羟基红花黄色素A在制备治疗缺氧性肺动脉高压的保健药物或功能食品中的用途.pdf

本发明公开了羟基红花黄色素A在制备治疗缺氧性肺动脉高压的保健药物或功能食品中的用途，所述羟基红花黄色素A具有抑制缺氧引起的肺动脉血管结构重建及右心室肥大的作用。本发明还涉及从中药红花中提取羟基红花黄色素A的方法。本发明的提出为研究开发红花药用资源提供了新的技术手段,对红花的有效成分羟基红花黄色素A的抗肺动脉高压的作用进行了研究，结果表明羟基红花黄色素A可以有效改善缺氧肺动脉高压大鼠的肺动脉重构及降低肺动脉压力，因此有望用于肺动脉高压的预防和治疗。

权利要求书
1.  羟基红花黄色素A在制备治疗缺氧性肺动脉高压的保健药物或功能食品中 的用途，所述的羟基红花黄色素A的结构如下所示：


2.  如权利要求1所述的用途，其特征在于羟基红花黄色素A抑制了缺氧引起 的肺动脉血管结构重建及右心室肥大。

3.  如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的药物由羟基红花黄色素A和 医学上可接受的药物辅料组成，羟基红花黄色素A在药物中的质量百分含量为 0.1％-90％，所述的药物包括片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、 硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、 混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、 贴剂、脂质体、各种缓控释剂型以及靶向制剂。

4.  如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的药物为冻干粉针剂，其通过 以下方法制备得到：
1)配液:将羟基红花黄色素A、维生素C以及甘露醇加入配液缸中，加入注 射用水搅拌至全部溶解，用氢氧化钠调节pH为6.5-7.5，补加注射用水至溶液体积 为羟基红花黄色素A质量的150-250倍；
2)脱色：向配好的药液中加入医用活性炭，室温搅拌，过滤脱碳，然后滤液 再用除菌微孔滤膜精滤，分装，半加塞；
3)冻干
a、预冻：将分装好的药液按1.1℃/分钟速度降温至-48℃，保温冷冻3小时；
b、升华：将预冻好的药液抽真空，至15Pa，然后在8小时内匀速缓慢升温至 -20℃，保温2小时，再在5小时内匀速升温至5℃；
c、干燥：将升华完毕阶段结束后的药液在4小时内匀速升温至40℃，保温干 燥3小时，即得。

5.  如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的羟基红花黄色素A通过以下 方法提取得到：
1)红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花适度粉碎，加去离子水，浸泡24h之 后40-60℃水浴加热0.5-2h，超声5-15分钟，过滤；滤渣再次用水浴加热0.5-2h， 超声5-15分钟，过滤，合并滤液；浓缩至相对密度为1.16～1.26，加乙醇，冷藏， 静置36-72小时，滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至相对密度为1.10～1.14，再加乙 醇使含醇量达75-85％(v/v)，冷藏，静置36-72小时，滤过，滤液回收乙醇，用 旋转蒸发仪浓缩得到相对密度为1.16～1.20的浸膏；
2)取红花浸膏上大孔树脂柱，依次用去离子水、10％(v/v)乙醇洗脱，流速 为2柱体积/h，收集10％(v/v)乙醇洗脱液，洗脱液浓缩，真空干燥，即得。

6.  如权利要求4所述的用途，其特征在于步骤(1)中维生素C的加入量为 羟基红花黄色素A重量的1％，甘露醇的加入量为羟基红花黄色素A重量的30％， 用氢氧化钠调节pH为7.0，补加注射用水至溶液体积为羟基红花黄色素A质量的 200倍。

说明书羟基红花黄色素A在制备治疗缺氧性肺动脉高压的保健药物或功能食品中的用途
技术领域
