α- 葡聚糖酶以及含有其的口腔护理组合物 优先权
本申请要求 2008 年 4 月 11 日提交的美国临时专利申请序列号 No.61/044,316 的 优先权， 其以其整体引入作为参考。
背景技术
齿斑的形成导致龋齿、 牙龈炎症、 牙周病以及最终导致牙齿损失。齿斑是细菌、 上 皮细胞、 白细胞、 巨噬细胞及其他口腔分泌液的混合物。细菌产生高度分枝的多糖 (highly branched polysaccharides)， 其与来自口腔的微生物一起形成齿斑继续增殖的粘性基质。
随着齿斑继续积累， 出现石头一样硬的白色或浅黄色沉积物。这些沉积物称为钙 斑、 牙石或牙垢， 其在唾液中由菌斑 (plaque) 和矿物例如钙形成。
对预防和 / 或减少齿斑以及相关牙齿损坏的新方法有着持续的需要。 发明内容 一方面， 提供了分离的 α- 葡聚糖酶， 包含下述氨基酸序列， 即 (a) 与天然 Hypocea tawa 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 1 的 38-635 位氨基酸残基 ) 有至少 99％同一性 ； 或者 (b) 与 Trichoderma konilangbra 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸残基 ) 有至少 85％同一性。
另一个方面中， 提供了编码本发明 α- 葡聚糖酶的分离多核苷酸以及含有该分离 多核苷酸的重组核酸。还提供了含有该重组核酸的载体和宿主细胞。
在另一个方面中， 提供了细胞培养物。 在一些实施方式中， 该细胞培养物含有生长 培养基和上述宿主细胞的群体。细胞培养物可用于提供在适于分离的 α- 葡聚糖酶产生的 条件下维持细胞培养物以产生本发明的 α- 葡聚糖酶。如果 α- 葡聚糖酶是分泌的， 这可 从生长培养基中收获。
在另一个方面中， 提供了产生蛋白质的方法， 其包括在适于分离的 α- 葡聚糖酶 产生的条件下维持如上细胞的培养物。在一些实施方式中， 该方法还包括从生长培养基中 收获 α- 葡聚糖酶。
另一个方面中， 提供了方法， 其包括接受选自以下的分离的 α- 葡聚糖酶 ： (a) 具有与成熟 Hypocea tawa 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 1 的 38-635 位氨基酸残基 ) 有 至少 99 ％同一性的氨基酸序列的 α- 葡聚糖酶 ； (b) 具有与成熟里氏木霉 (Trichoderma reesei) 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸残基 ) 有至少 85％同一性的氨 基酸序列的 α- 葡聚糖酶 ； 或者 (c) 具有与成熟 Trichoderma konilangbra 的 α- 葡聚糖 酶 (SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸残基 ) 有至少 85％同一性的氨基酸序列的 α- 葡聚 糖酶 ； 以及将该分离的 α- 葡聚糖酶与口腔可接受的赋形剂混合， 以制备口腔护理组合物。 在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶不同于里氏木霉的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸残基 )。在一些实施方式中， 该方法还包括包装该口腔护理组合物。
在另一个方面中， 提供口腔护理组合物， 其包含 (a) 口腔可接受的赋形剂 ； 和 (b)
分离的 α- 葡聚糖酶。
在一个相关方面中， 提供了口腔护理组合物， 其包含 ： 口腔可接受赋形剂和选自下 列的分离的 α- 葡聚糖酶 ： (a) 具有与成熟 Hypocea tawa 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 1的 38-635 位氨基酸残基 ) 有至少 99％同一性的氨基酸序列的 α- 葡聚糖酶 ； (b) 具有与成熟 里氏木霉的 α- 葡聚糖酶 (SEQID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸残基 ) 有至少 85％同一性的氨 基酸序列的 α- 葡聚糖酶 ； 或者 (c) 具有与成熟 Trichoderma konilangbra 的 α- 葡聚糖 酶 (SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸残基 ) 有至少 85％同一性的氨基酸序列的 α- 葡聚 糖酶。在一些实施方式中， 该 α- 葡聚糖酶不同于里氏木霉的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸残基 )。
在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶以组合物重量的 0.0001％至 5％的浓度存在于 该组合物中。
在一些实施方式中， 该口腔护理组合物还包含第二种酶。 在特定实施方案中， 该第 二种酶是脱氨酶、 酯酶、 糖苷酶、 脂肪酶、 氧化酶、 过氧化物酶、 蛋白酶、 脲酶或纤维素酶。
在一些实施方式中， 该组合物配制成牙膏， 尽管预见了其他的口腔护理制剂。 在一 些实施方式中， 该组合物例如包含增稠剂、 表面活性剂、 湿润剂和研磨剂中的至少一种。
在另一个方面中， 提供了方法， 其中接受分离的 α- 葡聚糖酶， 然后提供与口腔可 接受的赋形剂混合以制备口腔护理组合物。该口腔护理组合物可以包装。
在另一个方面中， 提供了包括在适于 α- 葡聚糖酶活性的条件下将本发明口腔护 理组合物与牙齿相接触的方法。该接触可以使用例如牙刷进行。在特定情况下， 该方法导 致对齿斑的预防和 / 或减少。 附图说明
图 1 显 示 来 自 Hypocea tawa(SEQ ID NO ： 1)、里 氏 木 霉 (SEQ IDNO ： 2) ； Trichoderma konilangbra(SEQ ID NO ： 3) 和哈茨木霉 (T.harzianum)(SEQ ID NO ： 4) 的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列比对， 以及基于比对的共有序列 (SEQ ID NO ： 5)。显示 α- 葡聚 糖酶的多个特征， 例如信号序列、 催化结构域、 接头结构域以及葡聚糖结合结构域。
图 2 汇总与多种无细胞培养溶液过夜孵育后获得的不溶葡聚糖水解物的 HPLC 分 析结果的表格。
图 3 显 示 在 pH4.5 和 pH6.0 的 来 自 表 达 里 氏 木 霉 (T.reesei)、 H.tawa 和 T.konilangbra 的推定 α-1， 3- 葡聚糖酶的里氏木霉培养物的上清的活性。天然 α- 葡聚 糖酶在宿主菌株中未检测到。葡聚糖水解反应物根据培养体积而不是蛋白质含量上样。
定义
除非本文中另有说明， 否则所有技术和科学术语应为本领域中常规的含义。为清 楚起见定义以下术语。其他定义可出现在本说明书的其他地方。
本文所用的术语 “α- 葡聚糖酶” 指水解多糖中 1， 3-α-D- 糖苷键的酶。本文所 述的 α- 葡聚糖酶具有根据 IUBMB 酶命名法的 EC 3.2.1.59 的活性， 可水解不溶的葡聚糖。 α- 葡聚糖酶的系统命名为 1， 3(1， 3； 1， 4)-α-D- 葡聚糖 3- 葡聚糖水解酶。在某些出版物 中， 此酶可能称为 1， 3-α- 葡聚糖酶。注意， 本发明的酶可具有除 1， 3-α-D- 糖苷活性之外 的其他活性， 包括但不限于 1， 2-α-D- 糖苷活性。本文所用的术语 “口腔护理组合物” 指成分混合物， 在常规使用过程中其不是供有 意吞咽从而全身性施用特定治疗剂， 而是保留在口腔中足够的时间以接触牙齿表面和 / 或 口腔组织， 用以递送对口腔活性有益的试剂。口腔组合物可以是牙膏、 洁齿剂、 牙粉、 牙凝 胶、 龈下凝胶、 漱口水、 假牙产品、 口喷雾、 锭剂、 口腔片剂、 口香糖等等的形式。口腔组合物 还可以合并在条或膜上， 用以直接施用或粘贴在口腔表面。
除非另作说明， 术语 “洁齿剂” 指膏剂、 凝胶、 固体或液体的口腔护理组合物制剂。 洁齿剂的实例有牙膏、 牙齿凝胶和牙粉。洁齿剂可以是单相组合物或者可以是两种或更多 种分开的组合物的组合。 洁齿剂可以是任何期望的形式， 例如深条纹、 表面条纹、 多层、 具有 包围膏剂的凝胶或者其任何组合。 包含两种或更多种分开的组合物的洁齿剂中的每种组合 物可以包含于分配器中物理上分开的区室中并且并行分配。
本文使用的术语 “口腔科接受载体” 指用于口腔护理组合物中的安全且有效的物 质。这些物质包括氟离子来源、 抗钙物质、 缓冲剂、 研磨抛光物质、 过氧化物来源、 碱金属碳 酸氢盐、 增稠物质、 湿润剂、 水、 表面活性剂、 二氧化钛、 调味体系、 甜味剂、 木糖醇、 着色剂及 其混合物。
本文使用的术语 “牙齿” 或 “牙” 指天然牙齿以及假牙或牙科假体。 本文使用的术语 “牙 釉 质”指 通 常 可 见 并 且 主 要 由 包 括 羟 基 磷 灰 石 (hydroxylapatite) 的矿物质构成的牙齿部分。牙釉质涵盖人和动物牙齿中的天然牙釉质 以及用于替代受损或脱落的牙齿部分的牙釉质样物质， 包括用于此目的的树脂和瓷。
本文使用的术语 “牙石” 和 “牙垢” 可互换地用于表示矿化齿斑沉积物。
本文使用的术语 “糖萼” 指一些细菌、 上皮细胞以及其他细胞产生的细胞外聚合 物， 其在牙齿表面上形成包被， 并作为菌斑附着的基质。
本文使用的术语 “菌 斑”表 示 在 牙 齿 表 面 上 形 成 的 生 物 膜。 形 成 生 物 膜 的 微 生 物 主 要是 细菌， 包括但不限 于变 形链球菌 (Streptococcus mutans)、 厌氧链 球 菌 (Streptococcus anaerobes)、 梭杆菌属物种 (Fusobacterium spp.) 和放线杆菌属物种 (Actinobacteria spp.)。菌斑可以在糖萼上形成， 由其支持或者是其一部分。
齿斑中存在的微生物全部是口腔中天然存在的， 通常是无害的。 但是， 通过定期刷 牙无法除去菌斑意味着使得它们形成厚层。最靠近牙齿表面的那些微生物变为厌氧呼吸 ； 在此状态下它们开始产生酸。
本文使用的术语 “重组的” 指野生型宿主细胞中不存在、 不分泌或者表达模式改变 的多核苷酸或多肽。重组多肽和多核苷酸分别具有不同于野生型序列的序列， 具有不同于 野生型多肽和多核苷酸的时间或空间表达模式， 和 / 或以不同于野生型多肽和多核苷酸的 水平表达。重组分子可含有两种或多种以非天然发生的方式连接在一起的天然序列。重组 细胞含有重组多核苷酸或重组多肽。
本文使用的术语 “异源” 指彼此通常不相连的元件。例如， 如果宿主细胞产生异源 蛋白， 该宿主细胞中通常不产生该蛋白质。 同样地， 有效连接异源编码序列的启动子是有效 连接在野生型宿主细胞中其通常不有效连接的编码序列的启动子。 针对多核苷酸或蛋白质 的， 术语 “同源的” 表示宿主细胞中天然的多核苷酸或蛋白质。
本文使用的术语 “蛋白质” 和 “多肽” 可互换地用于表示肽键相连的氨基酸链。除 非另作说明， 多肽以标准的 N 端至 C 端的方向书写。
本文使用的 “信号序列” 是蛋白质的 N 端部分存在的氨基酸序列， 其有助于成熟形 式的蛋白质分泌出细胞。 信号序列的定义是功能性的， 尽管许多信号序列的结构是已知。 成 熟形式的细胞外蛋白质缺乏信号序列， 其在分泌过程中被切割掉了。
本文使用的 “编码序列” 是编码多肽的 DNA 部分。
本文使用的术语 “核酸” 涵盖 DNA、 RNA、 杂化物以及合成或化学修饰的核酸， 不论是 单链还是双链。术语 “核酸” 和 “多核苷酸” 可互换地用于表示由磷酸二酯、 硫酸二酯或类 似键连接的核苷链。除非另作说明， 多核苷酸以标准的 5′至 3′的方向书写。
本文使用的 “载体” 指设计用以将核酸引入一个或多个宿主细胞的多核苷酸。载 体可在不同宿主细胞中自主复制， 包括 ： 克隆载体、 表达载体、 穿梭载体、 质粒、 噬菌体颗粒、 表达盒等。
本文使用的 “表达载体” 指包含蛋白质编码区域的 DNA 构建物， 该编码区域与能够 实现蛋白质在合适宿主细胞中表达的合适控制序列有效连接。 这些控制序列可包括实现转 录的启动子、 控制转录产生 mRNA 的任选操纵子序列、 编码 mRNA 上合适核糖体结合位点的序 列以及增强子和控制转录和翻译终止的其他序列。
本文使用的 “启动子” 是引发下游核酸转录的调节序列。 本文使用的术语 “有效连接” 指允许元件以所述形式或表观形式发挥功能的元件 排列。例如， 如果启动子控制编码序列的转录， 则启动子与编码序列有效连接。
本文使用的术语 “选择性 / 选择标记” 指能够在宿主中表达的蛋白质， 其使得易于 选择含有引入核酸或载体的那些细胞。 选择标记的实例包括但不限于赋予抗微生物抗性的 蛋白质 ( 例如潮霉素、 博来霉素或氯霉素 ) 和 / 或赋予代谢优势的基因， 例如对于宿主细胞 的营养优势。
本文使用的术语 “来源于” 涵盖术语 “来自” 、 “获自” 或者 “可获自” 以及 “分离自” 。
本文使用的 “非致病” 生物体是指对人来说非病原性 ( 即， 疾病或造成疾病的 ) 的 生物体。
本文使用的术语 “回收的” 、 “分离的” 和 “分开的” 指从与其天然相关联的至少一 种组分中移出的蛋白质、 细胞、 核酸或氨基酸。
本文使用的术语 “转化的” 、 “稳定转化的” 和 “转基因的” 在针对细胞使用时表示 该细胞具有非天然 ( 例如异源 ) 核酸序列， 其整合进其基因组或者作为附加体质粒维持多 代。
本文使用的术语 “表达” 指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转 录和翻译。
在将核酸序列插入细胞内的背景中， 本文使用的术语 “引入” 表示 “转染” 或 “转化” 或 “转导” ， 包括核酸序列并入真核或原核细胞， 其中该核酸序列可并入细胞的基因组 ( 例 如染色体、 质粒、 质体或线粒体 DNA)， 转化为自主复制子或者瞬时表达 ( 例如转染的 mRNA)。
本文使用的术语 “相容的” 表示特定组合物的成分能够合并 ( 混合 )， 而没有显著 降低组合物中成分稳定性和 / 或效力的相互作用。
本文使用的术语 “锭剂” 包括但不限于 ： 薄荷糖、 锭剂、 软锭剂、 微胶囊和快速溶解 固体形式， 包括冻干形式 ( 饼、 薄片、 薄膜、 片剂 ) 和压制片剂。
本文使用的术语 “快速溶解的固体形式” 表示该固体剂型置于口腔或者含有牙科
假体的容器中后在小于约 60 秒、 小于约 15 秒、 或者小于约 5 秒内溶解的固体剂型。
数值范围涵盖定义其范围的数值。除非另作说明， 本文中使用的所有百分比和比 值是基于具体口腔组合物的重量， 而不是所递送的整个口腔制剂的重量。除非另作说明或 由上下文推知， 没有数词修饰的形式包括了复数形式。
为了便于阅读提供标题， 而不应视为限制。 除非另作说明或由上下文推知， 一个标 题下面所包括的说明一般作为整体适用于全文。
描述了示例性材料和方法， 但是其他方法和材料可得到类似的或等同的结果。所 有专利和公开， 包括这些专利和公开中公开的所有序列， 通过引用明确地并入本文。 具体实施方式
描述了关于具有 α- 葡聚糖酶活性的多肽的组合物和方法。该组合物和方法可用 于降低或预防菌斑的形成， 降低或预防促进形成菌斑的根本生理情况。
A. 多肽、 多核苷酸和宿主细胞
本发明组合物和方法的一个方面涉及分离的 α- 葡聚糖酶。在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶包含与成熟 Hypocea tawa 的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1的 38-635 位氨基酸残基 ) 具有至少 98％同一性 ( 例如至少 99％或 99.5％同一性 ) 的氨基 酸序列。在具体实施方案中， α- 葡聚糖酶包含成熟 H.tawa 的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1 的 38-635 位氨基酸残基 )。 在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶包含与成熟 Trichoderma konilangbra 的 α- 葡 聚糖酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸 ) 有至少 85％同一性 ( 例如至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性 ) 的氨基酸序列。 在具 体实施方案中， α- 葡聚糖酶包含成熟 T.konilangbra 的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸残基 )。
在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶包含与成熟里氏木霉的 α- 葡聚糖酶的氨基酸 序列 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸 ) 有至少 85％同一性 ( 例如至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性 ) 的氨基酸序列。在具体实施方案中， α- 葡聚糖酶包含不同于成熟里氏木霉的 α- 葡聚糖酶氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸 ) 的氨基酸序列。
在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶类似于但不同于野生型 α- 葡聚糖酶。例如， 在 一些实施方式中， α- 葡聚糖酶具有与成熟 H.tawa 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 1 的 38-635 位氨基酸残基 ) 有至少 98％同一性但是不相同的氨基酸序列。 同样地， 在某些实施方案中， α- 葡聚糖酶可具有与成熟里氏木霉或者 T.konilangbra 的 α- 葡聚糖酶 ( 分别为 SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸或者 SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸 ) 有至少 85％同一性但是 不相同的氨基酸序列。
已知有超过 50 种不同的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列， 并保存于 NCBI 的 Genbank 数 据库， 包括来自黑曲霉 (Aspergillus niger)( 登录号 ： XP_001390909.1 ； GID ： 145236523)、 产 紫 青 霉 (Penicillium purpurogenum)( 登 录 号 ： AAF27912.1 ； GID ： 6752866)、 构巢裸 胞 壳 (Emericella nidulans)( 登 录 号 ： CAC48025.1 ； GID ： 15072711) 和 新 型 隐 球 酵 母 (Cryptococcusneoformans)( 登录号 ： AAW47079.1 ； GID ： 57230770) 的那些。以本专利申请
的最早提交日， 这些 Genbank 登录内容以其整体引入作为参考， 包括其中的核酸和蛋白质 序列以及这些序列的注释。描述 α- 葡聚糖酶中保守的结构域的条目存放于 NCBI 的保守 结构域数据库中的 pfam03659(Marchler-Bauer 等人 CDD ： a conserved domain database for interactivedomain family analysis.(2007)Nucleic Acids Res.35 ： D237-40)。来 自裂殖酵母 (S.pombe) 的 α- 葡聚糖酶的序列以及 α- 葡聚糖酶结构的讨论见于 Fuglsang 等人 ((2000)J.Biol.Chem.275 ： 2009-18)。
可 得 到 对 于 下 列 的 指 导， 即 可 改 变 氨 基 酸 以 产 生 H.tawa、 里氏木霉和 T.konilangbra 的野生型 α- 葡聚糖酶保留 α- 葡聚糖酶活性的变体， 例如， 通过比对这 些 α- 葡聚糖酶蛋白质的氨基酸序列， 鉴定在蛋白质中相同位置而蛋白质之间不同的氨 基酸， 以及将这些氨基酸从一个蛋白质转移到另一个。示例性序列对比显示于图 1， 以及 Fuglsang 等人 ( 见上文 )。
变体多肽可包含保守氨基酸取代， 其保留所取代氨基酸的总电荷、 疏水性 / 亲水 性和 / 或空间体积， 同时赋予该多肽其他有益生物化学性质。保守取代的非限制性实例包 括下列组之间的取代 ： Gly/Ala、 Val/Ile/Leu、 Lys/Arg、 Asn/Gln、 Glu/Asp、 Ser/Cys/Thr 和 Phe/Trp/Tyr。这些及其他保守取代显示于下表。
或者， 该氨基酸取代不是保守的， 其改变所取代氨基酸的总电荷、 疏水性 / 亲水性 和 / 或空间体积。
评价 α- 葡聚糖酶活性的测定描述于多个出版物， 包括 ： Fuglsang 等人 (supra)， Inoue 等人 ((1988)Carbohydr.Res.182 ： 277-86)， Ait-Lahsen 等人 ((2001)Appl.Environ. Microbiol.67 ： 5833-9)， 和 Sumitomo 等人 ((2007)Biochim.Biophys.Acta.1770 ： 716-24)。
还提供了编码该 α- 葡聚糖酶的分离多核苷酸， 以及含有该分离多核苷酸的重组 核酸。假定遗传密码已知， 可基于氨基酸序列容易地设计这些多核苷酸。在一个实施方案 中， 分离多核苷酸具有与下列核苷酸序列有至少 70 ％同一性 ( 例如至少 80 ％同一性、 至 少 90％同一性、 至少 95％同一性、 至少 98％同一性 ) 或者可在严格条件下杂交的核苷酸序 列， 该下列核苷酸序列即野生型 H.tawa 的 α- 葡聚糖酶基因或其编码序列 ( 例如分别为 SEQID NO ： 29 和 30)、 野生型里氏木霉的 α- 葡聚糖酶基因或其编码序列 ( 例如分别为 SEQ ID NO ： 31 和 32)、 或者野生型 T.konilangbra 的 α- 葡聚糖酶基因或其编码序列 ( 例如分 别为 SEQ ID NO ： 33 和 34)。在某些实施方案中， α- 葡聚糖酶的编码序列针对在所用宿主 细胞中表达 α- 葡聚糖酶经密码子优化。因为密码子使用表格列出了许多宿主细胞中每个 密码子的使用， 包括里氏木霉和多种其他酵母和细菌宿主细胞， 是本领域中已知的 ( 参见 例如 Nakamura 等人 (2000)Nucl.Acids Res.28 ： 292) 或者易于得到的， 只要有要待表达的 α- 葡聚糖酶氨基酸序列， 可容易地设计这些核酸。
还提供了含有重组核酸的表达载体和宿主细胞。在某些实施方案中， 宿主细胞是 细菌 ( 例如芽孢杆菌属物种 (Bacillus sp.) 或链霉菌属物种 (Streptomyces sp.) 宿主细 胞 ) 或者丝状真菌宿主细胞， 在某些情况下， 可以是不致病的， 即对人来说不致病的。在某 些实施方案中， 细胞可以是 FDA 认为是 GRAS 状态的 ( 即公认安全的 (Generally Recognized as Safe)) 具有用于生产蛋白质历史的丝状真菌菌株的细胞。
在 具 体 实 施 方 案 中， 本发明的真菌细胞可以是下列物种的细胞 ： 木霉属 (Trichoderma)( 例如里氏木霉 ( 之前归类为长梗木霉 (T.longibrachiatum)， 目前也称为 Hypocea jecorina)、 绿色木霉 (Trichodermaviride)、 康宁木霉 (Trichoderma koningii) 和 哈 茨 木 霉 (Trichodermaharzianum))、 青 霉 属 物 种 (Penicillium spp.)、 腐质霉属物 种 (Humicolaspp.)( 例 如 Humicola insolens 和 灰 腐 质 霉 (Humicola grisea))、 金孢 霉 属 物 种 (Chrysosporium spp.)( 例 如 C.lucknowense)、 粘 帚 霉 属 物 种 (Gliocladium spp.)、 曲 霉 菌 属 物 种 (Aspergillus spp.)( 例 如 米 曲 霉 (Aspergillus oryzae)、 黑曲 霉 (Aspergillus niger)、 构 巢 曲 霉 (Aspergillusnidulans)、 河 内 曲 霉 (Aspergillus
kawachi)、 棘 孢 曲 霉 (Aspergillusaculeatus)、 日 本 曲 霉 (Aspergillus japonicus)、 酱 油 曲 霉 (Aspergillus sojae) 和 泡 盛 曲 霉 (Aspergillus awamori) 和 镰 孢 霉 属 物 种 (Fusarium spp.)， 脉孢菌属物种 (Neurospora spp.)、 肉座菌属物种 (Hypocea spp.) 或者 裸孢壳属物种 (Emericella spp.)( 另外参见 Innis 等人 (1985)Science228 ： 21-26) 等等。 在一些实施方案中， 本发明的真菌细胞可以是黑曲霉菌株， 包括 ATCC 22342、 ATCC 44733、 ATCC 14331 以及来源于其的菌株。在一些实施方式中， 宿主细胞可以是其中天然基因已缺 失或失活的细胞。例如， 对应于蛋白酶基因的基因或者对应于纤维素酶基因的基因可缺失 或失活。
上述核酸可以存在于宿主细胞核基因组中或者可以存在于在宿主细胞中复制的 质粒中， 例如， 瞬时表达载体、 穿梭载体、 人工染色体等。
在具体实施方案中， α- 葡聚糖酶可以通过在真菌宿主细胞中表达融合蛋白质产 生， 该融合蛋白质含有与 α- 葡聚糖酶有效连接的信号序列。在此类实施方案中， α- 葡 聚糖酶可以分泌进培养基， 在其中其可被收获。融合蛋白质的信号序列可以是任何利于蛋 白质分泌出宿主细胞的信号序列。所用的信号序列可以是宿主细胞内源的或非内源， 在某 些实施方案中， 可以是已知高度分泌出木霉属物种或曲霉属物种宿主细胞的蛋白质信号序 列。这些信号序列包括但不限于 ： 纤维二糖水解酶 I、 纤维二糖水解酶 II、 内切葡聚糖酶 I、 内切葡聚糖酶 II、 内切葡聚糖酶 III、 α- 淀粉酶、 天冬氨酰蛋白酶、 葡糖淀粉酶、 甘露聚糖 酶、 糖苷酶和大麦内肽酶 B( 参见例如 Saarelainen(1997)Appl.Environ.Microbiol.63 ： 4938-40) 的信号序列。在具体实施方案中， 可以使用自身 ( 即内源 ) 信号序列分泌 α- 葡 聚糖酶。
在一些实施方案中， 通过引入核酸到宿主细胞中产生 α- 葡聚糖酶， 该核酸包含 与 α- 葡聚糖酶编码部分有效连接的编码信号序列的部分， 其中该核酸的翻译产生包含具 有 N 端信号序列的葡聚糖酶部分的融合蛋白， 该信号序列用以将 α- 葡聚糖酶分泌出宿主 细胞。
在具体实施方案中， 除了信号序列之外， 融合蛋白质可另外含有载体蛋白质， 其为 宿主细胞内源并且高度分泌的蛋白质的部分。合适的载体蛋白包括里氏木霉甘露聚糖酶 I(Man5A 或 MANI)、 里氏木霉纤维二糖水解酶 II(Cel6A 或 CBHII)( 参见例如 Paloheimo 等 人 (2003)Appl.Environ.Microbiol.69 ： 7073-82) 或者里氏木霉纤维二糖水解酶 I(CBHI) 的那些。在一个实施方案中， 载体蛋白是截短的里氏木霉 CBH1 蛋白， 包含 CBH1 核心区域和 CBH1 接头区域的部分。因此可使用编码融合蛋白质的核酸， 该融合蛋白质从氨基端至羧基 端有效连接信号序列、 载体蛋白质和本发明的 α- 葡聚糖酶。
