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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410853364.4 (22)申请日 2014.12.30 A61K 49/08(2006.01) A61K 49/18(2006.01) A61K 49/00(2006.01) A61K 9/51(2006.01) A61K 47/04(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 31/4745(2006.01) A61K 49/04(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 东华大学 地址 201620 上海市松江区松江新城人民北 路 2999 号 (72)发明人 何创龙。
2、 陈良 冯炜 贾亚听 常安妮 (74)专利代理机构 上海泰能知识产权代理事务 所 31233 代理人 黄志达 (54) 发明名称 一种具有还原 / 酶双响应和靶向性的介孔硅 纳米粒子的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种具有还原 / 酶双响应和靶向 性的介孔硅纳米粒子的制备方法， 包括 ： 介孔硅 复合粒子的合成 ； 采用化学方法在粒子表面修饰 二硫键， 并通过二硫键共价接透明质酸作为靶向 分子 ； 以透明质酸上的羧基为反应位点， 将聚乙 二醇修饰至复合粒子表面以提高粒子生物相容 性， 并将具有靶向作用的透明质酸分子通过二硫 键连接到纳米粒子表面， 制得兼具药物响应释放 和成像功能的介孔硅。
3、纳米诊疗剂。本方法制备的 粒子分散性好、 粒径均一且方法简便， 所制备的多 功能诊疗剂生物相容性良好、 能在肿瘤部位响应 性释放药物， 可实现对肿瘤的诊疗一体化。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104491886 A (43)申请公布日 2015.04.08 CN 104491886 A 1/2 页 2 1.一种具有还原 / 酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子的制备方法， 包括 ： (1)将介孔硅复合纳米粒子超声分散在溶剂中， 加入偶联剂， 在8090条件下， 回流 反应 6-1。
4、2h， 得到氨基化复合粒子 ； 其中介孔硅复合粒子和偶联剂的质量比为 (1 3) ： 1 ； (2) 将上述氨基化复合粒子分散在溶剂中， 加入酸酐， 在室温条件下， 搅拌反应 24-48h， 得到表面羧基化的复合粒子 ； 其中氨基化复合粒子、 酸酐的质量比为 (0.1 0.5):(1 6) ； (3)将上述表面羧基化的复合粒子分散在缓冲溶液中， 然后加入EDC/NHS或DCC/DMAP， 混匀后加入二硫键的连接剂， 30-60条件下， 反应 12-48h， 得到含二硫键连接剂的复合粒 子， 其中表面羧基化的复合粒子、 二硫键的连接剂的质量比约为 0.1 1 ： (1 5) ； (4) 将上述含。
5、二硫键连接剂的复合粒子、 透明质酸 HA、 EDC、 NHS 混合于去离子水中， 调 节 pH 为 8-10， 室温条件下搅拌 24-48h， 得到透明质酸包裹的复合粒子 ； 其中二硫键连接剂 的复合粒子、 透明质酸 HA、 EDC、 NHS 的质量比为 80 100:20 30:10 15:8 12 ； (5) 将氨基化聚乙二醇和上述透明质酸包裹的复合粒子分散在溶剂中， 室温反应 12-24h， 反应毕， 得到复合纳米粒子载体， 然后同抗癌药物溶液混合， 即得具有还原 / 酶双 响应和靶向性的介孔硅纳米粒子 ； 其中抗癌药物和复合纳米粒子载体的重量比为 (5 10) ： 1。 2.根据权利要。
