一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统.pdf

上传人:v**** 文档编号:5210802 上传时间:2018-12-26 格式:PDF 页数:9 大小:1.04MB
返回 下载 相关 举报
摘要
申请专利号:

CN201410746198.8

申请日:

2014.12.08

公开号:

CN104523723A

公开日:

2015.04.22

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K 31/704申请日:20141208|||公开

IPC分类号:

A61K31/704; A61K47/34; A61K9/51; A61P35/00

主分类号:

A61K31/704

申请人:

中国人民解放军第四军医大学

发明人:

周四元; 宦梦蕾; 崔晗; 宋彦峰; 腾增辉; 成颖; 刘道洲; 刘苗; 叶威良; 张邦乐

地址:

710032陕西省西安市新城区长乐西路17号

优先权:

专利代理机构:

西安文盛专利代理有限公司61100

代理人:

佘文英

PDF下载: PDF下载
内容摘要

本发明提供了一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统。该递药系统为聚合物胶束,由嵌段共聚物叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸自组装得到,同时合成线粒体靶向阿霉素-三苯基膦复合物(TPP-DOX),并将阿霉素与阿霉素-三苯基膦(DOX/TPP-DOX)共同包裹于聚合物胶束中得到载药胶束。此递药系统可发挥主动靶向作用并具有酸敏特性,进入肿瘤细胞后可将阿霉素同时定位释放于线粒体和细胞核,增强抗肿瘤活性,并逆转肿瘤耐药,为突破化疗药物易产生耐药性的困境提供新策略。

权利要求书

权利要求书
1.  一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统,其特征是 由嵌段化合物叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸(FA-PEG-PASP)同时包裹 阿霉素(DOX)和阿霉素-三苯基膦(TPP-DOX),自组装得到聚合物 纳米胶束,其中
(1)叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(FA-PEG-hyd-PASP) 的制备方法是:
将叶酸溶于二甲基亚砜(DMSO)中,加入NHS(N-羟基琥珀酰 亚胺)和EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺),上述反应液 在氮气保护下室温反应12h,随后将其滴入H2N-PEG-NH2的DMSO 溶液中,混合液继续室温反应2h,反应结束后,加入5倍反应液量 的水,过滤,滤液置于透析膜(MW 1000 Da)中透析3天,冻干即 得叶酸-聚乙二醇-NH2(FA-PEG-NH2);
将对乙酰基苯甲酸,NHS,EDCI依次加入DMSO中充分溶解, 混合液室温搅拌反应5h后加入FA-PEG-NH2,室温条件下氮气保护 反应过夜;反应结束后,加入10倍反应液量的水,并置于透析膜(MW  1000 Da)中透析3天,冻干即得叶酸-聚乙二醇-对乙酰氨基酸 (FA-PEG-ABA);
称取适量聚天冬氨酸溶于DMSO中,加入10%的水合肼,室温 搅拌2h后,加入FA-PEG-ABA,室温继续反应24h,反应结束后, 加入10倍反应液量的水,并置于透析膜(MW 8000 Da)中透析3天, 冻干即得具有酸敏特性的叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物 (FA-PEG-hyd-PASP);
(2)阿霉素-三苯基膦(TPP-DOX)的制备方法是:
称取(3-丙羧基)三苯基溴化膦(TPP)、NHS、EDCI溶于二氯 甲烷中,另将适量阿霉素(DOX)溶于二氯甲烷中,三乙胺处理后 将DOX二氯甲烷溶液缓慢滴加至TPP反应液中,室温搅拌反应24h, 目标产物通过硅胶柱层析纯化即得TPP-DOX;
(3)FA-PEG-hyd-PASP聚合物胶束的制备方法是:
称取适量的FA-PEG-hyd-PASP聚合物溶于DMSO中,加入DOX 和TPP-DOX(W/W,1:1),室温搅拌4h后,加入10倍量的去离子 水,置于透析袋(MW 35000 Da)中透析2天,收集透析液,冻干即 得载DOX/TPP-DOX的FA-PEG-hyd-PASP聚合物胶束。