除了编码序列之外， 核酸还可含有 α- 葡聚糖酶在宿主细胞中表达所需的其他元 件。 例如， 该核酸可含有转录编码序列的启动子和转录终止子。 可用于里氏木霉的示例性启 动子包括里氏木霉 cbh1、 cbh2、 egl1、 egl2、 eg5、 xln1 和 xln2 启动子， 或者其杂种或截短版 本。例如该启动子可以是里氏木霉 cbh1 启动子。合适的终止子包括里氏木霉 cbh1、 cbh2、 egl1、 egl2、 eg5、 xln1 和 xln2 终止子， 以及许多其他， 例如包括来自黑曲霉或河内黑曲霉 基因葡糖淀粉酶基因 (Nunberg 等人 (1984)Mol Cell Biol.4 ： 2306-15) ； Boel 等人 (1984) EMBO J.3 ： 1097-102 和 Boel 等人 (1984)EMBO J.3 ： 1581-85)、 构巢曲霉氨基邻苯甲酸酯合 酶基因、 米曲霉 TAKA 淀粉酶基因或者构巢曲霉 trpC(Punt 等人 (1987)Gene 56 ： 117-24) 的终止子。对于木霉菌属物种宿主细胞来说， 该启动子和 / 或终止子可以是天然的或非内源 的。
还提供了宿主细胞培养物 ( 即含有宿主细胞群体和生长培养基的组合物 )。培养 物的生长培养基可含有如上所述的 α- 葡聚糖酶。在某些实施方案中， 该细胞培养物可含 有生长培养基和上述细胞的群体。细胞培养物可用于通过在适于产生分离的 α- 葡聚糖酶 的条件下维持细胞培养物产生本发明的 α- 葡聚糖酶。如果 α- 葡聚糖酶分泌， 则其可从 生长培养基中收获。
丝状真菌表达蛋白质的方法包括其中细胞经改造产生分泌蛋白质的方法， 其包括 描述于美国专利 No.6,022,725 和 6,268,328， 以及公开的美国专利申请 No.20060041113、 20060040353、 20060040353 和 20050208623 中 的 那 些， 其 通 过 引 用 并 入 本 文。 另 外， 转 化曲霉菌株的一般方法公开于 Cao 等人 (2000)Protein Sci.9 ： 991-1001) 和 Yelton 等 人 (1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 ： 1470-74)， 转化木霉菌菌株的一般方法公开于 Nevalainen 等人 (1992) “The Molecular Biology of Trichoderma and itsApplication to the Expression of Both Homologous and HeterologousGenes” in Molecular Industrial Mycology， Leong 和 Berka 编辑， MarcelDekker Inc.， NY， 129-48 页 )。
如果分泌进培养基， 则 α- 葡聚糖酶可通过任何便利方法回收， 例如通过沉淀、 离 心、 亲和、 过滤或者任何其他本领域已知的方法。可使用， 例如亲和层析 (Tilbeurgh 等人 (1984)FEBS Lett.16 ： 215) ； 离子交换层析方法 (Goyal 等人 (1991)Biores.Technol.36 ： 37 ； Fliess 等 人 (1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17 ： 314 ； Bhikhabhai 等 人 (1984)J.Appl.Biochem.6 ： 336 ； 以 及 Ellouz 等 人 (1987)Chromatography396 ： 307)， 包括 使用高分辨率材料的离子交换 (Medve 等人 (1998)J.Chromatography A.808153 ； 疏水相互 作用层析 (Tomaz and Queiroz(1999)J.Chromatography A.865 ： 123 ； 两相分配 (Brumbauer 等人 (1999)Bioseparation 7 ： 287) ； 乙醇沉淀 ； 反相 HPLC ； 硅胶或者例如 DEAE 的阳离子 交换树脂上的层析 ； 层析聚焦 ； SDS-PAGE ； 硫酸铵沉淀 ； 或者凝胶过滤， 使用例如 Sephadex G-75。在具体实施方案中， α- 葡聚糖酶可在没有从培养基的其他成分纯化的情况下使用。 在这些实施方案中， 培养基可例如简单地浓缩， 然后在没有从生长培养基的成分进一步纯 化蛋白质的情况下使用， 或者在没有进一步修饰的情况下使用。
B. 口腔护理组合物
本发明组合物和方法的一个方面涉及口腔护理组合物。该口腔护理组合物含有 一种或多种该 α- 葡聚糖酶和口腔可接受载体。一种或多种 α- 葡聚糖酶的每一种可 以 0.0001wt ％至 5wt ％范围 ( 例如 0.0001wt ％至 0.0005wt ％、 0.0005wt ％至 0.001wt ％、 0.001wt ％ 至 0.005wt ％、 0.005wt ％ 至 0.01wt ％、 0.01wt ％ 至 0.05wt ％、 0.05wt ％ 至 0.1wt％、 0.1wt％至 0.5wt％、 0.5wt％至 1wt％或者 1wt％至 5wt％ ) 的浓度存在于组合物 中， 但是也设想此范围之外的浓度。该口腔护理组合物可由包括将 α- 葡聚糖酶与口腔可 接受赋形剂混合的方法制成。在某些情况下， 该方法还可包括包装口腔护理组合物。
该口腔护理组合物可以是例如洁齿剂、 牙膏、 牙粉、 局部口腔凝胶、 漱口水、 假牙产 品、 口喷雾、 锭剂、 口腔片剂或口香糖的形式。该口腔组合物也可合并在条带、 薄膜、 绒毛或 胶带上， 用以直接施用或粘附在口腔表面。
口腔可接受载体可包含一种或多种相容固体或液体填充稀释剂或者包装物质， 其适于局部口腔施用。 合适的载体或赋形剂包括如下文更详细描述的常用的和常规的洁齿剂 ( 包括非研磨凝胶和用于龈下施用的凝胶 )、 漱口水、 口喷雾、 口香糖和锭剂 ( 包括薄荷糖 ) 的成分。液体形式的本发明口腔护理组合物可优选具有约 4.0 至约 10.0 的 pH， 例如约 5.0 至约 8.0。
在一些实施方式中， 该载体基于组合物引入口腔的形式来选择。 例如， 如果使用牙 膏 ( 包括牙齿凝胶等 )， 则可选择 “牙膏载体” ( 包括例如研磨物质、 表面活性剂、 粘合剂、 润 湿剂、 调味剂和甜味剂等 ))， 例如 Benedict 的美国专利 No.3,988,433 中公开的。 如果使用 漱口水， 则可选择 “漱口水载体” ( 包括例如水、 调味剂和甜味剂等 )， 例如 Benedict 的美国 专利 No.3,988,433 所公开的。如果使用口喷雾， 则可选择 “口喷雾载体” ， 或者如果使用锭 剂， 这可选择 “锭剂载体” ( 例如糖果基质 (base))。如果使用口香糖， 则可选自 “口香糖载 体” ( 包括例如口香糖基质、 调味剂和甜味剂 )。如果使用香粉， 则可选自 “香粉载体” (例 如香粉、 调味剂和甜味剂 )。 如果使用龈下凝胶 ( 用于递送活性物质至牙周袋内或者牙周袋 周围 )， 则可选自 “龈下凝胶载体” 。适于制备本发明组合物的其他可用载体是本领域公知 的。它们的选择可取决于例如味道、 成本、 保存期、 对无糖或无盐组合物的需要等次要考虑 因素。
在一些实施方式中， 该组合物可以是非研磨凝胶的形式， 例如龈下凝胶， 其可以是 水性或非水性的。水性凝胶通常包括增稠剂 ( 约 0.1％至约 20％ )、 湿润剂 ( 约 10％至约 55％、 调味剂 ( 约 0.04％至约 2％ )、 甜味剂 ( 约 0.1％至约 3％ )、 着色剂 ( 约 0.01％至约 0.5％ ) 以及用于平衡的水。在某些情况下， 该组合物可包含防龋齿物质 ( 约 0.05％至约 0.3％， 如氟离子 ) 和防牙石物质 ( 约 0.1％至约 13％ )。
在其他一些的实施方式中， 该组合物也可以是洁齿剂的形式， 例如牙膏、 牙齿凝胶 或牙粉。 这些牙膏和牙齿凝胶的成分可包括一种或多种牙齿研磨剂 ( 约 5％至约 50％ )、 表 面活性剂 ( 约 0.5％至约 10％ )、 增稠剂 ( 约 0.1％至约 5％ )、 湿润剂 ( 约 10％至约 55％ )、 调味剂 ( 约 0.04％至约 2％ )、 甜味剂 ( 约 0.1％至约 3％ )、 着色剂 ( 约 0.01％至约 0.5％ ) 和水 ( 约 2％至约 45％ )。 这些牙膏或牙齿凝胶也可包含一种或多种防龋齿物质 ( 约 0.05％ 至约 0.3％， 如氟离子 ) 和防牙石物质 ( 约 0.1％至约 13％ )。牙粉可含有基本上全部为非 液体的成分。
一种示例性洁齿剂组合物描述于美国专利 No.6,238,648， 其具有下列组成 (w/ w) ：
甘油 14.0
聚乙二醇 300 4.5
二氧化硅 21.5
焦磷酸四钠 4.5
水 23.5
黄原胶 0.3
羧甲基纤维素 0.5
氟化钠 0.2
香料 1.0
月桂基硫酸钠 (27.9％溶液 ) 4.5糖精钠 0.4 二氧化钛 0.4 碳酸氢钠 0.9 无水碳酸钠 1.4 Poloxamer 407 1.8 木糖醇 10.0 丙二醇 10.6 总计 100.00 另一种示例性洁齿剂组合物描述于美国专利 No.5,578,295， 其具有下列组成 (w/ 三氯生二磷酸盐 (Triclosan diphosphate) 1 山梨糖醇 33 糖精 0.46 二氧化硅 22 NaF 0.243w) ：
甘油 9
NaOH(50％ ) 0.2
Carbopol 0.2
Keltrol 0.6
TiO2 0.5
烷基硫酸钠 (28％溶液 ) 4
PEG 6
3FD&C Blue#1(1％溶液 ) 0.05
香料 1.1
水 适量
在一些实施方式中， 该组合物是嗽口水， 包括口喷雾。 这些嗽口水和口喷雾的成分 通常包括下列一种或多种 ： 水 ( 约 45％至约 95％ )、 乙醇 ( 约 0％至约 25％ )、 润湿剂 ( 约 0％至约 50％ )、 表面活性剂 ( 约 0.01％至约 7％ )、 调味剂 ( 约 0.04％至约 2％ )、 甜味剂 ( 约 0.1％至约 3％ ) 和着色剂 ( 约 0.001％至约 0.5％ )。这些嗽口水和口喷雾还可包含 下列一种或多种 ： 防龋齿物质 ( 约 0.05％至约 0.3％， 如氟离子 ) 和防牙石物质 ( 约 0.1％ 至约 3％ )。
在某些实施方案中， 该组合物可以是牙科溶液， 包括冲洗流体。 这些牙科溶液的成 分通常包括下列一种或多种 ： 水 ( 约 90％至约 99％ )、 防腐剂 (0.01％至约 0.5％ )、 增稠剂 ( 约 0％至约 5％ )、 调味剂 ( 约 0.04％至约 2％ )、 甜味剂 ( 约 0.1％至约 3％ ) 和表面活性 剂 ( 约 0％至约 5％ )。
口香糖组合物通常包含下列一种或多种 ： 树胶基质 ( 约 50％至约 99％ )、 调味剂 ( 约 0.4％至约 2％ ) 和甜味剂 ( 约 0.01％至约 20％ )。
锭剂可包括包含调味基质中治疗剂的盘状固体。该基质可以是硬糖、 甘油胶或具 有足够胶水使其成形的糖的组合。这些剂型是本领域中通常公知的。在另一个实施方案中， 本发明提供了注入本文所提供组合物的牙科装置。该牙科 装置可包括接触牙齿及口腔中其他组织的装置， 该装置浸入包含氧化酶和聚乙烯亚胺或山 梨糖醇的组合物。该牙科装置可以是浸渍纤维的形式， 其包括牙线或胶带、 芯片、 条、 膜、 牙 签以及聚合物纤维。
可存在于口腔可接受载体中的示例性材料如下所述。
研磨剂
牙齿研磨剂包括许多不同的材料。所选的材料可以是在目的组合物中相容的， 可 能不过分磨损牙质。适宜的研磨剂可包括， 例如， 二氧化硅包括凝胶和沉淀、 不溶聚偏磷酸 钠、 水合氧化铝、 碳酸钙、 正磷酸二钙二水合物、 焦磷酸钙、 磷酸三钙、 聚偏磷酸钙和树脂研 磨材料例如尿素和甲醛缩合产物的颗粒。
用于该组合物的一类研磨剂是颗粒化热凝固聚合树脂。适宜的树脂包括， 例如 三聚氰胺、 酚醛树脂、 尿素、 三聚氰胺 - 尿素、 三聚氰胺 - 甲醛、 尿素 - 甲醛、 三聚氰胺 - 尿 素 - 甲醛、 交联环氧化物和交联聚酯。
可选择多种类型的二氧化硅牙齿研磨剂， 因为其有益于牙齿清洁和磨光性能， 而 不过度磨损牙釉质或牙质。二氧化硅研磨剂磨光材料， 以及其他研磨剂可具有约 0.1 至约 30 微米或者约 1 至约 15 微米范围的平均粒度。该研磨剂可以是沉淀的二氧化硅或二氧化 硅凝胶例如二氧化硅干凝胶。 也可使用研磨剂混合物。洁齿剂组合物中研磨剂总量可以为约 6％至约 70％重 量。以组合物重量计， 牙膏可含有约 10％至约 50％的研磨剂。溶液、 口喷雾、 嗽口水和非研 磨凝胶组合物可以不含研磨剂。
表面活性剂
本发明组合物还可含有表面活性剂， 例如肌氨酸盐表面活性剂、 羟乙基磺酸盐表 面活性剂或牛磺酸盐 (taurate) 表面活性剂。在某些实施方案中， 该组合物可含有这些表 面活性剂的碱金属盐或铵盐。 在某些情况下， 该组合物可含有下列的钠钾和钾盐 ： 月桂酰肌 氨酸、 十四酰肌氨酸、 棕榈酰肌氨酸、 硬脂酰肌氨酸和油酰肌氨酸。其他合适的相容表面活 性剂可用于替代这些表面活性剂或与之组合。
合适的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐的水溶盐， 其烷基具有 10 至 18 个碳原 子， 以及具有 10 至 18 个碳原子的脂肪酸的磺酸化单酸甘油酯的水溶盐。十二烷基硫酸钠 和椰子单酸甘油酯磺酸钠是该类型阴离子表面活性剂实例。 也可利用阴离子表面活性剂混 合物。
合适的阳离子表面活性剂包括具有一个约 8 至 18 个碳原子的长烷基链的脂肪族 季铵化合物的衍生物， 例如月桂基三甲基氯化氨 ； 氯化十六烷基吡啶鎓 (cetyl pyridinium chloride) ； 十六烷基三甲基溴化铵 ； 二 - 异丁基苯氧乙基 - 二甲基苯甲基氯化铵 ； 椰油基 三甲基亚硝酸铵 ； 氟化十六烷基吡啶鎓 (cetyl pyridinium fluoride) 等。 在某些情况下， 表面活性剂化合物可以是具有去污剂性能的季铵氟化物。 一些阳离子表面活性剂可作为组 合物中的杀菌剂。
适宜的非离子型表面活性剂包括烯基氧化物 (alkylene oxide) 基团 ( 本质上亲 水 ) 与有机疏水化合物缩合产生的化合物， 该有机疏水化合物可以本质上是脂肪族或者烷 基芳香族的。实例包括普卢兰尼克 (Pluronics)、 烷基酚的聚环氧乙烷缩合物、 来源于环氧
乙烷与环氧丙烷和乙二胺反应产物缩合的产物、 脂族醇的环氧乙烷缩合物、 长链叔胺氧化 物、 长链叔膦氧化物、 长链二烷基亚砜和这些物质的混合物。
合适的两性离子合成表面活性剂包括脂肪族季铵、 磷鎓和有机四价硫化合物的衍 生物， 其中该脂烃基可以是直链或支链的， 其中脂肪取代基之一含有约 8 至 18 个碳原子， 之 一含有阴离子水溶性基团， 例如羧基、 磺酸基、 硫酸基、 磷酸基或膦酸基。
合适的甜菜碱表面活性剂包括癸基甜菜碱或 2-(N- 癸基 -N， N- 二甲基胺基 ) 醋酸 酯、 椰油基甜菜碱或 2-(N- 椰油基 -N， N- 二甲基胺基 ) 醋酸酯、 十四烷基甜菜碱、 棕榈基甜 菜碱、 月桂基甜菜碱、 鲸蜡基甜菜碱、 鲸蜡基甜菜碱、 硬脂基甜菜碱等。 酰胺甜菜碱例如椰油 酰胺乙基甜菜碱、 椰油酰胺丙基甜菜碱、 月桂酰胺丙基甜菜碱等。在某些实施方案中， 该组 合物的甜菜碱是椰油酰胺丙基甜菜碱或月桂酰胺丙基甜菜碱。
以总组合物重量计， 表面活性剂可以约 0.1％至约 2.5％、 约 0.3％至约 2.5％或者 约 0.5％至约 2.0％范围的浓度存在。
防菌斑物质
该组合物还可包含抗菌斑物质， 例如合成阴离子聚合物， 例如聚丙烯酸酯或者马 来酸酐或酸和甲基乙烯基醚的共聚物， 以及聚氨基丙磺酸 (polyamino propane sulfonic acid， AMPS)、 柠檬酸锌三水合物、 多肽 ( 例如聚天冬氨酸和聚谷氨酸 ) 和其混合物。
螯合剂
该组合物可包含螯合剂。螯合剂包括酒石酸和其可药用盐、 柠檬酸和柠檬酸碱金 属盐以及其混合物。螯合剂可螯合细菌细胞壁中存在的钙。螯合剂还可通过将钙从有助于 保持生物质完整的钙桥除去从而破坏菌斑。不应使用可导致牙齿脱矿化的螯合剂。
在一些实施方式中， 该组合物中存在柠檬酸碱金属盐 ( 例如柠檬酸钠和钾 )。 在某 些情况下， 螯合剂包括柠檬酸 / 柠檬酸碱金属盐的组合。在其他一些情况下， 可使用酒石酸 碱金属盐。 其他物质包括酒石酸二钠、 酒石酸二钾、 酒石酸钾钠、 酒石酸氢钠和酒石酸氢钾。 酒石酸盐螯合剂可单独使用或者与其他任选的螯合剂联合使用。在某些实施方案中， 这些 1 5 螯合剂具有约 10 至 10 的钙结合常数， 以提供菌斑形成减少的改善清洗。
另一组螯合剂是阴离子聚合物聚羧酸。这些物质是本领域公知的， 以它们的游离 酸形式使用， 部分或完全中和的水溶性碱金属 ( 例如钾， 优选钠 ) 或铵盐。在某些情况下， 组合物含有 1 ∶ 4 至 4 ∶ 1 的马来酸酐或酸与另一种可聚合烯属不饱和单体的共聚物， 例 如平均分子量 (AMW) 为约 30,000 至约 1,000,000 的甲基乙烯基醚 ( 甲氧乙醚 )。
其他有效的聚合聚羧酸可包括下列这些， 例如马来酸酐与丙烯酸乙酯、 甲基丙烯 酸羟、 N- 乙烯基 -2- 吡咯烷酮或乙烯的 1 ∶ 1 共聚物， 以及丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯或甲基 丙烯酸羟乙酯、 丙烯酸甲酯或丙烯酸乙酯、 异丁基乙烯醚或 N- 乙烯基 -2- 吡咯烷酮的 1 ∶ 1 共聚物。
其他的有效聚合聚羧酸可以是马来酸酐与苯乙烯、 异丁烯或乙基乙烯基醚的共聚 物、 聚丙烯酸、 聚衣康酸和聚马来酸、 以及 AMW 低至 1000 的磺基乙酰化低聚物。
螯合剂的量可以是约 0.1 ％至约 2.5 ％、 约 0.5 ％至约 2.5 ％或者约 1.0 ％至约 2.5％。
氟化物来源
在某些实施方案中， 口腔护理组合物中可存在水溶性氟化物化合物， 其存在的量足以提供组合物中 25℃下约 0.0025wt％至约 5.0wt％或者约 0.005wt％至约 2.0wt％的氟 离子浓度。多种产生氟离子的物质可用作本发明组合物中可溶性氟化物的来源。代表性氟 离子来源可包括氟化亚锡、 氟化钠、 氟化钾、 单氟代磷酸钠等等。 在某些情况下， 本发明组合 物包含氟化亚锡和氟化钠以及其混合物。
牙齿增白活性剂和牙齿颜色调节物
口腔护理组合物中还可存在牙齿增白剂和 / 或牙齿颜色调节物。这些物质适于调 节牙齿的颜色。 这些物质可包括在施用到牙齿表面上时调节表面的光吸收和或光反射的颗 粒。当含有这些颗粒的薄膜施加到牙齿表面时， 这些颗粒可提供外观上的益处。
颗粒包括常用于化妆品领域的染料和着色剂。 对用于本发明组合物的染料和或着 色剂没有特别的限制。染料和着色剂包括无机白色染料、 无机彩色染料、 珠光剂、 填充粉末 等等。具体的实例可选自 ： 滑石、 云母、 碳酸镁、 碳酸钙、 硅酸镁、 硅酸镁铝、 二氧化硅、 二氧 化钛、 氧化锌、 红色氧化铁、 褐色氧化铁、 黄色氧化铁、 黑色氧化铁、 氰铁酸铵铁、 锰紫、 群青、 尼龙粉末、 聚乙烯粉末、 异丁烯酸粉末、 聚苯乙烯粉末、 丝粉末、 结晶纤维素、 淀粉、 钛酸盐云 母、 氧化铁钛酸盐云母、 氯氧化铋和其混合物。在某些实施方案中， 使用二氧化钛、 氯氧化 铋、 氧化锌或其混合物。
该染料可用作遮光剂和着色剂。 这些染料可以以经处理的颗粒使用或者以自身作 为原始染料使用。典型染料水平可选择成对消费者所预期的有特别的冲击。例如， 对于特 别黑或脏的牙齿， 可使用足以使得牙齿发亮的染料。 另一方面， 当个体的牙齿或牙齿上的斑 点比其他牙齿更亮时， 可使用使得牙齿变暗的染料。染料和着色剂的水平可以组合物的约 0.05％至约 20％、 约 0.10％至约 15％或者约 0.25％至约 10％的范围使用。
增稠剂
在某些实施方案中， 例如牙膏或凝胶， 一些增稠剂可提供组合物的一致性、 使用后 的活性释放特征、 保存稳定性以及组合物的稳定性等等。增稠剂包括聚羧乙烯、 角叉菜胶、 羟乙基纤维素、 合成锂皂石和纤维素醚的水溶性盐例如羧甲基纤维素钠和羧甲基羟乙基纤 维素钠。也可使用天然树胶， 例如刺梧桐树胶、 黄原胶、 阿拉伯树胶和黄芪胶。可使用胶体 硅酸镁铝或者细二氧化硅粉作为增稠剂的一部分来进一步改善质地。
增稠剂或胶凝剂可包括一类与季戊四醇的烷基醚或蔗糖的烷基醚交联的丙烯酸 的均聚物、 卡波姆或其混合物。
分子量在约 1000 至约 120000( 数均 ) 的丙交酯和乙交酯单体的共聚物可用于本 发明组合物， 例如 “龈下凝胶” 。
以牙膏或凝胶组合物总重量计， 增稠剂可以约 0.1％至约 15％、 约 2％至约 10％或 者约 4％至约 8％的量使用。口香糖、 锭剂 ( 包括薄荷糖 )、 香粉、 非研磨凝胶和龈下凝胶可 使用高浓度。
湿润剂
在某些实施方案中， 本发明组合物的局部口腔载体可包括湿润剂。湿润剂可用于 防止本发明组合物在暴露于空气后变硬， 使得组合物带给口湿润的感觉， 对于特定湿润剂， 给予牙膏组合物希望的甜味。 基于纯的湿润剂， 以本文组合物的重量计， 该湿润剂可包含约 0％至约 70％或者约 5％至约 25％。合适用于本发明组合物的湿润剂包括可食用多元醇例 如丙三醇、 山梨糖醇、 木糖醇、 丁二醇、 聚乙二醇和丙二醇。在某些情况下， 该湿润剂是山梨糖醇和 / 或丙三醇。
调味剂和甜味剂
组合物中也可加入调味剂。合适的调味剂包括冬青油、 薄荷油、 留兰香油、 丁香花 蕾油、 薄荷醇、 茴香醇、 水杨酸甲酯、 桉树醇、 桂皮、 1- 乙酸薄荷酯、 鼠尾草、 丁香酚、 欧芹油、 oxanone、 α- 紫罗兰酮、 甘牛至草、 柠檬、 橙、 丙烯基乙基愈创木酚、 肉桂、 香草醛、 麝香草酚、 芳樟醇、 肉桂醛甘油乙缩醛 ( 称为 CGA(cinnamaldehyde glycerol acetal)) 以及其混合 物。以组合物的重量计， 调味剂可以约 0.001％至约 5％的水平用于组合物。
合适的甜味剂包括蔗糖、 葡萄糖、 糖精、 右旋糖 (dextrose)、 左旋糖、 乳糖、 甘露醇、 山梨糖醇、 果糖、 麦芽糖、 木糖醇、 糖精盐、 非洲竹芋甜素、 阿司帕坦、 D- 色氨酸、 二氢查耳酮、 乙酰舒泛、 环磺酸盐、 环拉酸钠或糖精钠以及其混合物。以组合物重量计， 组合物可含有约 0.1％至约 10％或者约 0.1％至约 1％的这些物质。
除了调味剂和甜味剂之外， 冷却剂、 流涎剂、 加热剂和麻木剂可用作本发明组合物 的任选成分。以组合物的重量计， 这些物质可以约 0.001％至约 10％或者约 0.1％至约 1％ 的水平存在于组合物中。
冷却剂可以是多种材料中的任意种。这些材料中包括羧酰胺、 薄荷醇、 缩酮、 二醇 以及其混合物。示例性冷却剂有对孟烷氨基甲酰 (paramenthancarboxyamide) 物质， 例如 N- 乙基 - 对孟烷 -3- 羧酰胺、 N， 2， 3- 三甲基 -2- 异丙基丁酰胺以及其混合物。其他冷却剂 可选自薄荷醇、 3-1- 甲氧基丙烷 -1， 2- 二醇、 薄荷酮甘油乙缩醛和乳酸薄荷酯。 术语薄荷醇 和薄荷基包括这些化合物右旋和左旋异构体以及其外消旋混合物。
加热剂包括辣椒和烟酸酯， 例如烟酸苯甲酯。麻木剂可包括苯佐卡因、 利多卡因、 丁香花蕾油和乙醇。
碱金属碳酸氢盐
该组合物还可包含碱金属碳酸氢盐。 碱金属碳酸氢盐可溶于水， 除非是稳定， 否则 可在水体系中释放二氧化碳。碳酸氢钠， 也称为小苏打， 可以碱金属碳酸氢盐的形式存在。 在某些实施方案中， 该组合物含有约 0.5％至约 30％、 约 0.5％至约 15％、 或者约 0.5％至约 5％的碱金属碳酸氢盐。
其他载体 (Miscellaneous Carriers)
该口腔护理组合物的制备中所用的水可以是低离子含量的， 没有有机杂质， 以重 量计， 可以水性组合物的约 5％至约 70％、 或者约 20％至约 50％的量存在。这些水分含量 可包括所加入的自由水， 以及其他试剂或载体引入的水。
泊洛沙姆可用于该组合物中。泊洛沙姆可归类为非离子表面活性剂。其可用作乳 化剂、 粘合剂或稳定剂， 或者履行相关功能。泊洛沙姆包括分子量为 1000 至高于 15000 的 以伯醇羟基为末端的双官能封闭聚合物。
可用于该组合物的其他乳化剂包括聚合物乳化剂。 主要为高分子量的聚丙烯酸聚 合物可用作乳化剂。
组合物中也可加入二氧化钛。二氧化钛是可使得组合物不透明的白色粉末。二氧 化钛可包含组合物重量的约 0.25％至约 5％。
该组合物的 pH 优选通过使用一种或多种缓冲剂来调节。缓冲剂指可用于在约 pH 4.0 至约 pH 10.0 范围内调节组合物 pH 的物质。缓冲剂包括磷酸单钠、 磷酸三钠、 氢氧化钠、 碳酸钠、 酸式焦磷酸钠、 柠檬酸和柠檬酸钠。以本发明组合物的重量计， 缓冲剂可以约 0.5％至约 10％的水平施用。在某些实施方案中， 洁齿剂组合物的 pH 可由 3 ∶ 1 的水性洁 齿剂浆测量， 例如 3 份水比 1 份洁齿剂。
可用于本发明组合物的其他物质包括聚二甲基硅氧烷共聚醇， 其选自烷基 - 和烷 氧基 - 聚二甲基硅氧烷共聚醇， 例如 C12 至 C20 烷基聚二甲基硅氧烷共聚醇以及其混合物。 在某些情况下， 该组合物含有十六烷基聚二甲基硅氧烷共聚醇。该聚二甲基硅氧烷共聚醇 可以约 0.01wt％至约 25wt％、 约 0.1wt％至约 5wt％或者约 0.5wt％至约 1.5wt％的水平存 在。该聚二甲基硅氧烷共聚醇可有助于提供积极的牙齿感觉益处。
其他活性剂
本发明口腔护理组合物还可包含其他活性剂， 例如抗微生物剂。这些试剂包括不 溶于水的非阳离子抗微生物剂， 例如卤化二苯醚、 酚类化合物包括苯酚及其同系物、 单和聚 烷基和芳香卤代苯酚、 间苯二酚和其衍生物、 联苯酚化合物和卤化水杨酰苯胺、 安息香酯和 卤化二苯脲。水溶性抗菌剂包括季铵盐和双 biquamide 盐， 等等。额外的水溶性抗微生物 剂是三氯生单磷酸盐。 季铵试剂包括下列那些， 即其中四元氮上一个或两个取代基具有约 8 至约 20 或者约 10 至约 18 个碳原子长的碳链 ( 通常为烷基 )， 而剩余取代基 ( 通常为烷基 或苯甲基 ) 具有较低数目的碳原子， 例如约 1 至约 7 个碳原子例如甲基或乙基。十二基三 甲基溴化铵、 氯化十四基吡啶、 度米芬、 氯化 N- 十四基 -4- 乙基吡啶、 十二基二甲基 (2- 苯 氧乙基 ) 溴化铵、 苯甲基二甲基十八基氯化铵、 氯化十六烷基呲啶、 季铵化 5- 氨基 -1， 3- 双 (2- 乙基 - 己基 )-5- 甲基 - 六氢吡啶、 氯化苯甲烃铵、 氯化苄乙氧铵和甲基氯化苄乙氧铵 是示例性季铵抗菌剂。其他化合物是双 [4-(R- 氨基 )-1- 吡啶 ] 烷烃。也可包含其他抗菌 剂， 例如甘氨酸亚铜、 甘氨酸铜、 柠檬酸锌和乳酸锌。
除了 α- 葡聚糖酶之外， 本发明口腔护理组合物还可含有一种或多种具有碳水化 合物水解活性、 抗菌活性或牙齿增白活性的其他酶。 这些酶包括但不限于 ： 脱氨酶、 酯酶、 糖 苷酶、 葡聚糖水解酶、 糊精酶、 淀粉酶、 转葡糖苷酶、 纤维素酶、 半纤维素酶、 脂肪酶、 氧化酶、 过氧化物酶、 蛋白酶和脲酶。
C. 使用方法
本发明组合物和方法的另一个方面是将牙齿表面与包含 α- 葡聚糖酶的组合物 相接触从而减少或预防牙齿损坏或者减少或预防牙齿损坏之根本原因的方法。
在一些实施方案中， 方法包括将牙齿表面与包含 α- 葡聚糖酶的组合物相接触以 水解牙齿表面上存在的糖萼。根据该实施方案， α- 葡聚糖酶的 1， 3-α-D- 葡糖苷酶活性 和 / 或 α- 葡聚糖酶的其他活性水解多糖、 葡聚糖、 甘露聚糖和 / 或菌斑细菌产生的粘性分 子， 从而减少菌斑粘附到牙齿表面的能力， 减少菌斑的形成或者降低已有菌斑的水平。 这些 多糖、 葡聚糖、 甘露聚糖和 / 或粘性分子可存在于通常称为糖萼的部分之中。
在一些实施方案中， 该方法包括将牙齿表面与包含 α- 葡聚糖酶的组合物相接触 从而通过破坏口腔中细菌所产生的多糖、 葡聚糖、 甘露聚糖和 / 或粘性分子使得牙齿表面 脱水， 由此减少膜形成或细菌附着， 和 / 或预防损伤牙齿表面的细菌酸性和其他物质的积 累。
该方法可包括将牙齿表面与一种或多种 α- 葡聚糖酶相接触， 其如上该配制。该 方法可包括将牙齿表面与额外的酶相接触， 其可存在于同一制剂或不同制剂中。在一些实施方案中， 该酶不限于 ： 脱氨酶、 酯酶、 糖苷酶、 葡聚糖水解酶、 糊精酶、 淀粉酶、 转葡糖苷酶、 纤维素酶、 半纤维素酶、 脂肪酶、 氧化酶、 过氧化物酶、 蛋白酶和脲酶。该额外的酶也可是其 他的 α- 葡聚糖酶。
牙 齿 以 及 其 他 个 人 护 理 组 合 物 和 它 们 的 作 用 机 制 详 细 描 述 于 Lad.R.( 编 辑 )“Biotechnology in Personal Care” ， Cosmetic Science andTechnology Series， 第 29 卷， Taylor and Francis Group， New York， NY， USA， 2006。该参考文献标志着现有技术 的状态， 并入本文。