本发明涉及从中药红花中分离出的一个查尔酮类衍生物羟基红花黄色素A 的药物新用途，特别涉及羟基红花黄色素A制备治疗缺氧性肺动脉高压的保健药 物或功能食品中的用途，本发明属于医药技术领域。
背景技术
肺动脉高压(Pulmonary Artery Hypertension，PAH)是一种极度恶性的进行 性疾病，由于肺动脉阻塞导致的肺动脉压力持续升高，最终导致右心室衰竭和 过早死亡,是仅次于冠心病和高血压的第三类常见心血管疾病。大部分患者将 在2～3年内死于心力衰竭，仅比肝癌预后好，比其他肿瘤预后都差，病患的 存活率很低。因此，被医学界称为是“比很多恶性肿瘤还恶性的疾病”，“心血管 病中的癌症”。
肺动脉高压(PAH)的主要病理生理变化是肺血管收缩和肺血管重塑。肺动 脉平滑肌细胞(PASMCs)是肺血管的主要成分，PASMCs的增殖和凋亡失衡势必 导致肺血管收缩和肺血管重塑；PASMC膜上主要分布有4种离子通道：即钾、 钠、钙及氯离子通道。这些通道均参与和决定了SMC的膜电位，而膜电位不 仅是调节钙离子经由电压依赖性钙通道(VDC)内流，而且也是影响细胞内库存 钙离子释放和SMC收缩装置。迄今大多数学者认为低氧性肺动脉高压(PAH)以 及低氧性肺血管收缩(HPV)的发病机理是由于低氧抑制了平滑肌细胞膜上的钾 离子通道，使细胞膜去极化，从而激活电压门控的钙通道，引起细胞外钙离子 内流，导致肺动脉平滑肌细胞收缩和平滑肌细胞增殖从而启动HPV。钾离子通 道功能下降或受到抑制后，由于增加了细胞内钙浓度，抑制了平滑肌细胞的凋 亡，平滑肌细胞凋亡和增殖的失衡，导致肺动脉血管的重构。
K+通道既是PAH和HPV发病过程中的重要环节，也是药物作用的重要 靶点。肺循环上存在多种钾通道：(1)电压门控钾通道(Kv)；(2)Ca2+激活 性钾通道(KCa)；(3)ATP敏感性钾通道(KATP)；(4)内向整流性钾通道(Kir)。在 遗传因素、低氧、食欲抑制剂、病毒感染等因素作用下,钾通道关闭或活性下 降时,细胞内K+外流，细胞内膜电位(Em)就变正,膜去极化,当去极化到一定 程度时,L-钙通道开放,Ca2+内流,同时三磷酸肌醇(IP3)也被激活，肌质网释 放Ca2+，细胞质内Ca2+浓度([Ca2+]cyt)增加，激活肌动蛋白-肌球蛋白收缩装置， 平滑肌收缩，PASMCs增殖、肺动脉血管重构，形成PAH。
近二十年来，随着对肺动脉高压的病理及各种药物作用通路的认识和理 解，药物治疗有了很大的进展。在阻止PAH的发生发展过程中，现有的药物 治疗主要涉及三种途径，前列环素途径、内皮素途径及一氧化氮(NO)-鸟苷酸 环化酶(SGC)-环磷酸鸟苷(cGMP)途径。针对这3种途径所开发的药物包括 前列环素及其类似物、内皮素受体拮抗剂和磷酸二酯酶-5抑制剂等，这些药物 的开发和应用在当前PAH的治疗中发挥了重要的作用。但由于无法克服的副 作用和昂贵的治疗费用使得这些治疗药物的临床应用受到了极大的限制。内皮 受体拮抗剂会导致男性生殖功能萎缩或不育，或伴随包括潜在的肝毒性、贫血 及水肿等副作用,磷酸二酯酶抑制剂的副反应包括头痛、流鼻血、颊红及消化 不良等；此外，大多数的前列腺素类药物药理性质不稳定，皮下注射后回产生 疼痛及局部出现红疹。其他的副作用有头痛、恶心、皮疹和腹泻。所以这些现 有的药物治疗前景很不乐观，寻找新的治疗药物是亟待解决的问题。
中药红花是一种被中国药典收录的传统中药，广泛地用于治疗心脑血管疾 病。红花中的主要成分羟基红花黄色素A，具有多方面的药理活性,羟基红花 黄色素A有拮抗血小板活化因子受体结合作用；减少心肌梗塞面积；降低血压、 抗血栓和抑制血小板凝聚等；羟基红花黄色素A能显著降低压和减少心率,羟 基红花黄色素A还有抑制细胞凋亡和细胞周期保护缺氧引起的人脐静脉内皮 细胞损伤作用；此外羟基红花黄色素A还有抗氧化作用、抗肿瘤作用等，但目 前尚未见到有将其用于肺动脉高压(Pulmonary Arterial Hypertension,PAH)的 研究报道。
本发明为了研究开发红花药用资源,对红花的有效成分羟基红花黄色素A 的抗肺动脉高压的作用进行了研究,结果表明该成分可以有效改善缺氧肺动脉 高压大鼠的肺动脉重构及降低肺动脉压力，因此有望用于肺动脉高压的预防和 治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供羟基红花黄色素A在制备治疗缺氧性肺动脉高压的保健 药物或功能食品中的新用途，所述的羟基红花黄色素A的结构如下所示：

