法制备通过压制葡萄获得茎皮、种子和分枝，用水清洗，在烘箱中干燥，分离种子，然后采用常规方法将种子磨粉。0042在本发明的方法中，采用丙酮和水的混合溶液作为第一萃取溶剂，与常规萃取例如GBA1541469中公开的萃取中的用量相比，丙酮的量较低，本发明的第一个萃取方法在室温约25进行，无需加热。本发明所用的丙酮和水的混合溶液中，丙酮与水的体积比在112的范围内，优选约115。第一次萃取可以进行一次或重复多次，优选23次。步骤A中可以采用常规的。

30、方法过滤，收集滤液用于下一步操作。0043本发明的方法包括蒸馏步骤A中的滤液以除去丙酮，用氯化钠饱和，然后过滤所得溶液步骤B。在蒸馏过程中，除去沸点相对较低的丙酮，从而沉淀出溶于丙酮的杂质。蒸馏可以采用常规的方法进行，例如，减压蒸馏。蒸馏可以在50或稍低的温度下减压进行。通过蒸馏得到的萃取液不能用有机溶剂萃取，但可用氯化钠饱和后过滤。如果萃取液即丙酮蒸发的萃取液用氯化钠饱和，那么杂质诸如单宁酸就会沉淀出来并通过过滤除去。在用氯化钠饱和并过滤的杂质沉淀步骤中，所述过滤是将氯化钠的饱和溶液静置23小时后进行。可以采用常规的方法过滤，收集滤液用于下一步操作。0044本发明的方法包括用乙酸乙酯萃取步骤。

31、B中制备的滤液，然后浓缩所得溶液步骤C。采用乙酸乙酯萃取第二次萃取可以进行一次或重复多次，优选23次。可以将所得萃取液的总体积浓缩至0407倍。0045本发明的方法包括向步骤C中制备的浓缩液中加入氯仿，然后通过过滤使所得溶液沉淀步骤D。当将氯仿加入到浓缩液中时，包括低聚物在内的不溶于氯仿的活性成分被沉淀出来。通过过滤沉淀可以简单地分离葡萄籽萃取物。采用常规的方法干燥由过滤得到的沉淀，获得干燥粉末。可以采用减压干燥，例如在50或稍低的温度下减压。0046本发明还包括葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物的制备方法，该方法包括A制备第一萃取物I用体积比为351的丙酮和水的混合溶液萃取葡萄籽粉。

32、，然后过滤所得溶液；II浓缩步骤I中制备的滤液以除去丙酮，然后过滤所得溶液；III用乙酸乙酯萃取步骤II中制备的滤液；及IV干燥步骤III中制备的萃取液，得到第一萃取物；B制备第二萃取物P用水萃取葡萄籽粉，过滤所得溶液；Q用乙醇萃取步骤P中制备的滤液，然后过滤所得溶液；及R干燥步骤Q中制备的滤液，得到第二萃取物；以及C将第一萃取物和第二萃取物混合。0047葡萄籽粉可采用前述的方法制备。可以用通过分别制备第一萃取物和第二萃取物并将它们混合来制备本发明的萃取物。因此，本发明的方法可以减少丙酮的用量。而且，由于氯化钠饱和及氯仿萃取不是必须的，可以简化方法，并将因使用有机溶剂所导致的环境污染最小化。另。

33、外，萃取物的产量可以增加约10倍。0048在第一萃取物的制备中，步骤I用体积比为351、优选41的丙酮和水的混说明书CN102006880ACN102006893A6/14页10合溶液萃取葡萄籽粉，然后过滤所得溶液。该萃取可以进行一次或重复多次，优选23次。步骤I的过滤可以采用常规的方法进行，收集滤液用于下一步操作。0049在第一萃取物的制备中，步骤II为浓缩步骤I中制备的滤液以除去丙酮，然后过滤所得溶液。在浓缩过程中，除去沸点相对较低的丙酮，从而沉淀溶于丙酮的杂质。可以采用常规的方法在减压下浓缩或减压蒸馏，例如在减压的条件下蒸馏。通过过滤除去沉淀，收集滤液。0050在第一萃取物的制备中，步骤。