6、求1所述的一种具有还原/酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子的制备 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (1) 中介孔硅复合纳米粒子为介孔硅包裹的单个或多个粒径 为 5-50nm 的纳米粒子 ； 溶剂为无水乙醇 ； 偶联剂为 KH-550。 3.根据权利要求2所述的一种具有还原/酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子的制备 方法， 其特征在于 ： 所述介孔硅复合纳米粒子为磁性纳米粒子、 上转换纳米粒子、 金纳米粒 子中的一种或几种。 4.根据权利要求1所述的一种具有还原/酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子的制备 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (2) 中溶剂为二甲基亚砜 DMSO ； 酸酐为琥珀酸酐。 5。
7、.根据权利要求1所述的一种具有还原/酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子的制备 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (3) 中缓冲溶液为 PBS 缓冲液， pH 为 5-6 ； 二硫键的连接剂为 胱胺二盐酸盐或 2- 羟乙基二硫化物。 6.根据权利要求1所述的一种具有还原/酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子的制备 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (3) 中 EDC/NHS 中 EDC 和 NHS 的比例为 (2 4) ： 1 ； DCC/DMAP 中 DCC 和 DMAP 的比例为 (1 2) ： 1 ； 表面羧基化的复合粒子和 EDC/NHS 或 DCC/DMAP 的比 例为 0.1 1g ： 5。
8、0-80mmol。 7.根据权利要求1所述的一种具有还原/酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子的制备 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (4) 中三乙胺调节 pH 值 ； 透明质酸的分子量为 50 200kDa。 8.根据权利要求1所述的一种具有还原/酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子的制备 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (5) 中氨基化聚乙二醇的分子量为 5kDa ； 溶剂为乙醇。 9.根据权利要求1所述的一种具有还原/酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子的制备 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (5) 中抗癌药物为阿霉素、 地塞米松、 洛莫司汀、 卡莫司汀、 卡 培他滨、 紫杉醇、 羟基喜树碱中。
9、的一种或几种 ； 抗癌药物溶液的浓度为 0.1 1mg/mL。 10.根据权利要求 1 所述的一种具有还原 / 酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子的制 权 利 要 求 书 CN 104491886 A 2 2/2 页 3 备方法， 其特征在于 ： 所述步骤(1)中具有还原/酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子在制 备癌症诊断化疗一体化药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104491886 A 3 1/4 页 4 一种具有还原 / 酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子的制 备方法 技术领域 0001 本发明属于具有还原 / 酶双响应的纳米材料制备领域， 特别涉及一种具有还原 / 酶双响应和靶向性的介。
10、孔硅纳米粒子的制备方法。 背景技术 0002 介孔硅纳米粒子由于其比表面积大、 孔容大、 粒径可调、 形貌可控以及生物相容特 性良好等优点， 在药物传递领域具有较好应用前景。为实现药物到达靶向部位之前的 “零 释放” ， 人们在介孔硅的表面设计各种 “门禁” ， 并构建出具有刺激响应性的智能药物控释系 统。自 2003 年 Tanaka 等人 (Nature 2003,421,350353) 将香豆素作为介孔硅的 “门禁” 构建出光响应的介孔硅控释体系以来， 各种刺激响应的介孔硅控释系统层出不穷。由于肝 癌等癌症细胞内富含谷胱甘肽， 具有较强的还原性能， 人们便利用能够被谷胱甘肽还原的 二硫键。
