中药口服制剂的检测方法及应用.pdf

本发明提供了一种中药口服制剂的检测方法，该口服制剂选自颗粒剂、胶囊剂和片剂，优选为胶囊剂，并且该制剂由独一味和三七制成，所述检测方法包括以下一项或多项检测项目：木犀草素含量和皂苷类含量的测定、独一味的鉴别和/或树脂残留物的检查。本发明所提供的检测方法具有重复性良好、中间精密度良好、专属性强、对数线性关系良好，回收率较高的优点，适用于对独二味胶囊进行质量控制，有效控制相关产品的产品质量，保证产品的有效性。

1.  一种中药口服制剂的检测方法，该口服制剂选自颗粒剂、胶囊剂和片剂，优选为胶囊剂，并且该制剂由独一味和三七制成，其特征在于，所述检测方法包括以下一项或多项检测项目：木犀草素含量和皂苷类含量的测定、独一味的鉴别和/或树脂残留物的检查；
优选地，所述木犀草素含量的测定是采用高效液相色谱法，其中所述高效液相色谱的条件为：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)，检测波长为350nm。

2.  根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述木犀草素含量的测定方法包括以下步骤：
1)供试溶液的制备：取所述胶囊内容物，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2.5mol/L盐酸甲醇溶液25ml，称定重量，回流提取60分钟，取出，放冷，以2.5mol/L盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试溶液；
2)对照溶液的制备：精密称取木犀草素对照品适量，加甲醇制成每1ml含15ug的溶液，摇匀，作为对照溶液；
3)分别取步骤1)和2)所制备的供试品溶液与对照品溶液进样，依法测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，所述每粒胶囊中含独一味以木樨草素计在0.4mg以上。

3.  根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述皂苷类含量的测定包括采用高效液相色谱法测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量，其中所述高效液相色谱的条件为：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为水和乙腈，梯度洗脱条件为0～30分钟(81％水+19％乙腈)，30～65分钟(81～66％水+19～34％乙腈)，65～70分钟(66～91％水+34～19％乙腈)，70～80分钟(66～91％水+34～19％乙腈)，检测波长为203nm。

4.  根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述皂苷类含量的测定包括以下步骤：
1)供试溶液的制备：取所述胶囊内容物，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试溶液；
2)对照溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品和三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg10.4mg，人参皂苷Rb10.4mg、三七皂苷R10.1mg的混合溶液，作为对照溶液；
3)分别取步骤1)和2)所制备的供试品溶液与对照品溶液进样，依法测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，所述每粒胶囊中含三七以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1三种皂苷总量计不得低于30.0mg。

5.  根据权利要求1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述独一味的鉴别采用薄层色谱法，其中所述薄层色谱的条件为：薄层板为硅胶薄层板，展开剂为三氯甲烷-甲醇(4∶1)，紫外200-500nm优选254nm下检视。

6.  根据权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述薄层色谱鉴别法包括以下步骤：
1)供试溶液的制备：取胶囊剂内容物、片剂或颗粒剂，研细，加乙醇，加热回流5-30分钟优选15分钟，取出，滤过，滤液作为供试品溶液；
2)对照溶液的制备：另取独一味对照药材，按照步骤1)所述方法制成对照药材溶液；
3)照薄层色谱法试验，吸取步骤1)和2)所制备的两种溶液，分别点于同一块硅胶薄层板上，以三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯200-500nm优选254nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，相同颜色的斑点。

7.  根据权利要求1-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述薄层色谱鉴别法包括以下步骤：
1)供试溶液的制备：取所述胶囊内容物1.0g，研细，加乙醇15ml，加热回流15分钟，取出，滤过，滤液作为供试品溶液；
2)对照溶液的制备：取独一味对照药材1.0g，按照步骤1)所述方法制成对照溶液；
3)照薄层色谱法试验，吸取步骤1)和2)所制备的两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇为展开剂，所述展开剂中三氯甲烷-甲醇的体积比为1∶1～9∶1优选为4∶1，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视，供试溶液色谱中，在与对照溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

8.  根据权利要求1-7中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述树脂残留物的检查包括：
1)供试溶液的制备：取胶囊剂内容物、片剂或颗粒剂，加入N，N-二甲基甲酰胺和水，超声5分钟，作为供试溶液；
2)对照溶液的制备：分别取环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯用N，N-二甲基甲酰胺配制成贮备液；
分别取各贮备液混合后，用N，N-二甲基甲酰胺稀释成每1ml中含环己烷4μg、苯0.4μg、甲苯4μg、二甲苯4μg、苯乙烯4μg、对二乙苯4μg和二乙烯苯4μg的溶液，加水，混匀，作为对照溶液；和
3)分别取步骤1)和2)所制备的供试品溶液与对照品溶液进样，色谱柱为聚乙二醇石英毛细管柱，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯应符合以下规定：
含环己烷不得大于0.002％；含苯不得大于0.0002％；含甲苯不得大于0.002％；含二甲苯不得大于0.002％；含苯乙烯不得大于0.002％；含对二乙苯不得大于0.002％；含二乙烯基苯不得大于0.002％。