本发明通过研究发现羟基红花黄色素A具有抑制缺氧引起的肺动脉高压大鼠 的肺动脉血管结构重建及右心室肥大的作用。
在本发明中，所述的药物由羟基红花黄色素A和医学上可接受的药物辅料组成， 其中，药物中羟基红花黄色素A的质量百分含量为0.1％-90％。所述药物可以是任 何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶 囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、 丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、 滴剂、贴剂及脂质体、各种缓控释新剂型、靶向制剂等。本发明的制剂，优选的是 口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；其 次是冻干粉针剂。
所述的冻干粉针剂可通过以下方法制备得到：
1)配液:将羟基红花黄色素A、维生素C以及甘露醇加入配液缸中，加入注 射用水搅拌至全部溶解，用氢氧化钠调节pH为6.5-7.5，补加注射用水至溶液体积 为羟基红花黄色素A质量的150-250倍；
2)脱色：向配好的药液中加入医用活性炭，室温搅拌，过滤脱碳，然后滤液 再用除菌微孔滤膜精滤，分装，半加塞；
3)冻干
a、预冻：将分装好的药液按1.1℃/分钟速度降温至-48℃，保温冷冻3小时；
b、升华：将预冻好的药液抽真空，至15Pa，然后在8小时内匀速缓慢升温至 -20℃，保温2小时，再在5小时内匀速升温至5℃；
c、干燥：将升华完毕阶段结束后的药液在4小时内匀速升温至40℃，保温干 燥3小时，即得。
其中，优选的，步骤(1)中维生素C的加入量为羟基红花黄色素A重量的1％， 甘露醇的加入量为羟基红花黄色素A重量的30％，用氢氧化钠调节pH为7.0，补 加注射用水至溶液体积为羟基红花黄色素A质量的200倍。
其中，优选的，所述的羟基红花黄色素A通过以下方法提取得到：
1)红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花适度粉碎，加去离子水，浸泡24h之 后40-60℃水浴加热0.5-2h，超声5-15分钟，过滤；滤渣再次用水浴加热0.5-2h， 超声5-15分钟，过滤，合并滤液；浓缩至相对密度为1.16～1.26，加乙醇，冷藏， 静置36-72小时，滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至相对密度为1.10～1.14，再加乙 醇使含醇量达75-85％(v/v)，冷藏，静置36-72小时，滤过，滤液回收乙醇，用 旋转蒸发仪浓缩得到相对密度为1.16～1.20的浸膏；
2)取红花浸膏上大孔树脂柱，依次用去离子水、10％(v/v)乙醇洗脱，流速 为2柱体积/h，收集10％(v/v)乙醇洗脱液，洗脱液浓缩，真空干燥，即得。
本发明的化合物其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、 稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进 行包衣。适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的 崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润 滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。可通 过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物 质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。
