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本发明涉及对用于糖尿病或肥胖症的药物中的候选试剂进行鉴定的方法，所述方法包括(i)提供PPM磷酸酶的候选抑制剂，(ii)提供包含PPM磷酸酶的第一样品和第二样品，(iii)使所述候选抑制剂与包含PPM磷酸酶的所述第一样品接触，和(iv)测试所述第一和第二样品的PPM磷酸酶活性，其中，所述PPM磷酸酶选自由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L和PPM1M组成的组，其中，如果所述第一样品中的PPM磷酸酶活性低于所述第二样品，则所述候选抑制剂被鉴定为用于糖尿病(优选为II型糖尿病)或肥胖症药物中的候选试剂。本发明涉及美福明和苯乙福明在作为PPM磷酸酶的抑制剂上的应用。

1、  鉴定用于糖尿病或肥胖症的药物的候选试剂的方法，所述方法包括
(i)提供PPM磷酸酶的候选抑制剂，
(ii)提供包含PPM磷酸酶的第一样品和第二样品，
(iii)使所述候选抑制剂与包含PPM磷酸酶的所述第一样品接触，和
(iv)测试所述第一样品和第二样品的PPM磷酸酶活性，
其中，所述PPM磷酸酶选自由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L和PPM1M组成的组；
其中，如果所述第一样品中的PPM磷酸酶活性低于所述第二样品，则所述候选抑制剂被鉴定为用于糖尿病或肥胖症药物中的候选试剂。

2、  根据权利要求1所述的方法，其中所述PPM磷酸酶为PPM1E和/或PPM1F。

3、  根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述疾病为糖尿病。

4、  根据权利要求3所述的方法，其中所述糖尿病为II型糖尿病。

5、  根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述候选抑制剂为美福明或苯乙福明类似物或衍生物。

6、  糖尿病或肥胖症的治疗或预防方法，其包括抑制受试者的PPM磷酸酶。

7、  根据权利要求6所述的方法，其中所述PPM磷酸酶选自由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L和PPM1M组成的组。

8、  根据权利要求7所述的方法，具中所述PPM磷酸酶为PPM1E。

9、  根据权利要求7所述的方法，其中所述PPM磷酸酶为PPM1F。

10、  美福明或苯乙福明在抑制PPM型蛋白磷酸酶中的应用，其中所述PPM磷酸酶选自由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L和PPM1M组成的组。

11、  根据权利要求10所述的应用，其中所述PPM型蛋白磷酸酶为PPM1E或PPM1F。

12、  用于抑制PPM磷酸酶的美福明或苯乙福明，其中所述PPM磷酸酶选自由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L和PPM1M组成的组。

