Α葡聚糖酶以及含有其的口腔护理组合物.pdf

1、10申请公布号CN101998849A43申请公布日20110330CN101998849ACN101998849A21申请号200980112748822申请日2009040961/044,31620080411USA61K8/66200601A61Q11/00200601A61Q11/02200601C12N9/14200601C12N9/2420060171申请人丹尼斯科美国公司地址美国加利福尼亚州72发明人S金S兰茨M佩普森74专利代理机构北京市中咨律师事务所11247代理人黄革生凌立54发明名称葡聚糖酶以及含有其的口腔护理组合物57摘要本发明描述了来自HYPOCEATAWA、里氏木霉

2、和TRICHODERMAKONILANGBRA的分离的葡聚糖酶，以及含有它们的口腔护理组合物。该口腔护理组合物可用于预防或减少菌斑。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010101186PCT申请的申请数据PCT/US2009/0400132009040987PCT申请的公布数据WO2009/126773EN2009101551INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书23页序列表25页附图3页CN101998855A1/2页21分离的葡聚糖酶，其包含下列氨基酸序列A与成熟HYPOCEATAWA的葡聚糖酶SEQIDNO1的38635位氨基酸残基有至少

3、99同一性；或者B与成熟TRICHODERMAKONILANGBRA的葡聚糖酶SEQIDNO3的38627位氨基酸残基有至少85同一性。2编码权利要求1的分离的葡聚糖酶的分离的多核苷酸。3包含权利要求2的分离多核苷酸的重组核酸。4包含权利要求3的重组核酸的载体。5包含权利要求3的重组核酸的宿主细胞。6细胞培养物，其包含A生长培养基；和B权利要求5的细胞群体。7产生蛋白质的方法，其包括在适于所述分离的葡聚糖酶产生的条件下维持权利要求6的细胞培养物。8根据权利要求7的方法，其还包括从所述生长培养基中收获所述葡聚糖酶。9方法，其包括接受选自下列的葡聚糖酶A具有与成熟HYPOCEATAWA的葡聚糖酶S

4、EQIDNO1的38635位氨基酸残基有至少99同一性的氨基酸序列的葡聚糖酶；B具有与成熟里氏木霉的葡聚糖酶SEQIDNO2的38622位氨基酸残基有至少85同一性的氨基酸序列的葡聚糖酶；或者C具有与成熟TRICHODERMAKONILANGBRA的葡聚糖酶SEQIDNO3的38627位氨基酸残基有至少85同一性的氨基酸序列的葡聚糖酶；以及将所述分离的葡聚糖酶与口腔可接受的赋形剂混合，以制备口腔护理组合物。10根据权利要求9的方法，还包括包装所述口腔护理组合物。11根据权利要求1的方法，其中葡聚糖酶不同于里氏木霉的葡聚糖酶SEQIDNO2的38622位氨基酸残基。12口腔护理组合物，其包含A口

5、腔可接受赋形剂；和B权利要求1的分离的葡聚糖酶。13口腔护理组合物，其包含口腔可接受赋形剂；和选自下列的分离的葡聚糖酶A具有与成熟HYPOCEATAWA的葡聚糖酶SEQIDNO1的38635位氨基酸残基有至少99同一性的氨基酸序列的葡聚糖酶；B具有与成熟里氏木霉的葡聚糖酶SEQIDNO2的38622位氨基酸残基有至少85同一性的氨基酸序列的葡聚糖酶；或者C具有与成熟TRICHODERMAKONILANGBRA的葡聚糖酶SEQIDNO2的38627位权利要求书CN101998849ACN101998855A2/2页3氨基酸残基有至少85同一性的氨基酸序列的葡聚糖酶。14根据权利要求13的组合物，

6、其中葡聚糖酶不同于里氏木霉的葡聚糖酶SEQIDNO2的38622位氨基酸残基。15根据权利要求1214中任一项的口腔护理组合物，其中所述葡聚糖酶以所述组合物重量的00001至5的浓度存在于所述组合物中。16根据权利要求1215中任一项的口腔护理组合物，其还包含第二种酶。17根据权利要求16的口腔护理组合物，其中所述第二种酶是脱氨酶、酯酶、糖苷酶、脂肪酶、氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶、脲酶或纤维素酶。18根据权利要求1217中任一项的口腔护理组合物，其中所述组合物配制成牙膏。19根据权利要求1218中任一项的口腔护理组合物，其中所述组合物包含增稠剂、表面活性剂、湿润剂和研磨剂中的至少一种。20方法