口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏 剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体 制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、 羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷 脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如 杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟 基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着 色剂。
对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载 体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解 在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。本发明 的组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体(各种固体制 剂、液体制剂、凝胶制剂、缓控释制剂等)，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、 山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨 酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐 或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖 醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、 硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、 琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类 材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
本发明的药物制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每 次1-20剂，如：1-20袋或粒或片，每剂0.1mg-10.0g。
附图说明
图1为红花水提液过大孔色谱后的100％水洗脱及10％乙醇洗脱物的HPLC图 谱(A.HSYA标准品；B-F:100％水不同洗脱时间收集的组分；G:10％乙醇洗脱物， 以HSYA标准品为参比)；
图2为经waters 2545高通量分离纯化系统制备的羟基红花黄色素A的高效液 相色谱图；
图3为正常组大鼠肺动脉血管的肺组织形态学检测结果；
图4为缺氧肺动脉高压大鼠肺动脉血管的肺组织形态学检测结果；
图5-7为用不同剂量(低、中、高)羟基红花黄色素A灌胃的大鼠在缺氧状态下 的肺动脉血管的肺组织形态学检测结果；
图8-9为红花注射液在制备过程中不加稳定剂经高温灭菌前后羟基红花黄色素 A的含量变化；
图10-11为红花注射液在制备过程中加入稳定剂经高温灭菌前后羟基红花黄色 素A的含量变化；
图12为同等浓度的原液做成红花注射液和冻干粉后HSYA的含量对比。
上图为红花注射液中HSYA的含量，下图为冻干粉剂中HSYA的含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随 着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。 本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术 方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围 内。