9.  根据权利要求1-8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述树脂残留物的检查是采用极性毛细管柱顶空进样系统程序升温法对环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯进行测定，其中所述极性毛细管柱顶空进样系统程序升温法的条件为：色谱柱为聚乙二醇(PEG-20M)石英毛细管柱；柱温为程序升温，初始温度40℃，保持5分钟，再以每分钟6℃升温至200℃，保持6分钟；检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，检测器温度为250℃；进样口温度为230℃；顶空进样，顶空瓶平衡温度为70℃，平衡时间为45分钟。

10.  权利要求1-9中任一项所述的检测方法在中药口服制剂生产中质量控制方面的应用，该口服制剂选自颗粒剂、胶囊剂和片剂，优选为胶囊剂，并且该制剂由独一味和三七制成。

中药口服制剂的检测方法及应用
技术领域
本发明涉及一种中药口服制剂的检测方法，本发明属于分析化学技术领域。
背景技术
中药口服制剂“独二味胶囊”由独一味、三七两味药材制成，是本申请人结合长期用药经验，并经药理、毒理试验研究，采用新技术研究的新药品种。功能主治为：活血止痛，化瘀止血。用于治疗血瘀证(软组织损伤、月经不调)，症见肿胀疼痛，瘀血，关节活动受限，月经量多，经期不定，下腹疼痛，舌质紫，有瘀斑。
独二味胶囊使用的药材独一味系藏族习用药材，为唇形科植物独一味Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo的干燥全草，其作为藏族等少数民族的传统用药，应用历史已近2000年。根据有关文献报道，独一味中主要含有黄酮类成分，其中有木犀草素、木犀草素-7-O葡萄糖苷、槲皮素、槲皮素-3-O阿拉伯糖苷、芹菜素-7-O新陈皮苷和β-谷甾醇等成分；此外独一味根中尚含有环烯醚萜和苯乙醇苷类成分，其中有独一味素A(lamiophlomiolA，1a)、独一味素B(lamiophlomiol B，1b)、独一味素C(lamiophlomiol C)等。
三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根茎。应用广泛，为伤科圣药。根据有关文献报道，三七中主要含有三七皂苷、氨基酸、黄酮类、生物碱、核苷类等成分。
目前，尚缺乏一种能够有效控制独二味胶囊的产品质量，保证产品的有效性的检测方法。
发明内容
因此，本发明的目的在于，提供一种中药口服制剂的检测方法。
本发明的另一个目的在于，提供上述检测方法在中药口服制剂生产中质量控制方面的用途。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一方面，本发明提供一种中药口服制剂的检测方法，该口服制剂选自颗粒剂、胶囊剂和片剂，优选为胶囊剂，并且该制剂由独一味和三七制成，其中所述检测方法包括以下一项或多项检测项目：木犀草素含量和皂苷类含量的测定、独一味的鉴别和/或树脂残留物的检查；
优选地，所述木犀草素含量的测定是采用高效液相色谱法，其中所述高效液相色谱的条件为：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)，检测波长为350nm。
优选地，根据前述的检测方法，所述木犀草素含量的测定方法包括以下步骤：
1)供试溶液的制备：取所述胶囊内容物，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2.5mol/L盐酸甲醇溶液25ml，称定重量，回流提取60分钟，取出，放冷，以2.5mol/L盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试溶液；
2)对照溶液的制备：精密称取木犀草素对照品适量，加甲醇制成每1ml含15ug的溶液，摇匀，作为对照溶液；
3)分别取步骤1)和2)所制备的供试品溶液与对照品溶液进样，依法测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，所述每粒胶囊(0.18g)中含独一味以木樨草素计在0.4mg以上。
优选地，根据前述的检测方法，所述皂苷类含量的测定包括采用高效液相色谱法测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量，其中所述高效液相色谱的条件为：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为水和乙腈，梯度洗脱条件为0～30分钟(81％水+19％乙腈)，30～65分钟(81→66％水+19→34％乙腈)，65～70分钟(66→91％水+34→19％乙腈)，70～80分钟(66→91％水+34→19％乙腈)，检测波长为203nm。
优选地，根据前述的检测方法，所述皂苷类含量的测定包括以下步骤：
1)供试溶液的制备：取所述胶囊内容物，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试溶液；
2)对照溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品和三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg10.4mg，人参皂苷Rb10.4mg、三七皂苷R10.1mg的混合溶液作为对照溶液；
3)分别取步骤1)和2)所制备的供试品溶液与对照品溶液进样，依法测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，所述每粒胶囊(0.18g)中含三七以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1三种皂苷总量计不得低于30.0mg。
在本发明的另一个实施方案中，所述检测方法还包括独一味的鉴别，所述独一味的鉴别采用薄层色谱法，其中所述薄层色谱的条件为：薄层板为硅胶薄层板，展开剂为三氯甲烷-甲醇(4∶1)，紫外200-500nm优选254nm下检视。
优选地，根据前述的检测方法，所述薄层色谱鉴别法包括以下步骤：
1)供试溶液的制备：取胶囊剂内容物、片剂或颗粒剂，研细，加乙醇，加热回流5-30分钟优选15分钟，取出，滤过，滤液作为供试品溶液；
2)对照溶液的制备：另取独一味对照药材，按照步骤1)所述方法制成对照药材溶液；
3)照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液，分别点于同一块硅胶薄层板上，以三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯200-500nm优选254nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，相同颜色的斑点。
优选地，根据前述的检测方法，所述薄层色谱鉴别法包括以下步骤：
1)供试溶液的制备：取所述胶囊内容物1.0g，研细，加乙醇15ml，加热回流15分钟，取出，滤过，滤液作为供试品溶液；
2)对照溶液的制备：取独一味对照药材1.0g，按照步骤1)所述方法制成对照溶液；