说明书

说明书一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统
技术领域
本发明涉及一种兼具肿瘤主动靶向、线粒体定位及逆转肿瘤耐药 功能的胶束递药系统的处方组成及应用方案,此递药系统为包裹阿霉 素/阿霉素-三苯基膦复合物(DOX/TPP-DOX)的叶酸-聚乙二醇-聚天 冬氨酸胶束。
背景技术
肿瘤发病率逐年上升,致死率极高,严重威胁人类健康。化疗是 肿瘤的常用治疗手段,阿霉素(DOX)为一线化疗药物,疗效确切、 价格低廉,但阿霉素对正常组织的毒副作用及易耐药的特点限制了其 临床应用。肿瘤产生多药耐药是化疗失败的首要原因。阿霉素的主要 作用靶点为细胞核,若肿瘤细胞产生耐药性,阿霉素在到达作用靶点 前被泵出细胞而失活。因此,找寻其它作用靶点,提高阿霉素在胞内 的有效浓度是逆转耐药的手段之一。研究发现阿霉素可分作用于线粒 体,引起细胞凋亡。因此,设计线粒体靶向的阿霉素复合物或递药系 统可逆转耐药。阳离子脂质化合物(3-丙羧基)三苯基溴化膦(TPP) 对线粒体具有很高的亲和力,若将TPP与DOX或载体材料连接可得 到线粒体靶向的TPP-DOX连接物,从而改变DOX的胞内分布,并 逆转耐药。但是游离TPP-DOX在体内无肿瘤靶向性,需将其装载于 递药系统中,才能实现肿瘤细胞线粒体靶向。
聚合物胶束是由两亲性嵌段共聚物在水中自组装形成的一种热 力学稳定的胶体溶液,多为核-壳结构,可提高难溶性药物溶解度、 保护被包裹药物,且具有肿瘤靶向性和缓释特性。许多肿瘤细胞表面 叶酸受体高表达,而且肿瘤细胞内溶酶体环境呈酸性。因此,将DOX 和TPP-DOX同时包封于修饰有叶酸的酸敏胶束中,构建兼具肿瘤主 动靶向和逆转耐药功能的新型递药系统,增加阿霉素在肿瘤细胞的细 胞核和线粒体的富集,降低其在正常组织的分布,逆转耐药,得到高 效低毒的新型肿瘤靶向递药系统。
发明内容
本发明的目的是提供一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药 系统,兼具肿瘤主动靶向、线粒体定位及逆转肿瘤耐药功能。通过递 药系统的设计,可提高阿霉素在肿瘤细胞的细胞核和线粒体有效浓 度,降低药物在正常组织的分布,逆转耐药,从而得到高效、低毒、 逆转耐药的递药系统,为抗肿瘤药物开发提供新思路。
本发明的技术方案是:一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递 药系统,其特征是由嵌段化合物叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸 (FA-PEG-PASP)同时包裹阿霉素(DOX)和阿霉素-三苯基膦 (TPP-DOX),自组装得到聚合物纳米胶束,其中
(1)叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(FA-PEG-hyd-PASP) 的制备方法是:
将叶酸溶于二甲基亚砜(DMSO)中,加入NHS(N-羟基琥珀酰 亚胺)和EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺),上述反应液 在氮气保护下室温反应12h,随后将其滴入H2N-PEG-NH2的DMSO 溶液中,混合液继续室温反应2h,反应结束后,加入5倍反应液量 的水,过滤,滤液置于透析膜(MW 1000Da)中透析3天,冻干即 得叶酸-聚乙二醇-NH2(FA-PEG-NH2);
将对乙酰基苯甲酸,NHS,EDCI依次加入DMSO中充分溶解, 混合液室温搅拌反应5h后加入FA-PEG-NH2,室温条件下氮气保护 反应过夜;反应结束后,加入10倍反应液量的水,并置于透析膜(MW  1000Da)中透析3天,冻干即得叶酸-聚乙二醇-对乙酰氨基酸 (FA-PEG-ABA);
称取适量聚天冬氨酸溶于DMSO中,加入10%的水合肼,室温 搅拌2h后,加入FA-PEG-ABA,室温继续反应24h,反应结束后, 加入10倍反应液量的水,并置于透析膜(MW 8000Da)中透析3天, 冻干即得具有酸敏特性的叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物 (FA-PEG-hyd-PASP);
(2)阿霉素-三苯基膦(TPP-DOX)的制备方法是:
称取(3-丙羧基)三苯基溴化膦(TPP)、NHS、EDCI溶于二氯 甲烷中,另将适量阿霉素(DOX)溶于二氯甲烷中,三乙胺处理后 将DOX二氯甲烷溶液缓慢滴加至TPP反应液中,室温搅拌反应24h, 目标产物通过硅胶柱层析纯化即得TPP-DOX;
(3)FA-PEG-hyd-PASP聚合物胶束的制备方法是:
称取适量的FA-PEG-hyd-PASP聚合物溶于DMSO中,加入DOX 和TPP-DOX(W/W,1:1),室温搅拌4h后,加入10倍量的去离子 水,置于透析袋(MW 35000Da)中透析2天,收集透析液,冻干即 得载DOX/TPP-DOX的FA-PEG-hyd-PASP聚合物胶束。
本发明构建了一种新型纳米递药系统,此递药系统为聚合物纳米 胶束,胶束材料为叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸连接物 (FA-PEG-hyd-PASP),包裹阿霉素(DOX)与阿霉素-三苯基膦 (TPP-DOX)得载药胶束。该胶束可发挥主动靶向作用,递送更多 的药物至叶酸高表达肿瘤细胞。进入肿瘤细胞后,根据线粒体/溶酶 体微环境偏酸的特性(pH=5),呈酸敏特性的聚合物胶束可释放出 包裹药物,使具有线粒体靶向作用的TPP-DOX到达线粒体,逆转肿 瘤耐药。
附图说明
图1是共同包封DOX/TPP-DOX的FA-PEG-hyd-PASP聚合物胶束在 不同pH溶液中的DOX和TPP-DOX释药曲线图,其中n=3。
图2是载药(DOX/TPP-DOX)FA-PEG-hyd-PASP胶束在KB细胞(A)、 A549细胞(B)、Hela细胞(C)和MDA-MB-231/ADR细胞(D)上 的细胞毒性。其中n=6,##P<0.01vs载DOX胶束组,**P<0.01vs 载TPP-DOX胶束组。
图3是DOX(E)和载药(DOX/TPP-DOX)FA-PEG-hyd-PASP胶束 (F)在MDA-MB-231/ADR细胞中的摄取和定位示意图。
图4是DOX和载药(DOX/TPP-DOX)FA-PEG-hyd-PASP胶束对荷 瘤裸鼠(移植耐药细胞MDA-MB-231/ADR)肿瘤生长的抑制作用。
图5是荷瘤裸鼠静脉注射给予DOX和载药(DOX/TPP-DOX) FA-PEG-hyd-PASP胶束后,阿霉素(DOX)在裸鼠体内的分布图。
具体实施方式
阿霉素肿瘤靶向递药系统的制备及抗肿瘤活性研究
1目的:评价包裹DOX/DOX-TPP的聚合物胶束的抗肿瘤活性。
2研究方法:
2.1包封率及载药量测定
将胶束溶于DMSO中,破坏胶束结构,HPLC-MS/MS法检测包 封率和载药量。
载药量=(递药系统中包裹的药物量/载药递药系统重量)×100%
包封率=(实际载药量/投药量)×100%
2.2酸敏特性评价
称取适量载药胶束溶于不同释药介质,置于透析袋内,于设定时 间点下取样,通过HPLC-MS/MS测定不同pH下(pH 5.0,pH 6.5和 pH 7.4)递药系统的释药情况。
2.3细胞毒性评价
分别培养人肺癌A549细胞、人口腔表皮样癌KB细胞、肝癌 HepG2细胞、宫颈癌Hela细胞、耐阿霉素乳腺癌MDA-MB-231细胞, 取对数生长期细胞接种于96孔板中,密度为1×104,培养24h后分别 加入阿霉素及各载药胶束,不含血清的培养液设为空白对照组,48h 后加入20μL MTT继续孵育4h,弃去培养液,用150μL DMSO重新 溶解紫色结晶,酶标仪于490nm下读取OD值,绘制细胞存活率曲 线图,按公式计算细胞存活率。
细胞存活率(%)=(试验组OD值/空白对照组OD值)×100%
2.4药物在肿瘤细胞内亚定位评价
取对数生长的MDA-MB-231/ADR细胞接种至载有载玻片的细胞 培养板中,24h后加入阿霉素、载有DOX/DOX-TPP的聚合物胶束, 继续孵育4h后,除去培养液,加入细胞核染料DAPI染色10min, PBS冲洗3遍,线粒体染料MitoTracker green染色30min,除去染料, PBS冲洗3遍,多聚甲醛固定,激光共聚焦显微镜观察药物在耐药肿 瘤细胞内的亚定位。
2.5药物的体内抗肿瘤活性评价
20只Balb/c雄性裸鼠(4周龄)随机分成4组,每组4只。收集 MDA-MB-231/ADR细胞,悬浮于培养液中,细胞密度为3×107/ml, 每只小鼠背部皮下注射0.2ml。待肿瘤体积为60mm3时开始给药, 以生理盐水为阴性对照,DOX为阳性对照,给药剂量为10μmol/kg, 载药(DOX/TPP-DOX)FA-PEG-hyd-PASP胶束为两个剂量组,分别 为2、10μmol DOX/kg。每5天给药一次,共给药3次。给药后,每 三天记录一次体重与肿瘤大小,肿瘤体积=(肿瘤长度×宽度2)/2。 分离心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤组织,活体成像仪观察不同组织中 DOX分布。
3实验结果:
3.1包封率及载药量
载药胶束的包封率及载药量如表1所示。结果提示本专利设 计的胶束递药系统具有较高的载药量及包封效率。
表1递药系统的载药量及包封率