实施例1、羟基红花黄色素A的制备
1.1用中药材粉碎机粉碎干红花，称取干红花粉末700g，加水7000ml浸泡24h 之后通过50℃水浴锅水浴加热1h，50℃超声10分钟，用4层纱布过滤，总滤液抽 滤，得待用滤液1和滤渣。滤渣再次用50℃水浴加热1h，50℃超声10分钟，用4 层纱布过滤抽滤后得滤液2。将滤液1与滤液2合并，滤过，滤液浓缩至相对密度 为1.16～1.26，加乙醇使含醇量达70％v/v，冷藏，静置48小时，滤过，滤液回收 乙醇，并浓缩至相对密度为1.10～1.14，再加乙醇使含醇量达80％v/v，冷藏，静置 48小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.16～1.20，用旋转蒸发仪浓缩， 水浴锅温度不超过60℃。本制备方法可有效保护羟基红花黄色素A不分解变性。
1.2取直径为10cm长度为85cm的色谱柱洗净，最底层用洁净脱脂棉铺放，再 用醇、碱、酸处理后铺放洁净的石英砂，将D101型大孔树脂装柱并去离子水泡24h 发胀至饱和，去除色谱柱里的空气，在大孔树脂上层再铺上洁净脱脂棉和小玻璃珠。 然后用去离子水洗4倍柱体积后醇泡24h，再用醇洗至洗出液与水比例为1:5无白 色浑浊物为止，去离子水洗至无醇味后加入5％HCl浸泡4h，用5％HCl冲洗2倍柱 体积，水洗至中性，最后用2％NaOH浸泡4h后用2％NaOH冲洗2倍柱体积，去离 子水水洗至中性备用。
1.3取红花浸膏128g，上大孔树脂柱，依次用去离子水、10％(v/v)乙醇、20％ (v/v)乙醇和30％(v/v)乙醇洗脱，流速为2柱体积/h，接样瓶每瓶接样200ml 并分别进行编号，接样同时进行聚酰胺薄膜点板分析，在日光及紫外灯下观察斑点 情况，并进行合并。将合并后的样品分别浓缩，冷冻干燥成粉末，称量并标号放置 冰箱备用。
1.4精密称取HSYA标准品0.0010g，用蒸馏水配制成浓度为0.1mg/mL的溶剂， 过0.45μm微孔滤膜后在高效液相上进行梯度洗脱。设置0.5％磷酸水为A，甲醇为 B，洗脱程序为0～60min：10％B～100％B；60～70min：100％B。流速为1ml/min,在 以上设置的基础上通过安捷伦1200二极管阵列检测器进行全波长扫描，选取3D图 及220nm、360nm、403nm波长观察出峰情况，相对调整，最终确立最佳HPLC条 件Agilent Ecsipse XDB-C18(4.6×150mm，5μm)，甲醇-0.5％磷酸水(23:77)为流 动相，流速1ml/min，波长403nm，进样量10μl。以HSYA标准品为参比，将100％ 水洗脱、10％(v/v)乙醇洗脱物及羟基红花黄色素A标准品在相同色谱条件下进行 HPLC分析，结果见图1。最终确定10％(v/v)乙醇洗脱物为收集目标，经waters 2545 高通量分离纯化系统制备纯的羟基红花黄色素A纯度达97％，高效液相色谱图如图 2所示。
实施例2：羟基红花黄色素A对缺氧大鼠肺小动脉显微结构的影响及抑制肺动 脉血管结构重建及右心室肥大的影响
体重(160±109g)的雄性Wistar大鼠30只(哈尔滨医科大学大庆校区实验动物中 心，提供)，随机分成4组：对照组(control)、缺氧组、羟基红花黄色素A+缺氧组。 将缺氧组，缺氧给药组大鼠置于常压低氧气的有机玻璃容器箱内，通入氮气，与空 气混匀，用自动测氧仪控制氧气浓度为(10±0.5)％，温度传感器控制电路可维持 舱内温度始终恒定，用无水氯化钙吸收箱内的水分保持其湿度，用碳酸氢钠吸收箱 内的二氧化碳。每天给大鼠采用灌胃的方法给药，放入缺氧箱连续缺氧24h，缺氧 9天。
羟基红花黄色素A+缺氧组每天灌胃羟基红花黄色素A一次，根据给药剂量 为50mg/kg、70mg/kg、100mg/kg药物浓度为4.83mg/ml计算出大鼠给药剂量。对 照组、缺氧组每天给予同计量标准的生理盐水。记录每天不同时段的氧分压值。选 取给药后的氧分压，2小时后的氧分压，4小时后的氧分压，8小时后的氧分压，以 及次日给药前的氧分压，实验结果如表1所示。
表1不同时段氧分压值