3)按照薄层鉴别法测定：吸取步骤1)和2)所制备的两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇为展开剂，所述展开剂中三氯甲烷-甲醇的体积比为1∶1～9∶1优选为4∶1，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视，供试溶液色谱中，在与对照溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
在本发明的另一个实施方案中，所述检测方法还包括树脂残留物的的检查，所述树脂残留物的检查包括：
1)供试溶液的制备：取胶囊剂内容物、片剂或颗粒剂，加入N，N-二甲基甲酰胺和水，超声5分钟，作为供试溶液；
2)对照溶液的制备：分别取环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯分别用N，N-二甲基甲酰胺配制成贮备液；
分别取各贮备液混合后，用N，N-二甲基甲酰胺稀释成每1ml中含环己烷4μg、苯0.4μg、甲苯4μg、二甲苯4μg、苯乙烯4μg、对二乙苯4μg和二乙烯苯4μg的溶液，加水，混匀，作为对照溶液；和
3)分别取步骤1)和2)所制备的供试品溶液与对照品溶液进样，色谱柱为聚乙二醇石英毛细管柱，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯应符合以下规定(质量百分比)：
含环己烷不得大于0.002％；含苯不得大于0.0002％；含甲苯不得大于0.002％；含二甲苯不得大于0.002％；含苯乙烯不得大于0.002％；含对二乙苯不得大于0.002％；含二乙烯基苯不得大于0.002％。
优选地，根据前述的检测方法，树脂残留物的检查采用极性毛细管柱顶空进样系统程序升温法对环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯进行测定，其中所述极性毛细管柱顶空进样系统程序升温法的条件为：色谱柱为聚乙二醇(PEG-20M)石英毛细管柱；柱温为程序升温，初始温度40℃，保持5分钟，再以每分钟6℃升温至200℃，保持6分钟；检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，检测器温度为250℃；进样口温度为230℃；顶空进样，顶空瓶平衡温度70℃，平衡时间为45分钟。
另一方面，本发明提供前述的检测方法在中药口服制剂质量生产中控制方面的应用，该口服制剂选自颗粒剂、胶囊剂和片剂，优选为胶囊剂，并且该制剂由独一味和三七制成。
综上所述，本发明提供了一种独二味胶囊的检测方法，适用于对独二味胶囊进行质量控制，有效控制相关产品的产品质量，保证产品的有效性。本发明人通过大量实验，按照相关规定，从大量检测项目中筛选出能够有效控制独二味胶囊产品质量的项目，包括以下一项或多项检测项目：树脂残留物的检查、独一味的鉴别，和/或木犀草素含量和皂苷类含量的测定。本发明经过大量实验，反复验证，所建立的检测方法具有重复性良好、中间精密度良好、专属性强、对数线性关系良好及回收率较高的优点，适合含有独一味和三七的中药口服制剂检测的要求。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中的样品及对照品来源如下：
1、样品来源
本试验研究用独一味、三七药材购自成都雅星贸易有限公司，经检验符合中国药典2005年版要求。
试验小试及中试样品制备方法如下：取独一味药材1000g，加水煎煮后，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度，放冷，加于已处理好的树脂柱上，加水洗脱，继用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度，备用；另取三七药材1000g，粉碎，加乙醇回流提取后，合并提取液，滤过，药渣备用；滤液回收乙醇，浓缩至相对密度，放冷，加于已处理好的树脂柱上，加水洗脱，继用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩成稠膏，干燥，粉碎，得三七提取物I；取三七醇提后的药渣，挥尽乙醇，加水提取后，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度，放冷，加于已处理好的树脂柱上，加水洗脱，继用氨水洗脱，收集氨水洗脱液，浓缩除氨，干燥，粉碎，得三七提取物II。以独一味浓缩液作粘合剂，以三七提取物和淀粉作底料，一步制粒，整粒，装胶囊，每粒内容物为0.18g，制成1000粒，包装，即得。
2、对照品的来源
本研究所用的木犀草素对照品、购自独一味对照药材、三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1以及人参皂苷Rb1均购自中国药品生物制品检定所。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1：本发明独二味胶囊的鉴别
本实施例为对本发明独二味胶囊中的独一味、三七进行鉴别。以下结合本品特点对独二味胶囊(样品批号：080301、080302、080303)进行了薄层层析鉴别研究，以独一味对照药材作为对照鉴别本品，并采用不同的展开系统考察其薄层展开行为。
1、独一味的鉴别方法
供试品溶液的制备：取本品内容物1.0g，研细，加乙醇15ml，加热回流15分钟，取出，滤过，滤液作为供试品溶液。
阴性样品溶液(缺独一味)的制备：按照独二味胶囊的制法，制备不含独一味药材的胶囊样品，采用与供试品溶液相同的方法制备，即得。
对照药材溶液的制备：取独一味对照药材1.0g，同法制成对照药材溶液。
吸取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，分别以三氯甲烷-甲醇(4∶1)和三氯甲烷-丙酮(3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点明显。结果发现不同展开剂条件下，在与对照药材色谱相应位置附近，存在干扰情况，影响判断。
换用硅胶GF₂₅₄薄层板为展开材料，置紫外光灯(254nm)下检视，在与对照药材色谱相应位置上，阴性样品溶液无干扰，对照药材及样品溶液色谱行为良好，能达到质量控制的目的，予以选择，综合考虑色谱行为等因素，选择三氯甲烷-甲醇(4∶1)为展开剂。
独一味鉴别方法如下：取本品内容物1.0g，研细，加乙醇15ml，加热回流15分钟，取出，滤过，滤液作为供试品溶液。另取独一味对照药材1.0g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2、三七的鉴别
鉴于三七的指标成分为皂苷类，含量测定项下已有控制，故在鉴别项下未对三七药材进行控制。
实施例2：本发明独二味胶囊剂的树脂残留物
根据国家药品监督管理局于2000年2月17日以药管注[2000]56号文下发了《大孔吸附树脂分离纯化中药提取液的技术要求(暂行)》，应对苯乙烯骨架型大孔树脂残留物检查项目为苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、烷烃类、二乙基苯类(二乙烯基)及其他可能因树脂引入的有机残留物进行检测，其限量不能高于国家标准或国际通用标准。独二味胶囊在工艺中使用的苯乙烯骨架型大孔树脂可能引入的残留物及其限度见表1。
表1引入树脂残留物限度结果