13、  美福明或苯乙福明在组合物中用作PPM磷酸酶抑制剂的应用。

14、  苯乙福明或其类似物在增强或保持AMPK的磷酸化中的应用。

15、  PPM1E或PPM1F在AMPK的去磷酸化中的应用。

16、  美福明或苯乙福明在p-21活化激酶(PAK)的活化中的应用。

17、  美福明或苯乙福明在抑制Ca²⁺/钙调蛋白依赖型激酶II(CaMKII)的去磷酸化中的应用。

18、  由权利要求1至5中任一项所述的方法鉴定的试剂，其用作药物。

19、  由权利要求1至5中任一项所述的方法鉴定的试剂在制备用于糖尿病或肥胖症的药物中的应用。

20、  由权利要求1至5中任一项所述的方法鉴定的试剂，其用于糖尿病或肥胖症的治疗中。

21、  糖尿病或肥胖症的治疗或预防方法，其包括向受试者施用包含权利要求18或19中任一项所述的药物的组合物，其中所述药物不包括美福明或苯乙福明。

检测
技术领域
本发明涉及磷酸酶作用和抑制领域，还涉及与葡萄糖代谢/调节相关的疾病，如糖尿病和肥胖症。
背景技术
美福明(Metformin)是已知用于治疗糖尿病的双胍化合物。美福明的标靶尚不清楚。美福明可以作为线粒体毒素而发挥作用。
苯乙福明(Phenformin)是美福明的类似物且也是双胍化合物。苯乙福明已经用在糖尿病的治疗中。苯乙福明的标靶尚不清楚。苯乙福明是强的线粒体毒素。苯乙福明显示出包括严重乳酸中毒在内的副作用。这可能是致命的，并且已经证明是致命的。这些副作用(如乳酸中毒)的存在导致世界上大多数国家都已经停止将苯乙福明作为糖尿病治疗剂来使用。
AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase)一直被认为是一种细胞能量的关键调节物，且已经证明其可以被至少两个上游激酶LKB1和CaMKKβ所活化。负责AMPK去磷酸化的蛋白磷酸酶被认为是PPM家族蛋白磷酸酶的成员，所依据的事实是通过细菌表达的PP2Cα能够降低AMPK的磷酸化状态(被AMP抑制的一种作用)，以及关于冈田酸(okadaic acid)不敏感性的数据。
已经鉴定出蛋白磷酸酶PPM家族中的许多成员，但是本领域中尚没有鉴定出负责AMPK去磷酸化的PPM家族成员。许多研究已经指出抗糖尿病药美福明通过增加AMPK催化T-环残基Thr172的磷酸化来活化AMPK。美福明通过AMPK的活化来降低肝葡萄糖的生成并增加葡萄糖的利用，但是美福明活化AMPK的机理尚不清楚。
Koh等(2002 Current Biology vol 12 pp317-321)公开了p21活化的激酶PAK受PP2C家族的一对丝氨酸/苏氨酸磷酸酶POPX1和POPX2的负调节。
WO2006/091701公开了通过存活激酶或死亡激酶或磷酸酶来调节细胞死亡的方法和组合物。此文献列举了大量由于在细胞凋亡调控中发挥作用从而可能调节细胞死亡或存活的其它激酶和磷酸酶。
本发明试图克服现有技术中存在的问题。
发明概述
本发明人已经发现双胍化合物对磷酸酶活性具有惊人的作用。具体地，已经证明通常用于治疗糖尿病(如II型糖尿病)和肥胖症的双胍化合物实际上是蛋白磷酸酶活性的抑制剂。
特别地，发明人已经将受影响的这类磷酸酶具体定义为PPM型磷酸酶，并已经在PPM家族内鉴定出哪些酶的活性受到抑制。
因此，发明人首次公开了蛋白磷酸酶(特别是某些PPM磷酸酶)是治疗性干预的靶点。
本发明基于这些惊人的发现。
因此，在广泛的方面，本发明涉及双胍化合物作为蛋白磷酸酶活性抑制剂的应用。
在另一广泛的方面，本发明涉及磷酸酶抑制剂(特别是PPM磷酸酶抑制剂)在治疗或预防葡萄糖调节性疾病(如糖尿病和/或肥胖症)的应用。
一方面，本发明涉及鉴定用于糖尿病或肥胖症的药物的候选试剂的方法，所述方法包括
(i)提供PPM磷酸酶的候选抑制剂，
(ii)提供包含PPM磷酸酶的第一样品和第二样品，
(iii)使所述候选抑制剂与包含PPM磷酸酶的所述第一样品接触，和
(iv)测试所述第一样品和第二样品的PPM磷酸酶活性，
其中，如果所述第一样品中的PPM磷酸酶活性低于所述第二样品，则所述候选抑制剂被鉴定为用于糖尿病或肥胖症的药物的候选试剂。
优选地，所述磷酸酶是PPM BIGi(双胍抑制)家族成员。优选地，所述磷酸酶由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L、PHLPP或PHLPP2基因编码。优选地，所述磷酸酶由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K或PPM1L基因编码。优选地，所述PPM磷酸酶是PPM1E和/或PPM1F；优选地，所述PPM磷酸酶是PPM1E。
本文中的术语“试剂”或“候选抑制剂”可以是单个实体，也可以是多个实体的组合。所述试剂可以是有机化合物或其它化学品。所述试剂可以是来自天然或人工的任何适合来源而获得的或生产的化合物。所述试剂可以是氨基酸分子、多肽、或其化学衍生物、或其组合。所述试剂甚至可以是多核苷酸分子，其可以是有义或反义分子。所述试剂甚至可以是抗体。可以从化合物库中获得或设计所述试剂，该试剂可以包含肽以及其它化合物(如小的有机分子)。
本文详述了PPM磷酸酶活性试验，在实施例2具体提供了适合的试验形式的实例。
所述样品可以是包含PPM磷酸酶的任何适合的样品。其可以是重组酶的样品，也可以是纯化的酶的样品，还可以是包含PPM磷酸酶的简单提取物或裂解物。显然，重要的是样品中包含具有活性的PPM蛋白磷酸酶/包含PPM蛋白磷酸酶活性，否则无法区别具有抑制效果的试剂与不具有抑制效果的试剂。使用如本文所述的磷-酪蛋白试验(phosphor-casein assays)可以很容易地对此进行证明。
优选地，所述疾病为糖尿病，更优选为II型糖尿病。
优选地，所述候选抑制剂为双胍；优选地，所述候选抑制剂为美福明或苯乙福明类似物或衍生物。
另一方面，本发明提供美福明或苯乙福明在抑制PPM型蛋白磷酸酶(PPM type protein phosphatase)中的应用。
优选地，所述PPM型蛋白磷酸酶具有本文所述的PPM磷酸酶的一种或多种特性，优选具有两种或多种、优选三种或多种、优选四种或多种、优选本文所述的PPM磷酸酶的全部特性。优选地，所述PPM型蛋白磷酸酶为PPM1E或PPM1F。
另一方面，本发明提供了用于抑制PPM磷酸酶的美福明或苯乙福明。
另一方面，本发明提供了美福明或苯乙福明在用作PPM磷酸酶抑制剂的组合物中的应用。此外，本发明还提供美福明或苯乙福明在制备用作PPM磷酸酶抑制剂的组合物中的应用。
另一方面，本发明提供了苯乙福明或其类似物在增强或保持AMPK的磷酸化中的应用。
另一方面，本发明提供了PPM1E或PPM1F在AMPK去磷酸化中的应用。
另一方面，本发明提供了美福明或苯乙福明在p-21活化激酶(PAK)的活化中的应用。
另一方面，本发明提供了美福明或苯乙福明在抑制Ca²⁺/钙调蛋白依赖型激酶II(Ca²⁺/Calmodulin dependent kinase II，CaMKII)的去磷酸化中的应用。
另一方面，本发明提供了通过上述方法鉴定的、用作药物的试剂。
另一方面，本发明提供了上述方法鉴定的试剂在制备糖尿病或肥胖症的药物中的应用。
另一方面，本发明提供由上述方法鉴定的、用于糖尿病或肥胖症治疗的试剂。
另一方面，本发明提供了糖尿病或肥胖症的治疗或预防方法，该方法包括对受试者(subject)施用包含上述药物的组合物，其中所述药物不包括美福明或苯乙福明。
另一方面，本发明提供糖尿病或肥胖症的治疗或预防方法，该方法包括抑制受试者的PPM磷酸酶。优选地，所述PPM磷酸酶选自由以下组成的组：PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L、PPM1M、PHLPP和PHLPP2。优选地，所述PPM磷酸酶选自由以下组成的组：PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L或PPM1M。优选地，所述PPM磷酸酶为PPM1E和/或PPM1F。优选地，此抑制不是由美福明或苯乙福明产生的。
发明详述
美福明是II型糖尿病治疗中的主要药物之一，虽然作用机理尚不清楚，但其可以增强AMPK的活性。通常AMPK是在响应AMP水平的增加而被活化的，并通过α亚基的催化位点内苏氨酸残基的磷酸化而完成。用美福明类似物苯乙福明孵育HEK293和HeLa细胞后，通过蛋白磷酸酶活性试验显示：在对苯乙福明或美福明的响应中，具有冈田酸抗性的镁离子依赖型酪蛋白磷酸酶的活性降低约20％。进一步的研究显示，在用苯乙福明孵育HEK293后，两个紧密相关的PPM家族蛋白磷酸酶PPM1E和PPM1F的活性也被抑制，这揭示它们可能直接和/或间接地被苯乙福明所靶向，并导致AMPK活性的提高。本发明基于这些惊人的发现。
术语“试剂”或“候选抑制剂”具有本领域的一般含义，并可以指任何化学实体如有机化合物或无机化合物或其混合物。优选地，所述试剂可以是小分子化学实体。优选地，所述物质可以是大分子如生物大分子，如核酸或多肽。例如，所述试剂可以是天然物质，生物大分子，或从生物材料如细菌、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织获得的提取物，有机分子或无机分子，合成试剂，半合成试剂，结构或功能的模拟物，肽，拟肽，衍生的试剂，从完整蛋白切割的肽，或通过合成得到的肽(例如，使用肽合成仪或通过重组技术或其组合、重组试剂、抗体、天然或非天然试剂、融合蛋白或其等价物和突变物、衍生物或其组合)。通常，所述试剂为有机化合物。优选地，所述试剂为水溶性的。优选地，本发明的试剂为美福明类似物或苯乙福明类似物。优选地，本发明的试剂包含用于向细胞内运输的手段或工具(means)，可以包含用于向线粒体内运输的手段或工具。更优选地，本发明的试剂不被包含在线粒体内。
美福明/苯乙福明/类似物
优选地，本发明的PPM抑制剂为双胍化合物。实例包括美福明、苯乙福明或丁福明(buformin)。
优选地，本发明的PPM抑制剂包括美福明或其类似物，或苯乙福明或其类似物。
美福明的类似物包括苯乙福明。在PPM磷酸酶的抑制活性方而，苯乙福明为本发明的优选化合物。
苯乙福明为苯乙双胍。苯乙福明为双胍类降血糖药，其性质与美福明相似。必需要提到的是在许多管辖区域内，苯乙福明被认为与通常导致死亡且具有不能接受的高发病率的乳酸中毒有关。因此，优选不对人或动物受试者施用苯乙福明。因此，对于本发明的医学应用，优选PPM磷酸酶抑制剂不为苯乙福明。
关福明(C₄H₁₁N₅)为1-(二氨基亚甲基)-3，3-二甲基-胍。美福明是双胍类的抗糖尿病药物。美福明可以广泛地获得，其商品名为如Glucophage、Diabex、Diaformin、Fortamet、Riomet、Glumetza和其它。美福明因其PPM磷酸酶抑制活性和较低的毒性而成为本发明的优选化合物。
化学衍生物