大鼠低氧试验结束后，腹腔注射10％水合氯醛对其麻醉，完全麻醉后，固定于 动物手术台上，打开胸腔，取2侧较大的肺叶，放入10％的甲醛缓冲液中冲洗，洗 净血液，待以固定。
固定液的配制：精密称量磷酸二氢钾0.2g，十二水磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.2g， 氯化钾0.2g，溶于1000ml的烧杯，加500ml去离子水，放在搅拌器上搅拌均匀， 加100ml甲醛溶液，移液到10000ml容量瓶定容。最后，用多参数PH测试仪，调 节PH到7.4。
把分离好的2片肺叶用缓冲液洗净，放入底部垫有脱脂棉的广口瓶中，倒入缓 冲液(应该使用足量的固定液，多比少好，一般应为组织体积的5-10倍)，在上面 也盖上脱脂棉，使组织充分浸入缓冲液。组织固定24小时待用。
取出固定好的肺组织，用清水反复冲洗几次，再用刀片延纵面切3cm厚度的组 织，并转入包埋盒，用2B铅笔标记好编号，待所有的组织处理完后，放入脱水篮 中，运用Leica TP1020型全自动组织脱水机(德国徕卡仪器公司)使组织经过70％、 75％、80％、85％、90％、95％，以至无水酒精，两个二甲苯缸的脱水程序，即可达 到脱水的要求。全程脱水14小时。
打开包埋中心及工作灯，调节石蜡流量开关，预热包埋框及镊子。选择合适的 包埋盒，放入少量的蜡，用镊子夹取组织块，使指定面埋入蜡中，并用镊子轻轻按 压，加上该组织的塑料框格，再加合适的蜡，待蜡稍凝后将其移到冷冻台上使其加 速凝固。待全部包埋结束后，将蜡块从包埋框中取出，修整蜡块旁边多余的石蜡， 按序号排列，与取材列表一一核对，数据准确后放入冰盒内待用。所用仪器为Leica  EG 1150C包埋机(德国徕卡仪器公司)。
将提前修整好的蜡块固定于切片机头上的夹座内，调整到稍离开切片能够切到 的位置上，注意蜡块组织切面与切片刀口要垂直平行。再调整蜡块组织切面恰好与 刀口接触，旋紧刀架，固定好机头。调整切片厚度为4um，实践中可用右手转动切 片机手轮，左手用毛笔托起蜡片，协调地进行切片操作。切下的切片带，一端用镊 子轻轻拉起，应尽可能将切片带拉直展开，用毛笔将切片带从刀口向上挑起，拉下 切片带，然后轻拖铺于恒温水面上。
将数张切片，用镊子夹住蜡片的一边并提起，铺于恒温水中，(光亮的一面朝 下)立即用毛笔轻轻拉展以切片无皱褶为最好。如有皱褶时用镊子细心地逐个轻轻 拨开，注意不可拨破组织。然后分开每张切片，选取其中最完整的，没有皱褶的切 片。待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中以涂有蛋白甘油面 轻靠切片，并用毛笔将切片一边拨于玻片上，随即将玻片直立提起，趁玻片上仍有 少量水份时用毛笔，拨正切片位置。用铅笔在玻片一端的毛玻璃上写上组织编号待 用。
将组织片分别经过二甲苯I(15min)、二甲苯II(10min)、无水酒精I(1-2min)、无 水酒精II(1-2min)、95％酒精(1-2min)、80％酒精(1-2min)，脱蜡完毕，用自来水冲 洗10min。
用蒸馏水冲洗几次，放入苏木素液染核(15min)，自来水再次冲洗数次，用1％ 盐酸酒精分化(1min)，流水冲洗(1min)，碳酸锂饱和水溶液反蓝(1min)，自来水冲洗 (1min)，复染0.5％伊红水溶液(2-5min)，自来水洗分化伊红(2min)。
分别放入95％酒精I，95％酒精II，无水酒精I，无水酒精II，各洗2min，再 放入二甲苯I，二甲苯II，各5min使其透明。滴加中性树胶，用盖玻片封固，注意 不要有气泡。
肺组织血管HE染色显示，对照组大鼠肺小动脉内皮细胞连续性很好，管壁薄， 细胞分布很均匀，管腔大而且厚薄一样；缺氧组大鼠肺小动脉内皮细胞连续性受到 破坏，细胞有肿胀变性、坏死甚至脱落，血管中膜平滑肌细胞明显增生，管壁厚度 大幅度增加，管腔面积显著变小；与缺氧组相比，缺氧给药组大鼠肺小动脉内皮细 胞连续性较好、管壁厚度有所减小、管腔面积也增大。光学显微镜检测，并对肺小 动脉血管壁厚度进行统计学分析。每组取3只大鼠，每只大鼠取外径在50-200mm的 20个肺肌型小动脉，测其内外径，用下面公式估算肺血管壁厚度：