7、，其包括在适于所述葡聚糖酶活性的条件下将权利要求1219中任一项的口腔护理组合物与牙齿接触。21根据权利要求20的方法，其中所述接触使用牙刷进行。22根据权利要求20或21的方法，其中所述方法使得可以预防和/或减少菌斑。权利要求书CN101998849ACN101998855A1/23页4葡聚糖酶以及含有其的口腔护理组合物0001优先权0002本申请要求2008年4月11日提交的美国临时专利申请序列号NO61/044,316的优先权，其以其整体引入作为参考。背景技术0003齿斑的形成导致龋齿、牙龈炎症、牙周病以及最终导致牙齿损失。齿斑是细菌、上皮细胞、白细胞、巨噬细胞及其他口腔分泌液的混合物。

8、细菌产生高度分枝的多糖HIGHLYBRANCHEDPOLYSACCHARIDES，其与来自口腔的微生物一起形成齿斑继续增殖的粘性基质。0004随着齿斑继续积累，出现石头一样硬的白色或浅黄色沉积物。这些沉积物称为钙斑、牙石或牙垢，其在唾液中由菌斑PLAQUE和矿物例如钙形成。0005对预防和/或减少齿斑以及相关牙齿损坏的新方法有着持续的需要。发明内容0006一方面，提供了分离的葡聚糖酶，包含下述氨基酸序列，即A与天然HYPOCEATAWA的葡聚糖酶SEQIDNO1的38635位氨基酸残基有至少99同一性；或者B与TRICHODERMAKONILANGBRA的葡聚糖酶SEQIDNO3的38627位

9、氨基酸残基有至少85同一性。0007另一个方面中，提供了编码本发明葡聚糖酶的分离多核苷酸以及含有该分离多核苷酸的重组核酸。还提供了含有该重组核酸的载体和宿主细胞。0008在另一个方面中，提供了细胞培养物。在一些实施方式中，该细胞培养物含有生长培养基和上述宿主细胞的群体。细胞培养物可用于提供在适于分离的葡聚糖酶产生的条件下维持细胞培养物以产生本发明的葡聚糖酶。如果葡聚糖酶是分泌的，这可从生长培养基中收获。0009在另一个方面中，提供了产生蛋白质的方法，其包括在适于分离的葡聚糖酶产生的条件下维持如上细胞的培养物。在一些实施方式中，该方法还包括从生长培养基中收获葡聚糖酶。0010另一个方面中，提供了

10、方法，其包括接受选自以下的分离的葡聚糖酶A具有与成熟HYPOCEATAWA的葡聚糖酶SEQIDNO1的38635位氨基酸残基有至少99同一性的氨基酸序列的葡聚糖酶；B具有与成熟里氏木霉TRICHODERMAREESEI的葡聚糖酶SEQIDNO2的38622位氨基酸残基有至少85同一性的氨基酸序列的葡聚糖酶；或者C具有与成熟TRICHODERMAKONILANGBRA的葡聚糖酶SEQIDNO3的38627位氨基酸残基有至少85同一性的氨基酸序列的葡聚糖酶；以及将该分离的葡聚糖酶与口腔可接受的赋形剂混合，以制备口腔护理组合物。在一些实施方式中，葡聚糖酶不同于里氏木霉的葡聚糖酶SEQIDNO2的38

11、622位氨基酸残基。在一些实施方式中，该方法还包括包装该口腔护理组合物。0011在另一个方面中，提供口腔护理组合物，其包含A口腔可接受的赋形剂；和B说明书CN101998849ACN101998855A2/23页5分离的葡聚糖酶。0012在一个相关方面中，提供了口腔护理组合物，其包含口腔可接受赋形剂和选自下列的分离的葡聚糖酶A具有与成熟HYPOCEATAWA的葡聚糖酶SEQIDNO1的38635位氨基酸残基有至少99同一性的氨基酸序列的葡聚糖酶；B具有与成熟里氏木霉的葡聚糖酶SEQIDNO2的38622位氨基酸残基有至少85同一性的氨基酸序列的葡聚糖酶；或者C具有与成熟TRICHODERMAK

12、ONILANGBRA的葡聚糖酶SEQIDNO3的38627位氨基酸残基有至少85同一性的氨基酸序列的葡聚糖酶。在一些实施方式中，该葡聚糖酶不同于里氏木霉的葡聚糖酶SEQIDNO2的38622位氨基酸残基。0013在一些实施方式中，葡聚糖酶以组合物重量的00001至5的浓度存在于该组合物中。0014在一些实施方式中，该口腔护理组合物还包含第二种酶。在特定实施方案中，该第二种酶是脱氨酶、酯酶、糖苷酶、脂肪酶、氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶、脲酶或纤维素酶。0015在一些实施方式中，该组合物配制成牙膏，尽管预见了其他的口腔护理制剂。在一些实施方式中，该组合物例如包含增稠剂、表面活性剂、湿润剂和研磨剂中的