除了口腔护理应用之外， 本发明组合物和方法可改造以适于在很多其他情况下预 防或除去生物膜， 例如在冷却水装置中、 在饮用水装置中、 在食品和食品加工装置中、 在医 学植入物上 ( 或内 )、 在造纸和纺织制造和加工中、 在炼油和采矿装置中、 在船舶的船体上、 在化学制造中、 在游泳池中、 水族馆中和池塘中等。在此类情况下， α- 葡聚糖酶可用于破 坏生物膜中存在的多糖成分， 从而减少微生物附着和 / 或粘着到表面。这些多糖的破坏还 导致脱水， 其减少或防止适于表面上微生物生长和繁殖的微环境的形成。
根据本公开， 本发明组合物和方法的其他方面和实施方案对于本领域技术人员来 说是显而易见的。
实验
提供下列实施例以说明本发明组合物和方法以及其益处， 并且不应将其视为对它 们范围的限制。
实施例 1、 候选真菌 α-1， 3- 葡聚糖酶 (EC 3.2.1.59) 的鉴定
一些候选真菌， 包括 Hypocea tawa、 里氏木霉、 Trichodermakonilangbra 和哈茨木 霉在含有 15％麦芽糖的限定培养基中的培养物中培养 (28℃， 7 天， 150 转 / 分钟搅拌 )。通 过除菌过滤收集上清， 浓缩并脱盐， 用于葡聚糖 ( 和右旋糖 ) 水解活性筛选。将脱盐的培养 上清 (5％体积 ) 加入 100mM 磷酸盐缓冲液 pH 6.3( 或者 100mM 醋酸盐缓冲液， pH 4.5) 中 0.2％清洗过的不溶葡聚糖。 在 37-40℃下过夜孵育反应混合物。 目视检查该混合物的不溶 葡聚糖的溶解， 通过 HPLC 分析上清的可溶性水解产物。对于 HPLC 分析， 将反应上清 10 倍 稀释进 10mM NaOH， 然后将 10μl 注入装备有电化学检测的安捷伦 1100HPLC。用 NaOH/ 乙 酸钠梯度在 PA1 阴离子交换柱上洗脱单糖和二糖。基于之前的运行标准鉴定未知混合物的 成分。来自里氏木霉、 Trichoderma konilangbra 和 Hypocrea tawa 的上清得到葡聚糖最 大程度的溶解 ( 参见例如图 2)。选择 H.tawa、 里氏木霉和 T.konilangbra 的 α-1， 3- 葡聚 糖酶用于克隆、 表达和表征。通过同源性， 鉴定基因组序列 (JGI) 中的推定里氏木霉 α-1， 3- 葡聚糖酶序列。
实施例 2. 基因组 DNA 的分离
通过在生物安全柜中将 30ml 无菌 YEG 液体培养基添加到三个 250ml 带挡板锥形 瓶制备里氏木霉、 T.konilangbra 和 H.tawa 的真菌培养物。使用无菌塑料环从每种真菌培 养物平板上切下 1x1 英寸方形并移出置于合适的培养瓶。 然后将接种的培养瓶置于 28℃摇 床孵箱， 培养过夜。
从摇床孵箱中取出里氏木霉、 T.konilangbra、 H.tawa 培养物， 将每个瓶的内容物 倒入独立的无菌 50mL Sarstedt 管。将 Sarstedt 管置于台式离心机中， 以 4,500 转 / 分钟 离心 10 分钟， 使得真菌菌丝沉淀。弃去上清， 将满接种环的每种菌丝样品转移到含裂解介质 (FastDNA) 的独立管。使用 FastDNA 试剂盒 (Qbiogene) 根据制造商针对藻类、 真菌和酵 母的方案从收获的菌丝提取基因组 DNA。匀浆时间 (Mini BeadBeater-8) 为 25 秒。基因组 DNA 的量和品质由凝胶电泳确定。
实施例 3. 通过 PCR 获得 α- 葡聚糖酶多肽
A. 里氏木霉
通过同源性鉴定里氏木霉基因组 (JGI) 中的推定 α-1， 3 葡聚糖酶基因。基于推 定同源 DNA 序列设计里氏木霉的 PCR 引物。基于推定里氏木霉蛋白质序列和其他公开的 α-1， 3 葡聚糖酶蛋白质序列设计针对 T.konilangbra 或 H.tawa 的简并 PCR 引物。
里氏木霉特异性 PCR 引物 ：
SK592 ： 5′ -CACCATGTTTGGTCTTGTCCGC(SEQ ID NO ： 6)
SK593 ： 5′ -TCAGCAGTACTGGCATGCTG(SEQ ID NO ： 7)
用于从提取自里氏木霉菌株 RL-P37 的基因组 DNA 中扩增推定 α-1， 3 葡聚糖酶的 PCR 条件如下 ： 1.94℃ 2 分钟， 2.94℃ 30 秒， 3.56℃ 30 秒， 4.72℃ 3 分钟， 5. 返回步骤 2， 共 24 个循环， 6. 一直保持 4℃。反应样品含有 2μL 的 RL-P37 基因组 DNA， 10μL 的 10X 缓冲 液， 2μL 10mMdNTP 混合物， 1μL 的 20μM 引物 SK592 和 SK593， 1μL Pfu Ultra 和 83μL 蒸馏水。 B.T.konilangbra 和 H.tawa
初始 PCR 反应使用由一些同源序列的蛋白质比对设计的简并引物。在第一 PCR 反 应中使用设计用于在 5’ 和 3’ 端附近退火的一组简并引物， 以扩增 α-1， 3 葡聚糖酶序列的 类似序列。
用于初始克隆的简并引物 ：
H.tawa 和 T.konilangbra ：
MA1F ： GTNTTYTGYCAYTTYATGAT(SEQ ID NO ： 8)
MA2F ： GTNTTYTGYCAYTTYATGATHGGNAT(SEQ ID NO ： 9)
MA4F ： GAYTAYGAYGAYGAYATGCARCG(SEQ ID NO ： 10)
MA5F ： GTRCAYTTRCAIGGICCIGGIGGRCARTANCC(SEQ ID NO ： 11)
MA6R ： YTCICCIGGNAGNGGRCANCCRTT(SEQ ID NO ： 12)
MA7R ： RCARTAYTGRCAIGCYGTYGGYGGRCARTA(SEQ ID NO ： 13)
然后将这些 PCR 反应的产物用于嵌套 PCR， 其使用设计用于在初始 PCR 片段产物内 部结合的引物， 在相同扩增条件下进行。
初始克隆的特异性引物 ：
T.konilangbra ：
TP1S ： CCCCCTGGCCAAGTATGTGT(SEQ ID NO ： 14)
TP2A ： GTACGCAAAGTTGAGCTGCT(SEQ ID NO ： 15)
TP3S ： AGCACATCGCTGATGGATAT(SEQ ID NO ： 16)
TP3A ： AAGTATACGTTGCTTCCGGC(SEQ ID NO ： 17)
TP4S ： CTGACGATCGGACTRCACGT(SEQ ID NO ： 18)
TP4A ： GGTTGTCGACGTAGAGCTGT(SEQ ID NO ： 19)
H.tawa ：
HP2A ： ACGATCGGCAGAGTCATAGG(SEQ ID NO ： 20)
HP3S ： ATCGGATTGCATGTCACGAC(SEQ ID NO ： 21)
HP3A ： TACATCCAGACCGTCACCAG(SEQ ID NO ： 22)
HP4S ： ACGTTTGCTCTTGCGGTATC(SEQ ID NO ： 23)
HP4A ： TCATTATCCCAGGCCTAAAA(SEQ ID NO ： 24)
PCR 产物的凝胶电泳用于确定是否扩增了预期大小的片段。 使用 QIAquick PCR 纯 化试剂盒 (Qiagen) 纯化预期大小的单嵌套 PCR 产物。此外， 从含有多个产物条带的琼脂糖 凝胶上切下并提取预期大小的产物， 使用 QIAquick Gel Extraction 试剂盒 (Qiagen) 进行 纯化。
实施例 4. 转化 / 分离物筛选 / 质粒提取
使用 Invitrogen Zero PCR 克隆试剂盒根据制造商的说明书 将 PCR 产物插入克隆载体。 然后， 根据制造商的建议将该载体转化进 Shot Top10 化 学感受态大肠杆菌细胞 (Invitrogen)， 铺板于含有 50ppm 卡那霉素的 LB 平板上。 将这些平 板在 37℃孵箱中孵育过夜。
为了选择含有载体和 DNA 插入物 (insert) 的转化体， 从平板上选择菌落用于质 粒粗提。将 50μL DNA 提取溶液 (100mM NaCl， 10mM EDTA， 2mM Tris pH 7) 添加到干净的 1.5mL Eppendorf 管中。在生物安全柜中， 每种 转化克隆计数、 挑取 7-10 个独立 的菌落， 并重悬于提取溶液。在化学通风橱中， 向每个样品添加 50μL 的苯酚∶氯仿∶异戊 醇， 剧烈震荡。以最高速将管微离心 5 分钟， 之后取出 20μL 顶层水层置于干净 PCR 管中。 然后加入 1μL RNase 2mg/mL， 混合样品， 在 37℃下孵育 30 分钟。然后将全部样品体积在 凝胶上电泳， 从而根据与空载体的大小差异确定 载体中插入物的存在。一旦鉴 定到转化菌落， 就将这些克隆从平板上刮下， 并将其用于接种含有 5mi LB/ 卡那霉素培养基 (0.0001％ ) 的独立 15mL 管。将培养物置于 37℃摇床孵箱过夜。
从孵箱在取出样品， 使用 Sorval 离心机以 6,000 转 / 分钟离心 6 分钟。使用 QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 (Qiagen) 和方案分离质粒 DNA， 然后对其进行消化以确定 插入物的存在。所用的限制性酶取决于插入序列中及周围存在的位点。使用凝胶电泳确定 片段大小。将合适的 DNA 样品送交测序 (Sequetech， Mountain View， CA)。
实施例 5. 克隆 3′和 5′端
对所有 DNA 片段测序。使用 Align X 和(Vector软件包， Invitrogen) 比对并比较序列以确定核苷酸和氨基酸同一性。设计了特异性引物， 以通 过从已知序列向外扩展来扩增 H.tawa 和 T.konilangbra 的每个不完全片段的 3’ 和 5’ 部 分。每个模板设计了至少三个特异性引物， 其每个嵌套于之前的引物组扩增产物内。使用 嵌套引物组利用 LA PCR 体外克隆试剂盒 (TaKaRa BIO Inc.) 进行 5′和 3′序列的扩增。
制备新鲜基因组 DNA 用于此扩增。通过用 1 平方英寸的合适产孢子真菌平板培养 物块接种 250mL 带挡板锥形瓶中 30mLYEG 液体培养基， 制备 T.konilangbra 和 H.tawa 的培 养物。锥形瓶在 28℃摇床孵箱中过夜孵育。通过在 50mL Sarstedt 管中以 4,500 转 / 分 钟离心 10 分钟收获培养物。弃去上清， 将菌丝体在 -80℃冰箱中保存过夜。然后将冷冻的 菌丝体与一些干冰块一起置于咖啡研磨机中。运行研磨机直至整个混合物具有粉末样均 一性。然后， 将粉末风干， 并转移至含有 10mL Easy-DNATM Kit 溶液 A(Invitrogen) 的无菌50mL Sarstedt 管， 遵照制造商的方案。使用 NanoDrop 光度计测定收集自提取物的基因组 DNA 浓度。
根据已知 DNA 序列内特定限制性位点的缺失选择 LA PCR 体外克隆试剂盒组， 遵照 制造商的说明。对于第一轮 PCR， 在 33.5μL 灭菌蒸馏水中稀释 1μL 连接 DNA 样品。根据 样品和预期的末端片段使用不同引物。对于 5′端， H.tawa 和 T.konilangbra 分别使用引 物 HP4A 和 TP3A， 而对于 3′端， H.tawa 和 T.konilangbra 使用引物 HP4S 和 TP3S。 通过加入 34.5μL 稀释的连接 DNA 溶液、 5μL 10X LA Buffer II(Mg+2)、 8μL dNTP 混合物、 1μL 盒 引物 I、 1μL 特异性引物 I( 根据样品和末端片段 ) 和 0.5μLTaKaRa LA Taq 来制备 PCR 混 合物。 然后将 PCR 管置于热循环仪， 遵照下列方案 ： 1.94℃ 10 分钟， 2.94℃ 30 秒， 3.55℃ 30 秒， 4.72℃ 4 分钟， 返回到步骤 2.30 个循环， 4℃持续。
取 1μL 第一 PCR 反应物并将样品在无菌蒸馏水中以 1/10,000 的倍数稀释进行第 二 PCR 反应。 使用嵌套于第一扩增区域中的第二组引物扩增第一 PCR 反应物中分离的片段。 分别使用引物 HP3A 和 TP4A 向 H.tawa 和 T.konilangbra 的 5’ 端扩增， 而使用引物 HP3S 和 TP4S 向 3’ 端扩增。将稀释的 DNA 添加到含有 33.5μL 无菌蒸馏水、 5μL 10X LA Buffer II(Mg+2)、 8μL dNTP 混合物、 1μL 表达盒引物 2、 1μL 特异性引物 2( 根据样品盒片段末 端 )、 0.5μL TaKaRa LA Taq 的 PCR 反应物， 在进行 PCR 之前充分混合。PCR 方案与第一反 应相同， 唯一不同在于最初 94℃ 10 分钟。 在反应完成之后， 对样品进行凝胶电泳， 以确定所 分离片段的大小和数量。如果存在单条带， 则纯化样品并送交测序。如果未分离到片段， 则 使用之前针对嵌套 PCR 反应的方案进行第三 PCR 反应。扩增片段凝胶电泳之后， 切下最亮 的条带， 纯化并送交测序。
实施例 6. 序列比对的分析
获得序列并使用 Vector NTI 软件包 ( 包括 Align X 和 ContigExpress) 进行分析。 将各个末端片段序列与之前获得的 H.tawa 和 T.konilangbra 片段相比对， 以获得完整基因 的序列。与哈茨木霉和里氏木霉序列的核苷酸比对显示 H.tawa 和 T.konilangbra 中目的 基因的翻译起点和终点。鉴定完整基因序列之后， 设计特异性引物从基因组 DNA 扩增完整 基因。根据之前所述设计引物， 唯一不同的是在翻译起始位点之前添加 CACC 核苷酸序列， 用于
克隆 (Invitrogen)。 最终克隆的引物 ： T.konilangbra ：T1FS ： caccatgctaggcattctccg(SEQ ID NO ： 25)
T1FA ： tcagcagtattggcatgccg(SEQ ID NO ： 26)
H.tawa ：
H1FS ： CACCATGTTGGGCGTTTTTCG(SEQ ID NO ： 27)
H1FA ： CTAGCAGTATTGRCATGCCG(SEQ ID NO ： 28)
如上所述进行 PCR 方案， 唯一例外是退火温度改变为 55℃。通过凝胶电泳分离并 查看到单条带后， 如上所述纯化所扩增的片段， 根据制造商的说明用于 pENTR/D (Invitrogen) 转化。 然后， 如上所述转化化学感受态大肠杆菌， 转移到含有 50ppm 卡那霉素 的 LB 平板。37℃过夜孵育之后， 按照如前所述在粗提 DNA 和质粒大小分析之后， 选择含有 质粒和插入物的转化体。从平板上刮下所选的转化体， 并用于接种含有 5mlLB/ 卡那霉素培养基 (0.0001％ ) 的新鲜 15mL 管。将培养物置于 37℃摇床孵箱过夜。离心收获细胞， 如前 所述提取质粒 DNA。消化质粒 DNA， 以确认插入序列的存在， 然后送交测序。根据制造商的 说明， 使用 LR 克隆酶反应 (Gateway Cloning， Invitrogen)， 从而将插入物从 pENTR/D 载体 定向转移到终点载体。终点载体设计用于在里氏木霉中表达 CBH1 启动子和终止子控制下 的目的基因， 用黑曲霉乙酰胺酶进行选择。
实施例 7. 生物射弹转化
将 里 氏 木 霉 孢 子 悬 液 涂 在 乙 酰 胺 酶 转 化 平 板 的 ～ 6cm 直 径 中 央 (150μL 5x107-5x108 孢 子 /mL 悬 液 )。 然 后， 在 生 物 安 全 柜 中 风 干 平 板。 将 终 止 屏 (BioRad 165-2336) 和 大 载 体 架 (macrocarrier holder)(BioRad1652322) 浸 在 70 ％ 乙 醇 中， 风 干。将 DriRite 干燥剂置于小 Petri 平皿 (6cmPyrex)， 覆盖上 Whatman 滤纸。含有大载体 (BioRad 165-2335) 的大载体架平置于滤纸上， 盖上 Petri 平皿盖。
通过将 60mg 钨 M-10 颗粒 ( 微载体， 0.7 微米， BioRad#1652266) 置于 Eppendorf 管制备钨颗粒悬液。 加入 1mL 乙醇 (100％ )。 在乙醇溶液中涡旋混匀钨， 使之浸泡 15 分钟。 以最高速快速微离心 Eppendorf 管， 使钨沉淀。倒出乙醇， 用无菌蒸馏水清洗三遍。第三遍 将清洗用水倒出， 将钨重悬于 1mL 的无菌 50％甘油。
对于每个转化， 通过将 25μL 悬浮的钨添加到 1.5mL Eppendorf 管制备转化反应。 依次添加后续添加物 ： 2μL DNA pTrex3g 表达载体、 25μL2.5M CaCl2、 10μL 0.1M 亚精胺。 继续涡旋反应物 5-10 分钟， 保持钨悬浮。短暂微离心 Eppendorf 管， 倒出。用 200μL 70％ 乙醇洗涤钨沉淀， 短暂微离心， 形成沉淀并倒出。用 200μL 100％醇洗涤沉淀， 短暂微离心 形成沉淀， 并倒出。将钨沉淀重悬于 24μL 100％醇。将 Eppendorf 管置于超声水浴 15 秒， 将 8μL 等分试样转移到变干的大载体中央。使大载体在变干的 Petri 平皿中风干。
将 氦 气 瓶 打 开 至 1500psi。 在 Model PDS-1000/He 生 物 射 弹 颗 粒 递 送 系 统 (BioRad) 中使用 1100psi 保险片 (rupture disc)(BioRad 165-2329)。当钨溶液干燥时， 将终止屏和大载体架插入到 PDS-1000 中。将含有靶标里氏木霉孢子的乙酰胺酶平板置于 终止屏下方 6cm。在腔室中产生并保持 29 英寸 Hg 的真空。开启 He 生物射弹颗粒递送系 统。将腔室放气， 取出乙酰胺酶平板， 在 28℃下孵育， 直至出现菌落 (5 天 )。
改进 amdS 生物射弹琼脂 (MABA) 每升
部分 I， 在 500ml dH2O 中制备
1000x 盐 1ml
Noble 琼脂 20g
pH to 6.0， 高压灭菌
部分 II， 在 500ml dH2O 中制备
乙酰胺 0.6g
CsCl 1.68g
葡萄糖 20g
KH2PO4 15g
MgSO4·7H2O 0.6g
CaCl2·2H2O 0.6g
调节 pH 至 4.5， 0.2 微米过滤灭菌 ； 置于 50℃烘箱使之加温， 添加琼脂， 混合， 倾倒平板。保存于室温。
1000x 盐 每升
FeSO4·7H2O 5g
MnSO4·H2O 1.6g
ZnSO4·7H2O 1.4g
Cocl2·6H2O 1g
添加至 1L 去离子 H2O。
0.2 微米过滤灭菌
实施例 8. 里氏木霉转化体的 α-1， 3 葡聚糖酶的表达
使用 1cm2 琼脂栓 (plug) 接种 Proflo 接种培养基。 以 200 转份钟摇动在 28℃下孵 育培养物。第二天， 将 10％无菌转移到生产培养基。以 200 转 / 分钟摇动在 28℃下孵育培 养物。第三天， 离心收获培养物。将上清除菌过滤 (0.2μm PES) 并保存于 4℃。SDS-PAGE 的分析鉴定表达各个 α- 葡聚糖酶基因的克隆。
实施例 9. 不溶葡聚糖基质 (substrate) 的制备
用来自 BHI 平板的茸毛链球菌 (Streptococcus sobrinus)(ATCC27607) 接种四个 含有 BHI( 脑心灌注液 ) 液体培养基的无菌烧瓶。培养物在 37℃下静置孵育 24 小时， 之后 可见浑浊。离心收获上清 ( 含有茸毛链球菌葡糖基转移酶 )(15 分钟， 10,000 转 / 分钟 )。 汇集上清， 除菌过滤 (0.22μm) 以除去任何剩余的细胞。在无菌情况下， 添加蔗糖至终浓度 5％， 其诱导葡糖基转移酶产生葡聚糖聚合物。将培养上清与蔗糖密封、 混合并保存于 37℃ 孵箱 24-48 小时 ( 静置 )。形成茸毛样沉淀， 通过离心收获 (10,000 转 / 分钟， 15 分钟 )。 倒出上清， 留下沉淀， 用去离子水清洗三遍， 最后置于配衡 Eppendorf 管。在 SpeedVac 干燥 葡聚糖， 干燥后记录 Eppendorf 的重量。
实施例 10. 用于检测克隆 α- 葡聚糖酶活性的 PAHBAH 还原糖测定
用以下列出的量， 将转化的里氏木霉培养上清、 缓冲液和不溶葡聚糖分配于圆底 96- 孔平板。使用两种类型缓冲液 (pH 4.5 和 pH 6.0) 比较活性水平。分配样品后， 密封 96 孔平板， 将其置于摇动 37℃孵箱过夜。
葡聚糖水解混合物 ：
50μL 培养上清
50μL 28mg/mL 葡聚糖溶液
5μL 1M 柠檬酸缓冲液 (pH 4.5 或 6.0)
105μL
PAHBAH 溶液 ：
0.5g 酒石酸钠钾
0.15g 对羟基苯甲酸酰肼 (PAHBAH)
10mL 2％ NaOH
本申请要求 2008 年 4 月 11 日提交的美国临时专利申请序列号 No.61/044,316 的 优先权， 其以其整体引入作为参考。
背景技术
齿斑的形成导致龋齿、 牙龈炎症、 牙周病以及最终导致牙齿损失。齿斑是细菌、 上 皮细胞、 白细胞、 巨噬细胞及其他口腔分泌液的混合物。细菌产生高度分枝的多糖 (highly branched polysaccharides)， 其与来自口腔的微生物一起形成齿斑继续增殖的粘性基质。
随着齿斑继续积累， 出现石头一样硬的白色或浅黄色沉积物。这些沉积物称为钙 斑、 牙石或牙垢， 其在唾液中由菌斑 (plaque) 和矿物例如钙形成。
对预防和 / 或减少齿斑以及相关牙齿损坏的新方法有着持续的需要。 发明内容 一方面， 提供了分离的 α- 葡聚糖酶， 包含下述氨基酸序列， 即 (a) 与天然 Hypocea tawa 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 1 的 38-635 位氨基酸残基 ) 有至少 99％同一性 ； 或者 (b) 与 Trichoderma konilangbra 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸残基 ) 有至少 85％同一性。
另一个方面中， 提供了编码本发明 α- 葡聚糖酶的分离多核苷酸以及含有该分离 多核苷酸的重组核酸。还提供了含有该重组核酸的载体和宿主细胞。
在另一个方面中， 提供了细胞培养物。 在一些实施方式中， 该细胞培养物含有生长 培养基和上述宿主细胞的群体。细胞培养物可用于提供在适于分离的 α- 葡聚糖酶产生的 条件下维持细胞培养物以产生本发明的 α- 葡聚糖酶。如果 α- 葡聚糖酶是分泌的， 这可 从生长培养基中收获。
在另一个方面中， 提供了产生蛋白质的方法， 其包括在适于分离的 α- 葡聚糖酶 产生的条件下维持如上细胞的培养物。在一些实施方式中， 该方法还包括从生长培养基中 收获 α- 葡聚糖酶。
另一个方面中， 提供了方法， 其包括接受选自以下的分离的 α- 葡聚糖酶 ： (a) 具有与成熟 Hypocea tawa 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 1 的 38-635 位氨基酸残基 ) 有 至少 99 ％同一性的氨基酸序列的 α- 葡聚糖酶 ； (b) 具有与成熟里氏木霉 (Trichoderma reesei) 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸残基 ) 有至少 85％同一性的氨 基酸序列的 α- 葡聚糖酶 ； 或者 (c) 具有与成熟 Trichoderma konilangbra 的 α- 葡聚糖 酶 (SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸残基 ) 有至少 85％同一性的氨基酸序列的 α- 葡聚 糖酶 ； 以及将该分离的 α- 葡聚糖酶与口腔可接受的赋形剂混合， 以制备口腔护理组合物。 在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶不同于里氏木霉的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸残基 )。在一些实施方式中， 该方法还包括包装该口腔护理组合物。
在另一个方面中， 提供口腔护理组合物， 其包含 (a) 口腔可接受的赋形剂 ； 和 (b)
另一个方面中， 提供了编码本发明 α- 葡聚糖酶的分离多核苷酸以及含有该分离 多核苷酸的重组核酸。还提供了含有该重组核酸的载体和宿主细胞。
在另一个方面中， 提供了细胞培养物。 在一些实施方式中， 该细胞培养物含有生长 培养基和上述宿主细胞的群体。细胞培养物可用于提供在适于分离的 α- 葡聚糖酶产生的 条件下维持细胞培养物以产生本发明的 α- 葡聚糖酶。如果 α- 葡聚糖酶是分泌的， 这可 从生长培养基中收获。
在另一个方面中， 提供了产生蛋白质的方法， 其包括在适于分离的 α- 葡聚糖酶 产生的条件下维持如上细胞的培养物。在一些实施方式中， 该方法还包括从生长培养基中 收获 α- 葡聚糖酶。
另一个方面中， 提供了方法， 其包括接受选自以下的分离的 α- 葡聚糖酶 ： (a) 具有与成熟 Hypocea tawa 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 1 的 38-635 位氨基酸残基 ) 有 至少 99 ％同一性的氨基酸序列的 α- 葡聚糖酶 ； (b) 具有与成熟里氏木霉 (Trichoderma reesei) 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸残基 ) 有至少 85％同一性的氨 基酸序列的 α- 葡聚糖酶 ； 或者 (c) 具有与成熟 Trichoderma konilangbra 的 α- 葡聚糖 酶 (SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸残基 ) 有至少 85％同一性的氨基酸序列的 α- 葡聚 糖酶 ； 以及将该分离的 α- 葡聚糖酶与口腔可接受的赋形剂混合， 以制备口腔护理组合物。 在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶不同于里氏木霉的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸残基 )。在一些实施方式中， 该方法还包括包装该口腔护理组合物。
在另一个方面中， 提供口腔护理组合物， 其包含 (a) 口腔可接受的赋形剂 ； 和 (b)
分离的 α- 葡聚糖酶。
在一个相关方面中， 提供了口腔护理组合物， 其包含 ： 口腔可接受赋形剂和选自下 列的分离的 α- 葡聚糖酶 ： (a) 具有与成熟 Hypocea tawa 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 1的 38-635 位氨基酸残基 ) 有至少 99％同一性的氨基酸序列的 α- 葡聚糖酶 ； (b) 具有与成熟 里氏木霉的 α- 葡聚糖酶 (SEQID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸残基 ) 有至少 85％同一性的氨 基酸序列的 α- 葡聚糖酶 ； 或者 (c) 具有与成熟 Trichoderma konilangbra 的 α- 葡聚糖 酶 (SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸残基 ) 有至少 85％同一性的氨基酸序列的 α- 葡聚 糖酶。在一些实施方式中， 该 α- 葡聚糖酶不同于里氏木霉的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸残基 )。
在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶以组合物重量的 0.0001％至 5％的浓度存在于 该组合物中。
在一些实施方式中， 该口腔护理组合物还包含第二种酶。 在特定实施方案中， 该第 二种酶是脱氨酶、 酯酶、 糖苷酶、 脂肪酶、 氧化酶、 过氧化物酶、 蛋白酶、 脲酶或纤维素酶。
在一些实施方式中， 该组合物配制成牙膏， 尽管预见了其他的口腔护理制剂。 在一 些实施方式中， 该组合物例如包含增稠剂、 表面活性剂、 湿润剂和研磨剂中的至少一种。
在另一个方面中， 提供了方法， 其中接受分离的 α- 葡聚糖酶， 然后提供与口腔可 接受的赋形剂混合以制备口腔护理组合物。该口腔护理组合物可以包装。