血管壁厚度％＝(血管外径-血管内径)/血管外径x100％
与对照组相比，缺氧组大鼠肺小动脉血管壁明显增厚，管壁厚度由25.3％±6.7％ 增加至56.3％±7.3％(P<0.01)；羟基红花花色素A依赖性的降低了缺氧引起的肺血 管壁增厚，缺氧给药组管壁厚度由缺氧组56.3％±7.3％降至到35％±6.5％(P<0.01)。 这些结果表明缺氧可诱发明显的肺血管构型重建，羟基红花黄色素A明显抑制了缺 氧引起的肺动脉高压大鼠的肺血管构型重建，结果如图3-7所示。
实施实3：羟基红花黄色素A对缺氧大鼠肺动脉平均压力的影响及右心室肥厚 指数检测
各组大鼠常规给予食物和水，保持温度(18℃-22℃)和湿度(50％-70％)，按低、 中、高三个剂量组(50mg/kg，75mg/kg、100mg/kg)给药3天后缺氧饲养9天。缺氧 模型完成后，将大鼠用3％戊巴比妥(40mg/kg)经腹腔内注射麻醉，切开颈部皮肤， 分离右侧颈外静脉和颈总动脉。将微型聚乙烯导管插入右颈总动脉测量体循环压 (SAP)，将另一聚乙烯导管自右颈外静脉插入肺动脉测量肺动脉压(PAP)，由压力传 感器连至多导生理记录仪记录数据。经以上检测后将大鼠过量麻醉处死，取出整个 心脏，分离右心室(RV)和左心室+室间隔(LV十S)，分别称量RV和LV+S的重量， RV/(LV+s)即为右心室肥厚指数(RVI)。
实验结果表明与对照组相比，缺氧组大鼠平均肺动脉压从17.8±1.2mmHg明显 升高到32.7±5.7mmHg(P<0.01；与缺氧组相比，羟基红花黄色素A+缺氧组剂量组平 均肺动脉压明显降低，平均肺动脉压为25.8±5.4mmHg(P<0.05)，有统计学意义。平 均体循环压在各组间也无明显差异与对照组相比，MCT组右心室肥厚指数由 34.1％±2.1％明显增加到51.3％±8.8％(P<0.01)；羟基红花黄色素A以剂量依赖性方式 明显降低了缺氧引起的右心室肥厚指数的增加，HSYA+缺氧组降至45.2％± 5.3％(P<0.05)。
实施例4：红花注射液工艺流程考察及稳定性研究
1、2010药典红花注射液的制备工艺
取红花500g，加水煎煮三次，第一次1小时，第二次50分钟，第三次30分钟， 合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.161-26，加乙醇使含乙醇量达70％，冷藏， 静置48小时，滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至相对密度为1.10-1.14，再加乙醇使含 醇量达80％，冷藏，静置48小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.16-1.20， 加10倍量的水，冷藏，静置16-24小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.02-1.04，用 50％氢氧化钠溶液调节PH值7.5-8.0，加注射用水使成1000ml，滤过，获得原料液， 灌封，灭菌，即得。
2、灭菌前后羟基红花黄色素A的含量考察
取原料药液100ml，加入稳定剂，测量加入稳定剂(如维生素C)后的羟基红花 黄色素A的含量。取100ml原料液不加入稳定剂，测量此时的羟基红花黄色素A的 含量。对有稳定剂与无稳定剂的红花注射液灌封。两者在相同的环境下进行灭菌， 灭菌温度为103℃～108℃，灭菌时间为25-30min。观察灭菌后的红花注射液的性状 变化，高效液相法检测灭菌后的羟基红花黄色素A的含量。(高效液相基本色谱条 件：色谱柱XDB-C18,150×4.6mm,5μm coulmn；乙腈，5％磷酸水为流动相(乙腈： 5％磷酸水为1:9)；柱温25℃，流速v＝1.0ml/min，进样量为10微升)观察颜色和 PH值的变化。
3、灌装前HSYA的含量测定
取原料液20ml，置于4℃的冰箱储藏。在0天，2天，3天，4天，5天分别取2ml 原料液，置于5ml的容量瓶中，加注射用水至刻度。再从容量瓶中取2ml，高效液相 法检测HSYA的含量。高效液相基本色谱条件：色谱柱XDB-C18,150×4.6mm,5μm coulmn；乙腈，5％磷酸水为流动相(乙腈：5％磷酸水为1:9)；柱温25℃，流速 v＝1.0ml/min，进样量为10微升，并观察颜色变化。