11、为连接剂， 设计出各种还原响应的介孔硅基控释系统。 早在2003年， Lin教授(J.Am. Chem.Soc.2003 ； 125(15):4451-4459) 的课题组就通过二硫键连接硫化镉纳米粒子封堵介 孔硅的孔道， 设计出具有还原响应的介孔硅控释系统。 在此基础上， 人们设计还原响应的介 孔硅控释系统通常都是采用二硫键为桥梁， 将一些无机纳米粒子 ( 四氧化三铁、 金纳米粒 子等)、 聚合物(聚丙烯酸类、 聚乙二醇)或生物大分子(环糊精、 胶原)连接到介孔硅表面 作为 “门禁” ， 以达到控制释放的目的。 但无机纳米粒子不能生物降解， 且容易团聚造成在体 内富集， 对生物体产生危害。而。
12、生物大分子不仅生物相容性良好， 且具有一定的靶向作用， 是比较理想的封堵剂之一。 0003 然而， 传统的智能介孔硅载药粒子在体内呈现非特异性分布， 会对正常组织和 细胞造成较大伤害， 副作用极大。为了克服传统介孔硅控释系统的缺陷， 人们开始尝试 构建兼具医学成像和靶向化疗双重功能的介孔硅智能控释系统。最近， Ashley 等 (Nat. Mater.,2011,10:389-397.) 在介孔硅表面包覆脂质体， 并用富含组氨酸的多肽保护药物以 阻止降解， 用靶向多肽实现肝癌细胞的靶向结合， 负载白喉毒素、 siRNA、 以及化疗药物等多 种物质用于化疗， 包裹量子点以用于影像诊断， 以此构建。
13、出诊疗一体化的多功能介孔硅复 合诊疗剂， 实现了介孔硅控释系统在细胞分子水平上的集成。 可以预期， 诊疗一体化是介孔 硅药物控释系统未来的主要方向之一。 0004 透明质酸 (Hyaluronic Acid,HA) 是一种无毒、 生物可降解、 低免疫原性的天然聚 糖， 其来源广泛， 在动物骨髓细胞外间质和疏松的结缔组织中均有分布， 且含有大量的羟基 和羧基， 易于进行化学改性。已有研究表明 HA 是参与肿瘤形成的重要分子之一， 分子量低 的 HA 在体内具有多种受体， 特别是其特异性受体 CD44， 在许多肿瘤细胞内均呈现高表达， 这就为 HA 作为靶向分子提供了坚实的理论基础。不仅如此， 能。
14、够降解 HA 的透明质酸酶已 被证明是肿瘤微环境中的主要酶类之一， 以HA为介孔硅的封堵剂， 就能够实现HA酶响应释 放。 说 明 书 CN 104491886 A 4 2/4 页 5 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种具有还原 / 酶双响应和靶向性的介孔硅 纳米粒子的制备方法， 本发明实验装置简单， 操作方便， 成本不高， 所得诊疗剂能够实现药 物的刺激响应性释放， 并具有靶向作用 ； 将磁性粒子的成像功能和介孔硅的载药功能复合， 实现诊断治疗一体化 ； 此外， 其生物相容性好， 稳定性好， 体内循环时间长， 能够在癌症的诊 断治疗领域得到应用。 0006 本发明的一种具。
15、有还原 / 酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子的制备方法， 包 括 ： 0007 (1)将介孔硅复合纳米粒子超声分散在溶剂中， 加入偶联剂， 在8090条件下， 回流反应6-12h， 得到氨基化复合粒子 ； 其中介孔硅复合粒子和偶联剂的质量比为(13) ： 1 ； 0008 (2) 将上述氨基化复合粒子分散在溶剂中， 加入酸酐， 在室温条件下， 搅拌反 应 24-48h， 得到表面羧基化的复合粒子 ； 其中氨基化复合粒子、 酸酐的质量比为 (0.1 0.5):(1 6)g ； 0009 (3) 将上述表面羧基化的复合粒子分散在缓冲溶液中， 然后加入 EDC/NHS 或 DCC/ DMAP， 混匀。
16、后加入二硫键的连接剂， 30-60条件下， 反应 12-48h， 得到含二硫键连接剂的复 合粒子， 其中表面羧基化的复合粒子、 二硫键的连接剂的质量比约为 0.1 1 ： (1 5) ； 0010 (4) 将上述含二硫键连接剂的复合粒子、 透明质酸 HA、 EDC、 NHS 混合于去离子水 中， 调节pH为8-10， 室温条件下搅拌24-48h， 得到透明质酸包裹的复合粒子 ； 其中二硫键连 接剂的复合粒子、 透明质酸 HA、 EDC、 NHS 的质量比为 80 100:20 30:10 15:8 12 ； 0011 (5) 将氨基化聚乙二醇和上述透明质酸包裹的复合粒子分散在溶剂中， 室温反 。