在另一个方面中， 提供了包括在适于 α- 葡聚糖酶活性的条件下将本发明口腔护 理组合物与牙齿相接触的方法。该接触可以使用例如牙刷进行。在特定情况下， 该方法导 致对齿斑的预防和 / 或减少。 附图说明
图 1 显 示 来 自 Hypocea tawa(SEQ ID NO ： 1)、里 氏 木 霉 (SEQ IDNO ： 2) ； Trichoderma konilangbra(SEQ ID NO ： 3) 和哈茨木霉 (T.harzianum)(SEQ ID NO ： 4) 的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列比对， 以及基于比对的共有序列 (SEQ ID NO ： 5)。显示 α- 葡聚 糖酶的多个特征， 例如信号序列、 催化结构域、 接头结构域以及葡聚糖结合结构域。
图 2 汇总与多种无细胞培养溶液过夜孵育后获得的不溶葡聚糖水解物的 HPLC 分 析结果的表格。
图 3 显 示 在 pH4.5 和 pH6.0 的 来 自 表 达 里 氏 木 霉 (T.reesei)、 H.tawa 和 T.konilangbra 的推定 α-1， 3- 葡聚糖酶的里氏木霉培养物的上清的活性。天然 α- 葡聚 糖酶在宿主菌株中未检测到。葡聚糖水解反应物根据培养体积而不是蛋白质含量上样。
定义
除非本文中另有说明， 否则所有技术和科学术语应为本领域中常规的含义。为清 楚起见定义以下术语。其他定义可出现在本说明书的其他地方。
本文所用的术语 “α- 葡聚糖酶” 指水解多糖中 1， 3-α-D- 糖苷键的酶。本文所 述的 α- 葡聚糖酶具有根据 IUBMB 酶命名法的 EC 3.2.1.59 的活性， 可水解不溶的葡聚糖。 α- 葡聚糖酶的系统命名为 1， 3(1， 3； 1， 4)-α-D- 葡聚糖 3- 葡聚糖水解酶。在某些出版物 中， 此酶可能称为 1， 3-α- 葡聚糖酶。注意， 本发明的酶可具有除 1， 3-α-D- 糖苷活性之外 的其他活性， 包括但不限于 1， 2-α-D- 糖苷活性。本文所用的术语 “口腔护理组合物” 指成分混合物， 在常规使用过程中其不是供有 意吞咽从而全身性施用特定治疗剂， 而是保留在口腔中足够的时间以接触牙齿表面和 / 或 口腔组织， 用以递送对口腔活性有益的试剂。口腔组合物可以是牙膏、 洁齿剂、 牙粉、 牙凝 胶、 龈下凝胶、 漱口水、 假牙产品、 口喷雾、 锭剂、 口腔片剂、 口香糖等等的形式。口腔组合物 还可以合并在条或膜上， 用以直接施用或粘贴在口腔表面。
除非另作说明， 术语 “洁齿剂” 指膏剂、 凝胶、 固体或液体的口腔护理组合物制剂。 洁齿剂的实例有牙膏、 牙齿凝胶和牙粉。洁齿剂可以是单相组合物或者可以是两种或更多 种分开的组合物的组合。 洁齿剂可以是任何期望的形式， 例如深条纹、 表面条纹、 多层、 具有 包围膏剂的凝胶或者其任何组合。 包含两种或更多种分开的组合物的洁齿剂中的每种组合 物可以包含于分配器中物理上分开的区室中并且并行分配。
本文使用的术语 “口腔科接受载体” 指用于口腔护理组合物中的安全且有效的物 质。这些物质包括氟离子来源、 抗钙物质、 缓冲剂、 研磨抛光物质、 过氧化物来源、 碱金属碳 酸氢盐、 增稠物质、 湿润剂、 水、 表面活性剂、 二氧化钛、 调味体系、 甜味剂、 木糖醇、 着色剂及 其混合物。
本文使用的术语 “牙齿” 或 “牙” 指天然牙齿以及假牙或牙科假体。 本文使用的术语 “牙 釉 质”指 通 常 可 见 并 且 主 要 由 包 括 羟 基 磷 灰 石 (hydroxylapatite) 的矿物质构成的牙齿部分。牙釉质涵盖人和动物牙齿中的天然牙釉质 以及用于替代受损或脱落的牙齿部分的牙釉质样物质， 包括用于此目的的树脂和瓷。
本文使用的术语 “牙石” 和 “牙垢” 可互换地用于表示矿化齿斑沉积物。
本文使用的术语 “糖萼” 指一些细菌、 上皮细胞以及其他细胞产生的细胞外聚合 物， 其在牙齿表面上形成包被， 并作为菌斑附着的基质。
本文使用的术语 “菌 斑”表 示 在 牙 齿 表 面 上 形 成 的 生 物 膜。 形 成 生 物 膜 的 微 生 物 主 要是 细菌， 包括但不限 于变 形链球菌 (Streptococcus mutans)、 厌氧链 球 菌 (Streptococcus anaerobes)、 梭杆菌属物种 (Fusobacterium spp.) 和放线杆菌属物种 (Actinobacteria spp.)。菌斑可以在糖萼上形成， 由其支持或者是其一部分。
齿斑中存在的微生物全部是口腔中天然存在的， 通常是无害的。 但是， 通过定期刷 牙无法除去菌斑意味着使得它们形成厚层。最靠近牙齿表面的那些微生物变为厌氧呼吸 ； 在此状态下它们开始产生酸。
本文使用的术语 “重组的” 指野生型宿主细胞中不存在、 不分泌或者表达模式改变 的多核苷酸或多肽。重组多肽和多核苷酸分别具有不同于野生型序列的序列， 具有不同于 野生型多肽和多核苷酸的时间或空间表达模式， 和 / 或以不同于野生型多肽和多核苷酸的 水平表达。重组分子可含有两种或多种以非天然发生的方式连接在一起的天然序列。重组 细胞含有重组多核苷酸或重组多肽。
本文使用的术语 “异源” 指彼此通常不相连的元件。例如， 如果宿主细胞产生异源 蛋白， 该宿主细胞中通常不产生该蛋白质。 同样地， 有效连接异源编码序列的启动子是有效 连接在野生型宿主细胞中其通常不有效连接的编码序列的启动子。 针对多核苷酸或蛋白质 的， 术语 “同源的” 表示宿主细胞中天然的多核苷酸或蛋白质。
本文使用的术语 “蛋白质” 和 “多肽” 可互换地用于表示肽键相连的氨基酸链。除 非另作说明， 多肽以标准的 N 端至 C 端的方向书写。
本文使用的 “信号序列” 是蛋白质的 N 端部分存在的氨基酸序列， 其有助于成熟形 式的蛋白质分泌出细胞。 信号序列的定义是功能性的， 尽管许多信号序列的结构是已知。 成 熟形式的细胞外蛋白质缺乏信号序列， 其在分泌过程中被切割掉了。
本文使用的 “编码序列” 是编码多肽的 DNA 部分。
本文使用的术语 “核酸” 涵盖 DNA、 RNA、 杂化物以及合成或化学修饰的核酸， 不论是 单链还是双链。术语 “核酸” 和 “多核苷酸” 可互换地用于表示由磷酸二酯、 硫酸二酯或类 似键连接的核苷链。除非另作说明， 多核苷酸以标准的 5′至 3′的方向书写。
本文使用的 “载体” 指设计用以将核酸引入一个或多个宿主细胞的多核苷酸。载 体可在不同宿主细胞中自主复制， 包括 ： 克隆载体、 表达载体、 穿梭载体、 质粒、 噬菌体颗粒、 表达盒等。
本文使用的 “表达载体” 指包含蛋白质编码区域的 DNA 构建物， 该编码区域与能够 实现蛋白质在合适宿主细胞中表达的合适控制序列有效连接。 这些控制序列可包括实现转 录的启动子、 控制转录产生 mRNA 的任选操纵子序列、 编码 mRNA 上合适核糖体结合位点的序 列以及增强子和控制转录和翻译终止的其他序列。
本文使用的 “启动子” 是引发下游核酸转录的调节序列。 本文使用的术语 “有效连接” 指允许元件以所述形式或表观形式发挥功能的元件 排列。例如， 如果启动子控制编码序列的转录， 则启动子与编码序列有效连接。
本文使用的术语 “选择性 / 选择标记” 指能够在宿主中表达的蛋白质， 其使得易于 选择含有引入核酸或载体的那些细胞。 选择标记的实例包括但不限于赋予抗微生物抗性的 蛋白质 ( 例如潮霉素、 博来霉素或氯霉素 ) 和 / 或赋予代谢优势的基因， 例如对于宿主细胞 的营养优势。
本文使用的术语 “来源于” 涵盖术语 “来自” 、 “获自” 或者 “可获自” 以及 “分离自” 。
本文使用的 “非致病” 生物体是指对人来说非病原性 ( 即， 疾病或造成疾病的 ) 的 生物体。
本文使用的术语 “回收的” 、 “分离的” 和 “分开的” 指从与其天然相关联的至少一 种组分中移出的蛋白质、 细胞、 核酸或氨基酸。
本文使用的术语 “转化的” 、 “稳定转化的” 和 “转基因的” 在针对细胞使用时表示 该细胞具有非天然 ( 例如异源 ) 核酸序列， 其整合进其基因组或者作为附加体质粒维持多 代。
本文使用的术语 “表达” 指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转 录和翻译。
在将核酸序列插入细胞内的背景中， 本文使用的术语 “引入” 表示 “转染” 或 “转化” 或 “转导” ， 包括核酸序列并入真核或原核细胞， 其中该核酸序列可并入细胞的基因组 ( 例 如染色体、 质粒、 质体或线粒体 DNA)， 转化为自主复制子或者瞬时表达 ( 例如转染的 mRNA)。
本文使用的术语 “相容的” 表示特定组合物的成分能够合并 ( 混合 )， 而没有显著 降低组合物中成分稳定性和 / 或效力的相互作用。
本文使用的术语 “锭剂” 包括但不限于 ： 薄荷糖、 锭剂、 软锭剂、 微胶囊和快速溶解 固体形式， 包括冻干形式 ( 饼、 薄片、 薄膜、 片剂 ) 和压制片剂。
本文使用的术语 “快速溶解的固体形式” 表示该固体剂型置于口腔或者含有牙科
假体的容器中后在小于约 60 秒、 小于约 15 秒、 或者小于约 5 秒内溶解的固体剂型。
数值范围涵盖定义其范围的数值。除非另作说明， 本文中使用的所有百分比和比 值是基于具体口腔组合物的重量， 而不是所递送的整个口腔制剂的重量。除非另作说明或 由上下文推知， 没有数词修饰的形式包括了复数形式。
为了便于阅读提供标题， 而不应视为限制。 除非另作说明或由上下文推知， 一个标 题下面所包括的说明一般作为整体适用于全文。
描述了示例性材料和方法， 但是其他方法和材料可得到类似的或等同的结果。所 有专利和公开， 包括这些专利和公开中公开的所有序列， 通过引用明确地并入本文。 具体实施方式
描述了关于具有 α- 葡聚糖酶活性的多肽的组合物和方法。该组合物和方法可用 于降低或预防菌斑的形成， 降低或预防促进形成菌斑的根本生理情况。
A. 多肽、 多核苷酸和宿主细胞
本发明组合物和方法的一个方面涉及分离的 α- 葡聚糖酶。在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶包含与成熟 Hypocea tawa 的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1的 38-635 位氨基酸残基 ) 具有至少 98％同一性 ( 例如至少 99％或 99.5％同一性 ) 的氨基 酸序列。在具体实施方案中， α- 葡聚糖酶包含成熟 H.tawa 的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1 的 38-635 位氨基酸残基 )。 在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶包含与成熟 Trichoderma konilangbra 的 α- 葡 聚糖酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸 ) 有至少 85％同一性 ( 例如至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性 ) 的氨基酸序列。 在具 体实施方案中， α- 葡聚糖酶包含成熟 T.konilangbra 的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸残基 )。
在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶包含与成熟里氏木霉的 α- 葡聚糖酶的氨基酸 序列 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸 ) 有至少 85％同一性 ( 例如至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性 ) 的氨基酸序列。在具体实施方案中， α- 葡聚糖酶包含不同于成熟里氏木霉的 α- 葡聚糖酶氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸 ) 的氨基酸序列。
在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶类似于但不同于野生型 α- 葡聚糖酶。例如， 在 一些实施方式中， α- 葡聚糖酶具有与成熟 H.tawa 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 1 的 38-635 位氨基酸残基 ) 有至少 98％同一性但是不相同的氨基酸序列。 同样地， 在某些实施方案中， α- 葡聚糖酶可具有与成熟里氏木霉或者 T.konilangbra 的 α- 葡聚糖酶 ( 分别为 SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸或者 SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸 ) 有至少 85％同一性但是 不相同的氨基酸序列。
已知有超过 50 种不同的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列， 并保存于 NCBI 的 Genbank 数 据库， 包括来自黑曲霉 (Aspergillus niger)( 登录号 ： XP_001390909.1 ； GID ： 145236523)、 产 紫 青 霉 (Penicillium purpurogenum)( 登 录 号 ： AAF27912.1 ； GID ： 6752866)、 构巢裸 胞 壳 (Emericella nidulans)( 登 录 号 ： CAC48025.1 ； GID ： 15072711) 和 新 型 隐 球 酵 母 (Cryptococcusneoformans)( 登录号 ： AAW47079.1 ； GID ： 57230770) 的那些。以本专利申请
的最早提交日， 这些 Genbank 登录内容以其整体引入作为参考， 包括其中的核酸和蛋白质 序列以及这些序列的注释。描述 α- 葡聚糖酶中保守的结构域的条目存放于 NCBI 的保守 结构域数据库中的 pfam03659(Marchler-Bauer 等人 CDD ： a conserved domain database for interactivedomain family analysis.(2007)Nucleic Acids Res.35 ： D237-40)。来 自裂殖酵母 (S.pombe) 的 α- 葡聚糖酶的序列以及 α- 葡聚糖酶结构的讨论见于 Fuglsang 等人 ((2000)J.Biol.Chem.275 ： 2009-18)。
可 得 到 对 于 下 列 的 指 导， 即 可 改 变 氨 基 酸 以 产 生 H.tawa、 里氏木霉和 T.konilangbra 的野生型 α- 葡聚糖酶保留 α- 葡聚糖酶活性的变体， 例如， 通过比对这 些 α- 葡聚糖酶蛋白质的氨基酸序列， 鉴定在蛋白质中相同位置而蛋白质之间不同的氨 基酸， 以及将这些氨基酸从一个蛋白质转移到另一个。示例性序列对比显示于图 1， 以及 Fuglsang 等人 ( 见上文 )。
变体多肽可包含保守氨基酸取代， 其保留所取代氨基酸的总电荷、 疏水性 / 亲水 性和 / 或空间体积， 同时赋予该多肽其他有益生物化学性质。保守取代的非限制性实例包 括下列组之间的取代 ： Gly/Ala、 Val/Ile/Leu、 Lys/Arg、 Asn/Gln、 Glu/Asp、 Ser/Cys/Thr 和 Phe/Trp/Tyr。这些及其他保守取代显示于下表。
或者， 该氨基酸取代不是保守的， 其改变所取代氨基酸的总电荷、 疏水性 / 亲水性 和 / 或空间体积。
评价 α- 葡聚糖酶活性的测定描述于多个出版物， 包括 ： Fuglsang 等人 (supra)， Inoue 等人 ((1988)Carbohydr.Res.182 ： 277-86)， Ait-Lahsen 等人 ((2001)Appl.Environ. Microbiol.67 ： 5833-9)， 和 Sumitomo 等人 ((2007)Biochim.Biophys.Acta.1770 ： 716-24)。
还提供了编码该 α- 葡聚糖酶的分离多核苷酸， 以及含有该分离多核苷酸的重组 核酸。假定遗传密码已知， 可基于氨基酸序列容易地设计这些多核苷酸。在一个实施方案 中， 分离多核苷酸具有与下列核苷酸序列有至少 70 ％同一性 ( 例如至少 80 ％同一性、 至 少 90％同一性、 至少 95％同一性、 至少 98％同一性 ) 或者可在严格条件下杂交的核苷酸序 列， 该下列核苷酸序列即野生型 H.tawa 的 α- 葡聚糖酶基因或其编码序列 ( 例如分别为 SEQID NO ： 29 和 30)、 野生型里氏木霉的 α- 葡聚糖酶基因或其编码序列 ( 例如分别为 SEQ ID NO ： 31 和 32)、 或者野生型 T.konilangbra 的 α- 葡聚糖酶基因或其编码序列 ( 例如分 别为 SEQ ID NO ： 33 和 34)。在某些实施方案中， α- 葡聚糖酶的编码序列针对在所用宿主 细胞中表达 α- 葡聚糖酶经密码子优化。因为密码子使用表格列出了许多宿主细胞中每个 密码子的使用， 包括里氏木霉和多种其他酵母和细菌宿主细胞， 是本领域中已知的 ( 参见 例如 Nakamura 等人 (2000)Nucl.Acids Res.28 ： 292) 或者易于得到的， 只要有要待表达的 α- 葡聚糖酶氨基酸序列， 可容易地设计这些核酸。
还提供了含有重组核酸的表达载体和宿主细胞。在某些实施方案中， 宿主细胞是 细菌 ( 例如芽孢杆菌属物种 (Bacillus sp.) 或链霉菌属物种 (Streptomyces sp.) 宿主细 胞 ) 或者丝状真菌宿主细胞， 在某些情况下， 可以是不致病的， 即对人来说不致病的。在某 些实施方案中， 细胞可以是 FDA 认为是 GRAS 状态的 ( 即公认安全的 (Generally Recognized as Safe)) 具有用于生产蛋白质历史的丝状真菌菌株的细胞。
在 具 体 实 施 方 案 中， 本发明的真菌细胞可以是下列物种的细胞 ： 木霉属 (Trichoderma)( 例如里氏木霉 ( 之前归类为长梗木霉 (T.longibrachiatum)， 目前也称为 Hypocea jecorina)、 绿色木霉 (Trichodermaviride)、 康宁木霉 (Trichoderma koningii) 和 哈 茨 木 霉 (Trichodermaharzianum))、 青 霉 属 物 种 (Penicillium spp.)、 腐质霉属物 种 (Humicolaspp.)( 例 如 Humicola insolens 和 灰 腐 质 霉 (Humicola grisea))、 金孢 霉 属 物 种 (Chrysosporium spp.)( 例 如 C.lucknowense)、 粘 帚 霉 属 物 种 (Gliocladium spp.)、 曲 霉 菌 属 物 种 (Aspergillus spp.)( 例 如 米 曲 霉 (Aspergillus oryzae)、 黑曲 霉 (Aspergillus niger)、 构 巢 曲 霉 (Aspergillusnidulans)、 河 内 曲 霉 (Aspergillus
kawachi)、 棘 孢 曲 霉 (Aspergillusaculeatus)、 日 本 曲 霉 (Aspergillus japonicus)、 酱 油 曲 霉 (Aspergillus sojae) 和 泡 盛 曲 霉 (Aspergillus awamori) 和 镰 孢 霉 属 物 种 (Fusarium spp.)， 脉孢菌属物种 (Neurospora spp.)、 肉座菌属物种 (Hypocea spp.) 或者 裸孢壳属物种 (Emericella spp.)( 另外参见 Innis 等人 (1985)Science228 ： 21-26) 等等。 在一些实施方案中， 本发明的真菌细胞可以是黑曲霉菌株， 包括 ATCC 22342、 ATCC 44733、 ATCC 14331 以及来源于其的菌株。在一些实施方式中， 宿主细胞可以是其中天然基因已缺 失或失活的细胞。例如， 对应于蛋白酶基因的基因或者对应于纤维素酶基因的基因可缺失 或失活。
上述核酸可以存在于宿主细胞核基因组中或者可以存在于在宿主细胞中复制的 质粒中， 例如， 瞬时表达载体、 穿梭载体、 人工染色体等。
在具体实施方案中， α- 葡聚糖酶可以通过在真菌宿主细胞中表达融合蛋白质产 生， 该融合蛋白质含有与 α- 葡聚糖酶有效连接的信号序列。在此类实施方案中， α- 葡 聚糖酶可以分泌进培养基， 在其中其可被收获。融合蛋白质的信号序列可以是任何利于蛋 白质分泌出宿主细胞的信号序列。所用的信号序列可以是宿主细胞内源的或非内源， 在某 些实施方案中， 可以是已知高度分泌出木霉属物种或曲霉属物种宿主细胞的蛋白质信号序 列。这些信号序列包括但不限于 ： 纤维二糖水解酶 I、 纤维二糖水解酶 II、 内切葡聚糖酶 I、 内切葡聚糖酶 II、 内切葡聚糖酶 III、 α- 淀粉酶、 天冬氨酰蛋白酶、 葡糖淀粉酶、 甘露聚糖 酶、 糖苷酶和大麦内肽酶 B( 参见例如 Saarelainen(1997)Appl.Environ.Microbiol.63 ： 4938-40) 的信号序列。在具体实施方案中， 可以使用自身 ( 即内源 ) 信号序列分泌 α- 葡 聚糖酶。
在一些实施方案中， 通过引入核酸到宿主细胞中产生 α- 葡聚糖酶， 该核酸包含 与 α- 葡聚糖酶编码部分有效连接的编码信号序列的部分， 其中该核酸的翻译产生包含具 有 N 端信号序列的葡聚糖酶部分的融合蛋白， 该信号序列用以将 α- 葡聚糖酶分泌出宿主 细胞。
在具体实施方案中， 除了信号序列之外， 融合蛋白质可另外含有载体蛋白质， 其为 宿主细胞内源并且高度分泌的蛋白质的部分。合适的载体蛋白包括里氏木霉甘露聚糖酶 I(Man5A 或 MANI)、 里氏木霉纤维二糖水解酶 II(Cel6A 或 CBHII)( 参见例如 Paloheimo 等 人 (2003)Appl.Environ.Microbiol.69 ： 7073-82) 或者里氏木霉纤维二糖水解酶 I(CBHI) 的那些。在一个实施方案中， 载体蛋白是截短的里氏木霉 CBH1 蛋白， 包含 CBH1 核心区域和 CBH1 接头区域的部分。因此可使用编码融合蛋白质的核酸， 该融合蛋白质从氨基端至羧基 端有效连接信号序列、 载体蛋白质和本发明的 α- 葡聚糖酶。
除了编码序列之外， 核酸还可含有 α- 葡聚糖酶在宿主细胞中表达所需的其他元 件。 例如， 该核酸可含有转录编码序列的启动子和转录终止子。 可用于里氏木霉的示例性启 动子包括里氏木霉 cbh1、 cbh2、 egl1、 egl2、 eg5、 xln1 和 xln2 启动子， 或者其杂种或截短版 本。例如该启动子可以是里氏木霉 cbh1 启动子。合适的终止子包括里氏木霉 cbh1、 cbh2、 egl1、 egl2、 eg5、 xln1 和 xln2 终止子， 以及许多其他， 例如包括来自黑曲霉或河内黑曲霉 基因葡糖淀粉酶基因 (Nunberg 等人 (1984)Mol Cell Biol.4 ： 2306-15) ； Boel 等人 (1984) EMBO J.3 ： 1097-102 和 Boel 等人 (1984)EMBO J.3 ： 1581-85)、 构巢曲霉氨基邻苯甲酸酯合 酶基因、 米曲霉 TAKA 淀粉酶基因或者构巢曲霉 trpC(Punt 等人 (1987)Gene 56 ： 117-24) 的终止子。对于木霉菌属物种宿主细胞来说， 该启动子和 / 或终止子可以是天然的或非内源 的。
还提供了宿主细胞培养物 ( 即含有宿主细胞群体和生长培养基的组合物 )。培养 物的生长培养基可含有如上所述的 α- 葡聚糖酶。在某些实施方案中， 该细胞培养物可含 有生长培养基和上述细胞的群体。细胞培养物可用于通过在适于产生分离的 α- 葡聚糖酶 的条件下维持细胞培养物产生本发明的 α- 葡聚糖酶。如果 α- 葡聚糖酶分泌， 则其可从 生长培养基中收获。
丝状真菌表达蛋白质的方法包括其中细胞经改造产生分泌蛋白质的方法， 其包括 描述于美国专利 No.6,022,725 和 6,268,328， 以及公开的美国专利申请 No.20060041113、 20060040353、 20060040353 和 20050208623 中 的 那 些， 其 通 过 引 用 并 入 本 文。 另 外， 转 化曲霉菌株的一般方法公开于 Cao 等人 (2000)Protein Sci.9 ： 991-1001) 和 Yelton 等 人 (1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 ： 1470-74)， 转化木霉菌菌株的一般方法公开于 Nevalainen 等人 (1992) “The Molecular Biology of Trichoderma and itsApplication to the Expression of Both Homologous and HeterologousGenes” in Molecular Industrial Mycology， Leong 和 Berka 编辑， MarcelDekker Inc.， NY， 129-48 页 )。
如果分泌进培养基， 则 α- 葡聚糖酶可通过任何便利方法回收， 例如通过沉淀、 离 心、 亲和、 过滤或者任何其他本领域已知的方法。可使用， 例如亲和层析 (Tilbeurgh 等人 (1984)FEBS Lett.16 ： 215) ； 离子交换层析方法 (Goyal 等人 (1991)Biores.Technol.36 ： 37 ； Fliess 等 人 (1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17 ： 314 ； Bhikhabhai 等 人 (1984)J.Appl.Biochem.6 ： 336 ； 以 及 Ellouz 等 人 (1987)Chromatography396 ： 307)， 包括 使用高分辨率材料的离子交换 (Medve 等人 (1998)J.Chromatography A.808153 ； 疏水相互 作用层析 (Tomaz and Queiroz(1999)J.Chromatography A.865 ： 123 ； 两相分配 (Brumbauer 等人 (1999)Bioseparation 7 ： 287) ； 乙醇沉淀 ； 反相 HPLC ； 硅胶或者例如 DEAE 的阳离子 交换树脂上的层析 ； 层析聚焦 ； SDS-PAGE ； 硫酸铵沉淀 ； 或者凝胶过滤， 使用例如 Sephadex G-75。在具体实施方案中， α- 葡聚糖酶可在没有从培养基的其他成分纯化的情况下使用。 在这些实施方案中， 培养基可例如简单地浓缩， 然后在没有从生长培养基的成分进一步纯 化蛋白质的情况下使用， 或者在没有进一步修饰的情况下使用。
B. 口腔护理组合物
本发明组合物和方法的一个方面涉及口腔护理组合物。该口腔护理组合物含有 一种或多种该 α- 葡聚糖酶和口腔可接受载体。一种或多种 α- 葡聚糖酶的每一种可 以 0.0001wt ％至 5wt ％范围 ( 例如 0.0001wt ％至 0.0005wt ％、 0.0005wt ％至 0.001wt ％、 0.001wt ％ 至 0.005wt ％、 0.005wt ％ 至 0.01wt ％、 0.01wt ％ 至 0.05wt ％、 0.05wt ％ 至 0.1wt％、 0.1wt％至 0.5wt％、 0.5wt％至 1wt％或者 1wt％至 5wt％ ) 的浓度存在于组合物 中， 但是也设想此范围之外的浓度。该口腔护理组合物可由包括将 α- 葡聚糖酶与口腔可 接受赋形剂混合的方法制成。在某些情况下， 该方法还可包括包装口腔护理组合物。
该口腔护理组合物可以是例如洁齿剂、 牙膏、 牙粉、 局部口腔凝胶、 漱口水、 假牙产 品、 口喷雾、 锭剂、 口腔片剂或口香糖的形式。该口腔组合物也可合并在条带、 薄膜、 绒毛或 胶带上， 用以直接施用或粘附在口腔表面。
口腔可接受载体可包含一种或多种相容固体或液体填充稀释剂或者包装物质， 其适于局部口腔施用。 合适的载体或赋形剂包括如下文更详细描述的常用的和常规的洁齿剂 ( 包括非研磨凝胶和用于龈下施用的凝胶 )、 漱口水、 口喷雾、 口香糖和锭剂 ( 包括薄荷糖 ) 的成分。液体形式的本发明口腔护理组合物可优选具有约 4.0 至约 10.0 的 pH， 例如约 5.0 至约 8.0。