34、III为用乙酸乙酯萃取步骤II中制备的滤液。采用乙酸乙酯萃取第二次萃取可以进行一次或重复多次，优选23次。另外，步骤III可以进一步包括脱水步骤，例如在乙酸乙酯萃取后，采用无水硫酸钠脱水。0051在第一萃取物的制备中，步骤IV为干燥步骤III中制备的萃取液。可以采用常规的方法进行干燥，例如在50或稍低的温度下减压。更优选地，可以采用下述方式进行干燥通过浓缩步骤III中制备的萃取物以除去乙酸乙酯，将浓缩液溶于水中，然后喷雾干燥所得溶液。0052在第二萃取物的制备中，步骤P为用水萃取葡萄籽粉，过滤所得溶液；步骤Q为用乙醇萃取步骤P中制备的滤液，然后过滤所得溶液。步骤Q中的提取可以进行一次或重复多次。

35、，优选23次。0053在第二萃取物的制备中，步骤R为干燥步骤Q中制备的滤液。步骤R中的干燥可以采用喷雾干燥步骤Q中制备的滤液；或浓缩步骤Q中的滤液，然后喷雾干燥浓缩液。可以将步骤Q中制备的滤液体积浓缩至04至07倍，但不限于此。0054第一萃取物和第二萃取物的混合可以将所述萃取物进行简单地混合。所述第一萃取物和第二萃取物的混合比例按重量计可以是10515。0055步骤III或Q中的萃取可以重复23次。步骤III中可以进一步包括对所得萃取液进行脱水处理。步骤IV中的干燥可以通过浓缩步骤III中制备的萃取液以除去乙酸乙酯来实施，将浓缩液溶于水中，然后旋转蒸干所得溶液。步骤R中的干燥可以通过旋转蒸干。

36、步骤Q中制备的滤液或者浓缩步骤Q中制备的滤液、然后旋转蒸干浓缩液来实施。第一萃取物和第二萃取物的混合比例按重量计可以是10515。0056采用上述方法得到的葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物，其原花青素值PCV为80130；儿茶素和表儿茶素为30或更低；以及原花青素为95105。0057本发明中的“原花青素值PCV”按如下方法计算。0058对照品溶液的制备0059精密称取葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物标准品100MG，与异丙醇混合形成50ML溶液。取10ML该溶液与10ML3M盐酸混合，然后将所得溶液与异丙醇混合制成50ML对照品溶液。0060供试品溶液的制备0061取。

37、供试品各100MG，按照与标准品溶液相同的制备方法处理，制备供试品溶液。0062测量0063取供试品溶液和对照品溶液各10ML，分别加入5个试验管中，给试验管盖上管帽。然后，将试验管置于100的水浴中加热45分钟。加热后，将试验管在冷水中冷却，从每个试验管中取2ML溶液，分别与20ML异丙醇混合。在550NM处测量供试品溶液和对照品溶液的吸光度，以异丙醇作为空白对照溶液，计算5个吸光度的平均值。说明书CN102006880ACN102006893A7/14页110064计算0065PCV105ATMT100ET/ASM100E0066AT供试品溶液吸光度的平均值0067AS对照品溶液吸光度的平。

38、均值0068MT标准品的质量，MG0069M供试品的质量，MG0070ET标准品中水的含量0071E供试品中水的含量0072本发明中的儿茶素和表儿茶素按如下方法定量。0073对照品溶液的制备0074取儿茶素和表儿茶素标准品各50MG，溶于乙腈和稀磷酸595的混合溶液中，制成100ML对照品溶液。0075供试品溶液的制备0076取供试品各50MG，溶于乙腈和稀磷酸595的混合溶液中，制成10ML供试品溶液。0077分析条件0078色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶填充柱04625CM，5M0079流动相0080表10081时间分钟流动相A流动相B0955508515602080709550082流动相A。

39、稀磷酸溶液0083流动相B乙腈0084流速07ML/MIN0085检测器UV检测器波长278NM0086进样量10L0087计算0088儿茶素的含量，用表儿茶素表达0089A1ME100100/AEM1100E100090表儿茶素的含量0091A2ME100100/AEM1100E100092A1供试品溶液中儿茶素的峰面积说明书CN102006880ACN102006893A8/14页120093A2供试品溶液中表儿茶素的峰面积0094AE对照品溶液中表儿茶素的峰面积0095ME对照品溶液中表儿茶素的质量，MG0096M1供试品溶液中萃取物的质量，MG0097E萃取物中水的含量0098另外，“。