苯乙烯骨架型大孔树脂引入的残留物，需要在方法学研究时要进行限度控制，再根据样品中的实际残留量，酌情定入质量标准。
根据上述七种溶剂的沸点和极性，采用极性毛细管柱顶空进样系统程序升温法对环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯进行测定和研究。
1、色谱条件：
仪器：Agilent 4890D气相色谱仪，Agilent 7694E顶空进样器；
色谱条件：
色谱柱：Sepuclo-WAX石英毛细管柱(30m×0.32mm×1.0μm，固定液为聚乙二醇-20M)；
检测器：氢火焰离子化检测器，温度250℃；进样口：230℃，分流比为5∶1；
柱温：40℃保持5分钟后，以每分钟6℃的速率升温至200℃，保持6分钟；
载气：N₂，柱头压：4.0psi；氢气流量35ml/min；空气流量350ml/min；
进样方式：顶空进样，进样量1.0ml；顶空瓶平衡温度70℃，平衡时间45min。
2、溶液的配制：
(1)试剂：
环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯为分析纯；二乙烯苯和对二乙苯为进口气相对照品，N，N-二甲基甲酰胺为色谱纯，水为超纯水。
(2)标准溶液的配制：
分别取环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯各适量，精密称定，用N，N-二甲基甲酰胺配制成贮备液；分别取各贮备液适当体积混合后，用N，N-二甲基甲酰胺稀释成每1ml中含环己烷8μg、苯0.8μg、甲苯8μg、二甲苯8μg、苯乙烯8μg、对二乙苯8μg和二乙烯苯8μg的溶液，即到标准溶液溶液I；精密量取标准溶液I适量，加N，N-二甲基甲酰胺依次稀释2倍、4倍、8倍和16倍，分别得到标准溶液II、III、IV和V。精密量取标准溶液各1.0ml，分别置于20ml顶空瓶中，精密加入水5.0ml，封瓶，混匀，即得。
(3)检测限溶液的配制：
取环己烷、苯、甲苯、对二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯的贮备液，用N，N-二甲基甲酰胺多次稀释混合后配制成含环己烷1.99×10^-5mg·ml^-1、苯3.30×10^-5mg·ml^-1、甲苯2.57×10^-5mg·ml^-1、二甲苯7.27×10^-5mg·ml^-1、苯乙烯4.77×10^-5mg·ml^-1、对二乙苯2.80×10^-5mg·ml^-1和二乙烯苯1.69×10^-4mg·ml^-1的溶液。精密量取检测限溶液1.0ml，置于20ml顶空瓶中，精密加入水5.0ml，封瓶，混匀，即得。
3、系统适用性试验：
1)柱效：以环己烷峰计算，色谱系统的理论塔板数为：3.4×10⁴；
2)保留时间和分离度结果如表10所示。
表2树脂残留物保留时间、分离度试验结果


4、方法的考察
(1)专属性
在以上色谱条件下，环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯能完全分离，且空白不干扰。
(2)线性和范围
精密量取标准溶液I、II、III、IV、V各1.0ml，分别置于20ml顶空瓶中，在精密加入水5.0ml，封瓶，混匀，在以上色谱条件下测定，记录环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯、二乙烯苯的保留时间和峰面积。二甲苯和二乙烯苯的峰面积分别以其四个峰的峰面积之和计算。各溶剂的进样量与峰面积的线性关系良好，结果见表3。
表3树脂残留物保留时间、分离度试验结果