在一些实施方式中， 该载体基于组合物引入口腔的形式来选择。 例如， 如果使用牙 膏 ( 包括牙齿凝胶等 )， 则可选择 “牙膏载体” ( 包括例如研磨物质、 表面活性剂、 粘合剂、 润 湿剂、 调味剂和甜味剂等 ))， 例如 Benedict 的美国专利 No.3,988,433 中公开的。 如果使用 漱口水， 则可选择 “漱口水载体” ( 包括例如水、 调味剂和甜味剂等 )， 例如 Benedict 的美国 专利 No.3,988,433 所公开的。如果使用口喷雾， 则可选择 “口喷雾载体” ， 或者如果使用锭 剂， 这可选择 “锭剂载体” ( 例如糖果基质 (base))。如果使用口香糖， 则可选自 “口香糖载 体” ( 包括例如口香糖基质、 调味剂和甜味剂 )。如果使用香粉， 则可选自 “香粉载体” (例 如香粉、 调味剂和甜味剂 )。 如果使用龈下凝胶 ( 用于递送活性物质至牙周袋内或者牙周袋 周围 )， 则可选自 “龈下凝胶载体” 。适于制备本发明组合物的其他可用载体是本领域公知 的。它们的选择可取决于例如味道、 成本、 保存期、 对无糖或无盐组合物的需要等次要考虑 因素。
在一些实施方式中， 该组合物可以是非研磨凝胶的形式， 例如龈下凝胶， 其可以是 水性或非水性的。水性凝胶通常包括增稠剂 ( 约 0.1％至约 20％ )、 湿润剂 ( 约 10％至约 55％、 调味剂 ( 约 0.04％至约 2％ )、 甜味剂 ( 约 0.1％至约 3％ )、 着色剂 ( 约 0.01％至约 0.5％ ) 以及用于平衡的水。在某些情况下， 该组合物可包含防龋齿物质 ( 约 0.05％至约 0.3％， 如氟离子 ) 和防牙石物质 ( 约 0.1％至约 13％ )。
在其他一些的实施方式中， 该组合物也可以是洁齿剂的形式， 例如牙膏、 牙齿凝胶 或牙粉。 这些牙膏和牙齿凝胶的成分可包括一种或多种牙齿研磨剂 ( 约 5％至约 50％ )、 表 面活性剂 ( 约 0.5％至约 10％ )、 增稠剂 ( 约 0.1％至约 5％ )、 湿润剂 ( 约 10％至约 55％ )、 调味剂 ( 约 0.04％至约 2％ )、 甜味剂 ( 约 0.1％至约 3％ )、 着色剂 ( 约 0.01％至约 0.5％ ) 和水 ( 约 2％至约 45％ )。 这些牙膏或牙齿凝胶也可包含一种或多种防龋齿物质 ( 约 0.05％ 至约 0.3％， 如氟离子 ) 和防牙石物质 ( 约 0.1％至约 13％ )。牙粉可含有基本上全部为非 液体的成分。
一种示例性洁齿剂组合物描述于美国专利 No.6,238,648， 其具有下列组成 (w/ w) ：
甘油 14.0
聚乙二醇 300 4.5
二氧化硅 21.5
焦磷酸四钠 4.5
水 23.5
黄原胶 0.3
羧甲基纤维素 0.5
氟化钠 0.2
香料 1.0
月桂基硫酸钠 (27.9％溶液 ) 4.5糖精钠 0.4 二氧化钛 0.4 碳酸氢钠 0.9 无水碳酸钠 1.4 Poloxamer 407 1.8 木糖醇 10.0 丙二醇 10.6 总计 100.00 另一种示例性洁齿剂组合物描述于美国专利 No.5,578,295， 其具有下列组成 (w/ 三氯生二磷酸盐 (Triclosan diphosphate) 1 山梨糖醇 33 糖精 0.46 二氧化硅 22 NaF 0.243w) ：
甘油 9
NaOH(50％ ) 0.2
Carbopol 0.2
Keltrol 0.6
TiO2 0.5
烷基硫酸钠 (28％溶液 ) 4
PEG 6
3FD&C Blue#1(1％溶液 ) 0.05
香料 1.1
水 适量
在一些实施方式中， 该组合物是嗽口水， 包括口喷雾。 这些嗽口水和口喷雾的成分 通常包括下列一种或多种 ： 水 ( 约 45％至约 95％ )、 乙醇 ( 约 0％至约 25％ )、 润湿剂 ( 约 0％至约 50％ )、 表面活性剂 ( 约 0.01％至约 7％ )、 调味剂 ( 约 0.04％至约 2％ )、 甜味剂 ( 约 0.1％至约 3％ ) 和着色剂 ( 约 0.001％至约 0.5％ )。这些嗽口水和口喷雾还可包含 下列一种或多种 ： 防龋齿物质 ( 约 0.05％至约 0.3％， 如氟离子 ) 和防牙石物质 ( 约 0.1％ 至约 3％ )。
在某些实施方案中， 该组合物可以是牙科溶液， 包括冲洗流体。 这些牙科溶液的成 分通常包括下列一种或多种 ： 水 ( 约 90％至约 99％ )、 防腐剂 (0.01％至约 0.5％ )、 增稠剂 ( 约 0％至约 5％ )、 调味剂 ( 约 0.04％至约 2％ )、 甜味剂 ( 约 0.1％至约 3％ ) 和表面活性 剂 ( 约 0％至约 5％ )。
口香糖组合物通常包含下列一种或多种 ： 树胶基质 ( 约 50％至约 99％ )、 调味剂 ( 约 0.4％至约 2％ ) 和甜味剂 ( 约 0.01％至约 20％ )。
锭剂可包括包含调味基质中治疗剂的盘状固体。该基质可以是硬糖、 甘油胶或具 有足够胶水使其成形的糖的组合。这些剂型是本领域中通常公知的。在另一个实施方案中， 本发明提供了注入本文所提供组合物的牙科装置。该牙科 装置可包括接触牙齿及口腔中其他组织的装置， 该装置浸入包含氧化酶和聚乙烯亚胺或山 梨糖醇的组合物。该牙科装置可以是浸渍纤维的形式， 其包括牙线或胶带、 芯片、 条、 膜、 牙 签以及聚合物纤维。
可存在于口腔可接受载体中的示例性材料如下所述。
研磨剂
牙齿研磨剂包括许多不同的材料。所选的材料可以是在目的组合物中相容的， 可 能不过分磨损牙质。适宜的研磨剂可包括， 例如， 二氧化硅包括凝胶和沉淀、 不溶聚偏磷酸 钠、 水合氧化铝、 碳酸钙、 正磷酸二钙二水合物、 焦磷酸钙、 磷酸三钙、 聚偏磷酸钙和树脂研 磨材料例如尿素和甲醛缩合产物的颗粒。
用于该组合物的一类研磨剂是颗粒化热凝固聚合树脂。适宜的树脂包括， 例如 三聚氰胺、 酚醛树脂、 尿素、 三聚氰胺 - 尿素、 三聚氰胺 - 甲醛、 尿素 - 甲醛、 三聚氰胺 - 尿 素 - 甲醛、 交联环氧化物和交联聚酯。
可选择多种类型的二氧化硅牙齿研磨剂， 因为其有益于牙齿清洁和磨光性能， 而 不过度磨损牙釉质或牙质。二氧化硅研磨剂磨光材料， 以及其他研磨剂可具有约 0.1 至约 30 微米或者约 1 至约 15 微米范围的平均粒度。该研磨剂可以是沉淀的二氧化硅或二氧化 硅凝胶例如二氧化硅干凝胶。 也可使用研磨剂混合物。洁齿剂组合物中研磨剂总量可以为约 6％至约 70％重 量。以组合物重量计， 牙膏可含有约 10％至约 50％的研磨剂。溶液、 口喷雾、 嗽口水和非研 磨凝胶组合物可以不含研磨剂。
表面活性剂
本发明组合物还可含有表面活性剂， 例如肌氨酸盐表面活性剂、 羟乙基磺酸盐表 面活性剂或牛磺酸盐 (taurate) 表面活性剂。在某些实施方案中， 该组合物可含有这些表 面活性剂的碱金属盐或铵盐。 在某些情况下， 该组合物可含有下列的钠钾和钾盐 ： 月桂酰肌 氨酸、 十四酰肌氨酸、 棕榈酰肌氨酸、 硬脂酰肌氨酸和油酰肌氨酸。其他合适的相容表面活 性剂可用于替代这些表面活性剂或与之组合。
合适的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐的水溶盐， 其烷基具有 10 至 18 个碳原 子， 以及具有 10 至 18 个碳原子的脂肪酸的磺酸化单酸甘油酯的水溶盐。十二烷基硫酸钠 和椰子单酸甘油酯磺酸钠是该类型阴离子表面活性剂实例。 也可利用阴离子表面活性剂混 合物。
合适的阳离子表面活性剂包括具有一个约 8 至 18 个碳原子的长烷基链的脂肪族 季铵化合物的衍生物， 例如月桂基三甲基氯化氨 ； 氯化十六烷基吡啶鎓 (cetyl pyridinium chloride) ； 十六烷基三甲基溴化铵 ； 二 - 异丁基苯氧乙基 - 二甲基苯甲基氯化铵 ； 椰油基 三甲基亚硝酸铵 ； 氟化十六烷基吡啶鎓 (cetyl pyridinium fluoride) 等。 在某些情况下， 表面活性剂化合物可以是具有去污剂性能的季铵氟化物。 一些阳离子表面活性剂可作为组 合物中的杀菌剂。
适宜的非离子型表面活性剂包括烯基氧化物 (alkylene oxide) 基团 ( 本质上亲 水 ) 与有机疏水化合物缩合产生的化合物， 该有机疏水化合物可以本质上是脂肪族或者烷 基芳香族的。实例包括普卢兰尼克 (Pluronics)、 烷基酚的聚环氧乙烷缩合物、 来源于环氧
乙烷与环氧丙烷和乙二胺反应产物缩合的产物、 脂族醇的环氧乙烷缩合物、 长链叔胺氧化 物、 长链叔膦氧化物、 长链二烷基亚砜和这些物质的混合物。
合适的两性离子合成表面活性剂包括脂肪族季铵、 磷鎓和有机四价硫化合物的衍 生物， 其中该脂烃基可以是直链或支链的， 其中脂肪取代基之一含有约 8 至 18 个碳原子， 之 一含有阴离子水溶性基团， 例如羧基、 磺酸基、 硫酸基、 磷酸基或膦酸基。
合适的甜菜碱表面活性剂包括癸基甜菜碱或 2-(N- 癸基 -N， N- 二甲基胺基 ) 醋酸 酯、 椰油基甜菜碱或 2-(N- 椰油基 -N， N- 二甲基胺基 ) 醋酸酯、 十四烷基甜菜碱、 棕榈基甜 菜碱、 月桂基甜菜碱、 鲸蜡基甜菜碱、 鲸蜡基甜菜碱、 硬脂基甜菜碱等。 酰胺甜菜碱例如椰油 酰胺乙基甜菜碱、 椰油酰胺丙基甜菜碱、 月桂酰胺丙基甜菜碱等。在某些实施方案中， 该组 合物的甜菜碱是椰油酰胺丙基甜菜碱或月桂酰胺丙基甜菜碱。
以总组合物重量计， 表面活性剂可以约 0.1％至约 2.5％、 约 0.3％至约 2.5％或者 约 0.5％至约 2.0％范围的浓度存在。
防菌斑物质
该组合物还可包含抗菌斑物质， 例如合成阴离子聚合物， 例如聚丙烯酸酯或者马 来酸酐或酸和甲基乙烯基醚的共聚物， 以及聚氨基丙磺酸 (polyamino propane sulfonic acid， AMPS)、 柠檬酸锌三水合物、 多肽 ( 例如聚天冬氨酸和聚谷氨酸 ) 和其混合物。
螯合剂
该组合物可包含螯合剂。螯合剂包括酒石酸和其可药用盐、 柠檬酸和柠檬酸碱金 属盐以及其混合物。螯合剂可螯合细菌细胞壁中存在的钙。螯合剂还可通过将钙从有助于 保持生物质完整的钙桥除去从而破坏菌斑。不应使用可导致牙齿脱矿化的螯合剂。
在一些实施方式中， 该组合物中存在柠檬酸碱金属盐 ( 例如柠檬酸钠和钾 )。 在某 些情况下， 螯合剂包括柠檬酸 / 柠檬酸碱金属盐的组合。在其他一些情况下， 可使用酒石酸 碱金属盐。 其他物质包括酒石酸二钠、 酒石酸二钾、 酒石酸钾钠、 酒石酸氢钠和酒石酸氢钾。 酒石酸盐螯合剂可单独使用或者与其他任选的螯合剂联合使用。在某些实施方案中， 这些 1 5 螯合剂具有约 10 至 10 的钙结合常数， 以提供菌斑形成减少的改善清洗。
另一组螯合剂是阴离子聚合物聚羧酸。这些物质是本领域公知的， 以它们的游离 酸形式使用， 部分或完全中和的水溶性碱金属 ( 例如钾， 优选钠 ) 或铵盐。在某些情况下， 组合物含有 1 ∶ 4 至 4 ∶ 1 的马来酸酐或酸与另一种可聚合烯属不饱和单体的共聚物， 例 如平均分子量 (AMW) 为约 30,000 至约 1,000,000 的甲基乙烯基醚 ( 甲氧乙醚 )。
其他有效的聚合聚羧酸可包括下列这些， 例如马来酸酐与丙烯酸乙酯、 甲基丙烯 酸羟、 N- 乙烯基 -2- 吡咯烷酮或乙烯的 1 ∶ 1 共聚物， 以及丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯或甲基 丙烯酸羟乙酯、 丙烯酸甲酯或丙烯酸乙酯、 异丁基乙烯醚或 N- 乙烯基 -2- 吡咯烷酮的 1 ∶ 1 共聚物。
其他的有效聚合聚羧酸可以是马来酸酐与苯乙烯、 异丁烯或乙基乙烯基醚的共聚 物、 聚丙烯酸、 聚衣康酸和聚马来酸、 以及 AMW 低至 1000 的磺基乙酰化低聚物。
螯合剂的量可以是约 0.1 ％至约 2.5 ％、 约 0.5 ％至约 2.5 ％或者约 1.0 ％至约 2.5％。
氟化物来源
在某些实施方案中， 口腔护理组合物中可存在水溶性氟化物化合物， 其存在的量足以提供组合物中 25℃下约 0.0025wt％至约 5.0wt％或者约 0.005wt％至约 2.0wt％的氟 离子浓度。多种产生氟离子的物质可用作本发明组合物中可溶性氟化物的来源。代表性氟 离子来源可包括氟化亚锡、 氟化钠、 氟化钾、 单氟代磷酸钠等等。 在某些情况下， 本发明组合 物包含氟化亚锡和氟化钠以及其混合物。
牙齿增白活性剂和牙齿颜色调节物
口腔护理组合物中还可存在牙齿增白剂和 / 或牙齿颜色调节物。这些物质适于调 节牙齿的颜色。 这些物质可包括在施用到牙齿表面上时调节表面的光吸收和或光反射的颗 粒。当含有这些颗粒的薄膜施加到牙齿表面时， 这些颗粒可提供外观上的益处。
颗粒包括常用于化妆品领域的染料和着色剂。 对用于本发明组合物的染料和或着 色剂没有特别的限制。染料和着色剂包括无机白色染料、 无机彩色染料、 珠光剂、 填充粉末 等等。具体的实例可选自 ： 滑石、 云母、 碳酸镁、 碳酸钙、 硅酸镁、 硅酸镁铝、 二氧化硅、 二氧 化钛、 氧化锌、 红色氧化铁、 褐色氧化铁、 黄色氧化铁、 黑色氧化铁、 氰铁酸铵铁、 锰紫、 群青、 尼龙粉末、 聚乙烯粉末、 异丁烯酸粉末、 聚苯乙烯粉末、 丝粉末、 结晶纤维素、 淀粉、 钛酸盐云 母、 氧化铁钛酸盐云母、 氯氧化铋和其混合物。在某些实施方案中， 使用二氧化钛、 氯氧化 铋、 氧化锌或其混合物。
该染料可用作遮光剂和着色剂。 这些染料可以以经处理的颗粒使用或者以自身作 为原始染料使用。典型染料水平可选择成对消费者所预期的有特别的冲击。例如， 对于特 别黑或脏的牙齿， 可使用足以使得牙齿发亮的染料。 另一方面， 当个体的牙齿或牙齿上的斑 点比其他牙齿更亮时， 可使用使得牙齿变暗的染料。染料和着色剂的水平可以组合物的约 0.05％至约 20％、 约 0.10％至约 15％或者约 0.25％至约 10％的范围使用。
增稠剂
在某些实施方案中， 例如牙膏或凝胶， 一些增稠剂可提供组合物的一致性、 使用后 的活性释放特征、 保存稳定性以及组合物的稳定性等等。增稠剂包括聚羧乙烯、 角叉菜胶、 羟乙基纤维素、 合成锂皂石和纤维素醚的水溶性盐例如羧甲基纤维素钠和羧甲基羟乙基纤 维素钠。也可使用天然树胶， 例如刺梧桐树胶、 黄原胶、 阿拉伯树胶和黄芪胶。可使用胶体 硅酸镁铝或者细二氧化硅粉作为增稠剂的一部分来进一步改善质地。
增稠剂或胶凝剂可包括一类与季戊四醇的烷基醚或蔗糖的烷基醚交联的丙烯酸 的均聚物、 卡波姆或其混合物。
分子量在约 1000 至约 120000( 数均 ) 的丙交酯和乙交酯单体的共聚物可用于本 发明组合物， 例如 “龈下凝胶” 。
以牙膏或凝胶组合物总重量计， 增稠剂可以约 0.1％至约 15％、 约 2％至约 10％或 者约 4％至约 8％的量使用。口香糖、 锭剂 ( 包括薄荷糖 )、 香粉、 非研磨凝胶和龈下凝胶可 使用高浓度。
湿润剂
在某些实施方案中， 本发明组合物的局部口腔载体可包括湿润剂。湿润剂可用于 防止本发明组合物在暴露于空气后变硬， 使得组合物带给口湿润的感觉， 对于特定湿润剂， 给予牙膏组合物希望的甜味。 基于纯的湿润剂， 以本文组合物的重量计， 该湿润剂可包含约 0％至约 70％或者约 5％至约 25％。合适用于本发明组合物的湿润剂包括可食用多元醇例 如丙三醇、 山梨糖醇、 木糖醇、 丁二醇、 聚乙二醇和丙二醇。在某些情况下， 该湿润剂是山梨糖醇和 / 或丙三醇。
调味剂和甜味剂
组合物中也可加入调味剂。合适的调味剂包括冬青油、 薄荷油、 留兰香油、 丁香花 蕾油、 薄荷醇、 茴香醇、 水杨酸甲酯、 桉树醇、 桂皮、 1- 乙酸薄荷酯、 鼠尾草、 丁香酚、 欧芹油、 oxanone、 α- 紫罗兰酮、 甘牛至草、 柠檬、 橙、 丙烯基乙基愈创木酚、 肉桂、 香草醛、 麝香草酚、 芳樟醇、 肉桂醛甘油乙缩醛 ( 称为 CGA(cinnamaldehyde glycerol acetal)) 以及其混合 物。以组合物的重量计， 调味剂可以约 0.001％至约 5％的水平用于组合物。
合适的甜味剂包括蔗糖、 葡萄糖、 糖精、 右旋糖 (dextrose)、 左旋糖、 乳糖、 甘露醇、 山梨糖醇、 果糖、 麦芽糖、 木糖醇、 糖精盐、 非洲竹芋甜素、 阿司帕坦、 D- 色氨酸、 二氢查耳酮、 乙酰舒泛、 环磺酸盐、 环拉酸钠或糖精钠以及其混合物。以组合物重量计， 组合物可含有约 0.1％至约 10％或者约 0.1％至约 1％的这些物质。
除了调味剂和甜味剂之外， 冷却剂、 流涎剂、 加热剂和麻木剂可用作本发明组合物 的任选成分。以组合物的重量计， 这些物质可以约 0.001％至约 10％或者约 0.1％至约 1％ 的水平存在于组合物中。
冷却剂可以是多种材料中的任意种。这些材料中包括羧酰胺、 薄荷醇、 缩酮、 二醇 以及其混合物。示例性冷却剂有对孟烷氨基甲酰 (paramenthancarboxyamide) 物质， 例如 N- 乙基 - 对孟烷 -3- 羧酰胺、 N， 2， 3- 三甲基 -2- 异丙基丁酰胺以及其混合物。其他冷却剂 可选自薄荷醇、 3-1- 甲氧基丙烷 -1， 2- 二醇、 薄荷酮甘油乙缩醛和乳酸薄荷酯。 术语薄荷醇 和薄荷基包括这些化合物右旋和左旋异构体以及其外消旋混合物。
加热剂包括辣椒和烟酸酯， 例如烟酸苯甲酯。麻木剂可包括苯佐卡因、 利多卡因、 丁香花蕾油和乙醇。
碱金属碳酸氢盐
该组合物还可包含碱金属碳酸氢盐。 碱金属碳酸氢盐可溶于水， 除非是稳定， 否则 可在水体系中释放二氧化碳。碳酸氢钠， 也称为小苏打， 可以碱金属碳酸氢盐的形式存在。 在某些实施方案中， 该组合物含有约 0.5％至约 30％、 约 0.5％至约 15％、 或者约 0.5％至约 5％的碱金属碳酸氢盐。
其他载体 (Miscellaneous Carriers)
该口腔护理组合物的制备中所用的水可以是低离子含量的， 没有有机杂质， 以重 量计， 可以水性组合物的约 5％至约 70％、 或者约 20％至约 50％的量存在。这些水分含量 可包括所加入的自由水， 以及其他试剂或载体引入的水。
泊洛沙姆可用于该组合物中。泊洛沙姆可归类为非离子表面活性剂。其可用作乳 化剂、 粘合剂或稳定剂， 或者履行相关功能。泊洛沙姆包括分子量为 1000 至高于 15000 的 以伯醇羟基为末端的双官能封闭聚合物。
可用于该组合物的其他乳化剂包括聚合物乳化剂。 主要为高分子量的聚丙烯酸聚 合物可用作乳化剂。
组合物中也可加入二氧化钛。二氧化钛是可使得组合物不透明的白色粉末。二氧 化钛可包含组合物重量的约 0.25％至约 5％。
该组合物的 pH 优选通过使用一种或多种缓冲剂来调节。缓冲剂指可用于在约 pH 4.0 至约 pH 10.0 范围内调节组合物 pH 的物质。缓冲剂包括磷酸单钠、 磷酸三钠、 氢氧化钠、 碳酸钠、 酸式焦磷酸钠、 柠檬酸和柠檬酸钠。以本发明组合物的重量计， 缓冲剂可以约 0.5％至约 10％的水平施用。在某些实施方案中， 洁齿剂组合物的 pH 可由 3 ∶ 1 的水性洁 齿剂浆测量， 例如 3 份水比 1 份洁齿剂。
可用于本发明组合物的其他物质包括聚二甲基硅氧烷共聚醇， 其选自烷基 - 和烷 氧基 - 聚二甲基硅氧烷共聚醇， 例如 C12 至 C20 烷基聚二甲基硅氧烷共聚醇以及其混合物。 在某些情况下， 该组合物含有十六烷基聚二甲基硅氧烷共聚醇。该聚二甲基硅氧烷共聚醇 可以约 0.01wt％至约 25wt％、 约 0.1wt％至约 5wt％或者约 0.5wt％至约 1.5wt％的水平存 在。该聚二甲基硅氧烷共聚醇可有助于提供积极的牙齿感觉益处。
其他活性剂
本发明口腔护理组合物还可包含其他活性剂， 例如抗微生物剂。这些试剂包括不 溶于水的非阳离子抗微生物剂， 例如卤化二苯醚、 酚类化合物包括苯酚及其同系物、 单和聚 烷基和芳香卤代苯酚、 间苯二酚和其衍生物、 联苯酚化合物和卤化水杨酰苯胺、 安息香酯和 卤化二苯脲。水溶性抗菌剂包括季铵盐和双 biquamide 盐， 等等。额外的水溶性抗微生物 剂是三氯生单磷酸盐。 季铵试剂包括下列那些， 即其中四元氮上一个或两个取代基具有约 8 至约 20 或者约 10 至约 18 个碳原子长的碳链 ( 通常为烷基 )， 而剩余取代基 ( 通常为烷基 或苯甲基 ) 具有较低数目的碳原子， 例如约 1 至约 7 个碳原子例如甲基或乙基。十二基三 甲基溴化铵、 氯化十四基吡啶、 度米芬、 氯化 N- 十四基 -4- 乙基吡啶、 十二基二甲基 (2- 苯 氧乙基 ) 溴化铵、 苯甲基二甲基十八基氯化铵、 氯化十六烷基呲啶、 季铵化 5- 氨基 -1， 3- 双 (2- 乙基 - 己基 )-5- 甲基 - 六氢吡啶、 氯化苯甲烃铵、 氯化苄乙氧铵和甲基氯化苄乙氧铵 是示例性季铵抗菌剂。其他化合物是双 [4-(R- 氨基 )-1- 吡啶 ] 烷烃。也可包含其他抗菌 剂， 例如甘氨酸亚铜、 甘氨酸铜、 柠檬酸锌和乳酸锌。
除了 α- 葡聚糖酶之外， 本发明口腔护理组合物还可含有一种或多种具有碳水化 合物水解活性、 抗菌活性或牙齿增白活性的其他酶。 这些酶包括但不限于 ： 脱氨酶、 酯酶、 糖 苷酶、 葡聚糖水解酶、 糊精酶、 淀粉酶、 转葡糖苷酶、 纤维素酶、 半纤维素酶、 脂肪酶、 氧化酶、 过氧化物酶、 蛋白酶和脲酶。
C. 使用方法
本发明组合物和方法的另一个方面是将牙齿表面与包含 α- 葡聚糖酶的组合物 相接触从而减少或预防牙齿损坏或者减少或预防牙齿损坏之根本原因的方法。
在一些实施方案中， 方法包括将牙齿表面与包含 α- 葡聚糖酶的组合物相接触以 水解牙齿表面上存在的糖萼。根据该实施方案， α- 葡聚糖酶的 1， 3-α-D- 葡糖苷酶活性 和 / 或 α- 葡聚糖酶的其他活性水解多糖、 葡聚糖、 甘露聚糖和 / 或菌斑细菌产生的粘性分 子， 从而减少菌斑粘附到牙齿表面的能力， 减少菌斑的形成或者降低已有菌斑的水平。 这些 多糖、 葡聚糖、 甘露聚糖和 / 或粘性分子可存在于通常称为糖萼的部分之中。
在一些实施方案中， 该方法包括将牙齿表面与包含 α- 葡聚糖酶的组合物相接触 从而通过破坏口腔中细菌所产生的多糖、 葡聚糖、 甘露聚糖和 / 或粘性分子使得牙齿表面 脱水， 由此减少膜形成或细菌附着， 和 / 或预防损伤牙齿表面的细菌酸性和其他物质的积 累。
该方法可包括将牙齿表面与一种或多种 α- 葡聚糖酶相接触， 其如上该配制。该 方法可包括将牙齿表面与额外的酶相接触， 其可存在于同一制剂或不同制剂中。在一些实施方案中， 该酶不限于 ： 脱氨酶、 酯酶、 糖苷酶、 葡聚糖水解酶、 糊精酶、 淀粉酶、 转葡糖苷酶、 纤维素酶、 半纤维素酶、 脂肪酶、 氧化酶、 过氧化物酶、 蛋白酶和脲酶。该额外的酶也可是其 他的 α- 葡聚糖酶。
牙 齿 以 及 其 他 个 人 护 理 组 合 物 和 它 们 的 作 用 机 制 详 细 描 述 于 Lad.R.( 编 辑 )“Biotechnology in Personal Care” ， Cosmetic Science andTechnology Series， 第 29 卷， Taylor and Francis Group， New York， NY， USA， 2006。该参考文献标志着现有技术 的状态， 并入本文。
除了口腔护理应用之外， 本发明组合物和方法可改造以适于在很多其他情况下预 防或除去生物膜， 例如在冷却水装置中、 在饮用水装置中、 在食品和食品加工装置中、 在医 学植入物上 ( 或内 )、 在造纸和纺织制造和加工中、 在炼油和采矿装置中、 在船舶的船体上、 在化学制造中、 在游泳池中、 水族馆中和池塘中等。在此类情况下， α- 葡聚糖酶可用于破 坏生物膜中存在的多糖成分， 从而减少微生物附着和 / 或粘着到表面。这些多糖的破坏还 导致脱水， 其减少或防止适于表面上微生物生长和繁殖的微环境的形成。
根据本公开， 本发明组合物和方法的其他方面和实施方案对于本领域技术人员来 说是显而易见的。
实验
提供下列实施例以说明本发明组合物和方法以及其益处， 并且不应将其视为对它 们范围的限制。
实施例 1、 候选真菌 α-1， 3- 葡聚糖酶 (EC 3.2.1.59) 的鉴定
一些候选真菌， 包括 Hypocea tawa、 里氏木霉、 Trichodermakonilangbra 和哈茨木 霉在含有 15％麦芽糖的限定培养基中的培养物中培养 (28℃， 7 天， 150 转 / 分钟搅拌 )。通 过除菌过滤收集上清， 浓缩并脱盐， 用于葡聚糖 ( 和右旋糖 ) 水解活性筛选。将脱盐的培养 上清 (5％体积 ) 加入 100mM 磷酸盐缓冲液 pH 6.3( 或者 100mM 醋酸盐缓冲液， pH 4.5) 中 0.2％清洗过的不溶葡聚糖。 在 37-40℃下过夜孵育反应混合物。 目视检查该混合物的不溶 葡聚糖的溶解， 通过 HPLC 分析上清的可溶性水解产物。对于 HPLC 分析， 将反应上清 10 倍 稀释进 10mM NaOH， 然后将 10μl 注入装备有电化学检测的安捷伦 1100HPLC。用 NaOH/ 乙 酸钠梯度在 PA1 阴离子交换柱上洗脱单糖和二糖。基于之前的运行标准鉴定未知混合物的 成分。来自里氏木霉、 Trichoderma konilangbra 和 Hypocrea tawa 的上清得到葡聚糖最 大程度的溶解 ( 参见例如图 2)。选择 H.tawa、 里氏木霉和 T.konilangbra 的 α-1， 3- 葡聚 糖酶用于克隆、 表达和表征。通过同源性， 鉴定基因组序列 (JGI) 中的推定里氏木霉 α-1， 3- 葡聚糖酶序列。
实施例 2. 基因组 DNA 的分离
通过在生物安全柜中将 30ml 无菌 YEG 液体培养基添加到三个 250ml 带挡板锥形 瓶制备里氏木霉、 T.konilangbra 和 H.tawa 的真菌培养物。使用无菌塑料环从每种真菌培 养物平板上切下 1x1 英寸方形并移出置于合适的培养瓶。 然后将接种的培养瓶置于 28℃摇 床孵箱， 培养过夜。
从摇床孵箱中取出里氏木霉、 T.konilangbra、 H.tawa 培养物， 将每个瓶的内容物 倒入独立的无菌 50mL Sarstedt 管。将 Sarstedt 管置于台式离心机中， 以 4,500 转 / 分钟 离心 10 分钟， 使得真菌菌丝沉淀。弃去上清， 将满接种环的每种菌丝样品转移到含裂解介质 (FastDNA) 的独立管。使用 FastDNA 试剂盒 (Qbiogene) 根据制造商针对藻类、 真菌和酵 母的方案从收获的菌丝提取基因组 DNA。匀浆时间 (Mini BeadBeater-8) 为 25 秒。基因组 DNA 的量和品质由凝胶电泳确定。
实施例 3. 通过 PCR 获得 α- 葡聚糖酶多肽
A. 里氏木霉
通过同源性鉴定里氏木霉基因组 (JGI) 中的推定 α-1， 3 葡聚糖酶基因。基于推 定同源 DNA 序列设计里氏木霉的 PCR 引物。基于推定里氏木霉蛋白质序列和其他公开的 α-1， 3 葡聚糖酶蛋白质序列设计针对 T.konilangbra 或 H.tawa 的简并 PCR 引物。
里氏木霉特异性 PCR 引物 ：
SK592 ： 5′ -CACCATGTTTGGTCTTGTCCGC(SEQ ID NO ： 6)
SK593 ： 5′ -TCAGCAGTACTGGCATGCTG(SEQ ID NO ： 7)
用于从提取自里氏木霉菌株 RL-P37 的基因组 DNA 中扩增推定 α-1， 3 葡聚糖酶的 PCR 条件如下 ： 1.94℃ 2 分钟， 2.94℃ 30 秒， 3.56℃ 30 秒， 4.72℃ 3 分钟， 5. 返回步骤 2， 共 24 个循环， 6. 一直保持 4℃。反应样品含有 2μL 的 RL-P37 基因组 DNA， 10μL 的 10X 缓冲 液， 2μL 10mMdNTP 混合物， 1μL 的 20μM 引物 SK592 和 SK593， 1μL Pfu Ultra 和 83μL 蒸馏水。 B.T.konilangbra 和 H.tawa
初始 PCR 反应使用由一些同源序列的蛋白质比对设计的简并引物。在第一 PCR 反 应中使用设计用于在 5’ 和 3’ 端附近退火的一组简并引物， 以扩增 α-1， 3 葡聚糖酶序列的 类似序列。
用于初始克隆的简并引物 ：
H.tawa 和 T.konilangbra ：
MA1F ： GTNTTYTGYCAYTTYATGAT(SEQ ID NO ： 8)
MA2F ： GTNTTYTGYCAYTTYATGATHGGNAT(SEQ ID NO ： 9)
MA4F ： GAYTAYGAYGAYGAYATGCARCG(SEQ ID NO ： 10)
MA5F ： GTRCAYTTRCAIGGICCIGGIGGRCARTANCC(SEQ ID NO ： 11)
MA6R ： YTCICCIGGNAGNGGRCANCCRTT(SEQ ID NO ： 12)