本发明还涉及所述化合物的衍生物，特别是美福明和/或苯乙福明的衍生物。本文所用的术语“衍生物”包括试剂的化学修饰。所述化学修饰的实例可以是氢被卤素基团、烷基基团、酰基基团或氨基基团替代。
盐/酯
本发明的化合物可以以盐或酯的形式存在，特别是以药学上可接受的盐或酯的形式存在。
本发明的化合物的药学上可接受的盐包括其适合的酸加成盐或碱式盐(base salts)。适合的药学上的盐的综述可以参见Berge等，J Pharm Sci，66，1-19(1977)。盐的形成可以通过例如：强无机酸，如矿物酸，如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机羧酸，如未取代或取代的(如被卤素取代)具有1至4个碳原子的烷基羧酸，如乙酸；饱和或不饱和的二羧酸，如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或对苯二甲酸；羟基羧酸，如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，如未取代或取代的(如被卤素取代的)(C₁-C₄)-烷基-磺酸或芳基-磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。
根据被酯化的官能团，使用有机酸或醇/氢氧化物形成酯。有机酸包括羧酸，如未取代或取代的(如被卤素取代)具有1至12个碳原子的烷基羧酸，如乙酸；饱和或不饱和的二羧酸，如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或对苯二甲酸；羟基羧酸，如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，如未取代或取代的(如被卤素取代)(C₁-C₄)-烷基-或芳基-磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。适合的氢氧化物包括无机氢氧化物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括未取代或取代的(如被卤素取代的)1至12个碳原子的烷醇。
对映异构体/互变异构体
在各个方面，本发明包括本发明化合物的全部对映异构体和互变异构体。本领域的技术人员可识别具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或互变异构特性的化合物。相应的对映异构体和/或互变异构体可以通过本领域已知的方法来分离/制备。
立体异构体和几何异构体
本发明的一些化合物可以以立体异构体和/或几何异构体存在，如它们可以具有一个或多个不对称中心和/或几何中心，因此它们可以以两种或多种立体异构和/或几何异构的形式存在。本发明涉及这些抑制剂的所有立体异构体和几何异构体、及其混合物的应用。权利要求中所用的术语涵盖这些形式，条件是所述形式具有适当的功能活性(虽然程度不一定相同)。
本发明还包括所述试剂或其药学上可接受的盐的所有适合的同位素变体。本发明的试剂或其药学上可接受的盐的同位素变体的定义为：其中的至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量不同于自然界中通常发现的原子质量的原子所替代的同位素变体。可以加入到所述试剂和其药学上可接受的盐的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，如分别为²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。所述试剂和其药学上可接受的盐的某些同位素的变体(如加入放射性同位素如³H或¹⁴C的那些变体)在关于药物和/或底物的组织分布的研究中十分有用。氚(即³H)和碳-14(即¹⁴C)同位素因它们易于制备和可检测性而特别优选。此外，用同位素(如氘，即²H)进行的取代可以提供由更高的代谢稳定性所产生的某些治疗优点，如体内半衰期提高或剂量需求减少，并由此在一些情况中可以是优选的。本发明的试剂和其药学上可接受的盐的同位素变体通常可以使用适合试剂的适当同位素变体通过常规方法来制备。
溶剂合物
本发明还包括本发明化合物的溶剂合物的应用。权利要求中所用的术语涵盖这种形式。
多晶型物
本发明还涉及本发明化合物的各种晶体形式、多晶型形式和无水/含水形式。在制药工业中广泛使用的方法是，在合成制备所述化合物中，通过略微改变利用溶剂来纯化和/或分离的方法，可分离出任何所述形式的化合物。
前药
本发明还包括前药形式的本发明化合物。所述前药通常是一个或多个适当的基团已被修饰的本发明化合物，使得在对人或哺乳动物受试者给药后所述修饰可以被逆转。虽然为了在体内进行逆转，可以将第二试剂与所述前药一起施用，但是所述逆转通常通过所述受试者中天然存在的酶来完成。所述修饰的实例包括酯(如上述任何一种酯)，其中逆转可以由酯酶等完成。其它所述体系对本领域的技术人员是公知的。
蛋白磷酸酶的PPM家族
蛋白磷酸酶的PPM家族包括一群组丝氨酸磷酸酶/苏氨酸磷酸酶，其中许多磷酸酶的活性依赖于Mg²⁺或Mn²⁺。虽然PPP和PPM家族蛋白磷酸酶之间没有序列同一性，但是它们在三维结构和催化机理上十分相似。蛋白磷酸酶PPM家族包括至少16个成员(编码PPM的16个基因；一些经过选择性剪切得到不同的蛋白变体(如B1和B2))。虽然这些蛋白磷酸酶在结构上具有很大差异，但是它们具有非常相似的催化机理。根据惯例，蛋白和基因的名称可以不同，如下文所述(如PPM1E基因编码POPX1蛋白)。然而，如果通过基因名称来提及蛋白，则应该明白这是指所述基因编码的磷酸酶(如PPM1E磷酸酶是指PPM1E基因编码的磷酸酶，即POPX1蛋白)。
PPM1A
PPM1A，也称作PP2Cα，由两个同种型(isoforms)PP2Cα1(PPM1A1)和PP2Cα2(PPM1A2)组成，其分子量分别为42kDa和36kDa，且二者均以单体存在。PP2Cα首先表达于大肠杆菌，已发现在体外重组的PP2Cα能够使AMP活化蛋白激酶(AMPK)去磷酸化。此去磷酸化事件对冈田酸毒素不敏感且需要Mg²⁺。此外已经证明，PP2Cα通过脂肪细胞中PI 3-激酶活性的直接活化而作为胰岛素敏感性的正调节物，并已经被提示通过有丝分裂原活化的蛋白激酶激酶(MAPKK)以及p38MAPK的去磷酸化和失活而作为应激反应途径的负调节物。当细胞受到应激刺激时，可以检测到p38和PP2Cα间的直接相互作用。
PPM1B
PPM1B，也称作PP2Cβ，由至少两个同种型PP2Cβ1(PPM1B1)和PP2Cβ2(PPM1B2)组成，其分子量分别为43kDa和53kDa，且类似于PP2Cα，这些酶以单体存在。已经证明PP2Cβ通过p38的去磷酸化而作为应激反应途径的负调节物，并也已经被提示涉及TAK1(参与活化JNK和MAPK途径的酶)的去磷酸化。已经证明，PP2Cβ在细胞周期蛋白依赖型磷酸酶的去磷酸化中起作用。
PPM1G
PPM1G，也称作PP2Cγ或FIN13，是分子量为59kDa的、包含融合胶原蛋白同源结构域的单体蛋白磷酸酶，已经证明其能够通过引起G₁/S期细胞周期停滞来负调节细胞增殖。在成体组织中，PPM1G主要表达于睾丸中，但高表达于处于增殖的多个组织中。这些组织包括发育的胚胎、妊娠期子宫、胎盘和在用己烯雌酚(DES)进行卵泡发育刺激后性未成熟的小鼠的卵巢。PPM1G具有C-末端核定位信号，并且与PPM家族的其它成员不同，其具有大的内部酸性结构域，所述内部酸性结构域被认为参与提供对底物的特异性，因为PP2Cγ似乎主要偏爱碱性蛋白。已经证明PPM1G可被钙抑制，但由于抑制需要较高的微摩尔浓度，此抑制不可能为调节模式。PPM1G涉及剪接体的组装，并已经显示出与前mRNA剪接因子的组分相互作用。
ILKAP
ILKAP(整合素连接激酶1相关磷酸酶)，也称作PP2Cδ，是分子量为43kDa的单体蛋白，在用整合素连接激酶1(ILK1)为诱饵的酵母双杂交筛选中被鉴定出来。ILKAP(而非ILKAP的催化失活的突变体)能够强烈抑制胰岛素样生长因子1刺激的GSK3β在Ser9上的磷酸化，而不影响PKB在Ser473上的磷酸化，提示ILKAP选择性地影响ILK介导的GSK3β信号通路。此外，ILKAP可抑制前列腺癌LNCaP细胞的非支持物依赖性生长，提示ILKAP在细胞转化中起关键作用，且ILKAP在致癌性转化的抑制中起重要作用。
PPM1D
PPM1D，也称作Wip1(野生型p53诱导的磷酸酶1)，是分子量为66kDa的单体蛋白，在p53靶基因的筛选中首次被鉴定出来。已经证明，PPM1D的表达以p53依赖的方式被电离辐射快速诱导，这提示p53可能通过对PPM1D的诱导来介导其部分细胞周期抑制活性。Wip1启动子区不包含任何传统的p53响应元件，而是包含转录因子的潜在结合位点，所述转录因子包括NF-κB、E2F、c-Jun和ATF/CREB家族的成员。类似于其它PP2C家族成员，PPM 1D能使p38MAPK家族的成员去磷酸化。在被UV照射损伤的细胞的恢复期，PPM1D具有下调p38-p53信号通路的作用。此外，PPM1D也能被其它环境胁迫如苘香霉素、过氧化氢和甲磺酸甲酯所诱导。PPM1D的UV诱导需要p38活性以及p53，且PPM1D通过在p38保守苏氨酸残基上的去磷酸化使p38失活，而在有报道被p38磷酸化的那些残基上降低UV诱导的p53磷酸化。在对UV照射的响应中，PPM1D的表达还抑制p53介导的转录和凋亡。
PPM1E和PPM1F
PPM1E，也称作POPX1，是包含于融合PAK相互作用的鸟嘌呤核苷交换因子(PIX)结合结构域(fused PAK-interacting guanine nucletide exchangefactor binding domain)的83kDa单体蛋白，且已经提示其参与PAK的负调节。在使用PIX作为诱饵的双杂交筛选中，PPM1E被鉴定为与PIX相互作用的蛋白。PPM1F，也称作POPX2，在同一筛选中被鉴定出，且二者在磷酸酶核心结构域和同源的旁侧序列中呈现66％的相似性。已经证明，PPM1E和PPM1F使p21(cdc42/Rac)活化激酶(PAK)去磷酸化和失活，以及具有抑制肌动蛋白应力纤维断裂和抑制由活性cdc42引起的形态改变的能力。PPM1F也称作CaMKIIPase，或hFEM2，已经证明，其是负责Ca²⁺/钙调蛋白依赖型蛋白激酶II在其自磷酸化位点(Thr286)去磷酸化的主要磷酸酶。已经显示出PPM1F在体外直接与CaMKII相互作用，这提示PPM1F在其调节中起重要作用。
PDPC1和PDPC2