(3)进样重复性：
取标准溶液III，重复进样6次，计算各溶剂的平均峰面积及其相对标准偏差(RSD)。二甲苯和二乙烯苯的峰面积分别以其四个峰的峰面积之和计算。本试验进样重复性较好，结果见表4。
表4树脂残留物重复性试验结果

(4)检测限
精密量取检测限溶液1ml，置于20ml顶空瓶中，在精密加入水5.0ml，封瓶混匀，在以上色谱条件下测定，记录环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯的保留时间和峰高，结果：在以上色谱条件下，S/N＝3时，环己烷的检测限为0.11ppm，苯的检测限为0.16ppm，甲苯的检测限为0.08ppm，二甲苯的检测限为0.33ppm，苯乙烯的检测限为0.24ppm，对二乙苯的检测限为0.14ppm，二乙烯苯的检测限为0.70ppm。二甲苯和二乙烯苯以其四个峰中最高的峰的峰高计算检测限。
(5)准确度
取本品批号为080101的样品约0.20g，精密称定，置于20ml顶空瓶中，精密加入标准溶液II 1.0ml和水5.0ml，封瓶，混匀，超声5分钟，在以上色谱条件下测定，记录各溶剂的保留时间和峰面积，根据加入量和实测量计算分别计算回收率，结果见表5。
表5树脂残留物回收率试验结果


5、样品的测定
(1)样品测定方法：
对照溶液的制备：分别取环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯各适量，精密称定，用N，N-二甲基甲酰胺配制成贮备液；分别取各贮备液适当体积混合后，用水稀释成每1ml中含环己烷4μg、苯0.4μg、甲苯4μg、二甲苯4μg、苯乙烯4μg、对二乙苯4μg和二乙烯苯4μg的对照溶液；精密量取对照溶液1.0ml，置20ml顶空瓶中，再精密加入水5.0ml，封瓶，即得。
供试溶液的制备：取本品约0.20g，精密称定，置20ml顶空瓶中，精密加入N，N-二甲基甲酰胺1.0ml和水5ml，封瓶，超声5min，即得。
测定法：取对照品，在70℃下平衡45分钟后，取顶空气1.0ml注入气相色谱仪，记录色谱图；另取供试品，同法测定，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，各溶剂的残留量应符合规定。
环己烷的残留量不得大于0.002％；苯的残留量不得大于0.0002％；甲苯的残留量不得大于0.002％；二甲苯的残留量不得大于0.002％；苯乙烯的残留量不得大于0.002％；对二乙苯的残留量不得大于0.002％；二乙烯基苯的残留量不得大于0.002％。
(2)样品测定结果如表6所示。
表6各批样品残留物检测结果

综上所述，本发明所提供的树脂残留物检测方法如下：取本品约0.20g，精密称定，置20ml顶空瓶中，精密加入N，N-二甲基甲酰胺1.0ml和水5.0ml，封瓶，超声5min，作为供试溶液。分别取环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯各适量，精密称定，用N，N-二甲基甲酰胺配制成贮备液；分别取各贮备液适当体积混合后，用N，N-二甲基甲酰胺稀释成每1ml中含环己烷4μg、苯0.4μg、甲苯4μg、二甲苯4μg、苯乙烯4μg、对二乙苯4μg和二乙烯苯4μg的溶液，精密量取1.0ml，置20ml顶空瓶中，再精密加入水5.0ml，封瓶，混匀，作为对照溶液。色谱柱为聚乙二醇(PEG-20M)石英毛细管柱，柱温：程序升温，初始温度40℃，保持5分钟，再以每分钟6℃升温至200℃，保持6分钟；检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，检测器温度为250℃；进样口温度为230℃。顶空进样，顶空瓶平衡温度为70℃，平衡时间为45分钟，进样体积为1.0ml。分别取供试品溶液与对照品溶液进样，依法测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含环己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、对二乙苯和二乙烯苯应符合以下规定：
含环己烷不得大于0.002％；含苯不得大于0.0002％；含甲苯不得大于0.002％；含二甲苯不得大于0.002％；含苯乙烯不得大于0.002％；含对二乙苯不得大于0.002％；含二乙烯基苯不得大于0.002％。
实施例3：本发明独二味胶囊剂的的主要成分含量测定
本实施例为本发明独二味胶囊剂的的主要成分含量测定。独二味胶囊由独一味和三七药材经加工而成，参考药典和相关文献，采用了高效液相色谱法(HPLC法)测定其中独一味药材中木犀草素和三七药材中皂苷类指标成分的含量作为控制手段。
1、木犀草素的含量测定
(1)仪器与试药
仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪及配套工作站
Sartorius CP225D电子天平
木犀草素对照品批号：111520-200504，供含量测定用，购自中检所。
试剂：色谱用甲醇为色谱纯(购自美国Fisher化学试剂公司)，水为重蒸馏水(自制)；其它试剂均为分析纯。
(2)色谱条件
1)检测波长的选择
对木犀草素对照品溶液进行吸收波长扫描，结果：木犀草素在350nm波长处有最大吸收，试验选择350nm为检测波长。
2)流动相的选择
试验参曾选用流动相①甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)；②乙腈-0.4％磷酸溶液(25∶75)；③甲醇-水(50∶50)，对独二味胶囊中的木犀草素进行含量测定，结果均得到样品中木犀草素峰基线分离的对称色谱峰。方法学考察以流动相①甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相。
3)色谱柱的考察
试验参曾选用Thermo ODS-2HYPERSIL(250mm×4.6mm，5um)、Phenomenex Luna C₁₈(250mm×4.6mm，5um)、Alltima C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)三个品牌的色谱柱对独二味胶囊中的木犀草素进行含量测定，均得到样品中木犀草素峰基线分离的对称色谱峰，分离度大于1.5，理论塔板数按木犀草素峰计算大于3000，故该方法适用范围较广。方法学考察以Phenomenex Luna C₁₈(250mm×4.6mm，5um)为分析柱。
(3)对照品溶液的制备
对照品制备方法：精密称取木犀草素对照品适量，加甲醇制成每1ml含15ug的溶液，摇匀，即得。
(4)供试品溶液的制备
本试验沿用酸水解制备样品溶液的方法，对水解酸浓度、提取溶媒、提取方法、提取时间等因素做了考察，试验方法和结果如下。
1)水解酸浓度选择：取本品(批号：080101)内容物，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入2.0mol/L盐酸甲醇溶液、2.5mol/L盐酸甲醇溶液、3.0mol/L盐酸甲醇溶液各25ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，用各自水解溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件测定，测定结果见表7。
表7水解酸(盐酸甲醇)不同浓度考察试验结果