13、至少一种。0016在另一个方面中，提供了方法，其中接受分离的葡聚糖酶，然后提供与口腔可接受的赋形剂混合以制备口腔护理组合物。该口腔护理组合物可以包装。0017在另一个方面中，提供了包括在适于葡聚糖酶活性的条件下将本发明口腔护理组合物与牙齿相接触的方法。该接触可以使用例如牙刷进行。在特定情况下，该方法导致对齿斑的预防和/或减少。附图说明0018图1显示来自HYPOCEATAWASEQIDNO1、里氏木霉SEQIDNO2；TRICHODERMAKONILANGBRASEQIDNO3和哈茨木霉THARZIANUMSEQIDNO4的葡聚糖酶的氨基酸序列比对，以及基于比对的共有序列SEQIDNO5。显示

14、葡聚糖酶的多个特征，例如信号序列、催化结构域、接头结构域以及葡聚糖结合结构域。0019图2汇总与多种无细胞培养溶液过夜孵育后获得的不溶葡聚糖水解物的HPLC分析结果的表格。0020图3显示在PH45和PH60的来自表达里氏木霉TREESEI、HTAWA和TKONILANGBRA的推定1，3葡聚糖酶的里氏木霉培养物的上清的活性。天然葡聚糖酶在宿主菌株中未检测到。葡聚糖水解反应物根据培养体积而不是蛋白质含量上样。0021定义0022除非本文中另有说明，否则所有技术和科学术语应为本领域中常规的含义。为清楚起见定义以下术语。其他定义可出现在本说明书的其他地方。0023本文所用的术语“葡聚糖酶”指水解多

15、糖中1，3D糖苷键的酶。本文所述的葡聚糖酶具有根据IUBMB酶命名法的EC32159的活性，可水解不溶的葡聚糖。葡聚糖酶的系统命名为1，31，3；1，4D葡聚糖3葡聚糖水解酶。在某些出版物中，此酶可能称为1，3葡聚糖酶。注意，本发明的酶可具有除1，3D糖苷活性之外的其他活性，包括但不限于1，2D糖苷活性。说明书CN101998849ACN101998855A3/23页60024本文所用的术语“口腔护理组合物”指成分混合物，在常规使用过程中其不是供有意吞咽从而全身性施用特定治疗剂，而是保留在口腔中足够的时间以接触牙齿表面和/或口腔组织，用以递送对口腔活性有益的试剂。口腔组合物可以是牙膏、洁齿剂、

16、牙粉、牙凝胶、龈下凝胶、漱口水、假牙产品、口喷雾、锭剂、口腔片剂、口香糖等等的形式。口腔组合物还可以合并在条或膜上，用以直接施用或粘贴在口腔表面。0025除非另作说明，术语“洁齿剂”指膏剂、凝胶、固体或液体的口腔护理组合物制剂。洁齿剂的实例有牙膏、牙齿凝胶和牙粉。洁齿剂可以是单相组合物或者可以是两种或更多种分开的组合物的组合。洁齿剂可以是任何期望的形式，例如深条纹、表面条纹、多层、具有包围膏剂的凝胶或者其任何组合。包含两种或更多种分开的组合物的洁齿剂中的每种组合物可以包含于分配器中物理上分开的区室中并且并行分配。0026本文使用的术语“口腔科接受载体”指用于口腔护理组合物中的安全且有效的物质。

17、这些物质包括氟离子来源、抗钙物质、缓冲剂、研磨抛光物质、过氧化物来源、碱金属碳酸氢盐、增稠物质、湿润剂、水、表面活性剂、二氧化钛、调味体系、甜味剂、木糖醇、着色剂及其混合物。0027本文使用的术语“牙齿”或“牙”指天然牙齿以及假牙或牙科假体。0028本文使用的术语“牙釉质”指通常可见并且主要由包括羟基磷灰石HYDROXYLAPATITE的矿物质构成的牙齿部分。牙釉质涵盖人和动物牙齿中的天然牙釉质以及用于替代受损或脱落的牙齿部分的牙釉质样物质，包括用于此目的的树脂和瓷。0029本文使用的术语“牙石”和“牙垢”可互换地用于表示矿化齿斑沉积物。0030本文使用的术语“糖萼”指一些细菌、上皮细胞以及其

18、他细胞产生的细胞外聚合物，其在牙齿表面上形成包被，并作为菌斑附着的基质。0031本文使用的术语“菌斑”表示在牙齿表面上形成的生物膜。形成生物膜的微生物主要是细菌，包括但不限于变形链球菌STREPTOCOCCUSMUTANS、厌氧链球菌STREPTOCOCCUSANAEROBES、梭杆菌属物种FUSOBACTERIUMSPP和放线杆菌属物种ACTINOBACTERIASPP。菌斑可以在糖萼上形成，由其支持或者是其一部分。0032齿斑中存在的微生物全部是口腔中天然存在的，通常是无害的。但是，通过定期刷牙无法除去菌斑意味着使得它们形成厚层。最靠近牙齿表面的那些微生物变为厌氧呼吸；在此状态下它们开始产