PDPC1(丙酮酸脱氢酶磷酸酶复合物1)和PDPC2分别为分子量为61kDa和60kDa的异二聚体蛋白，并且是位于线粒体基质空间内的少数几种哺乳动物磷酸酶中的两种。已经证明，PDPC1在对Ca²⁺的响应中被活化，同时还证明PDPC2对Ca²⁺不敏感，而对与PDPC1没有作用的生物多胺(精胺)敏感。丙酮酸脱氢酶复合物是大的多酶复合物，其由三个催化组分组成：丙酮酸脱氢酶(E1)、二氢硫辛酰胺转乙酰酶(E2)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)。复合物的构建以60个E2亚基为核心，30个E1亚基和6-12个E3亚基与所述E2亚基结合。所述复合物通过E1组分中三个丝氨酸残基的磷酸化而失活，通过PDPC同种型的去磷酸化而被重新活化。在线粒体中，激酶和磷酸酶的活性均为组成型，这决定了在处于非活性态的PDC的比例。显然，PDPC1和PDPC2的活性调节必须受到非常严格的控制，并且最近的研究提示饥饿和糖尿病可以降低心脏和肾中PDP的水平。令人感兴趣的是，已经证明胰岛素治疗可以提高PDPC2的水平，这提示事实上胰岛素可能在丙酮酸脱氢酶复合物的长期调节中起作用。
PHLPP
PHLPP(PH结构域富含亮氨酸的蛋白磷酸酶)为约140kDa的新型磷酸酶，其在与PH结构域相连的蛋白磷酸酶的人基因组筛选中被鉴定出来，且使PKB上的Thr473去磷酸化。与其在PKB去磷酸化中的作用相一致，许多结肠癌细胞系和胶质细胞瘤细胞系中PHLPP的水平已经降低，且将PHLPP再引入这些细胞系中时会降低其生长速率。因此，PHLPP具有促进凋亡和抑制肿瘤生长的作用。人基因组中编码有PHLPP的第二个同种型。PHLPP和PHLPP2由于与PKB结合而并不太受关注；因此，相应地本发明的磷酸酶不为PHLPP或PHLPP2。
PPM1K
PPM1K为PPM丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员，其在最近被鉴定出来并被收录在NCBI和EBI数据库中，ID号为NP_689755、ENSP00000295908、ENSP00000324761、Q56AN8、Q8IUZ7、Q49AB5。
总之，不受苯乙福明/美福明抑制的PPM包括PPM1A、PPM1B(B1和B2)、PPM1G、ILKAP、PPM1D、NERPP-2C、PDPC1和PDPC2。
优选地，PPM为PPM BIGi家族(被双胍抑制)的成员。BIGi家族成员包括PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L、PHLPP和PHLPP2基因所编码的磷酸酶，和被双胍(如如本文公开中所测试的美福明和/或苯乙福明)所抑制的任何其它磷酸酶。优选地，所述PPM磷酸酶选自由以下组成的组：PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L、PPM1M、PHLPP和PHLPP2；优选地，所述PPM磷酸酶选自由以下组成的组：PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L和PPM1M，或选自其中的一种或多种磷酸酶的组合；优选地，所述PPM磷酸酶为PPM1E或PPM1F；优选地，所述PPM磷酸酶为PPM1E。
PPM家族成员总结：
基因名称    蛋白名称    Genbank蛋白登录号，(mRNA登录号)
                        Ensembl肽号，(基因号)
PPM1E       POPX1       NP_055721，(NM_014906)
            PP2CH       ENSP00000312411，(ENSG00000175175)
                        Q8WY54，Q8WY54_2，Q8WY54_1，Q8WY54_3
PPM1F       POPX2       NP_055449，P49593，(NM_014634)
            CaM-KPase   ENSP00000263212，(ENSG00000100034)
            hFEM2       P49593，Q0VGL7，Q6IPCO
PPM1J       PP2Cζ      NP_005158，(NM_027982)
                        ENSP00000308926；ENSP00000353088，
                        (ENSG00000155367)2同种型
                        Q6DKJ7，Q5JR12
PPM1K                   NP_689755，(NM152452)
                        ENSP00000295908，ENSP00000324761
                        (ENSG00000163644)2同种型
                        Q56AN8，Q8IUZ7，Q49AB5
PPM1L       PP2Cε      NP_640338，(NM_178726)
            PP2CL       ENSP00000295839，(ENSG00000163590)
                        Q5SGD2，Q2M3J2
PPM1M       PP2Cη      Q96MI6
PHLPP       PHLPPα     NP_919431，(NM_194449)
            SCQP        ENSP00000262719(ENSG00000081913)
            PLEKHE1     O60346
PHLPP2      PHLPPβ     NP_055835，(NM_015020)
以下列出所述PPM磷酸酶的优选特性：
优选地，所述PPM磷酸酶为镁(Mg²⁺)或锰(Mn²⁺)依赖型磷酸酶，优选为锰依赖型。
优选地，所述PPM磷酸酶具有冈田酸抗性。
优选地，所述PPM磷酸酶具有酪蛋白(如磷-酪蛋白(phospho-casein))磷酸酶活性。
优选地，所述PPM磷酸酶包含PIX结合结构域。
优选地，所述PPM磷酸酶为PPM1F或PPM1E或其混合物。
优选地，所述PPM磷酸酶为PPM1E。
优选地，所述PPM磷酸酶具有选自以下的氨基酸序列：
PPM1E.NP_055721
MAGCIPEEKTYRRFLELFLGEFRGPCGGGEPEPEPEPEPEPEPEPESEPE
PEPELVEAEAAEASVEEPGEEAATVAATEEGDQEQDPEPEEEAAVEGEEE
EEGAATAAAAPGHSAVPPPPPQLPPLPPLPRPLSERITPRPLSERITREE
VEGESLDLCLQQLYKYNCPSFLAAALARATSDEVLQSDLSAHYIPKETDG
TEGTVEIETVKLARSVFSKLHEICCSWVKDFPLRRRPQLYYETSIHAIKN
MRRKMEDKHVCIPDFNMLFNLEDQEEQAYFAVFDGHGGVDAAIYASIHLH
VNLVRQEMFPHDPAEALCRAFRVTDERFVQKAARESLRCGTTGVVTFIRG
NMLHVAWVGDSQVMLVRKGQAVELMKPHKPDREDEKQRIEALGGCIVWFG
AWRVNGSLSVSRAIGDAEHKPYICGDADSASTVLDGTEDYLILACDGFYD
TVNPDEAVKVVSDHLKENNGDSSMVAHKLVASARDAGSSDNITVIVVFLR
DMNKAVNVSEESDWTENSFQGGQEDGGDDKENHGECKRPWPQHQCSAPAD
LGYDGRVDSFTDRTSLSPGSQINVLEDPGYLDLTQIEASKPHSAQFLLPV
EMFGPGAPKKANLINELMMEKKSVQSSLPEWSGAGEFPTAFNLGSTGEQI
YRMQSLSPVCSGLENEQFKSPGNRVSRLSHLRHHYSKKWHRFRFNPKFYS
FLSAQEPSHKIGTSLSSLTGSGKRNRIRSSLPWRQNSWKGYSENMRKLRK
THDIPCPDLPWSYKIE
PPM1E.ENSP00000312411
MAGCIPEEKTYRRFLELFLGEFRGPCGGGEPEPEPEPEPEPEPESEPEPE
PELVEAEAAEASVEEPGEEAATVAATEEGDQEQDPEPEEEAAVEGEEEEE
GAATAAAAPGHSAVPPPPPQLPPLPPLPRPLSERITREEVEGESLDLCLQ
QLYKYNCPSFLAAALARATSDEVLQSDLSAHYIPKETDGTEGTVEIETVK
LARSVFSKLHEICCSWVKDFPLRRRPQLYYETSIHAIKNMRRKMEDKHVC
IPDFNMLFNLEDQEEQAYFAVFDGHGGVDAAIYASIHLHVNLVRQEMFPH
DPAEALCRAFRVTDERFVQKAARESLRCGTTGVVTFIRGNMLHVAWVGDS
QVMLVRKGQAVELMKPHKPDREDEKQRIEALGGCVVWFGAWRVNGSLSVS
RAIGDAEHKPYICGDADSASTVLDGTEDYLILACDGFYDTVNPDEAVKVV
SDHLKENNGDSSMVAHKLVASARDAGSSDNITVIVVFLRDMNKAVNVSEE
SDWTENSFQGGQEDGGDDKENHGECKRPWPQHQCSAPADLGYDGRVDSFT
DRTSLSPGSQINVLEDPGYLDLTQIEASKPHSAQFLLPVEMFGPGAPKKA
NLINELMMEKKSVQSSLPEWSGAGEFPTAFNLGSTGEQIYRMQSLSPVCS
GLENEQFKSPGNRVSRLSHLRHHYSKKWHRFRFNPKFYSFLSAQEPSHKI
GTSLSSLTGSGKRNRIRSSLPWRQNSWKGYSENMRKLRKTHDIPCPDLPW
SYKIE
两个PPM1E序列NP_055721和ENSP00000312411具有98％的同一性。
可选择的方案是，PPM1E序列可以选自Q8WY54_2、Q8WY54_1或Q8WY54_3。Q8WY54_2与以上列出的最适合的序列相比具有额外的EP(MAGCIPEEKTYRRFLELFLGEFRGPCGGGEP...)，Q8WY54_1和Q8WY54_3在氨基酸末端区域具有其它变化。
PPM1F.NP_055449和ENSP00000263212
MSSGAPQKSSPMASGAEETPGFLDTLLQDFPALLNPEDPLPWKAPGTVLS
QEEVEGELAELAMGFLGSRKAPPPLAAALAHEAVSQLLQTDLSEFRKLPR
EEEEEEEDDDEEEKAPVTLLDAQSLAQSFFNRLWEVAGQWQKQVPLAARA
SQRQWLVSIHAIRNTRRKMEDRHVSLPSFNQLFGLSDPVNRAYFAVFDGH
GGVDAARYAAVHVHTNAARQPELPTDPEGALREAFRRTDQMFLRKAKRER
LQSGTTGVCALIAGATLHVAWLGDSQVILVQQGQVVKLMEPHRPERQDEK