3.2酸敏特性评价
观察载药聚合物胶束的释药曲线发现,DOX和DOX-TPP的释放 均呈酸敏特性,pH5.0条件下孵育72h后,约80%的包裹药物可从胶 束中释放出来,提示显载药聚合物胶束进入肿瘤细胞溶酶体后,能够 释放DOX和DOX-TP,为提高抗肿瘤效果、逆转肿瘤耐药提供可能。
3.3体外抗肿瘤活性
通过对比载药胶束和游离阿霉素的细胞毒性发现,载药胶束具有 较强的细胞毒性,其对于叶酸高表达的KB肿瘤细胞的毒性高于叶酸 低表达的A549细胞,同时载药胶束对耐药肿瘤细胞仍表现出良好的 体外抗肿瘤活性,提示载DOX/DOX-TPP聚合物胶束可提高体外抗 肿瘤效果,并具逆转肿瘤细胞耐药。
3.4细胞内定位分布
激光共聚焦结果显示,与耐药肿瘤细胞MDA-MB-231/ADR共孵 育时,游离阿霉素几乎完全被耐药细胞泵出胞外,导致细胞毒性丧失。 而MDA-MB-231/ADR细胞与胶束孵育后,可观察到阿霉素定位于线 粒体内,提示此递药系统可将DOX递送至线粒体内,诱导耐药细胞 凋亡,从而逆转细胞耐药。
3.5体内抗肿瘤活性
相比于同剂量游离DOX,载药(DOX/TPP-DOX) FA-PEG-hyd-PASP胶束能够显著地抑制耐药肿瘤的生长。荷瘤裸鼠 静脉注射给予DOX后,阿霉素(DOX)广泛分布于裸鼠体内各个组 织器官,荷瘤裸鼠静脉注射给予载药(DOX/TPP-DOX) FA-PEG-hyd-PASP胶束后,阿霉素(DOX)主要分布于裸鼠肿瘤组 织。提示纳米递药系统具有很好的体内靶向性。
4结论:
体内外的抗肿瘤实验结果表明,与游离阿霉素相比,负负载 DOX/DOX-TPP的聚合物胶束FA-PEG-hyd-PASP可显著增加阿霉素 在肿瘤组织的富集,有效提高阿霉素对肿瘤细胞的细胞毒性,并可逆 转肿瘤细胞耐药,呈现出显著的体内抗肿瘤活性,具有一定的开发前 景。

一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统.pdf_第1页
第1页 / 共9页
一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统.pdf_第2页
第2页 / 共9页
一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统.pdf_第3页
第3页 / 共9页
点击查看更多>>
资源描述

《一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统.pdf(9页珍藏版)》请在专利查询网上搜索。

本发明提供了一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统。该递药系统为聚合物胶束,由嵌段共聚物叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸自组装得到,同时合成线粒体靶向阿霉素-三苯基膦复合物(TPP-DOX),并将阿霉素与阿霉素-三苯基膦(DOX/TPP-DOX)共同包裹于聚合物胶束中得到载药胶束。此递药系统可发挥主动靶向作用并具有酸敏特性,进入肿瘤细胞后可将阿霉素同时定位释放于线粒体和细胞核,增强抗肿瘤活性,并逆转。

展开阅读全文
相关资源
猜你喜欢
相关搜索

当前位置:首页 > 人类生活必需 > 医学或兽医学;卫生学


copyright@ 2017-2020 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备2021068784号-1