40、原花青素的量”采用下述的方法计算。0099内标溶液的制备0100取30MG2，6二叔丁基4甲基苯酚BHT，加入到100ML烧瓶中，加入流动相至刻度，制备内标溶液。0101供试品溶液1的制备0102将10MG样品加入到10ML烧瓶中，用5ML内标溶液溶解，然后加入内标溶液至刻度，制备供试品溶液1。0103供试品溶液2的制备0104将10MG样品加入到10ML烧瓶中，用5ML内标溶液溶解，然后加入内标溶液至刻度，制备供试品溶液2。0105对照品溶液校准曲线的绘制0106对照品溶液1将8MG原花青素标准品加入到10ML烧瓶中，用5ML内标溶液溶解，然后加入内标溶液至刻度，制备对照品溶液1。0107对。

41、照品溶液2将10MG原花青素标准品加入到10ML烧瓶中，用5ML内标溶液溶解，然后加入内标溶液至刻度，制备对照品溶液2。0108对照品溶液3将12MG原花青素标准品加入到10ML烧瓶中，用5ML内标溶液溶解，然后加入内标溶液至刻度，制备对照品溶液3。0109分析条件0110色谱柱PL凝胶柱76300MM，5M或相似柱0111检测器UV检测器波长280NM0112流动相四氢呋喃和溴化锂溶液955的混合溶液0113溴化锂溶液将104G溴化锂加入到1000ML烧瓶中，加水至刻度。0114流速10ML/MIN0115进样量10L0116运行时间15分钟0117方法0118采用下述液相色谱法，将对照品溶。

42、液1、2、3和供试品溶液1、2各分析两次。通过对照品溶液的浓度和主峰与IS峰的比例A原花青素/ABHT建立对照品溶液的校准曲线，计算方法如下。0119计算0120TIA原花青素/ABHT供试A/B1/C供试1000121A原花青素供试品溶液中原花青素的峰面积0122ABHT供试品溶液中BHT的峰面积0123A对照品溶液校准曲线的截距说明书CN102006880ACN102006893A9/14页130124B对照品溶液校准曲线的斜率0125C供试供试品溶液的浓度MG/ML0126原花青素的含量TI100KFSTD/100KF供试0127KFSTD对照品中水分的含量0128KF供试供试品中水分的。

43、含量0129本发明包括含有葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物作为活性成分的用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物及其药用载体。0130根据上述方法制备所述葡萄籽萃取物。更优选地，所述葡萄籽萃取物含原花青素值PCV为80130；儿茶素和表儿茶素为30或更低；以及原花青素为95105。0131如下述的实验例，根据本发明的方法制备的葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物显示出很强的预防和治疗类风湿性关节炎的效果，例如对胶原蛋白诱发关节炎CIA的动物模型具有很好的效果。0132也就是，当对CIA动物腹膜内注射100MG/KG葡萄籽萃取物时，关节炎得分显著降低图1和图2。而且，在具有慢。

44、性炎性关节炎的类风湿性关节炎动物模型ILRA/中，观察到关节炎的症状减轻。组织学检验结果表明，当注射100MG/KG葡萄籽萃取物时，动物的关节破坏度与正常小鼠相似，对软骨的破坏也有所改善图3。另外，血清学试验结果表明，当注射100MG/KG葡萄籽萃取物时，TH2型抗CIIIGG1的水平没有变化，但产生的CII特异性TH1型IGG2A降低了图4。由此可见，因为产生的CII特异性TH1型IGG2A降低了，所以通过施用葡萄籽萃取物可以有效治疗类风湿性关节炎。0133另外，当注射葡萄籽萃取物时，类风湿性关节炎的炎性因子IL17和TNF的量显著降低图5，采用葡萄籽萃取物体外治疗时，炎性因子IL17与抗炎。