MA7R ： RCARTAYTGRCAIGCYGTYGGYGGRCARTA(SEQ ID NO ： 13)
然后将这些 PCR 反应的产物用于嵌套 PCR， 其使用设计用于在初始 PCR 片段产物内 部结合的引物， 在相同扩增条件下进行。
初始克隆的特异性引物 ：
T.konilangbra ：
TP1S ： CCCCCTGGCCAAGTATGTGT(SEQ ID NO ： 14)
TP2A ： GTACGCAAAGTTGAGCTGCT(SEQ ID NO ： 15)
TP3S ： AGCACATCGCTGATGGATAT(SEQ ID NO ： 16)
TP3A ： AAGTATACGTTGCTTCCGGC(SEQ ID NO ： 17)
TP4S ： CTGACGATCGGACTRCACGT(SEQ ID NO ： 18)
TP4A ： GGTTGTCGACGTAGAGCTGT(SEQ ID NO ： 19)
H.tawa ：
HP2A ： ACGATCGGCAGAGTCATAGG(SEQ ID NO ： 20)
HP3S ： ATCGGATTGCATGTCACGAC(SEQ ID NO ： 21)
HP3A ： TACATCCAGACCGTCACCAG(SEQ ID NO ： 22)
HP4S ： ACGTTTGCTCTTGCGGTATC(SEQ ID NO ： 23)
HP4A ： TCATTATCCCAGGCCTAAAA(SEQ ID NO ： 24)
PCR 产物的凝胶电泳用于确定是否扩增了预期大小的片段。 使用 QIAquick PCR 纯 化试剂盒 (Qiagen) 纯化预期大小的单嵌套 PCR 产物。此外， 从含有多个产物条带的琼脂糖 凝胶上切下并提取预期大小的产物， 使用 QIAquick Gel Extraction 试剂盒 (Qiagen) 进行 纯化。
实施例 4. 转化 / 分离物筛选 / 质粒提取
使用 Invitrogen Zero PCR 克隆试剂盒根据制造商的说明书 将 PCR 产物插入克隆载体。 然后， 根据制造商的建议将该载体转化进 Shot Top10 化 学感受态大肠杆菌细胞 (Invitrogen)， 铺板于含有 50ppm 卡那霉素的 LB 平板上。 将这些平 板在 37℃孵箱中孵育过夜。
为了选择含有载体和 DNA 插入物 (insert) 的转化体， 从平板上选择菌落用于质 粒粗提。将 50μL DNA 提取溶液 (100mM NaCl， 10mM EDTA， 2mM Tris pH 7) 添加到干净的 1.5mL Eppendorf 管中。在生物安全柜中， 每种 转化克隆计数、 挑取 7-10 个独立 的菌落， 并重悬于提取溶液。在化学通风橱中， 向每个样品添加 50μL 的苯酚∶氯仿∶异戊 醇， 剧烈震荡。以最高速将管微离心 5 分钟， 之后取出 20μL 顶层水层置于干净 PCR 管中。 然后加入 1μL RNase 2mg/mL， 混合样品， 在 37℃下孵育 30 分钟。然后将全部样品体积在 凝胶上电泳， 从而根据与空载体的大小差异确定 载体中插入物的存在。一旦鉴 定到转化菌落， 就将这些克隆从平板上刮下， 并将其用于接种含有 5mi LB/ 卡那霉素培养基 (0.0001％ ) 的独立 15mL 管。将培养物置于 37℃摇床孵箱过夜。
从孵箱在取出样品， 使用 Sorval 离心机以 6,000 转 / 分钟离心 6 分钟。使用 QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 (Qiagen) 和方案分离质粒 DNA， 然后对其进行消化以确定 插入物的存在。所用的限制性酶取决于插入序列中及周围存在的位点。使用凝胶电泳确定 片段大小。将合适的 DNA 样品送交测序 (Sequetech， Mountain View， CA)。
实施例 5. 克隆 3′和 5′端
对所有 DNA 片段测序。使用 Align X 和(Vector软件包， Invitrogen) 比对并比较序列以确定核苷酸和氨基酸同一性。设计了特异性引物， 以通 过从已知序列向外扩展来扩增 H.tawa 和 T.konilangbra 的每个不完全片段的 3’ 和 5’ 部 分。每个模板设计了至少三个特异性引物， 其每个嵌套于之前的引物组扩增产物内。使用 嵌套引物组利用 LA PCR 体外克隆试剂盒 (TaKaRa BIO Inc.) 进行 5′和 3′序列的扩增。
制备新鲜基因组 DNA 用于此扩增。通过用 1 平方英寸的合适产孢子真菌平板培养 物块接种 250mL 带挡板锥形瓶中 30mLYEG 液体培养基， 制备 T.konilangbra 和 H.tawa 的培 养物。锥形瓶在 28℃摇床孵箱中过夜孵育。通过在 50mL Sarstedt 管中以 4,500 转 / 分 钟离心 10 分钟收获培养物。弃去上清， 将菌丝体在 -80℃冰箱中保存过夜。然后将冷冻的 菌丝体与一些干冰块一起置于咖啡研磨机中。运行研磨机直至整个混合物具有粉末样均 一性。然后， 将粉末风干， 并转移至含有 10mL Easy-DNATM Kit 溶液 A(Invitrogen) 的无菌50mL Sarstedt 管， 遵照制造商的方案。使用 NanoDrop 光度计测定收集自提取物的基因组 DNA 浓度。
根据已知 DNA 序列内特定限制性位点的缺失选择 LA PCR 体外克隆试剂盒组， 遵照 制造商的说明。对于第一轮 PCR， 在 33.5μL 灭菌蒸馏水中稀释 1μL 连接 DNA 样品。根据 样品和预期的末端片段使用不同引物。对于 5′端， H.tawa 和 T.konilangbra 分别使用引 物 HP4A 和 TP3A， 而对于 3′端， H.tawa 和 T.konilangbra 使用引物 HP4S 和 TP3S。 通过加入 34.5μL 稀释的连接 DNA 溶液、 5μL 10X LA Buffer II(Mg+2)、 8μL dNTP 混合物、 1μL 盒 引物 I、 1μL 特异性引物 I( 根据样品和末端片段 ) 和 0.5μLTaKaRa LA Taq 来制备 PCR 混 合物。 然后将 PCR 管置于热循环仪， 遵照下列方案 ： 1.94℃ 10 分钟， 2.94℃ 30 秒， 3.55℃ 30 秒， 4.72℃ 4 分钟， 返回到步骤 2.30 个循环， 4℃持续。
取 1μL 第一 PCR 反应物并将样品在无菌蒸馏水中以 1/10,000 的倍数稀释进行第 二 PCR 反应。 使用嵌套于第一扩增区域中的第二组引物扩增第一 PCR 反应物中分离的片段。 分别使用引物 HP3A 和 TP4A 向 H.tawa 和 T.konilangbra 的 5’ 端扩增， 而使用引物 HP3S 和 TP4S 向 3’ 端扩增。将稀释的 DNA 添加到含有 33.5μL 无菌蒸馏水、 5μL 10X LA Buffer II(Mg+2)、 8μL dNTP 混合物、 1μL 表达盒引物 2、 1μL 特异性引物 2( 根据样品盒片段末 端 )、 0.5μL TaKaRa LA Taq 的 PCR 反应物， 在进行 PCR 之前充分混合。PCR 方案与第一反 应相同， 唯一不同在于最初 94℃ 10 分钟。 在反应完成之后， 对样品进行凝胶电泳， 以确定所 分离片段的大小和数量。如果存在单条带， 则纯化样品并送交测序。如果未分离到片段， 则 使用之前针对嵌套 PCR 反应的方案进行第三 PCR 反应。扩增片段凝胶电泳之后， 切下最亮 的条带， 纯化并送交测序。
实施例 6. 序列比对的分析
获得序列并使用 Vector NTI 软件包 ( 包括 Align X 和 ContigExpress) 进行分析。 将各个末端片段序列与之前获得的 H.tawa 和 T.konilangbra 片段相比对， 以获得完整基因 的序列。与哈茨木霉和里氏木霉序列的核苷酸比对显示 H.tawa 和 T.konilangbra 中目的 基因的翻译起点和终点。鉴定完整基因序列之后， 设计特异性引物从基因组 DNA 扩增完整 基因。根据之前所述设计引物， 唯一不同的是在翻译起始位点之前添加 CACC 核苷酸序列， 用于
克隆 (Invitrogen)。 最终克隆的引物 ： T.konilangbra ：T1FS ： caccatgctaggcattctccg(SEQ ID NO ： 25)
T1FA ： tcagcagtattggcatgccg(SEQ ID NO ： 26)
H.tawa ：
H1FS ： CACCATGTTGGGCGTTTTTCG(SEQ ID NO ： 27)
H1FA ： CTAGCAGTATTGRCATGCCG(SEQ ID NO ： 28)
如上所述进行 PCR 方案， 唯一例外是退火温度改变为 55℃。通过凝胶电泳分离并 查看到单条带后， 如上所述纯化所扩增的片段， 根据制造商的说明用于 pENTR/D (Invitrogen) 转化。 然后， 如上所述转化化学感受态大肠杆菌， 转移到含有 50ppm 卡那霉素 的 LB 平板。37℃过夜孵育之后， 按照如前所述在粗提 DNA 和质粒大小分析之后， 选择含有 质粒和插入物的转化体。从平板上刮下所选的转化体， 并用于接种含有 5mlLB/ 卡那霉素培养基 (0.0001％ ) 的新鲜 15mL 管。将培养物置于 37℃摇床孵箱过夜。离心收获细胞， 如前 所述提取质粒 DNA。消化质粒 DNA， 以确认插入序列的存在， 然后送交测序。根据制造商的 说明， 使用 LR 克隆酶反应 (Gateway Cloning， Invitrogen)， 从而将插入物从 pENTR/D 载体 定向转移到终点载体。终点载体设计用于在里氏木霉中表达 CBH1 启动子和终止子控制下 的目的基因， 用黑曲霉乙酰胺酶进行选择。
实施例 7. 生物射弹转化
将 里 氏 木 霉 孢 子 悬 液 涂 在 乙 酰 胺 酶 转 化 平 板 的 ～ 6cm 直 径 中 央 (150μL 5x107-5x108 孢 子 /mL 悬 液 )。 然 后， 在 生 物 安 全 柜 中 风 干 平 板。 将 终 止 屏 (BioRad 165-2336) 和 大 载 体 架 (macrocarrier holder)(BioRad1652322) 浸 在 70 ％ 乙 醇 中， 风 干。将 DriRite 干燥剂置于小 Petri 平皿 (6cmPyrex)， 覆盖上 Whatman 滤纸。含有大载体 (BioRad 165-2335) 的大载体架平置于滤纸上， 盖上 Petri 平皿盖。
通过将 60mg 钨 M-10 颗粒 ( 微载体， 0.7 微米， BioRad#1652266) 置于 Eppendorf 管制备钨颗粒悬液。 加入 1mL 乙醇 (100％ )。 在乙醇溶液中涡旋混匀钨， 使之浸泡 15 分钟。 以最高速快速微离心 Eppendorf 管， 使钨沉淀。倒出乙醇， 用无菌蒸馏水清洗三遍。第三遍 将清洗用水倒出， 将钨重悬于 1mL 的无菌 50％甘油。
对于每个转化， 通过将 25μL 悬浮的钨添加到 1.5mL Eppendorf 管制备转化反应。 依次添加后续添加物 ： 2μL DNA pTrex3g 表达载体、 25μL2.5M CaCl2、 10μL 0.1M 亚精胺。 继续涡旋反应物 5-10 分钟， 保持钨悬浮。短暂微离心 Eppendorf 管， 倒出。用 200μL 70％ 乙醇洗涤钨沉淀， 短暂微离心， 形成沉淀并倒出。用 200μL 100％醇洗涤沉淀， 短暂微离心 形成沉淀， 并倒出。将钨沉淀重悬于 24μL 100％醇。将 Eppendorf 管置于超声水浴 15 秒， 将 8μL 等分试样转移到变干的大载体中央。使大载体在变干的 Petri 平皿中风干。
将 氦 气 瓶 打 开 至 1500psi。 在 Model PDS-1000/He 生 物 射 弹 颗 粒 递 送 系 统 (BioRad) 中使用 1100psi 保险片 (rupture disc)(BioRad 165-2329)。当钨溶液干燥时， 将终止屏和大载体架插入到 PDS-1000 中。将含有靶标里氏木霉孢子的乙酰胺酶平板置于 终止屏下方 6cm。在腔室中产生并保持 29 英寸 Hg 的真空。开启 He 生物射弹颗粒递送系 统。将腔室放气， 取出乙酰胺酶平板， 在 28℃下孵育， 直至出现菌落 (5 天 )。
改进 amdS 生物射弹琼脂 (MABA) 每升
部分 I， 在 500ml dH2O 中制备
1000x 盐 1ml
Noble 琼脂 20g
pH to 6.0， 高压灭菌
部分 II， 在 500ml dH2O 中制备
乙酰胺 0.6g
CsCl 1.68g
葡萄糖 20g
KH2PO4 15g
MgSO4·7H2O 0.6g
CaCl2·2H2O 0.6g
调节 pH 至 4.5， 0.2 微米过滤灭菌 ； 置于 50℃烘箱使之加温， 添加琼脂， 混合， 倾倒平板。保存于室温。
1000x 盐 每升
FeSO4·7H2O 5g
MnSO4·H2O 1.6g
ZnSO4·7H2O 1.4g
Cocl2·6H2O 1g
添加至 1L 去离子 H2O。
0.2 微米过滤灭菌
实施例 8. 里氏木霉转化体的 α-1， 3 葡聚糖酶的表达
使用 1cm2 琼脂栓 (plug) 接种 Proflo 接种培养基。 以 200 转份钟摇动在 28℃下孵 育培养物。第二天， 将 10％无菌转移到生产培养基。以 200 转 / 分钟摇动在 28℃下孵育培 养物。第三天， 离心收获培养物。将上清除菌过滤 (0.2μm PES) 并保存于 4℃。SDS-PAGE 的分析鉴定表达各个 α- 葡聚糖酶基因的克隆。
实施例 9. 不溶葡聚糖基质 (substrate) 的制备
用来自 BHI 平板的茸毛链球菌 (Streptococcus sobrinus)(ATCC27607) 接种四个 含有 BHI( 脑心灌注液 ) 液体培养基的无菌烧瓶。培养物在 37℃下静置孵育 24 小时， 之后 可见浑浊。离心收获上清 ( 含有茸毛链球菌葡糖基转移酶 )(15 分钟， 10,000 转 / 分钟 )。 汇集上清， 除菌过滤 (0.22μm) 以除去任何剩余的细胞。在无菌情况下， 添加蔗糖至终浓度 5％， 其诱导葡糖基转移酶产生葡聚糖聚合物。将培养上清与蔗糖密封、 混合并保存于 37℃ 孵箱 24-48 小时 ( 静置 )。形成茸毛样沉淀， 通过离心收获 (10,000 转 / 分钟， 15 分钟 )。 倒出上清， 留下沉淀， 用去离子水清洗三遍， 最后置于配衡 Eppendorf 管。在 SpeedVac 干燥 葡聚糖， 干燥后记录 Eppendorf 的重量。
实施例 10. 用于检测克隆 α- 葡聚糖酶活性的 PAHBAH 还原糖测定
用以下列出的量， 将转化的里氏木霉培养上清、 缓冲液和不溶葡聚糖分配于圆底 96- 孔平板。使用两种类型缓冲液 (pH 4.5 和 pH 6.0) 比较活性水平。分配样品后， 密封 96 孔平板， 将其置于摇动 37℃孵箱过夜。
葡聚糖水解混合物 ：
50μL 培养上清
50μL 28mg/mL 葡聚糖溶液
5μL 1M 柠檬酸缓冲液 (pH 4.5 或 6.0)
105μL
PAHBAH 溶液 ：
0.5g 酒石酸钠钾
0.15g 对羟基苯甲酸酰肼 (PAHBAH)
10mL 2％ NaOH
孵育后， 将 150μL 新鲜制备的 PAHBAH( 对羟基苯甲酸酰肼 ) 试剂转移到含 20μL 每种水解混合物的 0.2mL PCR 管。然后， 轻轻混合这些管， 并置于热循环仪中， 在其中加热 至 99℃， 保持 30 分钟。移出 PCR 管， 将 150μL 每种样品转移到新鲜 96 孔平板。测定每种 样品 410nm 处的吸光度。该测定结果显示于图 3。26101998849 A CN 101998855
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除非另作说明， 术语 “洁齿剂” 指膏剂、 凝胶、 固体或液体的口腔护理组合物制剂。 洁齿剂的实例有牙膏、 牙齿凝胶和牙粉。洁齿剂可以是单相组合物或者可以是两种或更多 种分开的组合物的组合。 洁齿剂可以是任何期望的形式， 例如深条纹、 表面条纹、 多层、 具有 包围膏剂的凝胶或者其任何组合。 包含两种或更多种分开的组合物的洁齿剂中的每种组合 物可以包含于分配器中物理上分开的区室中并且并行分配。
本文使用的术语 “口腔科接受载体” 指用于口腔护理组合物中的安全且有效的物 质。这些物质包括氟离子来源、 抗钙物质、 缓冲剂、 研磨抛光物质、 过氧化物来源、 碱金属碳 酸氢盐、 增稠物质、 湿润剂、 水、 表面活性剂、 二氧化钛、 调味体系、 甜味剂、 木糖醇、 着色剂及 其混合物。
本文使用的术语 “牙齿” 或 “牙” 指天然牙齿以及假牙或牙科假体。 本文使用的术语 “牙 釉 质”指 通 常 可 见 并 且 主 要 由 包 括 羟 基 磷 灰 石 (hydroxylapatite) 的矿物质构成的牙齿部分。牙釉质涵盖人和动物牙齿中的天然牙釉质 以及用于替代受损或脱落的牙齿部分的牙釉质样物质， 包括用于此目的的树脂和瓷。
本文使用的术语 “牙石” 和 “牙垢” 可互换地用于表示矿化齿斑沉积物。
本文使用的术语 “糖萼” 指一些细菌、 上皮细胞以及其他细胞产生的细胞外聚合 物， 其在牙齿表面上形成包被， 并作为菌斑附着的基质。
本文使用的术语 “菌 斑”表 示 在 牙 齿 表 面 上 形 成 的 生 物 膜。 形 成 生 物 膜 的 微 生 物 主 要是 细菌， 包括但不限 于变 形链球菌 (Streptococcus mutans)、 厌氧链 球 菌 (Streptococcus anaerobes)、 梭杆菌属物种 (Fusobacterium spp.) 和放线杆菌属物种 (Actinobacteria spp.)。菌斑可以在糖萼上形成， 由其支持或者是其一部分。
齿斑中存在的微生物全部是口腔中天然存在的， 通常是无害的。 但是， 通过定期刷 牙无法除去菌斑意味着使得它们形成厚层。最靠近牙齿表面的那些微生物变为厌氧呼吸 ； 在此状态下它们开始产生酸。
本文使用的术语 “重组的” 指野生型宿主细胞中不存在、 不分泌或者表达模式改变 的多核苷酸或多肽。重组多肽和多核苷酸分别具有不同于野生型序列的序列， 具有不同于 野生型多肽和多核苷酸的时间或空间表达模式， 和 / 或以不同于野生型多肽和多核苷酸的 水平表达。重组分子可含有两种或多种以非天然发生的方式连接在一起的天然序列。重组 细胞含有重组多核苷酸或重组多肽。
本文使用的术语 “异源” 指彼此通常不相连的元件。例如， 如果宿主细胞产生异源 蛋白， 该宿主细胞中通常不产生该蛋白质。 同样地， 有效连接异源编码序列的启动子是有效 连接在野生型宿主细胞中其通常不有效连接的编码序列的启动子。 针对多核苷酸或蛋白质 的， 术语 “同源的” 表示宿主细胞中天然的多核苷酸或蛋白质。
本文使用的术语 “蛋白质” 和 “多肽” 可互换地用于表示肽键相连的氨基酸链。除 非另作说明， 多肽以标准的 N 端至 C 端的方向书写。
本文使用的 “信号序列” 是蛋白质的 N 端部分存在的氨基酸序列， 其有助于成熟形 式的蛋白质分泌出细胞。 信号序列的定义是功能性的， 尽管许多信号序列的结构是已知。 成 熟形式的细胞外蛋白质缺乏信号序列， 其在分泌过程中被切割掉了。
本文使用的 “编码序列” 是编码多肽的 DNA 部分。
本文使用的术语 “核酸” 涵盖 DNA、 RNA、 杂化物以及合成或化学修饰的核酸， 不论是 单链还是双链。术语 “核酸” 和 “多核苷酸” 可互换地用于表示由磷酸二酯、 硫酸二酯或类 似键连接的核苷链。除非另作说明， 多核苷酸以标准的 5′至 3′的方向书写。
本文使用的 “载体” 指设计用以将核酸引入一个或多个宿主细胞的多核苷酸。载 体可在不同宿主细胞中自主复制， 包括 ： 克隆载体、 表达载体、 穿梭载体、 质粒、 噬菌体颗粒、 表达盒等。
本文使用的 “表达载体” 指包含蛋白质编码区域的 DNA 构建物， 该编码区域与能够 实现蛋白质在合适宿主细胞中表达的合适控制序列有效连接。 这些控制序列可包括实现转 录的启动子、 控制转录产生 mRNA 的任选操纵子序列、 编码 mRNA 上合适核糖体结合位点的序 列以及增强子和控制转录和翻译终止的其他序列。
本文使用的 “启动子” 是引发下游核酸转录的调节序列。 本文使用的术语 “有效连接” 指允许元件以所述形式或表观形式发挥功能的元件 排列。例如， 如果启动子控制编码序列的转录， 则启动子与编码序列有效连接。
本文使用的术语 “选择性 / 选择标记” 指能够在宿主中表达的蛋白质， 其使得易于 选择含有引入核酸或载体的那些细胞。 选择标记的实例包括但不限于赋予抗微生物抗性的 蛋白质 ( 例如潮霉素、 博来霉素或氯霉素 ) 和 / 或赋予代谢优势的基因， 例如对于宿主细胞 的营养优势。
本文使用的术语 “来源于” 涵盖术语 “来自” 、 “获自” 或者 “可获自” 以及 “分离自” 。
本文使用的 “非致病” 生物体是指对人来说非病原性 ( 即， 疾病或造成疾病的 ) 的 生物体。
本文使用的术语 “回收的” 、 “分离的” 和 “分开的” 指从与其天然相关联的至少一 种组分中移出的蛋白质、 细胞、 核酸或氨基酸。
本文使用的术语 “转化的” 、 “稳定转化的” 和 “转基因的” 在针对细胞使用时表示 该细胞具有非天然 ( 例如异源 ) 核酸序列， 其整合进其基因组或者作为附加体质粒维持多 代。
本文使用的术语 “表达” 指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转 录和翻译。
在将核酸序列插入细胞内的背景中， 本文使用的术语 “引入” 表示 “转染” 或 “转化” 或 “转导” ， 包括核酸序列并入真核或原核细胞， 其中该核酸序列可并入细胞的基因组 ( 例 如染色体、 质粒、 质体或线粒体 DNA)， 转化为自主复制子或者瞬时表达 ( 例如转染的 mRNA)。
本文使用的术语 “相容的” 表示特定组合物的成分能够合并 ( 混合 )， 而没有显著 降低组合物中成分稳定性和 / 或效力的相互作用。
本文使用的术语 “锭剂” 包括但不限于 ： 薄荷糖、 锭剂、 软锭剂、 微胶囊和快速溶解 固体形式， 包括冻干形式 ( 饼、 薄片、 薄膜、 片剂 ) 和压制片剂。
本文使用的术语 “快速溶解的固体形式” 表示该固体剂型置于口腔或者含有牙科
假体的容器中后在小于约 60 秒、 小于约 15 秒、 或者小于约 5 秒内溶解的固体剂型。
数值范围涵盖定义其范围的数值。除非另作说明， 本文中使用的所有百分比和比 值是基于具体口腔组合物的重量， 而不是所递送的整个口腔制剂的重量。除非另作说明或 由上下文推知， 没有数词修饰的形式包括了复数形式。
为了便于阅读提供标题， 而不应视为限制。 除非另作说明或由上下文推知， 一个标 题下面所包括的说明一般作为整体适用于全文。
描述了示例性材料和方法， 但是其他方法和材料可得到类似的或等同的结果。所 有专利和公开， 包括这些专利和公开中公开的所有序列， 通过引用明确地并入本文。 具体实施方式
描述了关于具有 α- 葡聚糖酶活性的多肽的组合物和方法。该组合物和方法可用 于降低或预防菌斑的形成， 降低或预防促进形成菌斑的根本生理情况。
A. 多肽、 多核苷酸和宿主细胞
本发明组合物和方法的一个方面涉及分离的 α- 葡聚糖酶。在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶包含与成熟 Hypocea tawa 的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1的 38-635 位氨基酸残基 ) 具有至少 98％同一性 ( 例如至少 99％或 99.5％同一性 ) 的氨基 酸序列。在具体实施方案中， α- 葡聚糖酶包含成熟 H.tawa 的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1 的 38-635 位氨基酸残基 )。 在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶包含与成熟 Trichoderma konilangbra 的 α- 葡 聚糖酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸 ) 有至少 85％同一性 ( 例如至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性 ) 的氨基酸序列。 在具 体实施方案中， α- 葡聚糖酶包含成熟 T.konilangbra 的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸残基 )。
在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶包含与成熟里氏木霉的 α- 葡聚糖酶的氨基酸 序列 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸 ) 有至少 85％同一性 ( 例如至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性 ) 的氨基酸序列。在具体实施方案中， α- 葡聚糖酶包含不同于成熟里氏木霉的 α- 葡聚糖酶氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸 ) 的氨基酸序列。
在一些实施方式中， α- 葡聚糖酶类似于但不同于野生型 α- 葡聚糖酶。例如， 在 一些实施方式中， α- 葡聚糖酶具有与成熟 H.tawa 的 α- 葡聚糖酶 (SEQ ID NO ： 1 的 38-635 位氨基酸残基 ) 有至少 98％同一性但是不相同的氨基酸序列。 同样地， 在某些实施方案中， α- 葡聚糖酶可具有与成熟里氏木霉或者 T.konilangbra 的 α- 葡聚糖酶 ( 分别为 SEQ ID NO ： 2 的 38-622 位氨基酸或者 SEQ ID NO ： 3 的 38-627 位氨基酸 ) 有至少 85％同一性但是 不相同的氨基酸序列。
已知有超过 50 种不同的 α- 葡聚糖酶的氨基酸序列， 并保存于 NCBI 的 Genbank 数 据库， 包括来自黑曲霉 (Aspergillus niger)( 登录号 ： XP_001390909.1 ； GID ： 145236523)、 产 紫 青 霉 (Penicillium purpurogenum)( 登 录 号 ： AAF27912.1 ； GID ： 6752866)、 构巢裸 胞 壳 (Emericella nidulans)( 登 录 号 ： CAC48025.1 ； GID ： 15072711) 和 新 型 隐 球 酵 母 (Cryptococcusneoformans)( 登录号 ： AAW47079.1 ； GID ： 57230770) 的那些。以本专利申请
的最早提交日， 这些 Genbank 登录内容以其整体引入作为参考， 包括其中的核酸和蛋白质 序列以及这些序列的注释。描述 α- 葡聚糖酶中保守的结构域的条目存放于 NCBI 的保守 结构域数据库中的 pfam03659(Marchler-Bauer 等人 CDD ： a conserved domain database for interactivedomain family analysis.(2007)Nucleic Acids Res.35 ： D237-40)。来 自裂殖酵母 (S.pombe) 的 α- 葡聚糖酶的序列以及 α- 葡聚糖酶结构的讨论见于 Fuglsang 等人 ((2000)J.Biol.Chem.275 ： 2009-18)。
可 得 到 对 于 下 列 的 指 导， 即 可 改 变 氨 基 酸 以 产 生 H.tawa、 里氏木霉和 T.konilangbra 的野生型 α- 葡聚糖酶保留 α- 葡聚糖酶活性的变体， 例如， 通过比对这 些 α- 葡聚糖酶蛋白质的氨基酸序列， 鉴定在蛋白质中相同位置而蛋白质之间不同的氨 基酸， 以及将这些氨基酸从一个蛋白质转移到另一个。示例性序列对比显示于图 1， 以及 Fuglsang 等人 ( 见上文 )。
变体多肽可包含保守氨基酸取代， 其保留所取代氨基酸的总电荷、 疏水性 / 亲水 性和 / 或空间体积， 同时赋予该多肽其他有益生物化学性质。保守取代的非限制性实例包 括下列组之间的取代 ： Gly/Ala、 Val/Ile/Leu、 Lys/Arg、 Asn/Gln、 Glu/Asp、 Ser/Cys/Thr 和 Phe/Trp/Tyr。这些及其他保守取代显示于下表。
或者， 该氨基酸取代不是保守的， 其改变所取代氨基酸的总电荷、 疏水性 / 亲水性 和 / 或空间体积。