ARIEALGGFVSHMDCWRVNGTLAVSRAIGDVFQKPYVSGEADAASRALTG
SEDYLLLACDGFFDVVPHQEVVGLVQSHLTRQQGSGLRVAEELVAAARER
GSHDNITVMVVFLRDPQELLEGGNQGEGDPQAEGRRQDLPSSLPEPETQA
PPRS
PPM1F.Q6IPC0
MSSGAPQKSSPMASGAEETPGFLDTLLQDFPALLNPEDPLPWKAPGTVLS
QEEVEGELAELAMGFLGSRKAPPPLAAALAHEAVSQLLQTDLSEFRKLPR
EEEEEEEDDDEEKAPVTLLDAQSLAQSFFNRLWEVAGQWQKQVPLAARAS
QRQWLVSIHAIRNTRRKMEDRHVSLPSFNQLFGLSDPVNRAYFAVFDGHG
GVDAARYAAVHVHTNAARQPELPTDPEGALREAFRRTDQMFLRKAKRERL
QSGTTGVCALIAGATLHVAWLGDSQVILVQQGQVVKLMEPHRPERQDEKA
RIEALGGFVSHMDCWRVNGTLAVSRAIGDVFQKPYVSGEADAASRALTGS
EDYLLLACDGFFDVVPHQEVVGLVQSHLTRQQGSGLRVAEELVAAARERG
SHDNITVMVVFLRDPQELLEGGNQGEGDPQAEGRRQDLPSSLPEPETQAP
PRS
PPM1F.Q0VGL7
MSSGAPQKSSPMASGAEETPGFLDTLLQDFPALLNPEDPLPWKAPGTVLS
QEEVEGELAELAMGFLGSRKAPPPLAAALAHEAVSQLLQTDLSEFRKLPR
EEEEEEEDDDEEEKAPVTLLDAQSLAQSFFNRLWEVAGQWQKQVPLAARA
SQRQWLVSIHAIRNTRRKMEDRHVSLPSFNQLFGLSDPVNRAYFAVFDGH
GGVDAARYAAVHVHTNAARQPELPTDPEGALREAFRRTDQMFLRKAKRER
LQSGTTGVCALIAGATLHVAWLGDSQVILVQQGQVVKLMEPHRPERQDEK
优选地，所述磷酸酶蛋白的序列与这些序列中的一条具有至少80％的同一性，优选至少85％的同一性，优选至少90％的同一性，优选至少95％的同一性，优选至少96％的同一性，优选至少97％的同一性，优选至少98％的同一性，优选至少99％的同一性，前提是在每种情况下磷酸酶蛋白都具有保持的磷酸酶活性。这可以通过使用本文所述的试验容易地得到验证。
抑制剂和PPM磷酸酶活性试验
关于磷酸酶抑制剂，特别是PPM磷酸酶抑制剂，应该根据有关磷酸酶的教导来解释，即优选磷酸酶抑制剂为镁或锰依赖型PPM磷酸酶的抑制剂，优选为具有冈田酸抗性的PPM磷酸酶的抑制剂，优选为PPM磷酸酶酪蛋白磷酸酶活性的抑制剂，优选为包含PIX结合结构域的PPM磷酸酶的抑制剂，优选为PPM1E或PPM1F磷酸酶或具混合物的抑制剂，优选为PPM1F磷酸酶的抑制剂，优选为PPM1E磷酸酶的抑制剂。
本发明的磷酸酶抑制剂优选为PPM磷酸酶的抑制剂，并优选对PP2A磷酸酶活性没有显著作用，优选检测不到对PP2A磷酸酶活性的作用，优选当如本文所述使用磷酸化酶α作为底物进行试验时检测不到对PP2A磷酸酶活性的作用(特别在使用I-2抑制剂来抑制PP1时，参见实施例2)。
优选PPM抑制剂对PP1活性没有显著作用，优选检测不到对PP1活性的作用，优选当如实施例2所述进行试验时检测不到对PP1活性的作用。
优选PPM抑制剂对PP5活性没有显著作用，优选检测不到对PP5活性的作用，优选当如实施例2所述进行试验时检测不到对PP5活性的作用。
优选通过施用PPM抑制剂来完成对PPM磷酸酶的抑制。“抑制”还可以包括PPM活性的降低或消除，或对PPM磷酸酶的水平进行干涉/干扰。例如，PPM磷酸酶表达的压制或抑制，PPM磷酸酶转录和/或翻译的压制或抑制，或PPM磷酸酶自身的下调(无论通过调节如抑制其活化或引起其失活的酶，或通过加速其降解或其它此类技术)。因此，“抑制”是指减少、消除、去除或压制或降低PPM磷酸酶活性的其它此类方式。抑制剂优选为根据本文公开的试验所鉴定的抑制剂。可以采用其它方式来抑制PPM磷酸酶。这些方式可以包括对PPM的活化剂或调节物的操作。或者这些方式可以包括PPM敲减(knock-down)，如PPM活性的siRNA敲减。用于抑制PPM活性的siRNA优选为PPM1E siRNA或PPM1F siRNA。
PPM磷酸酶活性试验可以是任何适合的试验。大量可能的形式详述于实施例部分。
试验所优选的特征为该试验包含Mg²⁺离子或Mn²⁺离子，优选为Mg²⁺离子；优选为MgAc(乙酸镁)；优选为10mM MgAc。由于PPM磷酸酶为Mg/Mn依赖型，因而这对于酶的活性是有利的。适合地，所述试验包含Mn²⁺离子；适合地为MnCl₂(氯化锰)；适合地为2mM氯化锰(II)。适合地，所述试验包含Mg²⁺离子和Mn²⁺离子。
优选地，所述试验包含冈田酸，优选为5μM冈田酸。这对抑制PP2A有利。
优选地，所述试验包含可能对正在使用的特定底物起作用的其它磷酸酶的一种或多种抑制剂，以便不使结果发生混淆，即试图确保试验能准确获得PPM磷酸酶的活性/抑制，而非具它磷酸酶(如非PPM磷酸酶)的活性/抑制。所述抑制剂和其抑制的磷酸酶是已知的，且在本文，特别是在实施例部分描述了示例性的抑制剂以及其可能抑制的酶。
优选地，使用酪蛋白作为底物(磷-酪蛋白)进行所述试验。优选地，所述酪蛋白用³²P标记以便于检测被PPM作用去除的磷酸盐。
优选地，所述试验基于FPLC纯化的磷酸酶。
优选地，所述试验基于PPM磷酸酶，如在哺乳动物细胞、细菌细胞或其它异源表达系统中表达的PPM1E/PPM1F磷酸酶，条件是所述磷酸酶具有活性(其根据本文所述很容易对其进行测试)。
优选地，所述试验基于免疫纯化的磷酸酶。优选使用抗PPM1E抗体和/或抗PPM1F抗体或抗体片段对磷酸酶进行免疫纯化。
优选地，所述试验的PPM磷酸酶的活性为PPM1E和/或PPM1F的活性。
常规蛋白磷酸酶试验
使用标记有1μM-10μM ³²P的底物，在30μl体积和30℃下测试蛋白磷酸酶。在缓冲液C中分别稀释³²P标记的底物和磷酸酶抑制剂/活化剂。在缓冲液B中稀释蛋白磷酸酶。通过将磷酸酶的10μl稀释液(或含免疫小球(immunopellet)的10μl缓冲液B)与10μl抑制剂/活化剂或缓冲液C混合，并将混合物在30℃下孵育10分钟来进行试验。通过加入³²P标记的10μl底物来启动试验。随后在30℃下孵育更长时间(5-30分钟)，并通过加入100μl20％(重量/体积)三氯乙酸终止试验。快速涡旋混合物并在14,000xg下离心5分钟。回收100μl上清，并在Wallac 1409液体闪烁计数器上通过Cerenkov计数来测量释放的³²P。对于免疫小球化的磷酸酶活性(immunopelletedphosphatase activity)的试验，方法如上所述，不同处在于将清洗的免疫小球重悬于10μl缓冲液B中，且在30℃、以1200rpm摇动下孵育试样。
缓冲液A 50mM Tris-HCl pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％(体积/体积)2-巯基乙醇。
缓冲液B包含1mg/ml BSA的缓冲液A。
缓冲液C包含0.01％(体积/体积)Brij-35的缓冲液A。
³²P标记的酪蛋白底物是使用蛋白激酶A的催化亚基部分水解的、标记有[^γ32P]ATP的牛奶酪蛋白(Sigma，Poole UK)。
可以使用其它³²P标记的底物，条件是感兴趣的磷酸酶(如PPM1E和PPM1F)能够将它们去磷酸化。
体外PPM试验
可以在抑制PP1和PP2A类活性的冈田酸存在下，通过测定从谷胱甘肽-S-转移酶肽底物(GST-(GGGGRRAT_[p]VA)₃底物)释放的[³²P]-正磷酸盐来测定PPM磷酸酶活性。
磷酸酶可以通过如实施例10中的免疫小球化来提供，或更常规地通过如实施例12中的PPM1E的表达并使用标准技术对表达的蛋白进行纯化来提供(如使用与PPM1E多肽融合的纯化标签，如6个组氨酸或GST)。如果需要任何指导，本文中提供了优选PPM1E变体的氨基酸序列。
通过使用蛋白激酶A(PKA)进行磷酸化来制备GST-(GGGGRRAT_[p]VA)₃磷酸酶底物。在由50mM Tris-HCl pH 7.0、0.1mM EGTA、10％甘油、10mM乙酸镁、0.1％(体积/体积)2-巯基乙醇、0.1mM[^γ32P]ATP组成的缓冲液中，于30℃、轻柔摇动下，将2mg细菌表达的GST-(GGGGRRATVA)₃与1-2mUPKA孵育过夜。
GST-(GGGGRRATVA)₃蛋白序列(划线处为蛋白酶预切割位点)：
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGL
EFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVL
DIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTH
PDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIA
WPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSGGGGRRATVAGGGGRRATV
AGGGGRRATVAGGG
通过在谷胱甘肽-Sepharose柱上进行柱层析和洗脱(洗脱液：50mMTris-HCl pH 7.0，0.1mM EGTA，10％甘油，10mM乙酸镁，0.1％(体积/体积)2-巯基乙醇，20mM谷胱甘肽)，从未结合的放射性核苷酸中分离标记的GST-(GGGGRRAT_[p]VA)₃。试验时，在加入前将GST-(GGGGRRAT_[p]VA)₃稀释至1-4μM。
磷酸酶的试验在30℃、持续摇动下，于30μl的总体积中进行10分钟。稀释于20μl缓冲液中的试样包含所述磷酸酶，在加³²P标记的10μlGST-(GGGGRRAT_[p]VA)₃磷酸酶底物前，在30℃下将其孵育2分钟。十分钟后，通过加入100μl 20％三氯乙酸终止反应。随后再将试管涡旋1分钟以确保完全混合，并在室温下以16,000xg离心5分钟。从每个反应中转移100μl上清至新的Eppendorf管中，并在液体闪烁计数器上通过Cerenkov计数测量。
酸-钼酸盐提取物具有很小的蛋白酶活性污染。
磷酸酶试验组合物(终浓度)
50mM Tris-HCl pH 7.0
0.1mM EGTA
10mM乙酸镁
2mM氯化锰(II)
5μM冈田酸
0.1％(体积/体积)2-巯基乙醇
根据制备，试验中所用磷酸酶的质量通常为10ng-10μg。
非放射性试验