19、生酸。0033本文使用的术语“重组的”指野生型宿主细胞中不存在、不分泌或者表达模式改变的多核苷酸或多肽。重组多肽和多核苷酸分别具有不同于野生型序列的序列，具有不同于野生型多肽和多核苷酸的时间或空间表达模式，和/或以不同于野生型多肽和多核苷酸的水平表达。重组分子可含有两种或多种以非天然发生的方式连接在一起的天然序列。重组细胞含有重组多核苷酸或重组多肽。0034本文使用的术语“异源”指彼此通常不相连的元件。例如，如果宿主细胞产生异源蛋白，该宿主细胞中通常不产生该蛋白质。同样地，有效连接异源编码序列的启动子是有效连接在野生型宿主细胞中其通常不有效连接的编码序列的启动子。针对多核苷酸或蛋白质的，术语“

20、同源的”表示宿主细胞中天然的多核苷酸或蛋白质。0035本文使用的术语“蛋白质”和“多肽”可互换地用于表示肽键相连的氨基酸链。除非另作说明，多肽以标准的N端至C端的方向书写。说明书CN101998849ACN101998855A4/23页70036本文使用的“信号序列”是蛋白质的N端部分存在的氨基酸序列，其有助于成熟形式的蛋白质分泌出细胞。信号序列的定义是功能性的，尽管许多信号序列的结构是已知。成熟形式的细胞外蛋白质缺乏信号序列，其在分泌过程中被切割掉了。0037本文使用的“编码序列”是编码多肽的DNA部分。0038本文使用的术语“核酸”涵盖DNA、RNA、杂化物以及合成或化学修饰的核酸，不论是

21、单链还是双链。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地用于表示由磷酸二酯、硫酸二酯或类似键连接的核苷链。除非另作说明，多核苷酸以标准的5至3的方向书写。0039本文使用的“载体”指设计用以将核酸引入一个或多个宿主细胞的多核苷酸。载体可在不同宿主细胞中自主复制，包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等。0040本文使用的“表达载体”指包含蛋白质编码区域的DNA构建物，该编码区域与能够实现蛋白质在合适宿主细胞中表达的合适控制序列有效连接。这些控制序列可包括实现转录的启动子、控制转录产生MRNA的任选操纵子序列、编码MRNA上合适核糖体结合位点的序列以及增强子和控制转录和翻译终止的其他

22、序列。0041本文使用的“启动子”是引发下游核酸转录的调节序列。0042本文使用的术语“有效连接”指允许元件以所述形式或表观形式发挥功能的元件排列。例如，如果启动子控制编码序列的转录，则启动子与编码序列有效连接。0043本文使用的术语“选择性/选择标记”指能够在宿主中表达的蛋白质，其使得易于选择含有引入核酸或载体的那些细胞。选择标记的实例包括但不限于赋予抗微生物抗性的蛋白质例如潮霉素、博来霉素或氯霉素和/或赋予代谢优势的基因，例如对于宿主细胞的营养优势。0044本文使用的术语“来源于”涵盖术语“来自”、“获自”或者“可获自”以及“分离自”。0045本文使用的“非致病”生物体是指对人来说非病原性

23、即，疾病或造成疾病的的生物体。0046本文使用的术语“回收的”、“分离的”和“分开的”指从与其天然相关联的至少一种组分中移出的蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。0047本文使用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”在针对细胞使用时表示该细胞具有非天然例如异源核酸序列，其整合进其基因组或者作为附加体质粒维持多代。0048本文使用的术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。0049在将核酸序列插入细胞内的背景中，本文使用的术语“引入”表示“转染”或“转化”或“转导”，包括核酸序列并入真核或原核细胞，其中该核酸序列可并入细胞的基因组例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA，

24、转化为自主复制子或者瞬时表达例如转染的MRNA。0050本文使用的术语“相容的”表示特定组合物的成分能够合并混合，而没有显著降低组合物中成分稳定性和/或效力的相互作用。0051本文使用的术语“锭剂”包括但不限于薄荷糖、锭剂、软锭剂、微胶囊和快速溶解固体形式，包括冻干形式饼、薄片、薄膜、片剂和压制片剂。0052本文使用的术语“快速溶解的固体形式”表示该固体剂型置于口腔或者含有牙科说明书CN101998849ACN101998855A5/23页8假体的容器中后在小于约60秒、小于约15秒、或者小于约5秒内溶解的固体剂型。0053数值范围涵盖定义其范围的数值。除非另作说明，本文中使用的所有百分比和比