17、应 12-24h， 反应毕， 得到复合纳米粒子载体， 然后同抗癌药物溶液混合， 即得具有还原 / 酶 双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子 ； 其中抗癌药物和复合纳米粒子载体的重量比为 (5 10) ： 1。 0012 所述步骤 (1) 中介孔硅复合纳米粒子为介孔硅包裹的单个或多个粒径为 5-50nm 的纳米粒子 ； 溶剂为无水乙醇 ； 偶联剂为 KH-550。 0013 所述介孔硅复合纳米粒子为无机纳米粒子， 优选磁性纳米粒子、 上转换纳米粒子、 金纳米粒子中的一种或几种。 0014 所述步骤 (2) 中溶剂为二甲基亚砜 DMSO ； 酸酐为琥珀酸酐。 0015 所述步骤(3)中缓冲溶液为PBS缓。
18、冲液， pH为5-6 ； 二硫键的连接剂为胱胺二盐酸 盐或 2- 羟乙基二硫化物。 0016 所述步骤 (3) 中 EDC/NHS 中 EDC 和 NHS 的摩尔比为 (2 4) ： 1 ； DCC/DMAP 中 DCC 和 DMAP 的摩尔比为 (1 2) ： 1 ； 表面羧基化的复合粒子和 EDC/NHS 或 DCC/DMAP 的比例为 0.1 1g ： 50-80mmol。 0017 所述步骤 (4) 中三乙胺调节 pH 值 ； 透明质酸的分子量为 50 200kDa。 0018 所述步骤 (5) 中氨基化聚乙二醇的分子量为 5kDa ； 溶剂为乙醇。 0019 所述步骤 (5) 中抗癌。
19、药物为阿霉素、 地塞米松、 洛莫司汀、 卡莫司汀、 卡培他滨、 紫 杉醇、 羟基喜树碱中的一种或几种 ； 抗癌药物溶液的浓度为 0.1 1mg/mL。 0020 所述步骤(1)中具有还原/酶双响应和靶向性的介孔硅纳米粒子在制备癌症诊断 说 明 书 CN 104491886 A 5 3/4 页 6 化疗一体化药物中的应用。 0021 本发明的制备 ： 介孔硅复合粒子的合成 ； 采用化学方法在粒子表面修饰二硫键， 并通过二硫键共价接透明质酸作为靶向分子 ； 以透明质酸上的羧基为反应位点， 将聚乙二 醇修饰至复合粒子表面以提高粒子生物相容性， 并将具有靶向作用的透明质酸分子通过二 硫键连接到纳米粒子。
20、表面， 制得兼具药物响应释放和成像功能的介孔硅纳米诊疗剂。 0022 本发明提供一种多功能介孔硅基纳米诊疗剂的制备方法。 以介孔硅包覆具备成像 功能的纳米粒子构成核-壳型纳米粒子， 并在其表面通过二硫键连接HA作为兼具还原性和 靶向性的封堵剂， 最后在孔道内负载抗癌药物， 制得多功能的介孔硅诊疗剂。 0023 有益效果 0024 a) 本发明将 HA 以二硫键为桥梁， 修饰到介孔硅表面， 并在介孔硅中包覆具有磁共 振或近红外成像功能的纳米粒子， 并在其孔道中负载抗癌药物， 旨在构建出还原和酶双响 应性， 且具有成像功能的多功能介孔硅纳米诊疗剂 ； 0025 b) 本发明实验装置简单， 操作方便。
21、， 成本不高 ； 所得诊疗剂能够实现药物的刺激 响应性释放， 并具有靶向作用 ； 将磁性粒子的成像功能和介孔硅的载药功能复合， 实现诊断 治疗一体化 ； 此外， 其生物相容性好， 稳定性好， 体内循环时间长， 能够在癌症的诊断治疗领 域得到应用。 附图说明 0026 图 1 为实施例 1 制备的磁性纳米粒子 (a) 和磁性介孔硅复合粒子 (b) 的 TEM 图。 具体实施方式 0027 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价。
22、形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 0028 实施例 1 0029 制备磁性介孔硅纳米粒子， 用于能够磁共振成像的响应性靶向药物传递。附图 1 为制备的磁性纳米粒子和磁性介孔硅复合粒子的 TEM 图片。 0030 (1)以Fe(acac)3为前驱体， 油胺为还原剂和稳定剂， 二苯醚为溶剂， 用高温分解法 制备油胺稳定的单分散四氧化三铁纳米粒子， 其中 Fe(acac)3与油胺的摩尔比为 15 ： 1， 二 苯醚为 15mL ； 0031 (2) 将油胺稳定的 Fe3O4转换为 CTAB 稳定的 Fe 3O4纳米粒子， 并依次加入水、 氢氧 化钠、 原硅酸四乙酯， 以溶胶 - 凝胶。