45、性因子IL4呈反比例关系图6。也观察到了同样模式的转录水平的IL17曲线。在体外用CII或LPS激发，然后用葡萄籽萃取物治疗时，由CII或LPS所致增加的IL17MRNA的表达量降低图7。0134由于类风湿性关节炎与免疫细胞尤其是慢性炎性T细胞的过度活性有关，因此CD4T细胞的调节可以作为治疗的靶标。当采用葡萄籽萃取物对CIA动物和IL1RA/动物治疗时，FOXP3调节性CD4T细胞的诱导增加。与仅用CII处理的组相比，当采用CII和葡萄籽萃取物对CIA动物中的CD4T细胞处理时，FOXP3调节性CD4T细胞的诱导增加图8和图9。我们期望通过由葡萄籽萃取物产生的CII特异性调节性CD4T细胞的。

46、传代可以有效抑制慢性炎性T细胞的增殖。0135由此可见，通过抑制炎性因子的传代和诱导抗炎性因子及调节性T细胞，葡萄籽萃取物具有很强的预防和治疗类风湿性关节炎的作用。0136本发明的药物组合物包括药用载体，且能按照常规方法制成各种制剂，例如口服制剂，诸如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂或气雾剂；外用制剂；栓剂；或无菌注射溶液。优选地，本发明的药物组合物可以制成片剂。所述药用载体可以是乳糖、葡聚糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻朊酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯。

47、、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油。所述药物组合物可进一步包括稀释剂说明书CN102006880ACN102006893A10/14页14或赋形剂，诸如填充剂、膨胀剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂或表面活性剂。固体口服制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂。这种固体制剂可以包括至少一种选自例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶的赋形剂。另外，这种固体制剂可以进一步包括润滑剂，诸如硬脂酸镁或滑石粉。液体口服制剂可以是混悬剂、溶液剂、乳剂或糖浆剂。另外，所述液体制剂可以包括稀释剂，诸如水、液体石蜡；湿润剂；甜味剂；矫味剂；或防腐剂。肠外制剂可以是无菌水溶液、无水溶液、混悬剂、乳剂、冻干制剂或栓剂。无水溶剂或混悬。

48、试剂可以是丙二醇，聚乙二醇，天然油脂，诸如橄榄油，或注射用酯类诸如油酸乙酯。栓剂的载体可以是半合成脂肪酸酯WITEPSOL、聚乙二醇MACROGOL、吐温61、可可黄油、月桂精LAURIN或甘油明胶GLYCEROGELATINE。0137在本发明的药物组合物中，葡萄籽萃取物的萃取物的剂量可以根据患者的状态或体重、疾病的严重程度、剂型、给药途径和给药时期而有所不同，可以由本领域的普通技术人员适当地确定。例如，葡萄籽萃取物的施用剂量可以是每天1100MG/KG，优选550MG/KG，更优选510MG/KG。可以每天完全给药一次或者分次给药。本发明的药物组合物可以与其他治疗类风湿性关节炎的药物联合给。

49、药。当联合给药时，所述治疗药物可以顺序给药或者同时给药。当联合给药时，可以使用能达到最佳治疗效果的尽可能少的各剂量，这可以由本领域的普通技术人员来确定。0138本发明的药物组合物可以通过例如口服、直肠、静脉内、肌肉内、皮下等各种途径施用于哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、家畜或人类，其中优选口服给药。0139以下将通过下面的工作实施例来更具体地说明本发明。但是，下面提供的工作实施例仅用于解释本发明，因此不用于限定本发明的范围。0140实施例1葡萄籽VITISVINIFERAPIP萃取物的制备0141通过压制葡萄VITISVINIFERA获得茎皮、种子和分枝，用水清洗，在烘箱中干燥，分离葡萄的种子。将1KG种子磨成粉，在室温下加入纯水300ML与丙酮200ML的混合溶液500ML进行萃取。重复三次萃取，合并萃取液，过滤。将滤液在50或稍低的温度减压蒸馏以除去丙酮，用氯化钠饱和所得溶液。将所得溶液在室温放置3小时然后过滤。滤液用250ML乙酸乙酯萃取三次，用无水硫酸钠脱水。将萃取液的体积浓缩至125ML。向浓缩液中加入约600ML氯仿以进行沉淀，过滤所得溶液。将沉淀在50。