评价 α- 葡聚糖酶活性的测定描述于多个出版物， 包括 ： Fuglsang 等人 (supra)， Inoue 等人 ((1988)Carbohydr.Res.182 ： 277-86)， Ait-Lahsen 等人 ((2001)Appl.Environ. Microbiol.67 ： 5833-9)， 和 Sumitomo 等人 ((2007)Biochim.Biophys.Acta.1770 ： 716-24)。
还提供了编码该 α- 葡聚糖酶的分离多核苷酸， 以及含有该分离多核苷酸的重组 核酸。假定遗传密码已知， 可基于氨基酸序列容易地设计这些多核苷酸。在一个实施方案 中， 分离多核苷酸具有与下列核苷酸序列有至少 70 ％同一性 ( 例如至少 80 ％同一性、 至 少 90％同一性、 至少 95％同一性、 至少 98％同一性 ) 或者可在严格条件下杂交的核苷酸序 列， 该下列核苷酸序列即野生型 H.tawa 的 α- 葡聚糖酶基因或其编码序列 ( 例如分别为 SEQID NO ： 29 和 30)、 野生型里氏木霉的 α- 葡聚糖酶基因或其编码序列 ( 例如分别为 SEQ ID NO ： 31 和 32)、 或者野生型 T.konilangbra 的 α- 葡聚糖酶基因或其编码序列 ( 例如分 别为 SEQ ID NO ： 33 和 34)。在某些实施方案中， α- 葡聚糖酶的编码序列针对在所用宿主 细胞中表达 α- 葡聚糖酶经密码子优化。因为密码子使用表格列出了许多宿主细胞中每个 密码子的使用， 包括里氏木霉和多种其他酵母和细菌宿主细胞， 是本领域中已知的 ( 参见 例如 Nakamura 等人 (2000)Nucl.Acids Res.28 ： 292) 或者易于得到的， 只要有要待表达的 α- 葡聚糖酶氨基酸序列， 可容易地设计这些核酸。
还提供了含有重组核酸的表达载体和宿主细胞。在某些实施方案中， 宿主细胞是 细菌 ( 例如芽孢杆菌属物种 (Bacillus sp.) 或链霉菌属物种 (Streptomyces sp.) 宿主细 胞 ) 或者丝状真菌宿主细胞， 在某些情况下， 可以是不致病的， 即对人来说不致病的。在某 些实施方案中， 细胞可以是 FDA 认为是 GRAS 状态的 ( 即公认安全的 (Generally Recognized as Safe)) 具有用于生产蛋白质历史的丝状真菌菌株的细胞。
在 具 体 实 施 方 案 中， 本发明的真菌细胞可以是下列物种的细胞 ： 木霉属 (Trichoderma)( 例如里氏木霉 ( 之前归类为长梗木霉 (T.longibrachiatum)， 目前也称为 Hypocea jecorina)、 绿色木霉 (Trichodermaviride)、 康宁木霉 (Trichoderma koningii) 和 哈 茨 木 霉 (Trichodermaharzianum))、 青 霉 属 物 种 (Penicillium spp.)、 腐质霉属物 种 (Humicolaspp.)( 例 如 Humicola insolens 和 灰 腐 质 霉 (Humicola grisea))、 金孢 霉 属 物 种 (Chrysosporium spp.)( 例 如 C.lucknowense)、 粘 帚 霉 属 物 种 (Gliocladium spp.)、 曲 霉 菌 属 物 种 (Aspergillus spp.)( 例 如 米 曲 霉 (Aspergillus oryzae)、 黑曲 霉 (Aspergillus niger)、 构 巢 曲 霉 (Aspergillusnidulans)、 河 内 曲 霉 (Aspergillus
kawachi)、 棘 孢 曲 霉 (Aspergillusaculeatus)、 日 本 曲 霉 (Aspergillus japonicus)、 酱 油 曲 霉 (Aspergillus sojae) 和 泡 盛 曲 霉 (Aspergillus awamori) 和 镰 孢 霉 属 物 种 (Fusarium spp.)， 脉孢菌属物种 (Neurospora spp.)、 肉座菌属物种 (Hypocea spp.) 或者 裸孢壳属物种 (Emericella spp.)( 另外参见 Innis 等人 (1985)Science228 ： 21-26) 等等。 在一些实施方案中， 本发明的真菌细胞可以是黑曲霉菌株， 包括 ATCC 22342、 ATCC 44733、 ATCC 14331 以及来源于其的菌株。在一些实施方式中， 宿主细胞可以是其中天然基因已缺 失或失活的细胞。例如， 对应于蛋白酶基因的基因或者对应于纤维素酶基因的基因可缺失 或失活。
上述核酸可以存在于宿主细胞核基因组中或者可以存在于在宿主细胞中复制的 质粒中， 例如， 瞬时表达载体、 穿梭载体、 人工染色体等。
在具体实施方案中， α- 葡聚糖酶可以通过在真菌宿主细胞中表达融合蛋白质产 生， 该融合蛋白质含有与 α- 葡聚糖酶有效连接的信号序列。在此类实施方案中， α- 葡 聚糖酶可以分泌进培养基， 在其中其可被收获。融合蛋白质的信号序列可以是任何利于蛋 白质分泌出宿主细胞的信号序列。所用的信号序列可以是宿主细胞内源的或非内源， 在某 些实施方案中， 可以是已知高度分泌出木霉属物种或曲霉属物种宿主细胞的蛋白质信号序 列。这些信号序列包括但不限于 ： 纤维二糖水解酶 I、 纤维二糖水解酶 II、 内切葡聚糖酶 I、 内切葡聚糖酶 II、 内切葡聚糖酶 III、 α- 淀粉酶、 天冬氨酰蛋白酶、 葡糖淀粉酶、 甘露聚糖 酶、 糖苷酶和大麦内肽酶 B( 参见例如 Saarelainen(1997)Appl.Environ.Microbiol.63 ： 4938-40) 的信号序列。在具体实施方案中， 可以使用自身 ( 即内源 ) 信号序列分泌 α- 葡 聚糖酶。
在一些实施方案中， 通过引入核酸到宿主细胞中产生 α- 葡聚糖酶， 该核酸包含 与 α- 葡聚糖酶编码部分有效连接的编码信号序列的部分， 其中该核酸的翻译产生包含具 有 N 端信号序列的葡聚糖酶部分的融合蛋白， 该信号序列用以将 α- 葡聚糖酶分泌出宿主 细胞。
在具体实施方案中， 除了信号序列之外， 融合蛋白质可另外含有载体蛋白质， 其为 宿主细胞内源并且高度分泌的蛋白质的部分。合适的载体蛋白包括里氏木霉甘露聚糖酶 I(Man5A 或 MANI)、 里氏木霉纤维二糖水解酶 II(Cel6A 或 CBHII)( 参见例如 Paloheimo 等 人 (2003)Appl.Environ.Microbiol.69 ： 7073-82) 或者里氏木霉纤维二糖水解酶 I(CBHI) 的那些。在一个实施方案中， 载体蛋白是截短的里氏木霉 CBH1 蛋白， 包含 CBH1 核心区域和 CBH1 接头区域的部分。因此可使用编码融合蛋白质的核酸， 该融合蛋白质从氨基端至羧基 端有效连接信号序列、 载体蛋白质和本发明的 α- 葡聚糖酶。
除了编码序列之外， 核酸还可含有 α- 葡聚糖酶在宿主细胞中表达所需的其他元 件。 例如， 该核酸可含有转录编码序列的启动子和转录终止子。 可用于里氏木霉的示例性启 动子包括里氏木霉 cbh1、 cbh2、 egl1、 egl2、 eg5、 xln1 和 xln2 启动子， 或者其杂种或截短版 本。例如该启动子可以是里氏木霉 cbh1 启动子。合适的终止子包括里氏木霉 cbh1、 cbh2、 egl1、 egl2、 eg5、 xln1 和 xln2 终止子， 以及许多其他， 例如包括来自黑曲霉或河内黑曲霉 基因葡糖淀粉酶基因 (Nunberg 等人 (1984)Mol Cell Biol.4 ： 2306-15) ； Boel 等人 (1984) EMBO J.3 ： 1097-102 和 Boel 等人 (1984)EMBO J.3 ： 1581-85)、 构巢曲霉氨基邻苯甲酸酯合 酶基因、 米曲霉 TAKA 淀粉酶基因或者构巢曲霉 trpC(Punt 等人 (1987)Gene 56 ： 117-24) 的终止子。对于木霉菌属物种宿主细胞来说， 该启动子和 / 或终止子可以是天然的或非内源 的。
还提供了宿主细胞培养物 ( 即含有宿主细胞群体和生长培养基的组合物 )。培养 物的生长培养基可含有如上所述的 α- 葡聚糖酶。在某些实施方案中， 该细胞培养物可含 有生长培养基和上述细胞的群体。细胞培养物可用于通过在适于产生分离的 α- 葡聚糖酶 的条件下维持细胞培养物产生本发明的 α- 葡聚糖酶。如果 α- 葡聚糖酶分泌， 则其可从 生长培养基中收获。
丝状真菌表达蛋白质的方法包括其中细胞经改造产生分泌蛋白质的方法， 其包括 描述于美国专利 No.6,022,725 和 6,268,328， 以及公开的美国专利申请 No.20060041113、 20060040353、 20060040353 和 20050208623 中 的 那 些， 其 通 过 引 用 并 入 本 文。 另 外， 转 化曲霉菌株的一般方法公开于 Cao 等人 (2000)Protein Sci.9 ： 991-1001) 和 Yelton 等 人 (1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 ： 1470-74)， 转化木霉菌菌株的一般方法公开于 Nevalainen 等人 (1992) “The Molecular Biology of Trichoderma and itsApplication to the Expression of Both Homologous and HeterologousGenes” in Molecular Industrial Mycology， Leong 和 Berka 编辑， MarcelDekker Inc.， NY， 129-48 页 )。
如果分泌进培养基， 则 α- 葡聚糖酶可通过任何便利方法回收， 例如通过沉淀、 离 心、 亲和、 过滤或者任何其他本领域已知的方法。可使用， 例如亲和层析 (Tilbeurgh 等人 (1984)FEBS Lett.16 ： 215) ； 离子交换层析方法 (Goyal 等人 (1991)Biores.Technol.36 ： 37 ； Fliess 等 人 (1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17 ： 314 ； Bhikhabhai 等 人 (1984)J.Appl.Biochem.6 ： 336 ； 以 及 Ellouz 等 人 (1987)Chromatography396 ： 307)， 包括 使用高分辨率材料的离子交换 (Medve 等人 (1998)J.Chromatography A.808153 ； 疏水相互 作用层析 (Tomaz and Queiroz(1999)J.Chromatography A.865 ： 123 ； 两相分配 (Brumbauer 等人 (1999)Bioseparation 7 ： 287) ； 乙醇沉淀 ； 反相 HPLC ； 硅胶或者例如 DEAE 的阳离子 交换树脂上的层析 ； 层析聚焦 ； SDS-PAGE ； 硫酸铵沉淀 ； 或者凝胶过滤， 使用例如 Sephadex G-75。在具体实施方案中， α- 葡聚糖酶可在没有从培养基的其他成分纯化的情况下使用。 在这些实施方案中， 培养基可例如简单地浓缩， 然后在没有从生长培养基的成分进一步纯 化蛋白质的情况下使用， 或者在没有进一步修饰的情况下使用。
B. 口腔护理组合物
本发明组合物和方法的一个方面涉及口腔护理组合物。该口腔护理组合物含有 一种或多种该 α- 葡聚糖酶和口腔可接受载体。一种或多种 α- 葡聚糖酶的每一种可 以 0.0001wt ％至 5wt ％范围 ( 例如 0.0001wt ％至 0.0005wt ％、 0.0005wt ％至 0.001wt ％、 0.001wt ％ 至 0.005wt ％、 0.005wt ％ 至 0.01wt ％、 0.01wt ％ 至 0.05wt ％、 0.05wt ％ 至 0.1wt％、 0.1wt％至 0.5wt％、 0.5wt％至 1wt％或者 1wt％至 5wt％ ) 的浓度存在于组合物 中， 但是也设想此范围之外的浓度。该口腔护理组合物可由包括将 α- 葡聚糖酶与口腔可 接受赋形剂混合的方法制成。在某些情况下， 该方法还可包括包装口腔护理组合物。
该口腔护理组合物可以是例如洁齿剂、 牙膏、 牙粉、 局部口腔凝胶、 漱口水、 假牙产 品、 口喷雾、 锭剂、 口腔片剂或口香糖的形式。该口腔组合物也可合并在条带、 薄膜、 绒毛或 胶带上， 用以直接施用或粘附在口腔表面。
口腔可接受载体可包含一种或多种相容固体或液体填充稀释剂或者包装物质， 其适于局部口腔施用。 合适的载体或赋形剂包括如下文更详细描述的常用的和常规的洁齿剂 ( 包括非研磨凝胶和用于龈下施用的凝胶 )、 漱口水、 口喷雾、 口香糖和锭剂 ( 包括薄荷糖 ) 的成分。液体形式的本发明口腔护理组合物可优选具有约 4.0 至约 10.0 的 pH， 例如约 5.0 至约 8.0。
在一些实施方式中， 该载体基于组合物引入口腔的形式来选择。 例如， 如果使用牙 膏 ( 包括牙齿凝胶等 )， 则可选择 “牙膏载体” ( 包括例如研磨物质、 表面活性剂、 粘合剂、 润 湿剂、 调味剂和甜味剂等 ))， 例如 Benedict 的美国专利 No.3,988,433 中公开的。 如果使用 漱口水， 则可选择 “漱口水载体” ( 包括例如水、 调味剂和甜味剂等 )， 例如 Benedict 的美国 专利 No.3,988,433 所公开的。如果使用口喷雾， 则可选择 “口喷雾载体” ， 或者如果使用锭 剂， 这可选择 “锭剂载体” ( 例如糖果基质 (base))。如果使用口香糖， 则可选自 “口香糖载 体” ( 包括例如口香糖基质、 调味剂和甜味剂 )。如果使用香粉， 则可选自 “香粉载体” (例 如香粉、 调味剂和甜味剂 )。 如果使用龈下凝胶 ( 用于递送活性物质至牙周袋内或者牙周袋 周围 )， 则可选自 “龈下凝胶载体” 。适于制备本发明组合物的其他可用载体是本领域公知 的。它们的选择可取决于例如味道、 成本、 保存期、 对无糖或无盐组合物的需要等次要考虑 因素。
在一些实施方式中， 该组合物可以是非研磨凝胶的形式， 例如龈下凝胶， 其可以是 水性或非水性的。水性凝胶通常包括增稠剂 ( 约 0.1％至约 20％ )、 湿润剂 ( 约 10％至约 55％、 调味剂 ( 约 0.04％至约 2％ )、 甜味剂 ( 约 0.1％至约 3％ )、 着色剂 ( 约 0.01％至约 0.5％ ) 以及用于平衡的水。在某些情况下， 该组合物可包含防龋齿物质 ( 约 0.05％至约 0.3％， 如氟离子 ) 和防牙石物质 ( 约 0.1％至约 13％ )。
在其他一些的实施方式中， 该组合物也可以是洁齿剂的形式， 例如牙膏、 牙齿凝胶 或牙粉。 这些牙膏和牙齿凝胶的成分可包括一种或多种牙齿研磨剂 ( 约 5％至约 50％ )、 表 面活性剂 ( 约 0.5％至约 10％ )、 增稠剂 ( 约 0.1％至约 5％ )、 湿润剂 ( 约 10％至约 55％ )、 调味剂 ( 约 0.04％至约 2％ )、 甜味剂 ( 约 0.1％至约 3％ )、 着色剂 ( 约 0.01％至约 0.5％ ) 和水 ( 约 2％至约 45％ )。 这些牙膏或牙齿凝胶也可包含一种或多种防龋齿物质 ( 约 0.05％ 至约 0.3％， 如氟离子 ) 和防牙石物质 ( 约 0.1％至约 13％ )。牙粉可含有基本上全部为非 液体的成分。
一种示例性洁齿剂组合物描述于美国专利 No.6,238,648， 其具有下列组成 (w/ w) ：
甘油 14.0
聚乙二醇 300 4.5
二氧化硅 21.5
焦磷酸四钠 4.5
水 23.5
黄原胶 0.3
羧甲基纤维素 0.5
氟化钠 0.2
香料 1.0
月桂基硫酸钠 (27.9％溶液 ) 4.5糖精钠 0.4 二氧化钛 0.4 碳酸氢钠 0.9 无水碳酸钠 1.4 Poloxamer 407 1.8 木糖醇 10.0 丙二醇 10.6 总计 100.00 另一种示例性洁齿剂组合物描述于美国专利 No.5,578,295， 其具有下列组成 (w/ 三氯生二磷酸盐 (Triclosan diphosphate) 1 山梨糖醇 33 糖精 0.46 二氧化硅 22 NaF 0.243w) ：
甘油 9
NaOH(50％ ) 0.2
Carbopol 0.2
Keltrol 0.6
TiO2 0.5
烷基硫酸钠 (28％溶液 ) 4
PEG 6
3FD&C Blue#1(1％溶液 ) 0.05
香料 1.1
水 适量
在一些实施方式中， 该组合物是嗽口水， 包括口喷雾。 这些嗽口水和口喷雾的成分 通常包括下列一种或多种 ： 水 ( 约 45％至约 95％ )、 乙醇 ( 约 0％至约 25％ )、 润湿剂 ( 约 0％至约 50％ )、 表面活性剂 ( 约 0.01％至约 7％ )、 调味剂 ( 约 0.04％至约 2％ )、 甜味剂 ( 约 0.1％至约 3％ ) 和着色剂 ( 约 0.001％至约 0.5％ )。这些嗽口水和口喷雾还可包含 下列一种或多种 ： 防龋齿物质 ( 约 0.05％至约 0.3％， 如氟离子 ) 和防牙石物质 ( 约 0.1％ 至约 3％ )。
在某些实施方案中， 该组合物可以是牙科溶液， 包括冲洗流体。 这些牙科溶液的成 分通常包括下列一种或多种 ： 水 ( 约 90％至约 99％ )、 防腐剂 (0.01％至约 0.5％ )、 增稠剂 ( 约 0％至约 5％ )、 调味剂 ( 约 0.04％至约 2％ )、 甜味剂 ( 约 0.1％至约 3％ ) 和表面活性 剂 ( 约 0％至约 5％ )。
口香糖组合物通常包含下列一种或多种 ： 树胶基质 ( 约 50％至约 99％ )、 调味剂 ( 约 0.4％至约 2％ ) 和甜味剂 ( 约 0.01％至约 20％ )。
锭剂可包括包含调味基质中治疗剂的盘状固体。该基质可以是硬糖、 甘油胶或具 有足够胶水使其成形的糖的组合。这些剂型是本领域中通常公知的。在另一个实施方案中， 本发明提供了注入本文所提供组合物的牙科装置。该牙科 装置可包括接触牙齿及口腔中其他组织的装置， 该装置浸入包含氧化酶和聚乙烯亚胺或山 梨糖醇的组合物。该牙科装置可以是浸渍纤维的形式， 其包括牙线或胶带、 芯片、 条、 膜、 牙 签以及聚合物纤维。
可存在于口腔可接受载体中的示例性材料如下所述。
研磨剂
牙齿研磨剂包括许多不同的材料。所选的材料可以是在目的组合物中相容的， 可 能不过分磨损牙质。适宜的研磨剂可包括， 例如， 二氧化硅包括凝胶和沉淀、 不溶聚偏磷酸 钠、 水合氧化铝、 碳酸钙、 正磷酸二钙二水合物、 焦磷酸钙、 磷酸三钙、 聚偏磷酸钙和树脂研 磨材料例如尿素和甲醛缩合产物的颗粒。
用于该组合物的一类研磨剂是颗粒化热凝固聚合树脂。适宜的树脂包括， 例如 三聚氰胺、 酚醛树脂、 尿素、 三聚氰胺 - 尿素、 三聚氰胺 - 甲醛、 尿素 - 甲醛、 三聚氰胺 - 尿 素 - 甲醛、 交联环氧化物和交联聚酯。
可选择多种类型的二氧化硅牙齿研磨剂， 因为其有益于牙齿清洁和磨光性能， 而 不过度磨损牙釉质或牙质。二氧化硅研磨剂磨光材料， 以及其他研磨剂可具有约 0.1 至约 30 微米或者约 1 至约 15 微米范围的平均粒度。该研磨剂可以是沉淀的二氧化硅或二氧化 硅凝胶例如二氧化硅干凝胶。 也可使用研磨剂混合物。洁齿剂组合物中研磨剂总量可以为约 6％至约 70％重 量。以组合物重量计， 牙膏可含有约 10％至约 50％的研磨剂。溶液、 口喷雾、 嗽口水和非研 磨凝胶组合物可以不含研磨剂。
表面活性剂
本发明组合物还可含有表面活性剂， 例如肌氨酸盐表面活性剂、 羟乙基磺酸盐表 面活性剂或牛磺酸盐 (taurate) 表面活性剂。在某些实施方案中， 该组合物可含有这些表 面活性剂的碱金属盐或铵盐。 在某些情况下， 该组合物可含有下列的钠钾和钾盐 ： 月桂酰肌 氨酸、 十四酰肌氨酸、 棕榈酰肌氨酸、 硬脂酰肌氨酸和油酰肌氨酸。其他合适的相容表面活 性剂可用于替代这些表面活性剂或与之组合。
合适的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐的水溶盐， 其烷基具有 10 至 18 个碳原 子， 以及具有 10 至 18 个碳原子的脂肪酸的磺酸化单酸甘油酯的水溶盐。十二烷基硫酸钠 和椰子单酸甘油酯磺酸钠是该类型阴离子表面活性剂实例。 也可利用阴离子表面活性剂混 合物。
合适的阳离子表面活性剂包括具有一个约 8 至 18 个碳原子的长烷基链的脂肪族 季铵化合物的衍生物， 例如月桂基三甲基氯化氨 ； 氯化十六烷基吡啶鎓 (cetyl pyridinium chloride) ； 十六烷基三甲基溴化铵 ； 二 - 异丁基苯氧乙基 - 二甲基苯甲基氯化铵 ； 椰油基 三甲基亚硝酸铵 ； 氟化十六烷基吡啶鎓 (cetyl pyridinium fluoride) 等。 在某些情况下， 表面活性剂化合物可以是具有去污剂性能的季铵氟化物。 一些阳离子表面活性剂可作为组 合物中的杀菌剂。
适宜的非离子型表面活性剂包括烯基氧化物 (alkylene oxide) 基团 ( 本质上亲 水 ) 与有机疏水化合物缩合产生的化合物， 该有机疏水化合物可以本质上是脂肪族或者烷 基芳香族的。实例包括普卢兰尼克 (Pluronics)、 烷基酚的聚环氧乙烷缩合物、 来源于环氧
乙烷与环氧丙烷和乙二胺反应产物缩合的产物、 脂族醇的环氧乙烷缩合物、 长链叔胺氧化 物、 长链叔膦氧化物、 长链二烷基亚砜和这些物质的混合物。
合适的两性离子合成表面活性剂包括脂肪族季铵、 磷鎓和有机四价硫化合物的衍 生物， 其中该脂烃基可以是直链或支链的， 其中脂肪取代基之一含有约 8 至 18 个碳原子， 之 一含有阴离子水溶性基团， 例如羧基、 磺酸基、 硫酸基、 磷酸基或膦酸基。
合适的甜菜碱表面活性剂包括癸基甜菜碱或 2-(N- 癸基 -N， N- 二甲基胺基 ) 醋酸 酯、 椰油基甜菜碱或 2-(N- 椰油基 -N， N- 二甲基胺基 ) 醋酸酯、 十四烷基甜菜碱、 棕榈基甜 菜碱、 月桂基甜菜碱、 鲸蜡基甜菜碱、 鲸蜡基甜菜碱、 硬脂基甜菜碱等。 酰胺甜菜碱例如椰油 酰胺乙基甜菜碱、 椰油酰胺丙基甜菜碱、 月桂酰胺丙基甜菜碱等。在某些实施方案中， 该组 合物的甜菜碱是椰油酰胺丙基甜菜碱或月桂酰胺丙基甜菜碱。
以总组合物重量计， 表面活性剂可以约 0.1％至约 2.5％、 约 0.3％至约 2.5％或者 约 0.5％至约 2.0％范围的浓度存在。
防菌斑物质
该组合物还可包含抗菌斑物质， 例如合成阴离子聚合物， 例如聚丙烯酸酯或者马 来酸酐或酸和甲基乙烯基醚的共聚物， 以及聚氨基丙磺酸 (polyamino propane sulfonic acid， AMPS)、 柠檬酸锌三水合物、 多肽 ( 例如聚天冬氨酸和聚谷氨酸 ) 和其混合物。
螯合剂
该组合物可包含螯合剂。螯合剂包括酒石酸和其可药用盐、 柠檬酸和柠檬酸碱金 属盐以及其混合物。螯合剂可螯合细菌细胞壁中存在的钙。螯合剂还可通过将钙从有助于 保持生物质完整的钙桥除去从而破坏菌斑。不应使用可导致牙齿脱矿化的螯合剂。
在一些实施方式中， 该组合物中存在柠檬酸碱金属盐 ( 例如柠檬酸钠和钾 )。 在某 些情况下， 螯合剂包括柠檬酸 / 柠檬酸碱金属盐的组合。在其他一些情况下， 可使用酒石酸 碱金属盐。 其他物质包括酒石酸二钠、 酒石酸二钾、 酒石酸钾钠、 酒石酸氢钠和酒石酸氢钾。 酒石酸盐螯合剂可单独使用或者与其他任选的螯合剂联合使用。在某些实施方案中， 这些 1 5 螯合剂具有约 10 至 10 的钙结合常数， 以提供菌斑形成减少的改善清洗。
另一组螯合剂是阴离子聚合物聚羧酸。这些物质是本领域公知的， 以它们的游离 酸形式使用， 部分或完全中和的水溶性碱金属 ( 例如钾， 优选钠 ) 或铵盐。在某些情况下， 组合物含有 1 ∶ 4 至 4 ∶ 1 的马来酸酐或酸与另一种可聚合烯属不饱和单体的共聚物， 例 如平均分子量 (AMW) 为约 30,000 至约 1,000,000 的甲基乙烯基醚 ( 甲氧乙醚 )。
其他有效的聚合聚羧酸可包括下列这些， 例如马来酸酐与丙烯酸乙酯、 甲基丙烯 酸羟、 N- 乙烯基 -2- 吡咯烷酮或乙烯的 1 ∶ 1 共聚物， 以及丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯或甲基 丙烯酸羟乙酯、 丙烯酸甲酯或丙烯酸乙酯、 异丁基乙烯醚或 N- 乙烯基 -2- 吡咯烷酮的 1 ∶ 1 共聚物。
其他的有效聚合聚羧酸可以是马来酸酐与苯乙烯、 异丁烯或乙基乙烯基醚的共聚 物、 聚丙烯酸、 聚衣康酸和聚马来酸、 以及 AMW 低至 1000 的磺基乙酰化低聚物。
螯合剂的量可以是约 0.1 ％至约 2.5 ％、 约 0.5 ％至约 2.5 ％或者约 1.0 ％至约 2.5％。
氟化物来源
在某些实施方案中， 口腔护理组合物中可存在水溶性氟化物化合物， 其存在的量足以提供组合物中 25℃下约 0.0025wt％至约 5.0wt％或者约 0.005wt％至约 2.0wt％的氟 离子浓度。多种产生氟离子的物质可用作本发明组合物中可溶性氟化物的来源。代表性氟 离子来源可包括氟化亚锡、 氟化钠、 氟化钾、 单氟代磷酸钠等等。 在某些情况下， 本发明组合 物包含氟化亚锡和氟化钠以及其混合物。
牙齿增白活性剂和牙齿颜色调节物
口腔护理组合物中还可存在牙齿增白剂和 / 或牙齿颜色调节物。这些物质适于调 节牙齿的颜色。 这些物质可包括在施用到牙齿表面上时调节表面的光吸收和或光反射的颗 粒。当含有这些颗粒的薄膜施加到牙齿表面时， 这些颗粒可提供外观上的益处。
颗粒包括常用于化妆品领域的染料和着色剂。 对用于本发明组合物的染料和或着 色剂没有特别的限制。染料和着色剂包括无机白色染料、 无机彩色染料、 珠光剂、 填充粉末 等等。具体的实例可选自 ： 滑石、 云母、 碳酸镁、 碳酸钙、 硅酸镁、 硅酸镁铝、 二氧化硅、 二氧 化钛、 氧化锌、 红色氧化铁、 褐色氧化铁、 黄色氧化铁、 黑色氧化铁、 氰铁酸铵铁、 锰紫、 群青、 尼龙粉末、 聚乙烯粉末、 异丁烯酸粉末、 聚苯乙烯粉末、 丝粉末、 结晶纤维素、 淀粉、 钛酸盐云 母、 氧化铁钛酸盐云母、 氯氧化铋和其混合物。在某些实施方案中， 使用二氧化钛、 氯氧化 铋、 氧化锌或其混合物。
该染料可用作遮光剂和着色剂。 这些染料可以以经处理的颗粒使用或者以自身作 为原始染料使用。典型染料水平可选择成对消费者所预期的有特别的冲击。例如， 对于特 别黑或脏的牙齿， 可使用足以使得牙齿发亮的染料。 另一方面， 当个体的牙齿或牙齿上的斑 点比其他牙齿更亮时， 可使用使得牙齿变暗的染料。染料和着色剂的水平可以组合物的约 0.05％至约 20％、 约 0.10％至约 15％或者约 0.25％至约 10％的范围使用。
增稠剂
在某些实施方案中， 例如牙膏或凝胶， 一些增稠剂可提供组合物的一致性、 使用后 的活性释放特征、 保存稳定性以及组合物的稳定性等等。增稠剂包括聚羧乙烯、 角叉菜胶、 羟乙基纤维素、 合成锂皂石和纤维素醚的水溶性盐例如羧甲基纤维素钠和羧甲基羟乙基纤 维素钠。也可使用天然树胶， 例如刺梧桐树胶、 黄原胶、 阿拉伯树胶和黄芪胶。可使用胶体 硅酸镁铝或者细二氧化硅粉作为增稠剂的一部分来进一步改善质地。
增稠剂或胶凝剂可包括一类与季戊四醇的烷基醚或蔗糖的烷基醚交联的丙烯酸 的均聚物、 卡波姆或其混合物。
分子量在约 1000 至约 120000( 数均 ) 的丙交酯和乙交酯单体的共聚物可用于本 发明组合物， 例如 “龈下凝胶” 。
以牙膏或凝胶组合物总重量计， 增稠剂可以约 0.1％至约 15％、 约 2％至约 10％或 者约 4％至约 8％的量使用。口香糖、 锭剂 ( 包括薄荷糖 )、 香粉、 非研磨凝胶和龈下凝胶可 使用高浓度。
湿润剂
在某些实施方案中， 本发明组合物的局部口腔载体可包括湿润剂。湿润剂可用于 防止本发明组合物在暴露于空气后变硬， 使得组合物带给口湿润的感觉， 对于特定湿润剂， 给予牙膏组合物希望的甜味。 基于纯的湿润剂， 以本文组合物的重量计， 该湿润剂可包含约 0％至约 70％或者约 5％至约 25％。合适用于本发明组合物的湿润剂包括可食用多元醇例 如丙三醇、 山梨糖醇、 木糖醇、 丁二醇、 聚乙二醇和丙二醇。在某些情况下， 该湿润剂是山梨糖醇和 / 或丙三醇。
调味剂和甜味剂
组合物中也可加入调味剂。合适的调味剂包括冬青油、 薄荷油、 留兰香油、 丁香花 蕾油、 薄荷醇、 茴香醇、 水杨酸甲酯、 桉树醇、 桂皮、 1- 乙酸薄荷酯、 鼠尾草、 丁香酚、 欧芹油、 oxanone、 α- 紫罗兰酮、 甘牛至草、 柠檬、 橙、 丙烯基乙基愈创木酚、 肉桂、 香草醛、 麝香草酚、 芳樟醇、 肉桂醛甘油乙缩醛 ( 称为 CGA(cinnamaldehyde glycerol acetal)) 以及其混合 物。以组合物的重量计， 调味剂可以约 0.001％至约 5％的水平用于组合物。