23、法在其表面生长介孔硅壳层， 得到复合粒子 ； 0032 (3) 将复合粒子分散在无水乙醇中， 加入适量 KH-550， 在 80回流 12h， 得到氨基 化的复合粒子 ； 0033 (4) 将 0.1g 氨基化的复合粒子分散在 20mL 无水 DMSO 中， 向其中加入 1g 琥珀酸 酐， 在室温下搅拌 48h， 得到表面羧基化的复合粒子 ； 0034 (5)0.1g羧基化的复合粒子分散在20mL的pH为5的PBS缓冲液中， 向其中依次加 入 75mmol 的 EDC 和 NHS， 搅拌均匀后加入 1g 胱胺二盐酸盐， 40反应 48h， 得到含二硫键连 说 明 书 CN 104491886 。
24、A 6 4/4 页 7 接剂的复合粒子 ； 0035 (6) 将表面含二硫键连接剂的介孔硅复合粒子、 HA、 EDC、 NHS 混合于适量的去离子 水中， 用三乙胺调节混合溶液pH至9.0左右， 在室温下搅拌48h， 制得HA包裹的复合介孔硅 纳米粒子。其中复合粒子、 HA、 EDC 和 NHS 的质量比为 80:20:10:12， HA 的分子量为 32kDa， 得到靶向修饰的复合粒子 ； 0036 (7)将氨基化的PEG与复合粒子分散在100mL乙醇中， 室温反应24h得到PEG功能 化的多功能介孔硅诊纳米粒子。 0037 实施例 2 0038 制备包裹金纳米棒的复合介孔硅纳米粒子， 用于。
25、有 CT 成像功能的响应性靶向药 物传递。 0039 (1) 以种子生长法制备金纳米棒。种子液配方如下 ： 2.5mL 浓度为 0.2M 的 CTAB 溶 液， 向其中加入 1.5mL 浓度为 1.0mM 的 HAuCl4溶液， 剧烈搅拌下加入 0.6mL 浓度为 0.01M 的冰冷 NaBH4溶液， 搅拌 2min 后在 28下静置 2h 后使用 ； 生长液配方如下 ： 将 50mL 0.2M CTAB、 2.8mL 4mM AgNO3、 5mL 15mM HAuCl4和45mL去离子水混合， 向其中加入1.25mL 0.08M 的抗坏血酸溶液， 混合均匀后， 向其中加入 1mL 的种子液，。
26、 在室温下反应 6h 后得到 CTAB 稳 定的金纳米棒 ； 0040 (2)以CTAB为模板， 在金棒上生长介孔硅壳层。 取15mL制得的金纳米棒离心去除 上清后分散在 10mL 去离子水中， 向其中加入 0.1mL 0.1M 的 NaOH 溶液， 然后每隔 30min 向 混合液中加入 20的 TEOS 甲醇溶液， 室温下搅拌 48 小时得到介孔硅包裹的金纳米棒 ； 0041 (3) 将介孔硅包裹的金纳米棒分散在无水乙醇中， 加入适量 KH-550， 在 80回流 12h， 得到氨基化的复合粒子 ； 0042 (4) 将 0.1g 氨基化的复合粒子分散在 20mL 无水 DMSO 中， 向。
27、其中加入 1g 琥珀酸 酐， 在室温下搅拌 48h， 得到表面羧基化的复合粒子 ； 0043 (5)0.1g羧基化的复合粒子分散在20mL的pH为5的PBS缓冲液中， 向其中依次加 入 75mmol 的 EDC 和 NHS， 搅拌均匀后加入 1g 胱胺二盐酸盐， 40反应 48h， 得到含二硫键连 接剂的复合粒子 ； 0044 (6) 将表面含二硫键连接剂的介孔硅复合粒子、 HA、 EDC、 NHS 混合于适量的去离子 水中， 用三乙胺调节混合溶液pH至9.0左右， 在室温下搅拌48h， 制得HA包裹的复合介孔硅 纳米粒子。其中复合粒子、 HA、 EDC 和 NHS 的质量比为 80:20:10:12， HA 的分子量为 32kDa， 得到靶向修饰的复合粒子 ； 0045 (7)将氨基化的PEG与复合粒子分散在100mL乙醇中， 室温反应24h得到PEG功能 化的多功能介孔硅诊纳米粒子。 0046 (8) 将上述 PEG 功能化的多功能介孔硅诊纳米粒子负载抗癌药物羟基喜树碱， 得 到具有响应性的靶向介孔硅纳米诊疗剂， 用于 CT 成像和靶向性药物传输。 说 明 书 CN 104491886 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 104491886 A 8 。