由表7可见，以2.5mol/L盐酸甲醇和3.0mol/L盐酸甲醇溶液为水解酸浓度时，木犀草素的提取效率基本无差异，选择水解介质为2.5mol/L盐酸甲醇溶液。
2)提取溶媒选择：取本品(批号：080101)内容物，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入2.5mol/L盐酸50％甲醇溶液、2.5mol/L盐酸甲醇溶液、2.5mol/L盐酸乙醇溶液各20ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，用各自提取溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件测定，测定结果如表8所示。
表8提取溶媒考察试验结果

由表8可见，以2.5mol/L盐酸甲醇溶液提取，木犀草素的含量最高，故实验选择2.5mol/L盐酸甲醇溶液为提取溶液。
3)提取时间选择：取本品(批号：080101)内容物，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2.5mol/L盐酸甲醇溶液20ml，称定重量，分别进行①回流提取30min，②回流提取60min，③回流提取90min，取出，放冷，以提取溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件测定，测定结果如表9所示。
表9提取时间考察试验结果

由表9可见，提取60分钟后样品中木犀草素的含量影响几乎无差别，实验选择直接回流60分钟。
综上所述，供试品溶液的制备方法为：取本品内容物，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2.5mol/L盐酸甲醇溶液25ml，称定重量，回流提取60分钟，取出，放冷，以2.5mol/L盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(5)空白试验
按处方自配不含独一味的空白试剂，按制法制成空白制剂。
依据供试品溶液制备方法制备并测定，结果空白溶液在与木犀草素对照品相同保留时间处未显色谱峰，故认为无干扰。
(6)标准曲线及线性范围考察
分别精密吸取木犀草素对照品溶液(0.0116mg/ml)1、2.5、5、10、15μl，对照品溶液(0.1160mg/ml)2.5、5、10、15μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，结果见表18。以峰面积(A)为纵坐标(Y)，木犀草素对照品进样量(ug)为横坐标(X)，绘制标准曲线，并计算回归方程：标准曲线Y＝4092.7X-20.2，相关系数1.0。
表10木犀草素对照品标准曲线测定结果

由表10可见，木犀草素进样量在0.0116～1.74ug范围内与色谱峰面积呈良好线性关系。
(7)稳定性试验
取批号为080101的样品，按质量标准正文含量测定项下的测定方法制备供试品溶液，室温下保存，分别精密吸取10μl于0、2、4、8小时，注入液相色谱仪，按正文测定条件进行测定，记录色谱图，考察其稳定性，试验结果如表11所示。
表11稳定性考察试验结果

由表11可见，供试品溶液在配制后8小时内测定，结果稳定。
(8)精密度试验
精密吸取同一供试品溶液(批号：080101)，重复进样5次，每次10ul，测定木犀草素峰面积，试验结果如表20所示。
表12精密度试验考察试验结果

表12可见，样品峰面积平均值为657.0，RSD＝0.62％，表明精密度良好。
(9)重复性试验
取本品内容物，研细，取约0.5g，平行5份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2.5mol/L盐酸甲醇溶液25ml，称定重量，回流提取60min，取出，放冷，以2.5mol/L盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按质量标准正文含量测定项下的测定方法进行测定，实验结果如表13所示。
表13重现性试验结果