25、值是基于具体口腔组合物的重量，而不是所递送的整个口腔制剂的重量。除非另作说明或由上下文推知，没有数词修饰的形式包括了复数形式。0054为了便于阅读提供标题，而不应视为限制。除非另作说明或由上下文推知，一个标题下面所包括的说明一般作为整体适用于全文。0055描述了示例性材料和方法，但是其他方法和材料可得到类似的或等同的结果。所有专利和公开，包括这些专利和公开中公开的所有序列，通过引用明确地并入本文。具体实施方式0056描述了关于具有葡聚糖酶活性的多肽的组合物和方法。该组合物和方法可用于降低或预防菌斑的形成，降低或预防促进形成菌斑的根本生理情况。0057A多肽、多核苷酸和宿主细胞0058本发明组合

26、物和方法的一个方面涉及分离的葡聚糖酶。在一些实施方式中，葡聚糖酶包含与成熟HYPOCEATAWA的葡聚糖酶的氨基酸序列SEQIDNO1的38635位氨基酸残基具有至少98同一性例如至少99或995同一性的氨基酸序列。在具体实施方案中，葡聚糖酶包含成熟HTAWA的葡聚糖酶的氨基酸序列SEQIDNO1的38635位氨基酸残基。0059在一些实施方式中，葡聚糖酶包含与成熟TRICHODERMAKONILANGBRA的葡聚糖酶的氨基酸序列SEQIDNO3的38627位氨基酸有至少85同一性例如至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的同一性的氨基酸序列。在具体实施方案中，葡聚糖酶

27、包含成熟TKONILANGBRA的葡聚糖酶的氨基酸序列SEQIDNO3的38627位氨基酸残基。0060在一些实施方式中，葡聚糖酶包含与成熟里氏木霉的葡聚糖酶的氨基酸序列SEQIDNO2的38622位氨基酸有至少85同一性例如至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的同一性的氨基酸序列。在具体实施方案中，葡聚糖酶包含不同于成熟里氏木霉的葡聚糖酶氨基酸序列SEQIDNO2的38622位氨基酸的氨基酸序列。0061在一些实施方式中，葡聚糖酶类似于但不同于野生型葡聚糖酶。例如，在一些实施方式中，葡聚糖酶具有与成熟HTAWA的葡聚糖酶SEQIDNO1的38635位氨基酸残基有至少

28、98同一性但是不相同的氨基酸序列。同样地，在某些实施方案中，葡聚糖酶可具有与成熟里氏木霉或者TKONILANGBRA的葡聚糖酶分别为SEQIDNO2的38622位氨基酸或者SEQIDNO3的38627位氨基酸有至少85同一性但是不相同的氨基酸序列。0062已知有超过50种不同的葡聚糖酶的氨基酸序列，并保存于NCBI的GENBANK数据库，包括来自黑曲霉ASPERGILLUSNIGER登录号XP_0013909091；GID145236523、产紫青霉PENICILLIUMPURPUROGENUM登录号AAF279121；GID6752866、构巢裸胞壳EMERICELLANIDULANS登录号

29、CAC480251；GID15072711和新型隐球酵母CRYPTOCOCCUSNEOFORMANS登录号AAW470791；GID57230770的那些。以本专利申请说明书CN101998849ACN101998855A6/23页9的最早提交日，这些GENBANK登录内容以其整体引入作为参考，包括其中的核酸和蛋白质序列以及这些序列的注释。描述葡聚糖酶中保守的结构域的条目存放于NCBI的保守结构域数据库中的PFAM03659MARCHLERBAUER等人CDDACONSERVEDDOMAINDATABASEFORINTERACTIVEDOMAINFAMILYANALYSIS2007NUCLEI

30、CACIDSRES35D23740。来自裂殖酵母SPOMBE的葡聚糖酶的序列以及葡聚糖酶结构的讨论见于FUGLSANG等人2000JBIOLCHEM275200918。0063可得到对于下列的指导，即可改变氨基酸以产生HTAWA、里氏木霉和TKONILANGBRA的野生型葡聚糖酶保留葡聚糖酶活性的变体，例如，通过比对这些葡聚糖酶蛋白质的氨基酸序列，鉴定在蛋白质中相同位置而蛋白质之间不同的氨基酸，以及将这些氨基酸从一个蛋白质转移到另一个。示例性序列对比显示于图1，以及FUGLSANG等人见上文。0064变体多肽可包含保守氨基酸取代，其保留所取代氨基酸的总电荷、疏水性/亲水性和/或空间体积，同时赋