4、稳定剂考察
有稳定剂和无稳定剂的红花注射液成品，各取8只放入综合药品稳定性试验箱 的光照实验箱。其中4支放于光照处，另外4支放于暗处。在5小时，24小时，50小 时，70小时分别吸取药液2ml，置于5ml的容量瓶中，加注射用水至刻度。从容量瓶 中取2ml，高效液相法检测羟基红花黄色素A的含量，并观察颜色变化。结果如图 8-11所示。
红花注射液在灭菌前和灭菌后羟基红花黄色素A的含量有很大程度的改变，无 稳定剂和有稳定剂的红花注射液灭菌前后的颜色变化、PH值、羟基红花黄色素A 峰面积以及灭菌前后峰面积的减少百分率，如表2。制成红花注射液原料液后，及 时加入稳定剂(如维生素C)及时灌封。灌封过程应该排除安瓿内的空气或充入惰 性气体。灭菌后，成品应该密封，低温，暗处储存。红花注射液的主要活性成分羟 基红花黄色素A极易受到环境影响，因此，红花做成注射液的制备必须严格控制温 度，可考虑做成冻干粉针剂，以避免高温灭菌过程。
表2有稳定剂和无稳定剂的灭菌前后的变化


实施例5：羟基红花黄色素A冻干粉针的制备及其稳定性考察
1、处方：羟基红花黄色素A 5g、赋形剂甘露醇1.5g、稳定剂维生素C 0.05g, 加注射用水至1000ml。
2、冻干骨架剂种类的筛选：
常见的冻干稳定剂有：柠檬酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、维 生素C、乙二胺四乙酸二钠等。根据我们前期对红花注射液稳定性的考察结果，加 入羟基红花黄色素A重量的1％的稳定剂维生素C可防止红花水提液中有效成分羟 基红花黄色素A的分解，对其制成粉针剂有较好的稳定作用。鉴于此，本发明优 选以1％的维生素C作为羟基红花黄色素A冻干粉针剂的稳定剂。
常见的冻干支持剂有：甘露醇、葡萄糖、乳糖、氯化钠等，对上述支持剂进行 了筛选。
取羟基红花黄色素A 5g，加入维生素C 0.05g，加入羟基红花黄色素A重量的 3％的不同支持剂，待充分溶解后加活性炭处理，微孔滤膜过滤，进行冻干。冻干效 果见表3。
表3冻干支持剂种类的筛选


由表2可见，以冻干粉针剂的成型性、水溶性、澄明度以及在冻干过程中有无 喷瓶现象发生为依据，选择甘露醇为冻干支持剂。
2、冻干支持剂的用量考察：
取羟基红花黄色素A 5g，加入维生素C 0.05g，不同比例量的甘露醇支持剂， 待充分溶解后加活性炭处理，微孔滤膜过滤，进行冻干。冻干效果见表4，可见以 3％(w/w)的甘露醇作为冻干支持剂效果最好。
表4冻干支持剂用量考察

3、除菌方法：
湿热灭菌法，干热灭菌法或加压灭菌法都会造成羟基红花黄色素A的结构破 坏，不但降低药物的含量和药效，可能还会引起不良反应，所以我们采用孔径为0.22 μm的微孔滤膜，在常温下通过物理过筛作用，对药液进行过滤灭菌，以避免红花 有效成分的破坏和损失。
4.羟基红花黄色素A冻干粉制备方法：
4.1配液：将羟基红花黄色素A 5g、赋形剂甘露醇1.5g、稳定剂维生素C 0.05g 加入配液缸中，加入适量注射用水搅拌至全部溶解，用氢氧化钠调节pH为7.0，补 加注射用水至溶液体积为1000毫升；
4.2脱色：向配好的药液中加入药液质量1.0-3.0％的医用活性炭，室温搅拌 15分钟，过滤脱碳，然后滤液再用0.22um除菌微孔滤膜精滤，滤液测PH值、含 量，分装半加塞，
4.3冻干
a、预冻：将分装好的药液按1.1℃/分钟速度降温至-48℃，保温冷冻3小时。
b、升华：将预冻好的药液抽真空，至15Pa，然后在8小时内匀速缓慢升温至 -20℃，保温2小时，再在5小时内匀速升温至5℃。
c、干燥：将升华完毕阶段结束后的药液在4小时内匀速升温至40℃，保温干 燥3小时。
同等浓度的原液做成红花注射液(参照药典2010版)和冻干粉后HSYA的含 量对比如图12所示。
实施例6：羟基红花黄色素A常用药物制剂的制备
本发明所述羟基红花黄色素A和药物可接受的载体，或与其他药物配伍，混合 以制剂学常规技术制备成片剂，胶囊，颗粒，口服液等制剂。