表13可见，含量平均值为4.23mg/g，RSD＝2.83％，表明重现性较好。
(10)回收率试验
采用加样回收法，取已知含量的样品(批号080101木犀草素含量为4.23mg/g)，研细，取上述样品0.15g(由于对照品浓度稍大，故样品的取样量有所调整，以便使峰面积相应匹配)，精密称定于锥形瓶中，平行6份，分别精密加入木犀草素对照品溶液(C＝0.1160mg/ml)4.0、5.0、6.0ml，再精密加入2.5mol/L盐酸甲醇溶液20ml，称定重量，加热回流60分钟，取出，放冷，以2.5mol/L盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2.0ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。按质量标准正文含量测定项下的测定方法进行测定，按下式计算回收率，试验结果如表22所示，其中回收率的计算方法如下：

表14加样回收率考察试验结果

由表14可见，采用加样回收试验所得平均回收率为98.6％，RSD为0.88％，表明回收率较好。
(11)样品测定
按照质量标准正文含量测定方法对3批中试产品木犀草素的含量进行了测定，每批平行测定2次，试验结果如表15所示。
表15样品中木犀草素含量测定结果

(12)含量限度的确定
根据自制样品的独一味药材质量及生产出独二味胶囊的质量控制数据如表16所示。
表16独一味药材及木犀草素转移率

木犀草素：在满足独一味药材符合中国药典2005年版要求的前提下，根据药效学研究及中试生产数据，每粒独二味胶囊中含独一味药材1g，自制4批样品中木犀草素的转移率介于45.7％～46.9％，成品中木犀草素的含量介于0.74～0.76mg，独二味胶囊中木犀草素的转移率均大于40％，不同批次间转移率差异较小，表明工艺基本稳定。考虑到独一味药材及独二味胶囊装量差异等因素各批次之间存在差异，暂定每片独二味胶囊中含独一味以木犀草素计不得低于0.4mg。
2、皂苷类成分
(1)仪器与试药
仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪及配套工作站
Sartorius CP225D电子天平
三七皂苷R1批号：110745-200516；人参皂苷Rg1批号：110703-200424；人参皂苷Rb1批号：110704-200420。
试剂：色谱用甲醇为色谱纯(购自美国Fisher化学试剂公司)，水为重蒸馏水(自制)；其它试剂均为分析纯。
(2)色谱条件
1)检测波长的选择
分别对上述3种对照品溶液进行吸收波长光谱扫描，结果：均在203nm波长处有最大吸收，试验选择203nm为检测波长。
2)流动相的选择
试验曾选用不同流动相，就独二味胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1进行含量测定，以色谱峰分离度、分析时间、理论塔板数等指标做综合评价，筛选出比较合适的分析条件。方法学考察按表17规定的流动相进行梯度洗脱。
表17三七皂苷类成分含量测定流动相梯度表

3)色谱柱的考察
试验曾选用Dikma Diamonsil C₁₈(250mm×4.6mm，5um)、PhenomenexLuna C₁₈(250mm×4.6mm，5um)、Alltima C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)三个品牌的色谱柱对独二味胶囊中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1进行含量测定，均得到样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1基线分离的对称色谱峰，分离度大于1.5，阴性样品溶液在对应时间处无吸收，理论塔板数按木犀草素峰计算大于4000，故该方法适用范围较广。方法学考察以Phenomenex Luna C₁₈(250mm×4.6mm，5um)为分析柱。
(3)对照品溶液的制备
对照品制备方法：精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品和三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg10.4mg，人参皂苷Rb10.4mg、三七皂苷R10.1mg的混合溶液，即得。
(4)供试品溶液的制备
本试验考察了样品溶液的制备方法，对提取溶媒、提取方法、提取时间等因素做了考察，试验方法和结果如下。
1)提取溶媒选择：取本品(批号：080101)内容物，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、70％甲醇、30％甲醇各50ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，用各自提取溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。按上述色谱条件测定，测定结果如表18所示。
表18提取溶媒考察试验结果

由表18可见，以甲醇提取时上述3种皂苷总量最高，故选择甲醇为提取溶液。
2)提取方法选择：取本品(批号：080101)内容物，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，分别进行(1)回流提取30分钟，(2)超声30分钟，取出，放冷，以甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。按上述色谱条件测定，测定结果见表19。
表19提取方法考察试验结果

由表19可见，上述2种提取方法对样品中3种皂苷总量影响几乎无差别，故实验选择直接回流。
3)提取时间选择：取本品(批号：080101)内容物，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，分别进行(1)回流30分钟，(2)回流提取60分钟，(3)回流提取90分钟，取出，放冷，以甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。按上述色谱条件测定，测定结果见表20。
表20提取时间考察试验结果