31、予该多肽其他有益生物化学性质。保守取代的非限制性实例包括下列组之间的取代GLY/ALA、VAL/ILE/LEU、LYS/ARG、ASN/GLN、GLU/ASP、SER/CYS/THR和PHE/TRP/TYR。这些及其他保守取代显示于下表。00650066说明书CN101998849ACN101998855A7/23页100067说明书CN101998849ACN101998855A8/23页110068或者，该氨基酸取代不是保守的，其改变所取代氨基酸的总电荷、疏水性/亲水性和/或空间体积。0069评价葡聚糖酶活性的测定描述于多个出版物，包括FUGLSANG等人SUPRA，INOUE等人1988

32、CARBOHYDRRES18227786，AITLAHSEN等人2001APPLENVIRONMICROBIOL6758339，和SUMITOMO等人2007BIOCHIMBIOPHYSACTA177071624。0070还提供了编码该葡聚糖酶的分离多核苷酸，以及含有该分离多核苷酸的重组核酸。假定遗传密码已知，可基于氨基酸序列容易地设计这些多核苷酸。在一个实施方案中，分离多核苷酸具有与下列核苷酸序列有至少70同一性例如至少80同一性、至少90同一性、至少95同一性、至少98同一性或者可在严格条件下杂交的核苷酸序列，该下列核苷酸序列即野生型HTAWA的葡聚糖酶基因或其编码序列例如分别为SEQID

33、NO29和30、野生型里氏木霉的葡聚糖酶基因或其编码序列例如分别为SEQIDNO31和32、或者野生型TKONILANGBRA的葡聚糖酶基因或其编码序列例如分别为SEQIDNO33和34。在某些实施方案中，葡聚糖酶的编码序列针对在所用宿主细胞中表达葡聚糖酶经密码子优化。因为密码子使用表格列出了许多宿主细胞中每个密码子的使用，包括里氏木霉和多种其他酵母和细菌宿主细胞，是本领域中已知的参见例如NAKAMURA等人2000NUCLACIDSRES28292或者易于得到的，只要有要待表达的葡聚糖酶氨基酸序列，可容易地设计这些核酸。0071还提供了含有重组核酸的表达载体和宿主细胞。在某些实施方案中，宿主

34、细胞是细菌例如芽孢杆菌属物种BACILLUSSP或链霉菌属物种STREPTOMYCESSP宿主细胞或者丝状真菌宿主细胞，在某些情况下，可以是不致病的，即对人来说不致病的。在某些实施方案中，细胞可以是FDA认为是GRAS状态的即公认安全的GENERALLYRECOGNIZEDASSAFE具有用于生产蛋白质历史的丝状真菌菌株的细胞。0072在具体实施方案中，本发明的真菌细胞可以是下列物种的细胞木霉属TRICHODERMA例如里氏木霉之前归类为长梗木霉TLONGIBRACHIATUM，目前也称为HYPOCEAJECORINA、绿色木霉TRICHODERMAVIRIDE、康宁木霉TRICHODERMA

35、KONINGII和哈茨木霉TRICHODERMAHARZIANUM、青霉属物种PENICILLIUMSPP、腐质霉属物种HUMICOLASPP例如HUMICOLAINSOLENS和灰腐质霉HUMICOLAGRISEA、金孢霉属物种CHRYSOSPORIUMSPP例如CLUCKNOWENSE、粘帚霉属物种GLIOCLADIUMSPP、曲霉菌属物种ASPERGILLUSSPP例如米曲霉ASPERGILLUSORYZAE、黑曲霉ASPERGILLUSNIGER、构巢曲霉ASPERGILLUSNIDULANS、河内曲霉ASPERGILLUS说明书CN101998849ACN101998855A9/23

36、页12KAWACHI、棘孢曲霉ASPERGILLUSACULEATUS、日本曲霉ASPERGILLUSJAPONICUS、酱油曲霉ASPERGILLUSSOJAE和泡盛曲霉ASPERGILLUSAWAMORI和镰孢霉属物种FUSARIUMSPP，脉孢菌属物种NEUROSPORASPP、肉座菌属物种HYPOCEASPP或者裸孢壳属物种EMERICELLASPP另外参见INNIS等人1985SCIENCE2282126等等。在一些实施方案中，本发明的真菌细胞可以是黑曲霉菌株，包括ATCC22342、ATCC44733、ATCC14331以及来源于其的菌株。在一些实施方式中，宿主细胞可以是其中天然基

37、因已缺失或失活的细胞。例如，对应于蛋白酶基因的基因或者对应于纤维素酶基因的基因可缺失或失活。0073上述核酸可以存在于宿主细胞核基因组中或者可以存在于在宿主细胞中复制的质粒中，例如，瞬时表达载体、穿梭载体、人工染色体等。0074在具体实施方案中，葡聚糖酶可以通过在真菌宿主细胞中表达融合蛋白质产生，该融合蛋白质含有与葡聚糖酶有效连接的信号序列。在此类实施方案中，葡聚糖酶可以分泌进培养基，在其中其可被收获。融合蛋白质的信号序列可以是任何利于蛋白质分泌出宿主细胞的信号序列。所用的信号序列可以是宿主细胞内源的或非内源，在某些实施方案中，可以是已知高度分泌出木霉属物种或曲霉属物种宿主细胞的蛋白质信号序列