10分钟试验后(在加入三氯乙酸前)，可以通过向100μl试样中加入包含10mg/ml钼酸铵和0.38mg/ml孔雀石绿的150μl 1N HCl，对磷酸盐的释放进行测定。室温(如18-25℃)进行20分钟后，测定620nm处的吸光度。可以利用250μl体积在平板读数器上读取吸光度。然而，此试验的灵敏度比基于放射性的试验低10-100倍，因此如果需要可以在试验中使用10-100倍以上的磷酸酶进行补偿，或在评定结果时可以仅考虑较低的读数。
对PPM1E的试验
用由氨基酸序列KTHDIPCPDLPWSY产生的抗体对PPM1E进行免疫小球化，并在存在10mM Mg²⁺或Mn²⁺离子和5μM冈田酸并使用³²P标记的酪蛋白作为底物的蛋白磷酸酶试验中，测定免疫小球中的磷酸酶活性。
也可以使用识别由基因ENSG00000175175编码的PPM1E蛋白的其它抗体。
对PPPM1F的试验
用由氨基酸序列LPSSLPEPETQAPPRS产生的抗体对PPM1F进行免疫小球化，并在存在10mM Mg²⁺或Mn²⁺离子和5μM冈田酸并使用³²P标记的酪蛋白作为底物的蛋白磷酸酶试验中，测定免疫小球中的磷酸酶活性。
也可以使用识别由基因ENSG00000100034编码的PPM1F蛋白的其它抗体。
AMP活化蛋白激酶(AMPK)
AMPK起细胞能量传感器的作用，切断消耗ATP的通路，并开启产生ATP的分解代谢过程。许多不同的分解代谢过程(包括葡萄糖动态平衡、脂代谢和线粒体的生物发生)的行为受AMPK的控制。此酶由异三聚体构成，包括催化的α亚基和调节的β和γ亚基，其中每个亚基都由多个基因编码。每个亚基存在多个剪切变体，这表明异三聚体可能有若干种组合。AMPK的α亚基包含催化激酶结构域，以及靠近C末端并必须且足以与β和γ亚基形成复合物的结构域。β亚基包含碳水化合物结合结构域，其被认为参与复合物与糖元颗粒的结合。如之前所讨论的，AMPK的其中一种生理标靶为糖原合成酶，该糖原合成酶也存在于糖原颗粒中，且有越来越多的证据表明高水平的细胞糖原导致AMPK活性降低。AMPK的γ亚基包含约4个由60个残基组成的重复基序，称为CBS结构域。这些基序成对地起作用，每个基序以互相排斥的方式结合一分子AMP或ATP，这与高浓度的ATP抑制由AMP产生的AMPK活化的想法一致。
在对运动和相关的ATP利用得到增加的响应中，可以活化AMPK。在运动期间，AMPK抑制消耗ATP的途径，而活化碳水化合物和脂肪酸代谢途径以试图恢复ATP的水平。可以通过AMP，以及通过α亚基催化“T环”中苏氨酸残基(Thr172)的磷酸化，别构活化AMPK。已经确定AMPK对细胞中AMP∶ATP比例的变化做出响应。肿瘤抑制物激酶LKB1是负责体内Thr172磷酸化的酶。LKB1通过与鼠蛋白25(MO25)和STE20相关衔接蛋白(STRAD)的相互作用而被活化；STRAD为假激酶，然而MO25可以稳定LKB1和STRAD之间的相互作用。此外，MO25和STRAD具有在细胞质中定位LKB1的作用。有趣地是，LKB1不受活化AMPK的刺激的调节，也不被AMP活化。许多研究人员目前正在研究LKB1的可能调节方式。除了活化AMPK，LKB1也能够在T-环残基处活化11个其它的AMPK相关激酶。Ca²⁺/钙调蛋白依赖型蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)也作为体内AMPK的上游激酶，确定肌肉收缩和AMPK活化之间的潜在联系。尽管证据有限，但认为体内AMPK的去磷酸化由PP2C类酶完成。
AMPK为抗糖尿病药美福明的间接标靶，其可以通过降低肝葡萄糖的产生和增加葡萄糖利用对2型糖尿病产生益处。美福明能够在肝细胞中活化AMPK，并因此可以通过增加Ser79的磷酸化来降低ACC的活性，进而增加脂肪酸的氧化，并抑制参与脂肪生成的酶。美福明为双胍家族药物的成员，且已经显示出能够抑制呼吸链中的复合物1。
已经鉴定出大量的AMPK下游标靶，包括乙酰辅酶A羧化酶和GLUT4。最重要的一种作用是作用于糖原合成酶(GS)，使用不具有活性AMPK的动物模型证明其为负责GS第2位点的磷酸化的主要激酶。已经证明，AMPK的非特异性活化剂(5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β-D-呋喃核糖苷(AICAR))可以降低GS的活性。当在AICAR刺激后检查时，在大鼠肌肉内GS第2位点上的磷酸化增强，而第3a或3b位点没有任何影响。相反，用AICAR处理后，小鼠的糖原水平提高，最有可能是由于AICAR增加葡萄糖吸收，并伴有由不依赖磷酸化状态的别构活化导致的GS活性的增加。在对运动的响应中，GS活性增加，且可以认为此增加能够使糖原储存在一次运动后快速饱和。然而，在非常强烈的运动期间，糖原分解可以达到极高的速度，从而减弱了GS活性增加产生的影响。因为AMPK在运动期间以强度依赖性方式被活化，因此似乎AMPK对GS的影响依赖于运动的持续时间和强度。在表达负显性AMPK的小鼠模型中，通常在对10分钟体外收缩的应答中，GS活性增加，这强烈提示在收缩期间的此时间点上，AMPK对GS的活化不起主要作用，但是如果继续运动，GS第2位点的磷酸化增加。第2位点的磷酸化将GS活性维持在基础水平，直到第3a和3b位点的磷酸化降低。除了其对AMPK的影响之外，骨骼肌的AICAR治疗增加了GLUT4的招募，所述增加与AMPK的活化程度一致。本发明通过维持或增加AMPK磷酸化及其活化而适用于此类应用，由此增加或维持/保持其的下游影响。
活化AMPK的美福明为2型糖尿病治疗中广泛使用的药物。认为在对增加的AMP水平的响应中，AMPK催化T-环残基(Thr172)的磷酸化的增加是通过AMPK的构象改变产生的，使得其能更好地被其上游激酶磷酸化。因此，重要的是理解AMPK去磷酸化中所涉及的机理，所述机理公开于本文，并包括鉴定负责AMPK去磷酸化的蛋白磷酸酶，和这些磷酸酶在AMPK响应苯乙福明和其类似物(如美福明)中的作用。
PPM1F可以优先地与AMPKα1结合。因此在一些方面，本发明涉及PPM1F在AMPKα1去磷酸化中的应用。在一个实施方案中，本发明涉及AMPKα1的纯化方法，该方法包括富集或纯化PPM1F。
PPM1E可以优先与AMPKα2结合。在一个实施方案中，本发明涉及AMPKα2的纯化方法，该方法包括富集或纯化PPM1E。
PPM1E和PPM1F可以结合。因此在一些实施方案中，本发明涉及PPM1E的纯化方法，该方法包括富集或纯化PPM1F。相反地，在一些实施方案中本发明涉及PPM1F的纯化方法，该方法包括富集或纯化PPM1E。
更多的应用
优选地，本发明的应用为体外应用。更优选地，涉及美福明的本发明的应用为体外应用。更优选地，涉及苯乙福明的本发明的应用为体外应用。
本发明的一些实施方案可以包括筛选磷酸酶活性活化剂的试剂，在此情况中可以简单地颠倒比较PPM磷酸酶活性的步骤(如测定是否其在本发明方法的所述第一样品中的活性比在本发明方法的所述第二样品中要低)，因此，当所述第一样品中的活性相对于所述第二样品增加时，可以将此试剂确定为活化剂。特别优选地是化合物，如为磷酸酶活性抑制剂的候选试剂。如实施例所述，适合的试剂为细胞中(如细胞裂解物中)磷酸酶活性的抑制剂。
对磷酸酶活性的作用(如抑制)可以是直接或间接的。试剂可以与磷酸酶或AMPK直接结合或不直接结合。试剂可以影响磷酸酶和AMPK之间的相互作用，如通过降低或抑制相互作用或通过促进解离。因此，本发明还涉及对能够影响AMPK和磷酸酶之间相互作用的试剂进行的试验。这可能是通过如实施例中所述的在被测试试剂存在下抑制或促进共免疫沉淀，或通过任何本领域技术人员熟知的其它技术来进行。
关键的试验是磷酸酶活性是否在体外受到影响，以及任选地这种影响是否在如细胞中(如在细胞裂解物中)被确定。
本发明的目的是鉴定关键磷酸酶的抑制剂，其目标是在受试者中抑制这些磷酸酶，以便增加或保持AMPK磷酸化和由此的活性，这在如糖尿病的治疗中十分有用。
适合地磷酸酶为PPM1E。
适合地磷酸酶为PPM1F。
适合地磷酸酶为PPM1E和PPM1F(如混合物，或包含PPM1E和PPM1F的结合物或复合物)。
附图说明
图1显示了在未处理的HEK293细胞中或用10mM苯乙福明处理1小时的HEK293细胞中，I型蛋白磷酸酶的分析结果。A：在4个未处理和4个处理的样品中AMPK在Thr172上的磷酸化水平。将抗PP5-TPR结构域抗体用作内参。分子量(kDa)在图的左侧标出。B：在4nM冈田酸存在下，使用磷酸化酶a作为底物，在处理和未处理的HEK293细胞裂解物中PP1磷酸化酶磷酸酶的活性。数据为一式三份的测量中四个样品的平均值±SEM。C：在200nM I-2存在下，使用磷酸化酶a作为底物，在处理和未处理的HEK293细胞裂解物中PP2A磷酸化酶磷酸酶的活性。数据为一式三份测量中四个样品的平均值±SEM。
图2显示了在未处理的细胞裂解物中或用10mM苯乙福明处理1小时的细胞裂解物中，具有冈田酸抗性的Mg²⁺依赖型磷酸酶(PPM磷酸酶)的活性。A：在10mM MgAc和5μM冈田酸存在下，使用酪蛋白作为底物，在处理和未处理的HEK293细胞裂解物中PPM磷酸酶的活性。数据是一式两份测量中五个独立样品的平均值±SEM。(p＜0.001)。B：在10mM MgAc和5μM冈田酸存在下，使用酪蛋白作为底物，在处理和未处理的HeLa细胞裂解物中PPM磷酸酶的活性。数据是一式两份测量中四个独立样品的平均±SEM。(p＜0.001)。
图3显示了使用酪蛋白作为底物，在与1mM苯乙福明预孵育后重组的PPM磷酸酶的活性。细菌表达的PPM磷酸酶与或不与1mM苯乙福明孵育15分钟，随后在10mM MgAc和5μM冈田酸存在下，使用³²P酪蛋白作为底物进行试验。试验一式三份进行。
图4显示了在未处理的HEK293细胞中或用苯乙福明处理的HEK293细胞中PPM磷酸酶的水平。未处理或用10mM苯乙福明处理1小时的HEK293细胞裂解物的免疫印迹。使用针对所述PPM酶产生的抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。每次处理给出两个代表性的样品。圆括号中指明了预测的分子量(kDa)。标准蛋白的分子量(kDa)在图的左侧标出。
图5显示了用FPLC分离后来自处理和未处理的HEK293细胞裂解物的PPM磷酸酶的活性。将来自对照或苯乙福明处理的HEK293细胞的裂解物用0.45μm和0.22μm过滤器进行过滤，并使用HiTrap脱盐柱进行脱盐。使用HR5/5 Source 15-Q柱根据蛋白的净电荷来分离蛋白。分析各部分的蛋白浓度，且在10mM MgAc和5μM冈田酸存在下，使用³²P标记的酪蛋白作为底物测定每个部分中PP2C磷酸酶活性。
图6显示了在未处理或用苯乙福明处理的HEK293细胞中PPM磷酸酶的活性。在未处理或用10mM苯乙福明处理1小时的HEK293细胞裂解物中的PPM磷酸酶的活性。从对照或苯乙福明处理的细胞裂解物中免疫沉淀出单独的同种型，并在10mM MgAc和5μM冈田酸存在下，使用³²P标记的酪蛋白作为底物测定活性。数据为一式三份进行的试验的平均活性。