由表20可见，提取不同时间对样品中3种皂苷总量影响几乎无差别，RSD为0.41％，实验选择直接回流30分钟。
综上所述，供试品溶液的制备方法为：取独二味胶囊内容物，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。
(5)空白试验
按处方自配不含三七的空白试剂，按制法制成空白制剂。
依据供试品溶液制备方法制备并测定，结果空白溶液在与上述3种对照品相同保留时间处未显色谱峰，故认为无干扰。
(6)标准曲线及线性范围考察
分别精密吸取对照品溶液(人参皂苷Rg10.4298mg/ml，人参皂苷Rb10.3710mg/ml、三七皂苷R10.1144mg/ml)1、2.5、5、7.5、10、15μl，对照品溶液(人参皂苷Rg12.149mg/ml，人参皂苷Rb11.855mg/ml、三七皂苷R10.572mg/ml)5、10、15μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，结果见表29至表31。以峰面积(A)为纵坐标(Y)，各对照品进样量(μg)为横坐标(X)，绘制标准曲线图，并计算回归方程。
表21人参皂苷Rg1标准曲线测定结果

由表21可见，人参皂苷Rg1进样量在0.4298～32.2350ug范围内与色谱峰面积呈良好线性关系。
表22人参皂苷Rb1标准曲线测定结果

由表22可见，人参皂苷Rb1进样量在0.3710～27.8250ug范围内与色谱峰面积呈良好线性关系。
表23三七皂苷R1标准曲线测定结果

由表23可见，三七皂苷R1进样量在0.1144～5.7200ug范围内与色谱峰面积呈良好线性关系。
(7)稳定性试验
取批号为080101的样品，按质量标准正文含量测定项下的测定方法制备供试品溶液，室温下保存，分别精密吸取10μl于0、4、8小时，注入液相色谱仪，按正文测定条件进行测定，记录色谱图，考察其稳定性，试验结果如表24。
表24稳定性考察试验结果

由表24可见，供试品溶液在配制后8小时内测定，各色谱峰面积RSD均小于2％，表明样品溶液稳定。
(8)精密度试验
精密吸取同一供试品溶液(批号：080101)，重复进样5次，每次10ul，测定各色谱峰面积，试验结果如表25所示。
表25精密度试验考察试验结果

由表25可见，供试品中各色谱峰面积RSD均小于2％，表明精密度良好。
(9)重复性试验
取独二味胶囊内容物，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得，按质量标准正文含量测定项下的测定方法进行测定，实验结果如表26所示。
表26重现性试验结果

由表26可见，各指标成分含量测定值的RSD均小于2％，认为选定方法重现性良好。
(10)回收率试验
1)人参皂苷Rg1回收率试验：采用加样回收法，取已知含量的样品(批号080101，人参皂苷Rg1含量为124.1934mg/g，人参皂苷Rb1含量为143.0980mg/g、三七皂苷R1含量为20.4731mg/g)0.1g，精密称定，平行6份，分别精密加入人参皂苷Rg1对照品溶液(人参皂苷Rg1含量为3.0858mg/g)4.0、5.0、6.0ml，再精密加入甲醇20ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，以甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按质量标准正文含量测定项下的测定方法进行测定，按下式计算回收率，试验结果如表27所示。

表27人参皂苷Rg1加样回收率试验结果

2)人参皂苷Rb1回收率试验：采用加样回收法，取已知含量的样品(批号080101，人参皂苷Rg1含量为124.1934mg/g，人参皂苷Rb1含量为143.0980mg/g、三七皂苷R1含量为20.4731mg/g)0.1g，精密称定，平行6份，分别精密加入人参皂苷Rb1对照品溶液(人参皂苷Rb1含量为3.0592mg/g)4.0、5.0、6.0ml，再精密加入甲醇20ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，以甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按质量标准正文含量测定项下的测定方法进行测定，按上面公式计算回收率，试验结果如表28所示。
表28人参皂苷Rb1加样回收率试验结果

3)三七皂苷R1回收率试验：采用加样回收法，取已知含量的样品(批号080101，人参皂苷Rg1含量为124.1934mg/g，人参皂苷Rb1含量为143.0980mg/g、三七皂苷R1含量为20.4731mg/g)0.1g，精密称定，平行6份，分别精密加入三七皂苷R1对照品溶液(三七皂苷R1含量为0.4128mg/g)4.0、5.0、6.0ml，再精密加入甲醇20ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，以甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按质量标准正文含量测定项下的测定方法进行测定，按上面公式计算回收率，试验结果如表29所示。
表29三七皂苷R1加样回收率试验结果

由表29可见，加样回收率法中各样品回收率均介于97.％～103.％，RSD(％)均小于3％，认为制样方法可行。
(11)样品测定
按照质量标准正文含量测定方法对3批中试产品三种皂苷类成分的含量进行了测定，每批平行测定2次，试验结果如表30所示。
表30样品中三种皂苷含量测定结果

(12)含量限度的确定
根据自制样品的三七药材质量及生产出独二味胶囊的质量控制数据，现总结如表31所示。
表31三七药材及三种皂苷转移率

在满足三七药材符合中国药典2005年版要求的前提下，根据药效学研究及中试生产数据，每片独二味胶囊中含三七药材6g，自制4批样品中三种皂苷成分的转移率为63.1％～68.8％，成品中三种皂苷的总量为47.7～51.8mg，独二味胶囊中三种总皂苷的转移率均大于50％，不同批次间转移率差异较小，表明工艺基本稳定。考虑到三七药材及独二味胶囊含膏量等因素各批次之间存在差异，暂定每粒独二味胶囊中含三七以三种皂苷总量计不得低于30.0mg。