38、。这些信号序列包括但不限于纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、内切葡聚糖酶III、淀粉酶、天冬氨酰蛋白酶、葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、糖苷酶和大麦内肽酶B参见例如SAARELAINEN1997APPLENVIRONMICROBIOL63493840的信号序列。在具体实施方案中，可以使用自身即内源信号序列分泌葡聚糖酶。0075在一些实施方案中，通过引入核酸到宿主细胞中产生葡聚糖酶，该核酸包含与葡聚糖酶编码部分有效连接的编码信号序列的部分，其中该核酸的翻译产生包含具有N端信号序列的葡聚糖酶部分的融合蛋白，该信号序列用以将葡聚糖酶分泌出宿主细胞。0076在具体实施方案

39、中，除了信号序列之外，融合蛋白质可另外含有载体蛋白质，其为宿主细胞内源并且高度分泌的蛋白质的部分。合适的载体蛋白包括里氏木霉甘露聚糖酶IMAN5A或MANI、里氏木霉纤维二糖水解酶IICEL6A或CBHII参见例如PALOHEIMO等人2003APPLENVIRONMICROBIOL69707382或者里氏木霉纤维二糖水解酶ICBHI的那些。在一个实施方案中，载体蛋白是截短的里氏木霉CBH1蛋白，包含CBH1核心区域和CBH1接头区域的部分。因此可使用编码融合蛋白质的核酸，该融合蛋白质从氨基端至羧基端有效连接信号序列、载体蛋白质和本发明的葡聚糖酶。0077除了编码序列之外，核酸还可含有葡聚糖酶

40、在宿主细胞中表达所需的其他元件。例如，该核酸可含有转录编码序列的启动子和转录终止子。可用于里氏木霉的示例性启动子包括里氏木霉CBH1、CBH2、EGL1、EGL2、EG5、XLN1和XLN2启动子，或者其杂种或截短版本。例如该启动子可以是里氏木霉CBH1启动子。合适的终止子包括里氏木霉CBH1、CBH2、EGL1、EGL2、EG5、XLN1和XLN2终止子，以及许多其他，例如包括来自黑曲霉或河内黑曲霉基因葡糖淀粉酶基因NUNBERG等人1984MOLCELLBIOL4230615；BOEL等人1984EMBOJ31097102和BOEL等人1984EMBOJ3158185、构巢曲霉氨基邻苯甲酸

41、酯合酶基因、米曲霉TAKA淀粉酶基因或者构巢曲霉TRPCPUNT等人1987GENE5611724的说明书CN101998849ACN101998855A10/23页13终止子。对于木霉菌属物种宿主细胞来说，该启动子和/或终止子可以是天然的或非内源的。0078还提供了宿主细胞培养物即含有宿主细胞群体和生长培养基的组合物。培养物的生长培养基可含有如上所述的葡聚糖酶。在某些实施方案中，该细胞培养物可含有生长培养基和上述细胞的群体。细胞培养物可用于通过在适于产生分离的葡聚糖酶的条件下维持细胞培养物产生本发明的葡聚糖酶。如果葡聚糖酶分泌，则其可从生长培养基中收获。0079丝状真菌表达蛋白质的方法包括其

42、中细胞经改造产生分泌蛋白质的方法，其包括描述于美国专利NO6,022,725和6,268,328，以及公开的美国专利申请NO20060041113、20060040353、20060040353和20050208623中的那些，其通过引用并入本文。另外，转化曲霉菌株的一般方法公开于CAO等人2000PROTEINSCI99911001和YELTON等人1984PROCNATLACADSCIUSA81147074，转化木霉菌菌株的一般方法公开于NEVALAINEN等人1992“THEMOLECULARBIOLOGYOFTRICHODERMAANDITSAPPLICATIONTOTHEEXPRES

43、SIONOFBOTHHOMOLOGOUSANDHETEROLOGOUSGENES”INMOLECULARINDUSTRIALMYCOLOGY，LEONG和BERKA编辑，MARCELDEKKERINC，NY，12948页。0080如果分泌进培养基，则葡聚糖酶可通过任何便利方法回收，例如通过沉淀、离心、亲和、过滤或者任何其他本领域已知的方法。可使用，例如亲和层析TILBEURGH等人1984FEBSLETT16215；离子交换层析方法GOYAL等人1991BIORESTECHNOL3637；FLIESS等人1983EURJAPPLMICROBIOLBIOTECHNOL17314；BHIKHABH