图7显示了PPM1E和PPM1F的结构域结构。保守的区域以阴影线区域显示；黑框代表在所有家族成员中都具有保守性的PP2C特征基序(YFAVFDGHG)，且灰框表示在PPM1中未发现的一段酸性残基。
图8的表显示了将PPM磷酸酶从FPLC柱上洗脱的盐浓度。对用FPLC分离HEK293细胞裂解物后收集到的馏分进行免疫印迹。图中显示了各个酶洗脱的大约盐浓度，以及所检测到的条带的预测分子量(kDa)和观察分子量(kDa)。
图9显示了代表未处理或用苯乙福明处理的HEK293细胞中PPM磷酸酶活性的条形图(图6中显示的绝对数据的％比例)。
图10显示了条形图。
图11和12分别显示了免疫印迹的照片。
现以举例的方式描述本发明。这些实施例的目的是说明，而非限制所附带的权利要求。
实施例
实施例1：双胍对AMPK磷酸化的作用
为了测定蛋白磷酸酶的作用是否部分介导双胍(如美福明或苯乙福明)的作用，进行实验以研究美福明类似物苯乙福明是否影响可以使AMPK去磷酸化的蛋白磷酸酶的活性，描述了苯乙福明对蛋白磷酸酶的作用。
为了研究苯乙福明对AMPK活性的作用，在37℃下用10mM苯乙福明刺激血清饥饿的HEK293细胞1小时。在包含可以保持AMPK的磷酸化状态的1μM微囊藻毒素-LR的裂解缓冲液中裂解细胞。使用针对磷酸肽产生的抗体进行免疫印迹，所述磷酸肽对应于AMPK的催化Thr172残基周围区域。在用苯乙福明刺激后可以观察到AMPK的Thr172磷酸化的增加(图1A，上部)。
实施例2：双胍对蛋白磷酸酶活性的作用
为了研究双胍对蛋白磷酸酶活性的作用，对未处理或用双胍(如上所述，此实施例中为10mM苯乙福明)处理的HEK293细胞裂解物进行免疫印迹，或使用磷酸酶抑制剂和活化剂以及不同磷酸化底物的组合测定特定蛋白磷酸酶的活性。
因为HEK293细胞中PP5的活性很低，所以使用针对所述蛋白TPR结构域的抗体通过免疫印迹测试PP5的水平。没有观察到苯乙福明应答引起的PP5的水平变化(图1A，下部)。
测定在对苯乙福明的响应中PP1的活性，方法是使用³²P标记的磷酸化酶a作为底物，连同包含在反应物中以抑制PP2A活性的4mM冈田酸和包含在反应物中以抑制金属离子活化的蛋白磷酸酶的EGTA(0.1-2mM)。在未刺激和10mM苯乙福明刺激的细胞裂解物之间未能检测出PP1磷酸化酶磷酸酶活性的变化(图1B)。
测试PP2A的活性对苯乙福明的响应，方法是使用³²P标记的磷酸化酶a作为底物，但是对于此试验，包含200nM I-2和抑制金属离子活化的蛋白磷酸酶的EGTA(0.1-2mM)以抑制PP1。未能检测出未刺激和10mM苯乙福明刺激的细胞裂解物之间存在PP2A磷酸化酶磷酸酶活性的变化(图1C)。
PPM抑制剂试验
对PP2C(PPM1)和PPM家族相关成员的活性进行测试，方法是使用³²P标记的酪蛋白作为底物，连同包含在反应物中以抑制PP2A的5μM冈田酸，和已知是PP2C活性所需的10mM乙酸镁(Ingebritsen and Cohen，1983Science vol 221，pp331-338；Ingebritsen等，1983 Eur J Biochem vol 132，pp263-274)。
与未处理的对照细胞相比，在苯乙福明处理的HEK293细胞中，具有冈田酸抗性的Mg²⁺依赖型酪蛋白磷酸酶的活性(下文称为PPM磷酸酶活性)降低了～20％(图2A)，表明苯乙福明在细胞中(即体内)对该活性的抑制作用。
在缺少LBK1(AMPK的一种上游活化物)的HeLa细胞中，苯乙福明不能活化AMPK(Hawley等，2003 J.Biol vol 2，p28)。为了测试苯乙福明在此细胞系中是否具有相似作用，对未处理或用10mM苯乙福明处理的HeLa细胞中的PPM磷酸酶活性进行测试。同时，在用苯乙福明处理的细胞中能够观察到PPM磷酸酶活性下降～20％(图2B)。在此实验中，测量了许多PP2C同种型的活性，且观察到的20％下降可能代表仅有一种所述同种型的活性有较严重的下降。
使用2mM美福明代替10mM苯乙福明进行相同的实验。在用美福明处理的细胞中同样观察到PPM磷酸酶活性下降20％。
因此，这首次表明双胍(如苯乙福明和美福明)为PPM磷酸酶活性的抑制剂，且似乎是所述活性的特异性抑制剂。
实施例3：双胍对PPM家族成员的活性的作用
蛋白磷酸酶PPM家族包括至少16个结构上不同，且具有不同底物特异性的同种型。为了确定这些磷酸酶中哪些可能因响应双胍而改变了活性，对细菌表达的PPM酶进行测试。在单独与缓冲液预孵育后或与缓冲液和1mM双胍(此实施例中为苯乙福明)一起预孵育后，测试与各个酶相关的PPM磷酸的的活性。在能够以活性形式表达的这些酶中(PPM1A、PPM1B、PDPC1、PDPC2和Nerpp)，在对照样品中和与苯乙福明预孵育的样品中未检测出差异。在这样的试验条件下，细菌表达的PPM1F和ILKAP显示出对磷-酪蛋白无活性(图3)。在此实验中未测试PPM1D、PPM1E和PPM1G。
实施例4：双胍对PPM家族成员水平的作用
为了确定双胍是否能够对任何PPM磷酸酶的水平产生作用，使用抗体进行免疫印迹。针对PPM1A、PPM1B1、PPM1B2、PPM1D、PPM1F、PPM1G和ILKAP产生的抗体所产生的条带靠近所述酶的预测分子量，尽管PPM1D还产生许多其它条带。在未处理细胞中和用双胍(此实施例中为苯乙福明)刺激的那些细胞中未检测出这些酶在水平上的差异(图4)。针对PPM1E和PDPC1的抗体不产生任何信号，然而PDPC2和Nerpp分别在错误的分子大小处以及一般的染色背景下产生一模糊条带。
实施例5：在由FPLC分离的处理的和未处理的细胞裂解物中的PPM的活性
为了确定双胍(如苯乙福明)所抑制的确切的PPM磷酸酶，对来自未处理的和苯乙福明处理的HEK293细胞的细胞裂解物进行过滤和脱盐，然后根据净电荷通过FPLC对其进行分离。收集各个分离部分(每个500μl)，并测量每一部分中的总PPM磷酸酶活性。可以在用约150mM NaCl和500mMNaCl从FPLC柱上洗脱的未处理样品和苯乙福明处理样品之间检测到蛋白磷酸酶活性上的一些微小差异(图5)。通过来自FPLC柱的各部分的免疫印迹可以鉴定出一些PPM磷酸酶和它们的洗脱盐浓度(参见图8的表)，然而此方法没有鉴定出图5中可见的最大峰。
在此实验中，针对PPM1G和ILKAP的抗体鉴定出大小不正确的条带，然而不能检测到PPM1D、PPM1E、Nerpp和PDPC1。可能是活性受苯乙福明抑制的PPM在约150mM NaCl或500mM NaCl处从FPLC柱上洗脱(图5)。不受到理论束缚，此结果不排除这样的可能性，即与其中一种PPM同种型结合的小分子在柱上被洗掉，因此不能检测到之前观察到的活性变化。
实施例6：双胍对特定PPM酶的活性的作用
为了更确切的测定受双胍影响的PPM磷酸酶，对与各种PPM酶相关的PPM磷酸酶的活性进行评估。在此实施例中，双胍为美福明和苯乙福明。使用肽抗体进行PPM磷酸酶的免疫沉淀，所述PPM磷酸酶来自于未处理或已经用10mM苯乙福明处理的HEK293细胞裂解物(图6/图9；参照图9，比例为容易比较的百分比例，原因是图6中的绝对值可以根据非实质性实验因素如³²P标记的加入水平而改变)。对于与PPM1A1、PPM1B1、PPM1B2、PPM1D、PPM1G、ILKAP、Nerpp、PDPC1或PDPC2相关的PPM磷酸酶，没有检测到变化。然而，有趣地是在用苯乙福明处理后PPM1E的活性几乎完全被去除，而密切相关的PPM1F的活性下降了～40％(图6)。在对来自未处理HEK293细胞的PPM1E免疫沉淀物进行免疫沉淀和免疫印迹后，使用针对PPM1E的抗体未检测到信号。
实施例7：双胍对PPP磷酸酶无作用，但抑制PPM磷酸酶
双胍(如苯乙福明)通过增加α亚基Thr172残基的磷酸化引起HEK293细胞中AMPK的活化。因为HeLa细胞缺少LKB1(AMPK的一种上游激酶)，这种作用在这些细胞中降低。LKB1自身的活性不受苯乙福明的影响，因此重要的是测试苯乙福明是否能够影响负责AMPK去磷酸化的蛋白磷酸酶的活性。我们认为对冈田酸不敏感的蛋白磷酸酶负责完整细胞中AMPK的去磷酸化，且已经报道的证据提示金属离子依赖型PP2C(PPM1)可能负责体内AMPK的去磷酸化，而在体外PP2A和PP2Cα(PPM1A)都能完成此任务。
用苯乙福明刺激HEK293细胞对PP1或PP2A的活性(根据体外磷酸酶试验测定)或对PP5的水平没有作用。然而，在HEK293细胞和HeLa细胞中，苯乙福明能够将PPM磷酸酶活性抑制约20％。与PPM酶可能是负责AMPK去磷酸化的主要磷酸酶的证据一起，这产生一种可能性，即苯乙福明可能发挥抑制PPM酶活性的作用，并由此提高AMPK的活性。因为本领域中尚不知道苯乙福明活化AMPK的确切机理，所以抑制蛋白磷酸酶活性代表抗糖尿病药活化AMPK的新机理。因此，可以证明PPM磷酸酶为所述疾病的治疗性干预标靶。
实施例8：双胍对PPM酶的作用
PPM酶存在多种不同的同种型，且双胍(如苯乙福明)预孵育不影响细菌表达的多种PPM磷酸酶的酪蛋白磷酸酶活性。能够表达并纯化PPM1A、PPM1B、PPM1F、PDPC1、PDPC2、ILKAP和Nerpp。可以在PPM1A1、PPM1B、PDPC1、PDPC2和Nerpp的制品中检测到酪蛋白磷酸酶活性，但是其不受1mM浓度的苯乙福明预孵育的影响，这对苯乙福明直接结合并抑制这些酶的作用提出了质疑。由于这些纯化的酶未显现出针对磷-酪蛋白的活性，从此特定实验中无法对PPM1F或ILKAP做出结论。
针对个体PPM酶的特异性抗体未能检测出多种PPM磷酸酶在水平上的任何变化。这些免疫印迹实验对苯乙福明改变PPM1A1、PPM1B1、PPM1B2、PPM1D、PPM1F、PPM1G或ILKAP水平的作用提出了质疑。这些特定的免疫实验不能确定PPM1E、PDPC1、PDPC2或Nerpp的水平是否受苯乙福明的影响。
通过FPLC分离PPM活性产生两个主要的磷酸酶活性峰。这提示来自骨骼肌裂解物的两个活性峰代表PP2Cα(PPM1A)和PP2Cβ(PPM1B)，而在HEK293细胞中每个峰包含一个以上的PPM磷酸酶活性。
使用针对PPM磷酸酶的特异性抗体进行免疫沉淀并检测与各个PPM酶相关的酪蛋白磷酸酶的活性。有趣地是，在双胍苯乙福明或美福明处理的细胞中，PPM1E的活性几乎完全消失，PPM1F的活性减少至未处理细胞水平的～60％。PPM1E和PPM1F是两种密切相关的酶，在核心磷酸酶结构域和同源旁侧序列上具有66％的相似性，且均包含融合的PIX结合结构域。PPM1E参与p21活化激酶PAK的去磷酸化。已经证明，PPM1F能够使自磷酸化的钙/钙调蛋白依赖型蛋白激酶II(CaMKII)以及CaMKI和CaMKIV的催化性Thr286残基去磷酸化。