合适的甜味剂包括蔗糖、 葡萄糖、 糖精、 右旋糖 (dextrose)、 左旋糖、 乳糖、 甘露醇、 山梨糖醇、 果糖、 麦芽糖、 木糖醇、 糖精盐、 非洲竹芋甜素、 阿司帕坦、 D- 色氨酸、 二氢查耳酮、 乙酰舒泛、 环磺酸盐、 环拉酸钠或糖精钠以及其混合物。以组合物重量计， 组合物可含有约 0.1％至约 10％或者约 0.1％至约 1％的这些物质。
除了调味剂和甜味剂之外， 冷却剂、 流涎剂、 加热剂和麻木剂可用作本发明组合物 的任选成分。以组合物的重量计， 这些物质可以约 0.001％至约 10％或者约 0.1％至约 1％ 的水平存在于组合物中。
冷却剂可以是多种材料中的任意种。这些材料中包括羧酰胺、 薄荷醇、 缩酮、 二醇 以及其混合物。示例性冷却剂有对孟烷氨基甲酰 (paramenthancarboxyamide) 物质， 例如 N- 乙基 - 对孟烷 -3- 羧酰胺、 N， 2， 3- 三甲基 -2- 异丙基丁酰胺以及其混合物。其他冷却剂 可选自薄荷醇、 3-1- 甲氧基丙烷 -1， 2- 二醇、 薄荷酮甘油乙缩醛和乳酸薄荷酯。 术语薄荷醇 和薄荷基包括这些化合物右旋和左旋异构体以及其外消旋混合物。
加热剂包括辣椒和烟酸酯， 例如烟酸苯甲酯。麻木剂可包括苯佐卡因、 利多卡因、 丁香花蕾油和乙醇。
碱金属碳酸氢盐
该组合物还可包含碱金属碳酸氢盐。 碱金属碳酸氢盐可溶于水， 除非是稳定， 否则 可在水体系中释放二氧化碳。碳酸氢钠， 也称为小苏打， 可以碱金属碳酸氢盐的形式存在。 在某些实施方案中， 该组合物含有约 0.5％至约 30％、 约 0.5％至约 15％、 或者约 0.5％至约 5％的碱金属碳酸氢盐。
其他载体 (Miscellaneous Carriers)
该口腔护理组合物的制备中所用的水可以是低离子含量的， 没有有机杂质， 以重 量计， 可以水性组合物的约 5％至约 70％、 或者约 20％至约 50％的量存在。这些水分含量 可包括所加入的自由水， 以及其他试剂或载体引入的水。
泊洛沙姆可用于该组合物中。泊洛沙姆可归类为非离子表面活性剂。其可用作乳 化剂、 粘合剂或稳定剂， 或者履行相关功能。泊洛沙姆包括分子量为 1000 至高于 15000 的 以伯醇羟基为末端的双官能封闭聚合物。
可用于该组合物的其他乳化剂包括聚合物乳化剂。 主要为高分子量的聚丙烯酸聚 合物可用作乳化剂。
组合物中也可加入二氧化钛。二氧化钛是可使得组合物不透明的白色粉末。二氧 化钛可包含组合物重量的约 0.25％至约 5％。
该组合物的 pH 优选通过使用一种或多种缓冲剂来调节。缓冲剂指可用于在约 pH 4.0 至约 pH 10.0 范围内调节组合物 pH 的物质。缓冲剂包括磷酸单钠、 磷酸三钠、 氢氧化钠、 碳酸钠、 酸式焦磷酸钠、 柠檬酸和柠檬酸钠。以本发明组合物的重量计， 缓冲剂可以约 0.5％至约 10％的水平施用。在某些实施方案中， 洁齿剂组合物的 pH 可由 3 ∶ 1 的水性洁 齿剂浆测量， 例如 3 份水比 1 份洁齿剂。
可用于本发明组合物的其他物质包括聚二甲基硅氧烷共聚醇， 其选自烷基 - 和烷 氧基 - 聚二甲基硅氧烷共聚醇， 例如 C12 至 C20 烷基聚二甲基硅氧烷共聚醇以及其混合物。 在某些情况下， 该组合物含有十六烷基聚二甲基硅氧烷共聚醇。该聚二甲基硅氧烷共聚醇 可以约 0.01wt％至约 25wt％、 约 0.1wt％至约 5wt％或者约 0.5wt％至约 1.5wt％的水平存 在。该聚二甲基硅氧烷共聚醇可有助于提供积极的牙齿感觉益处。
其他活性剂
本发明口腔护理组合物还可包含其他活性剂， 例如抗微生物剂。这些试剂包括不 溶于水的非阳离子抗微生物剂， 例如卤化二苯醚、 酚类化合物包括苯酚及其同系物、 单和聚 烷基和芳香卤代苯酚、 间苯二酚和其衍生物、 联苯酚化合物和卤化水杨酰苯胺、 安息香酯和 卤化二苯脲。水溶性抗菌剂包括季铵盐和双 biquamide 盐， 等等。额外的水溶性抗微生物 剂是三氯生单磷酸盐。 季铵试剂包括下列那些， 即其中四元氮上一个或两个取代基具有约 8 至约 20 或者约 10 至约 18 个碳原子长的碳链 ( 通常为烷基 )， 而剩余取代基 ( 通常为烷基 或苯甲基 ) 具有较低数目的碳原子， 例如约 1 至约 7 个碳原子例如甲基或乙基。十二基三 甲基溴化铵、 氯化十四基吡啶、 度米芬、 氯化 N- 十四基 -4- 乙基吡啶、 十二基二甲基 (2- 苯 氧乙基 ) 溴化铵、 苯甲基二甲基十八基氯化铵、 氯化十六烷基呲啶、 季铵化 5- 氨基 -1， 3- 双 (2- 乙基 - 己基 )-5- 甲基 - 六氢吡啶、 氯化苯甲烃铵、 氯化苄乙氧铵和甲基氯化苄乙氧铵 是示例性季铵抗菌剂。其他化合物是双 [4-(R- 氨基 )-1- 吡啶 ] 烷烃。也可包含其他抗菌 剂， 例如甘氨酸亚铜、 甘氨酸铜、 柠檬酸锌和乳酸锌。
除了 α- 葡聚糖酶之外， 本发明口腔护理组合物还可含有一种或多种具有碳水化 合物水解活性、 抗菌活性或牙齿增白活性的其他酶。 这些酶包括但不限于 ： 脱氨酶、 酯酶、 糖 苷酶、 葡聚糖水解酶、 糊精酶、 淀粉酶、 转葡糖苷酶、 纤维素酶、 半纤维素酶、 脂肪酶、 氧化酶、 过氧化物酶、 蛋白酶和脲酶。
C. 使用方法
本发明组合物和方法的另一个方面是将牙齿表面与包含 α- 葡聚糖酶的组合物 相接触从而减少或预防牙齿损坏或者减少或预防牙齿损坏之根本原因的方法。
在一些实施方案中， 方法包括将牙齿表面与包含 α- 葡聚糖酶的组合物相接触以 水解牙齿表面上存在的糖萼。根据该实施方案， α- 葡聚糖酶的 1， 3-α-D- 葡糖苷酶活性 和 / 或 α- 葡聚糖酶的其他活性水解多糖、 葡聚糖、 甘露聚糖和 / 或菌斑细菌产生的粘性分 子， 从而减少菌斑粘附到牙齿表面的能力， 减少菌斑的形成或者降低已有菌斑的水平。 这些 多糖、 葡聚糖、 甘露聚糖和 / 或粘性分子可存在于通常称为糖萼的部分之中。
在一些实施方案中， 该方法包括将牙齿表面与包含 α- 葡聚糖酶的组合物相接触 从而通过破坏口腔中细菌所产生的多糖、 葡聚糖、 甘露聚糖和 / 或粘性分子使得牙齿表面 脱水， 由此减少膜形成或细菌附着， 和 / 或预防损伤牙齿表面的细菌酸性和其他物质的积 累。
该方法可包括将牙齿表面与一种或多种 α- 葡聚糖酶相接触， 其如上该配制。该 方法可包括将牙齿表面与额外的酶相接触， 其可存在于同一制剂或不同制剂中。在一些实施方案中， 该酶不限于 ： 脱氨酶、 酯酶、 糖苷酶、 葡聚糖水解酶、 糊精酶、 淀粉酶、 转葡糖苷酶、 纤维素酶、 半纤维素酶、 脂肪酶、 氧化酶、 过氧化物酶、 蛋白酶和脲酶。该额外的酶也可是其 他的 α- 葡聚糖酶。
牙 齿 以 及 其 他 个 人 护 理 组 合 物 和 它 们 的 作 用 机 制 详 细 描 述 于 Lad.R.( 编 辑 )“Biotechnology in Personal Care” ， Cosmetic Science andTechnology Series， 第 29 卷， Taylor and Francis Group， New York， NY， USA， 2006。该参考文献标志着现有技术 的状态， 并入本文。
除了口腔护理应用之外， 本发明组合物和方法可改造以适于在很多其他情况下预 防或除去生物膜， 例如在冷却水装置中、 在饮用水装置中、 在食品和食品加工装置中、 在医 学植入物上 ( 或内 )、 在造纸和纺织制造和加工中、 在炼油和采矿装置中、 在船舶的船体上、 在化学制造中、 在游泳池中、 水族馆中和池塘中等。在此类情况下， α- 葡聚糖酶可用于破 坏生物膜中存在的多糖成分， 从而减少微生物附着和 / 或粘着到表面。这些多糖的破坏还 导致脱水， 其减少或防止适于表面上微生物生长和繁殖的微环境的形成。
根据本公开， 本发明组合物和方法的其他方面和实施方案对于本领域技术人员来 说是显而易见的。
实验
提供下列实施例以说明本发明组合物和方法以及其益处， 并且不应将其视为对它 们范围的限制。
实施例 1、 候选真菌 α-1， 3- 葡聚糖酶 (EC 3.2.1.59) 的鉴定
一些候选真菌， 包括 Hypocea tawa、 里氏木霉、 Trichodermakonilangbra 和哈茨木 霉在含有 15％麦芽糖的限定培养基中的培养物中培养 (28℃， 7 天， 150 转 / 分钟搅拌 )。通 过除菌过滤收集上清， 浓缩并脱盐， 用于葡聚糖 ( 和右旋糖 ) 水解活性筛选。将脱盐的培养 上清 (5％体积 ) 加入 100mM 磷酸盐缓冲液 pH 6.3( 或者 100mM 醋酸盐缓冲液， pH 4.5) 中 0.2％清洗过的不溶葡聚糖。 在 37-40℃下过夜孵育反应混合物。 目视检查该混合物的不溶 葡聚糖的溶解， 通过 HPLC 分析上清的可溶性水解产物。对于 HPLC 分析， 将反应上清 10 倍 稀释进 10mM NaOH， 然后将 10μl 注入装备有电化学检测的安捷伦 1100HPLC。用 NaOH/ 乙 酸钠梯度在 PA1 阴离子交换柱上洗脱单糖和二糖。基于之前的运行标准鉴定未知混合物的 成分。来自里氏木霉、 Trichoderma konilangbra 和 Hypocrea tawa 的上清得到葡聚糖最 大程度的溶解 ( 参见例如图 2)。选择 H.tawa、 里氏木霉和 T.konilangbra 的 α-1， 3- 葡聚 糖酶用于克隆、 表达和表征。通过同源性， 鉴定基因组序列 (JGI) 中的推定里氏木霉 α-1， 3- 葡聚糖酶序列。
实施例 2. 基因组 DNA 的分离
通过在生物安全柜中将 30ml 无菌 YEG 液体培养基添加到三个 250ml 带挡板锥形 瓶制备里氏木霉、 T.konilangbra 和 H.tawa 的真菌培养物。使用无菌塑料环从每种真菌培 养物平板上切下 1x1 英寸方形并移出置于合适的培养瓶。 然后将接种的培养瓶置于 28℃摇 床孵箱， 培养过夜。
从摇床孵箱中取出里氏木霉、 T.konilangbra、 H.tawa 培养物， 将每个瓶的内容物 倒入独立的无菌 50mL Sarstedt 管。将 Sarstedt 管置于台式离心机中， 以 4,500 转 / 分钟 离心 10 分钟， 使得真菌菌丝沉淀。弃去上清， 将满接种环的每种菌丝样品转移到含裂解介质 (FastDNA) 的独立管。使用 FastDNA 试剂盒 (Qbiogene) 根据制造商针对藻类、 真菌和酵 母的方案从收获的菌丝提取基因组 DNA。匀浆时间 (Mini BeadBeater-8) 为 25 秒。基因组 DNA 的量和品质由凝胶电泳确定。
实施例 3. 通过 PCR 获得 α- 葡聚糖酶多肽
A. 里氏木霉
通过同源性鉴定里氏木霉基因组 (JGI) 中的推定 α-1， 3 葡聚糖酶基因。基于推 定同源 DNA 序列设计里氏木霉的 PCR 引物。基于推定里氏木霉蛋白质序列和其他公开的 α-1， 3 葡聚糖酶蛋白质序列设计针对 T.konilangbra 或 H.tawa 的简并 PCR 引物。
里氏木霉特异性 PCR 引物 ：
SK592 ： 5′ -CACCATGTTTGGTCTTGTCCGC(SEQ ID NO ： 6)
SK593 ： 5′ -TCAGCAGTACTGGCATGCTG(SEQ ID NO ： 7)
用于从提取自里氏木霉菌株 RL-P37 的基因组 DNA 中扩增推定 α-1， 3 葡聚糖酶的 PCR 条件如下 ： 1.94℃ 2 分钟， 2.94℃ 30 秒， 3.56℃ 30 秒， 4.72℃ 3 分钟， 5. 返回步骤 2， 共 24 个循环， 6. 一直保持 4℃。反应样品含有 2μL 的 RL-P37 基因组 DNA， 10μL 的 10X 缓冲 液， 2μL 10mMdNTP 混合物， 1μL 的 20μM 引物 SK592 和 SK593， 1μL Pfu Ultra 和 83μL 蒸馏水。 B.T.konilangbra 和 H.tawa
初始 PCR 反应使用由一些同源序列的蛋白质比对设计的简并引物。在第一 PCR 反 应中使用设计用于在 5’ 和 3’ 端附近退火的一组简并引物， 以扩增 α-1， 3 葡聚糖酶序列的 类似序列。
用于初始克隆的简并引物 ：
H.tawa 和 T.konilangbra ：
MA1F ： GTNTTYTGYCAYTTYATGAT(SEQ ID NO ： 8)
MA2F ： GTNTTYTGYCAYTTYATGATHGGNAT(SEQ ID NO ： 9)
MA4F ： GAYTAYGAYGAYGAYATGCARCG(SEQ ID NO ： 10)
MA5F ： GTRCAYTTRCAIGGICCIGGIGGRCARTANCC(SEQ ID NO ： 11)
MA6R ： YTCICCIGGNAGNGGRCANCCRTT(SEQ ID NO ： 12)
MA7R ： RCARTAYTGRCAIGCYGTYGGYGGRCARTA(SEQ ID NO ： 13)
然后将这些 PCR 反应的产物用于嵌套 PCR， 其使用设计用于在初始 PCR 片段产物内 部结合的引物， 在相同扩增条件下进行。
初始克隆的特异性引物 ：
T.konilangbra ：
TP1S ： CCCCCTGGCCAAGTATGTGT(SEQ ID NO ： 14)
TP2A ： GTACGCAAAGTTGAGCTGCT(SEQ ID NO ： 15)
TP3S ： AGCACATCGCTGATGGATAT(SEQ ID NO ： 16)
TP3A ： AAGTATACGTTGCTTCCGGC(SEQ ID NO ： 17)
TP4S ： CTGACGATCGGACTRCACGT(SEQ ID NO ： 18)
TP4A ： GGTTGTCGACGTAGAGCTGT(SEQ ID NO ： 19)
H.tawa ：
HP2A ： ACGATCGGCAGAGTCATAGG(SEQ ID NO ： 20)
HP3S ： ATCGGATTGCATGTCACGAC(SEQ ID NO ： 21)
HP3A ： TACATCCAGACCGTCACCAG(SEQ ID NO ： 22)
HP4S ： ACGTTTGCTCTTGCGGTATC(SEQ ID NO ： 23)
HP4A ： TCATTATCCCAGGCCTAAAA(SEQ ID NO ： 24)
PCR 产物的凝胶电泳用于确定是否扩增了预期大小的片段。 使用 QIAquick PCR 纯 化试剂盒 (Qiagen) 纯化预期大小的单嵌套 PCR 产物。此外， 从含有多个产物条带的琼脂糖 凝胶上切下并提取预期大小的产物， 使用 QIAquick Gel Extraction 试剂盒 (Qiagen) 进行 纯化。
实施例 4. 转化 / 分离物筛选 / 质粒提取
使用 Invitrogen Zero PCR 克隆试剂盒根据制造商的说明书 将 PCR 产物插入克隆载体。 然后， 根据制造商的建议将该载体转化进 Shot Top10 化 学感受态大肠杆菌细胞 (Invitrogen)， 铺板于含有 50ppm 卡那霉素的 LB 平板上。 将这些平 板在 37℃孵箱中孵育过夜。
为了选择含有载体和 DNA 插入物 (insert) 的转化体， 从平板上选择菌落用于质 粒粗提。将 50μL DNA 提取溶液 (100mM NaCl， 10mM EDTA， 2mM Tris pH 7) 添加到干净的 1.5mL Eppendorf 管中。在生物安全柜中， 每种 转化克隆计数、 挑取 7-10 个独立 的菌落， 并重悬于提取溶液。在化学通风橱中， 向每个样品添加 50μL 的苯酚∶氯仿∶异戊 醇， 剧烈震荡。以最高速将管微离心 5 分钟， 之后取出 20μL 顶层水层置于干净 PCR 管中。 然后加入 1μL RNase 2mg/mL， 混合样品， 在 37℃下孵育 30 分钟。然后将全部样品体积在 凝胶上电泳， 从而根据与空载体的大小差异确定 载体中插入物的存在。一旦鉴 定到转化菌落， 就将这些克隆从平板上刮下， 并将其用于接种含有 5mi LB/ 卡那霉素培养基 (0.0001％ ) 的独立 15mL 管。将培养物置于 37℃摇床孵箱过夜。
从孵箱在取出样品， 使用 Sorval 离心机以 6,000 转 / 分钟离心 6 分钟。使用 QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 (Qiagen) 和方案分离质粒 DNA， 然后对其进行消化以确定 插入物的存在。所用的限制性酶取决于插入序列中及周围存在的位点。使用凝胶电泳确定 片段大小。将合适的 DNA 样品送交测序 (Sequetech， Mountain View， CA)。
实施例 5. 克隆 3′和 5′端
对所有 DNA 片段测序。使用 Align X 和(Vector软件包， Invitrogen) 比对并比较序列以确定核苷酸和氨基酸同一性。设计了特异性引物， 以通 过从已知序列向外扩展来扩增 H.tawa 和 T.konilangbra 的每个不完全片段的 3’ 和 5’ 部 分。每个模板设计了至少三个特异性引物， 其每个嵌套于之前的引物组扩增产物内。使用 嵌套引物组利用 LA PCR 体外克隆试剂盒 (TaKaRa BIO Inc.) 进行 5′和 3′序列的扩增。
制备新鲜基因组 DNA 用于此扩增。通过用 1 平方英寸的合适产孢子真菌平板培养 物块接种 250mL 带挡板锥形瓶中 30mLYEG 液体培养基， 制备 T.konilangbra 和 H.tawa 的培 养物。锥形瓶在 28℃摇床孵箱中过夜孵育。通过在 50mL Sarstedt 管中以 4,500 转 / 分 钟离心 10 分钟收获培养物。弃去上清， 将菌丝体在 -80℃冰箱中保存过夜。然后将冷冻的 菌丝体与一些干冰块一起置于咖啡研磨机中。运行研磨机直至整个混合物具有粉末样均 一性。然后， 将粉末风干， 并转移至含有 10mL Easy-DNATM Kit 溶液 A(Invitrogen) 的无菌50mL Sarstedt 管， 遵照制造商的方案。使用 NanoDrop 光度计测定收集自提取物的基因组 DNA 浓度。
根据已知 DNA 序列内特定限制性位点的缺失选择 LA PCR 体外克隆试剂盒组， 遵照 制造商的说明。对于第一轮 PCR， 在 33.5μL 灭菌蒸馏水中稀释 1μL 连接 DNA 样品。根据 样品和预期的末端片段使用不同引物。对于 5′端， H.tawa 和 T.konilangbra 分别使用引 物 HP4A 和 TP3A， 而对于 3′端， H.tawa 和 T.konilangbra 使用引物 HP4S 和 TP3S。 通过加入 34.5μL 稀释的连接 DNA 溶液、 5μL 10X LA Buffer II(Mg+2)、 8μL dNTP 混合物、 1μL 盒 引物 I、 1μL 特异性引物 I( 根据样品和末端片段 ) 和 0.5μLTaKaRa LA Taq 来制备 PCR 混 合物。 然后将 PCR 管置于热循环仪， 遵照下列方案 ： 1.94℃ 10 分钟， 2.94℃ 30 秒， 3.55℃ 30 秒， 4.72℃ 4 分钟， 返回到步骤 2.30 个循环， 4℃持续。
取 1μL 第一 PCR 反应物并将样品在无菌蒸馏水中以 1/10,000 的倍数稀释进行第 二 PCR 反应。 使用嵌套于第一扩增区域中的第二组引物扩增第一 PCR 反应物中分离的片段。 分别使用引物 HP3A 和 TP4A 向 H.tawa 和 T.konilangbra 的 5’ 端扩增， 而使用引物 HP3S 和 TP4S 向 3’ 端扩增。将稀释的 DNA 添加到含有 33.5μL 无菌蒸馏水、 5μL 10X LA Buffer II(Mg+2)、 8μL dNTP 混合物、 1μL 表达盒引物 2、 1μL 特异性引物 2( 根据样品盒片段末 端 )、 0.5μL TaKaRa LA Taq 的 PCR 反应物， 在进行 PCR 之前充分混合。PCR 方案与第一反 应相同， 唯一不同在于最初 94℃ 10 分钟。 在反应完成之后， 对样品进行凝胶电泳， 以确定所 分离片段的大小和数量。如果存在单条带， 则纯化样品并送交测序。如果未分离到片段， 则 使用之前针对嵌套 PCR 反应的方案进行第三 PCR 反应。扩增片段凝胶电泳之后， 切下最亮 的条带， 纯化并送交测序。
实施例 6. 序列比对的分析
获得序列并使用 Vector NTI 软件包 ( 包括 Align X 和 ContigExpress) 进行分析。 将各个末端片段序列与之前获得的 H.tawa 和 T.konilangbra 片段相比对， 以获得完整基因 的序列。与哈茨木霉和里氏木霉序列的核苷酸比对显示 H.tawa 和 T.konilangbra 中目的 基因的翻译起点和终点。鉴定完整基因序列之后， 设计特异性引物从基因组 DNA 扩增完整 基因。根据之前所述设计引物， 唯一不同的是在翻译起始位点之前添加 CACC 核苷酸序列， 用于
克隆 (Invitrogen)。 最终克隆的引物 ： T.konilangbra ：T1FS ： caccatgctaggcattctccg(SEQ ID NO ： 25)
T1FA ： tcagcagtattggcatgccg(SEQ ID NO ： 26)
H.tawa ：
H1FS ： CACCATGTTGGGCGTTTTTCG(SEQ ID NO ： 27)
H1FA ： CTAGCAGTATTGRCATGCCG(SEQ ID NO ： 28)
如上所述进行 PCR 方案， 唯一例外是退火温度改变为 55℃。通过凝胶电泳分离并 查看到单条带后， 如上所述纯化所扩增的片段， 根据制造商的说明用于 pENTR/D (Invitrogen) 转化。 然后， 如上所述转化化学感受态大肠杆菌， 转移到含有 50ppm 卡那霉素 的 LB 平板。37℃过夜孵育之后， 按照如前所述在粗提 DNA 和质粒大小分析之后， 选择含有 质粒和插入物的转化体。从平板上刮下所选的转化体， 并用于接种含有 5mlLB/ 卡那霉素培养基 (0.0001％ ) 的新鲜 15mL 管。将培养物置于 37℃摇床孵箱过夜。离心收获细胞， 如前 所述提取质粒 DNA。消化质粒 DNA， 以确认插入序列的存在， 然后送交测序。根据制造商的 说明， 使用 LR 克隆酶反应 (Gateway Cloning， Invitrogen)， 从而将插入物从 pENTR/D 载体 定向转移到终点载体。终点载体设计用于在里氏木霉中表达 CBH1 启动子和终止子控制下 的目的基因， 用黑曲霉乙酰胺酶进行选择。
实施例 7. 生物射弹转化
将 里 氏 木 霉 孢 子 悬 液 涂 在 乙 酰 胺 酶 转 化 平 板 的 ～ 6cm 直 径 中 央 (150μL 5x107-5x108 孢 子 /mL 悬 液 )。 然 后， 在 生 物 安 全 柜 中 风 干 平 板。 将 终 止 屏 (BioRad 165-2336) 和 大 载 体 架 (macrocarrier holder)(BioRad1652322) 浸 在 70 ％ 乙 醇 中， 风 干。将 DriRite 干燥剂置于小 Petri 平皿 (6cmPyrex)， 覆盖上 Whatman 滤纸。含有大载体 (BioRad 165-2335) 的大载体架平置于滤纸上， 盖上 Petri 平皿盖。
通过将 60mg 钨 M-10 颗粒 ( 微载体， 0.7 微米， BioRad#1652266) 置于 Eppendorf 管制备钨颗粒悬液。 加入 1mL 乙醇 (100％ )。 在乙醇溶液中涡旋混匀钨， 使之浸泡 15 分钟。 以最高速快速微离心 Eppendorf 管， 使钨沉淀。倒出乙醇， 用无菌蒸馏水清洗三遍。第三遍 将清洗用水倒出， 将钨重悬于 1mL 的无菌 50％甘油。
对于每个转化， 通过将 25μL 悬浮的钨添加到 1.5mL Eppendorf 管制备转化反应。 依次添加后续添加物 ： 2μL DNA pTrex3g 表达载体、 25μL2.5M CaCl2、 10μL 0.1M 亚精胺。 继续涡旋反应物 5-10 分钟， 保持钨悬浮。短暂微离心 Eppendorf 管， 倒出。用 200μL 70％ 乙醇洗涤钨沉淀， 短暂微离心， 形成沉淀并倒出。用 200μL 100％醇洗涤沉淀， 短暂微离心 形成沉淀， 并倒出。将钨沉淀重悬于 24μL 100％醇。将 Eppendorf 管置于超声水浴 15 秒， 将 8μL 等分试样转移到变干的大载体中央。使大载体在变干的 Petri 平皿中风干。
将 氦 气 瓶 打 开 至 1500psi。 在 Model PDS-1000/He 生 物 射 弹 颗 粒 递 送 系 统 (BioRad) 中使用 1100psi 保险片 (rupture disc)(BioRad 165-2329)。当钨溶液干燥时， 将终止屏和大载体架插入到 PDS-1000 中。将含有靶标里氏木霉孢子的乙酰胺酶平板置于 终止屏下方 6cm。在腔室中产生并保持 29 英寸 Hg 的真空。开启 He 生物射弹颗粒递送系 统。将腔室放气， 取出乙酰胺酶平板， 在 28℃下孵育， 直至出现菌落 (5 天 )。
改进 amdS 生物射弹琼脂 (MABA) 每升
部分 I， 在 500ml dH2O 中制备
1000x 盐 1ml
Noble 琼脂 20g
pH to 6.0， 高压灭菌
部分 II， 在 500ml dH2O 中制备
乙酰胺 0.6g
CsCl 1.68g
葡萄糖 20g
KH2PO4 15g
MgSO4·7H2O 0.6g
CaCl2·2H2O 0.6g
调节 pH 至 4.5， 0.2 微米过滤灭菌 ； 置于 50℃烘箱使之加温， 添加琼脂， 混合， 倾倒平板。保存于室温。
1000x 盐 每升
FeSO4·7H2O 5g
MnSO4·H2O 1.6g
ZnSO4·7H2O 1.4g
Cocl2·6H2O 1g
添加至 1L 去离子 H2O。
0.2 微米过滤灭菌
实施例 8. 里氏木霉转化体的 α-1， 3 葡聚糖酶的表达
使用 1cm2 琼脂栓 (plug) 接种 Proflo 接种培养基。 以 200 转份钟摇动在 28℃下孵 育培养物。第二天， 将 10％无菌转移到生产培养基。以 200 转 / 分钟摇动在 28℃下孵育培 养物。第三天， 离心收获培养物。将上清除菌过滤 (0.2μm PES) 并保存于 4℃。SDS-PAGE 的分析鉴定表达各个 α- 葡聚糖酶基因的克隆。
实施例 9. 不溶葡聚糖基质 (substrate) 的制备
用来自 BHI 平板的茸毛链球菌 (Streptococcus sobrinus)(ATCC27607) 接种四个 含有 BHI( 脑心灌注液 ) 液体培养基的无菌烧瓶。培养物在 37℃下静置孵育 24 小时， 之后 可见浑浊。离心收获上清 ( 含有茸毛链球菌葡糖基转移酶 )(15 分钟， 10,000 转 / 分钟 )。 汇集上清， 除菌过滤 (0.22μm) 以除去任何剩余的细胞。在无菌情况下， 添加蔗糖至终浓度 5％， 其诱导葡糖基转移酶产生葡聚糖聚合物。将培养上清与蔗糖密封、 混合并保存于 37℃ 孵箱 24-48 小时 ( 静置 )。形成茸毛样沉淀， 通过离心收获 (10,000 转 / 分钟， 15 分钟 )。 倒出上清， 留下沉淀， 用去离子水清洗三遍， 最后置于配衡 Eppendorf 管。在 SpeedVac 干燥 葡聚糖， 干燥后记录 Eppendorf 的重量。
实施例 10. 用于检测克隆 α- 葡聚糖酶活性的 PAHBAH 还原糖测定
用以下列出的量， 将转化的里氏木霉培养上清、 缓冲液和不溶葡聚糖分配于圆底 96- 孔平板。使用两种类型缓冲液 (pH 4.5 和 pH 6.0) 比较活性水平。分配样品后， 密封 96 孔平板， 将其置于摇动 37℃孵箱过夜。
葡聚糖水解混合物 ：
50μL 培养上清
50μL 28mg/mL 葡聚糖溶液
5μL 1M 柠檬酸缓冲液 (pH 4.5 或 6.0)
105μL
PAHBAH 溶液 ：
0.5g 酒石酸钠钾
0.15g 对羟基苯甲酸酰肼 (PAHBAH)
10mL 2％ NaOH
孵育后， 将 150μL 新鲜制备的 PAHBAH( 对羟基苯甲酸酰肼 ) 试剂转移到含 20μL 每种水解混合物的 0.2mL PCR 管。然后， 轻轻混合这些管， 并置于热循环仪中， 在其中加热 至 99℃， 保持 30 分钟。移出 PCR 管， 将 150μL 每种样品转移到新鲜 96 孔平板。测定每种 样品 410nm 处的吸光度。该测定结果显示于图 3。26101998849 A CN 101998855
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