44、AI等人1984JAPPLBIOCHEM6336；以及ELLOUZ等人1987CHROMATOGRAPHY396307，包括使用高分辨率材料的离子交换MEDVE等人1998JCHROMATOGRAPHYA808153；疏水相互作用层析TOMAZANDQUEIROZ1999JCHROMATOGRAPHYA865123；两相分配BRUMBAUER等人1999BIOSEPARATION7287；乙醇沉淀；反相HPLC；硅胶或者例如DEAE的阳离子交换树脂上的层析；层析聚焦；SDSPAGE；硫酸铵沉淀；或者凝胶过滤，使用例如SEPHADEXG75。在具体实施方案中，葡聚糖酶可在没有从培养基的其他成分纯

45、化的情况下使用。在这些实施方案中，培养基可例如简单地浓缩，然后在没有从生长培养基的成分进一步纯化蛋白质的情况下使用，或者在没有进一步修饰的情况下使用。0081B口腔护理组合物0082本发明组合物和方法的一个方面涉及口腔护理组合物。该口腔护理组合物含有一种或多种该葡聚糖酶和口腔可接受载体。一种或多种葡聚糖酶的每一种可以00001WT至5WT范围例如00001WT至00005WT、00005WT至0001WT、0001WT至0005WT、0005WT至001WT、001WT至005WT、005WT至01WT、01WT至05WT、05WT至1WT或者1WT至5WT的浓度存在于组合物中，但是也设想此范

46、围之外的浓度。该口腔护理组合物可由包括将葡聚糖酶与口腔可接受赋形剂混合的方法制成。在某些情况下，该方法还可包括包装口腔护理组合物。0083该口腔护理组合物可以是例如洁齿剂、牙膏、牙粉、局部口腔凝胶、漱口水、假牙产品、口喷雾、锭剂、口腔片剂或口香糖的形式。该口腔组合物也可合并在条带、薄膜、绒毛或胶带上，用以直接施用或粘附在口腔表面。0084口腔可接受载体可包含一种或多种相容固体或液体填充稀释剂或者包装物质，其说明书CN101998849ACN101998855A11/23页14适于局部口腔施用。合适的载体或赋形剂包括如下文更详细描述的常用的和常规的洁齿剂包括非研磨凝胶和用于龈下施用的凝胶、漱口水

47、、口喷雾、口香糖和锭剂包括薄荷糖的成分。液体形式的本发明口腔护理组合物可优选具有约40至约100的PH，例如约50至约80。0085在一些实施方式中，该载体基于组合物引入口腔的形式来选择。例如，如果使用牙膏包括牙齿凝胶等，则可选择“牙膏载体”包括例如研磨物质、表面活性剂、粘合剂、润湿剂、调味剂和甜味剂等，例如BENEDICT的美国专利NO3,988,433中公开的。如果使用漱口水，则可选择“漱口水载体”包括例如水、调味剂和甜味剂等，例如BENEDICT的美国专利NO3,988,433所公开的。如果使用口喷雾，则可选择“口喷雾载体”，或者如果使用锭剂，这可选择“锭剂载体”例如糖果基质BASE。如

48、果使用口香糖，则可选自“口香糖载体”包括例如口香糖基质、调味剂和甜味剂。如果使用香粉，则可选自“香粉载体”例如香粉、调味剂和甜味剂。如果使用龈下凝胶用于递送活性物质至牙周袋内或者牙周袋周围，则可选自“龈下凝胶载体”。适于制备本发明组合物的其他可用载体是本领域公知的。它们的选择可取决于例如味道、成本、保存期、对无糖或无盐组合物的需要等次要考虑因素。0086在一些实施方式中，该组合物可以是非研磨凝胶的形式，例如龈下凝胶，其可以是水性或非水性的。水性凝胶通常包括增稠剂约01至约20、湿润剂约10至约55、调味剂约004至约2、甜味剂约01至约3、着色剂约001至约05以及用于平衡的水。在某些情况下，

49、该组合物可包含防龋齿物质约005至约03，如氟离子和防牙石物质约01至约13。0087在其他一些的实施方式中，该组合物也可以是洁齿剂的形式，例如牙膏、牙齿凝胶或牙粉。这些牙膏和牙齿凝胶的成分可包括一种或多种牙齿研磨剂约5至约50、表面活性剂约05至约10、增稠剂约01至约5、湿润剂约10至约55、调味剂约004至约2、甜味剂约01至约3、着色剂约001至约05和水约2至约45。这些牙膏或牙齿凝胶也可包含一种或多种防龋齿物质约005至约03，如氟离子和防牙石物质约01至约13。牙粉可含有基本上全部为非液体的成分。0088一种示例性洁齿剂组合物描述于美国专利NO6,238,648，其具有下列组成W/W0089甘油1400090聚乙二醇300450091二氧化硅2150092焦磷酸四钠450093水2350094黄原胶03