图10显示了在用2mM美福明处理或未处理的HEK293细胞中PPM磷酸酶PPM1A1和PPM1E的活性。在裂解前，用2mM美福明处理HEK293细胞10分钟。将来自未处理或美福明处理的HEK293细胞裂解物的PPM1A1和PPM1E同种型进行免疫沉淀(一式三份)，并使用³²P标记的酪蛋白作为底物，在10mM乙酸镁和5μM冈田酸存在下对活性进行测定。使用免疫前抗体(pre-immune antibody)对每种裂解物进行一式三份的对照免疫沉淀，并从PPM磷酸酶免疫沉淀计算的活性中减去该活性。显示出相对于未处理的PM1A1的活性。表明了美福明处理基本上特异性地敲减了PPM1E的活性。
在人蛋白激酶组(kinome)(http://www.kinase.com/human/kinome)中，蛋白激酶被分为许多不同的激酶家族，依据是其催化结构域序列的相似性、催化结构域外的结构域结构、其已知的生物学功能和其分类在其它种类中的比较。蛋白激酶AMPK和CaMKK家族均包含在CaMK超家族内。AMPK和CaMK的调节有趣地相似；两种酶的别构活化均需要通过它们的适当配体(AMP用于AMPK，Ca²⁺/钙调蛋白用于CaMKK)，随后在活化环内进行苏氨酸残基的磷酸化。
此处所述的结果有至少两种可能含义：第一，考虑到CaMK和它们的上游激酶CaMKKα和CaMKKβ之间的结构相似性，PPM1E和PPM1F可能起到对CaMKK同种型去磷酸化的作用，因此降低了它们的活性，并由此降低了AMPK的活性。第二，考虑到上述CaMK和AMPK活化的保守机制，以及AMPK和CaMKs均位于同一蛋白激酶超家族内的事实，PPM1E和PPM1F可能起到直接对AMPK去磷酸化的作用。不论哪种设想都证明双胍(如苯乙福明)能够抑制AMPK去磷酸化中涉及的蛋白磷酸酶活性。由此，证明PPM磷酸酶是用于AMPK活性调节的有效治疗试剂，且PPM磷酸酶抑制剂也同样为优秀的候选治疗剂。
实施例9：双胍对PPM家族蛋白磷酸酶成员的作用
此处显示的数据是鉴定负责AMPK去磷酸化的蛋白磷酸酶和抗糖尿病药(如美福明和苯乙福明)的标靶的研究结果。这些化合物降低血糖水平的机制之一是通过增加AMPK的活性；本领域中尚缺乏对这种作用机制的了解。我们公开了在对双胍化合物的响应中，蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PPM家族的一个或多个成员参与提高AMPK的活性。
PPM家族蛋白磷酸酶PPM1E和PPM1F在对美福明/苯乙福明的响应中发挥AMPK去磷酸化的作用，这是一个重要的进展。与包含AMPKα₁的复合物相比，包含AMPKα₂的复合物对AMP的依赖性更大，并集中在细胞核中，推定它们在此处对基因转录发挥作用。已经发现由于运动诱导而使AMPKα₂转位至细胞核，但是本领域中对其发生的机理尚不清楚。PPM1E和PPM1F在其磷酸酶结构域上具有64％的同源性，但是PPM1E在N-和C-末端均有较大区域没有同源性(图7)。已经鉴定出在PPM1E C-末端具有两种核定位信号，并鉴定出对其功能至关重要的一些碱性残基。PPM1F、CaMKI、CaMKII和CaMKKβ特异性地定位于细胞质，而PPM1E、CaMKIV和CaMKKα特异性地定位于细胞核，这提示细胞内存在两个CaMK调节体系，且PPM1E和PPM1F在细胞内可能起互补作用。在使用针对PPM1E蛋白C-末端残基产生的抗体(与本研究中所用的抗体相似)的免疫印迹实验中，PPM1E主要大量表达于脑中。不受任何理论的束缚，可能是该蛋白在其它组织中的表达较低，也可以解释在这些特定实验中通过免疫印迹未检测出蛋白。
存在于脑中的多数PPM1E以在细胞质中最丰富的截短形式存在，这使得PPM1E可能能够对胞质和细胞核CaMK家族蛋白激酶进行去磷酸化的可能性加大。
已知美福明可以通过降低肝葡萄糖的生成和增加骨骼肌对葡萄糖的吸收来降低葡萄糖和脂类，且AMPK首先被假定为美福明药物作用的潜在调节子，但是美福明活化AMPK的机理在本领域中一直是个谜团。已经证明，美福明能够抑制呼吸链中的复合物I，并由此可以削弱线粒体的功能和细胞呼吸，从而抑制肝葡萄糖的生成并提高葡萄糖的利用。美福明主要通过抑制肝糖原的分解来抑制葡萄糖的生成。这与美福明参与提高细胞内AMP∶ATP的比例稍有矛盾。已有报道美福明通过不依赖腺嘌呤核苷酸的机制活化AMPK，但另一报道指出将更强的双胍苯乙福明与多种类型的细胞孵育可以增加AMP∶ATP的比例。由于美福明对AMP∶ATP比例的作用在较长时间内存在但功效较低，因而对该功效进行检测似乎较为困难。美福明对PPM1E和/或PPM1F活性的抑制以及这种抑制是否依赖于AMP∶ATP的比例的变化可能很重要。
因为钙和钙调蛋白调节CaMK家族的活性并由此调节AMPK的活性，所以钙和钙调蛋白也可能对PPM1E和PPM1F产生作用。在此处显示的实验所用的试验条件下，在反应混合物中不存在钙离子。可以使用向反应混合物中加入钙和/或EGTA的进一步实验来评价钙对这些酶的活性以及美福明/苯乙福明对它们的抑制是否具有任何作用。此外为了了解磷酸酶PPM1E和PPM1F是否能够对CaMK蛋白激酶超家族的特定成员进行去磷酸化，可以利用比磷-酪蛋白特异性更强的底物。这也可以帮助评价在对未刺激细胞的提取物进行酶免疫沉淀后，美福明/苯乙福明对PPM1E活性的直接作用。
利用短干扰RNA(siRNA)的研究可以用于证明是否PPM1E和PPM1F水平的敲减对AMPK活性具有深切作用，以及美福明/苯乙福明在缺少磷酸酶时是否活化AMPK。所述研究可用于评价这些酶中各个酶在体内对其底物去磷酸化所做的相对贡献。
实施例10：试验/筛选
本实施例说明了用于在糖尿病或肥胖症药物中的候选试剂的鉴定方法。该方法包括提供PPM磷酸酶的候选抑制剂，提供包含PPM磷酸酶的第一样品和第二样品，使所述候选抑制剂与包含PPM磷酸酶的所述第一样品接触，以及测试所述第一样品和第二样品的PPM磷酸酶活性。在此实施例中，所述PPM磷酸酶是PPM1E。
用从氨基酸序列KTHDIPCPDLPWSY得到的抗体对PPM1E进行免疫小球化。
在10mM Mg²⁺或Mn²⁺离子和5μM冈田酸存在下使用³²P标记的酪蛋白作为底物的蛋白磷酸酶试验中，测定免疫小球中的磷酸酶活性。在此实施例中，试验按照以下进行：
将清洗的免疫小球重悬于10μl缓冲液B中。在30℃下和30μl体积中，使用1μM-10μM ³²P标记的底物进行蛋白磷酸酶试验。在此实施例中，³²P标记的酪蛋白底物是使用蛋白激酶A的催化亚基部分水解的、标记有[^γ32P]ATP的牛奶酪蛋白(Sigma，Poole UK)，标记有[^γ32P]ATP)。
将³²P标记的底物和磷酸酶抑制剂/活化剂分别在缓冲液C中稀释。通过将10μl缓冲液B中的免疫小球与10μl的抑制剂/活化剂或缓冲液C混合，并将混合物在30℃下孵育10分钟来进行试验。通过加入10μl ³²P标记的底物来启动试验。随后在30℃下以1200rpm将被分析物摇动孵育更长时间(15分钟)，并通过加入100μl 20％(重量/体积)三氯乙酸终止反应。快速涡旋混合物，并在14,000xg下离心5分钟。回收100μl上清，并在Wallac 1409液体闪烁计数器上通过Cerenkov计数测量释放的³²P。
缓冲液A 50mM Tris-HCl pH 7.5、0.1mM EGTA、0.1％(体积/体积)2-巯基乙醇。
缓冲液B包含1mg/ml BSA的缓冲液A。
缓冲液C包含0.01％(体积/体积)Brij-35的缓冲液A。
随后比较所述第一样品和所述第二样品中的PPM磷酸酶活性；当所述第一样品中的活性低于所述第二样品时，则所述候选抑制剂被鉴定为用于糖尿病或肥胖症药物中的候选试剂。
实施例11：确认PPM为标靶
为了进一步表征本文所讨论的信号通路中元件之间的关系，且为了提供其它方法以确认本发明方法所鉴定的候选化学物，我们对分子间相互作用进行了研究。
使用共价偶联有AMPKα1、AMPKα2、一些PPM和对照IgG的Sepharose珠子从HEK293细胞裂解物中免疫吸附其各自的抗原。结果显示在表11和表12中。清洗免疫小球(IP)，将其溶解在20μl SDS凝胶上样缓冲液中，并通过SDS-PAGE和所示抗体的免疫印迹进行分析。条带的大小(千道尔顿)示于右手侧。
材料和方法
在50mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EGTA、1mM EDTA、1％(体积/体积)Igepal CA-630(NP-40代替物)、1mM原钒酸钠、10mM β-甘油磷酸钠、50mM氟化钠、5mM焦磷酸钠、0.27M蔗糖、5mM N-乙基马来酰亚胺、“完全”蛋白酶抑制剂混合物(一片/50ml)中裂解HEK293细胞。在50mM Tris-HClpH 7.5、150mM氯化钠、“完全”蛋白酶抑制剂混合物(一片/50ml)中将裂解物约5倍稀释至1mg/ml。在含100μg蛋白的细胞裂解物稀释液中加入抗体-Sepharose(由10μl Sepharose珠子和10μg抗体制备)，进行免疫吸附。在4℃进行免疫吸附3小时后，将免疫小球在13,000xg下离心5分钟，并用冰冷的50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM氯化钠清洗两次。
亲和纯化针对其各自人抗原的抗体，以1μg/ml的浓度将其用于印迹，并通过增强型化学发光进行检测。针对AMPKα1(344-CTSPPDSFLDDHHLTR-358)产生的抗AMPKα1抗体和针对AMPKα2(352-CMDDSAMHIPPGLKPH-366)产生的抗AMPKα2抗体来自于D.G.Hardie教授(邓迪大学)。针对PPM1A1(369-KNDDTDSTSTDDMW-382)产生的抗PPM1A1抗体、针对ILKAP(373-KAVQRGSADNVTVMV-387)产生的抗ILKAP抗体、针对PPM1E(728-RSSLPWRQNSWK-739)产生的抗PPM1E抗体和针对PPM1F(439-LPSSLPEPETQAPPRS-454)产生的抗PPM1F抗体、针对PPM1K(359-FSFSRSFASSGRWA-372)产生的抗PPM1K抗体在Hilary McLauchlan博士和James Hastie博士(邓迪大学)管理的Division of Signal Transduction Therapy中制备。抗PHLIPP-L抗体来自NovusBiologicals(Littleton，Colorado)。对照IgG是免疫前IgG片段(pre-immuneIgG)，其来自未产生免疫反应的绵羊的血清。
图11显示内源PPM1F存在于内源AMPKα1(泳道2)而非AMPKα2(泳道3)的免疫小球中。相反的免疫小球显示AMPKα1(泳道7)而非AMPKα2存在于PPM1F免疫小球中。需要注意在一些情况下PPM1E和PPM1F可以结合，从而导致PPM1E免疫小球中存在一些PPM1F(泳道6)。内源PPM1E的免疫小球显示存在内源AMPKα2的条带而非AMPKα1的条带(图12)。
与AMPKα1和AMPKα2结合的一些PPM磷酸酶的总结