防过敏霜剂.pdf

本发明涉及一种防过敏霜剂，包括：第一组分，第一组分包括鱼腥草、石菖蒲、防风、黄芪、枇杷叶、苦参、三白草、黄柏皮、积雪草、天南星和紫菀；和第二组分，第二组分包括甘油、辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯、向日葵籽油、丁二醇、丁二醇二辛酸酯或丁二醇二癸酸酯、澳洲坚果籽油、聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯、PEG-4橄榄油酸酯、白芒花籽油、二甲硅油、鲸蜡醇乙基己酸脂、氧化玉米油、鲸蜡硬脂醇、醋酸生育酚、丙烯酸甘油酯或丙烯酸共聚物、硬脂醇甘草亭酸酯、氯化钠、丙烯酸钠或丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、藻胶、异十六烷、辛乙二醇、聚山梨醇酯80、尿囊素、辛酰氧肟酸、丙二醇、EDTA二钠和神经酰胺3，在防过敏霜剂中，第一组分和第二组分以5:5至7:3范围内的重量比混合。根据本发明，在防过敏霜剂应用于患DNCB诱导的过敏性皮炎的小鼠时，血液免疫球蛋白E减少，同时抑制了肥大细胞产生的释放组胺的量，从而使提供对过敏性皮炎具有治疗效果的防过敏霜剂成为可能。

权利要求书
1.  一种防过敏霜剂，包括：
第一组分，所述第一组分包括鱼腥草、石菖蒲、防风、黄芪、枇杷叶、苦参、三白草、 黄柏皮、积雪草、天南星和紫菀；和
第二组分，所述第二组分包括甘油、辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯、向日葵籽油、丁二 醇、丁二醇二辛酸酯或丁二醇二癸酸酯、澳洲坚果籽油、聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯、PEG-4 橄榄油酸酯、白芒花籽油、二甲硅油、鲸蜡醇乙基己酸脂、氧化玉米油、鲸蜡硬脂醇、醋酸 生育酚、丙烯酸甘油酯或丙烯酸共聚物、硬脂醇甘草亭酸酯、氯化钠、丙烯酸钠或丙烯酰二 甲基牛磺酸钠共聚物、藻胶、异十六烷、辛乙二醇、聚山梨醇酯80、尿囊素、辛酰氧肟酸、 丙二醇、EDTA二钠和神经酰胺3，
其中所述第一组分和所述第二组分以5:5至7:3范围内的重量比混合。

2.  根据权利要求1所述的防过敏霜剂，其中所述第一组分包括55至65重量份的蒸馏 水、7至9重量份的鱼腥草提取物、4至6重量份的石菖蒲根或茎提取物、3至5重量份的 防风提取物、2至4重量份的黄芪提取物、5至7重量份的枇杷叶提取物、2至4重量份的 苦参提取物、4至6重量份的三白草提取物、3至5重量份的黄柏皮提取物、0.5至1.5重量 份的积雪草提取物、0.5至1.5重量份的天南星提取物和0.5至1.5重量份的紫菀提取物。

3.  根据权利要求1所述的防过敏霜剂，其中所述第二组分包括20至25重量份的甘油、 10至15重量份的辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯、10至15重量份的向日葵籽油、7至12重 量份的丁二醇、7至12重量份的丁二醇二辛酸酯或丁二醇二癸酸酯、2至7重量份的澳洲坚 果籽油、1.5至3.5重量份的聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯、1.5至3.5重量份的PEG-4橄榄 油酸酯、1.5至3.5重量份的白芒花籽油、1.5至3.5重量份的二甲硅油、1.5至3.5重量份的 鲸蜡醇乙基己酸脂、1.4至3.4重量份的氧化玉米油、0.7至2.3重量份的鲸蜡硬脂醇、0.7至 1.5重量份的醋酸生育酚、0.7至1.5重量份的丙烯酸甘油酯或丙烯酸共聚物、0.7至1.5重量 份的硬脂醇甘草亭酸酯、0.7至1.5重量份的氯化钠、0.7至1.5重量份的丙烯酸钠或丙烯酰 二甲基牛磺酸钠共聚物、0.7至1.5重量份的藻胶、0.6至1.2重量份的异十六烷、0.6至1.0 重量份的辛乙二醇、0.2至0.6重量份的聚山梨醇酯80、0.25重量份的尿囊素、0.25重量份 的辛酰氧肟酸、0.25重量份的丙二醇、0.17重量份的EDTA二钠和0.17重量份的神经酰胺3。

说明书防过敏霜剂
技术领域
本发明涉及一种防过敏霜剂，在应用于患DNCB诱导的过敏性皮炎的小鼠时，防过敏 霜剂降低了血液免疫球蛋白E的水平，同时抑制了肥大细胞产生的释放组胺的量，从而对过 敏性皮炎具有治疗效果。
背景技术
本发明涉及一种防过敏霜剂，在应用于患DNCB诱导的过敏性皮炎的小鼠时，防过敏 霜剂降低血液免疫球蛋白E的水平，同时抑制了肥大细胞产生的释放组胺的量，从而对过敏 性皮炎具有治疗效果。
最近，在韩国患有过敏性皮炎的婴儿和青少年患者的数量迅速增长。
根据2008年公共卫生和营养研究报告，年龄在1至5岁之间的儿童中的19.2％(即约 五个儿童中的一个)患有过敏性皮炎(NHNS，2009)。
过敏性皮炎是特征为发痒症和炎症作为主要症状的慢性炎症性皮肤病。已知的过敏性皮 炎的发作机制是：在过敏原(引起过敏的物质)从外部进入体内时，引起血液中B细胞中免 疫球蛋白E的产生，然后免疫球蛋白E被输送至肥大细胞，与嗜碱细胞(白细胞)结合， 以形成和存储组胺，且在人重复地暴露于过敏原时，因为组胺被释放，所以出现过敏症状。
引起过敏性皮炎的原因还没有清楚地确定，但是似乎是由于遗传因素、免疫因素和环境 因素的组合作用而产生的。
与搔抓行为有关的发痒症的治疗被认为是治疗过敏性皮炎的有效方法。
显示出抗组胺治疗不足以抑制患有过敏性皮炎的患者的发痒症，且由于甾类的常见的副 作用，甾类的应用不适合用于长期使用(参见Jiang等，2009；Yun等，2008；Koblenzer， 1999；Mihara等，2004)。
作为本发明的基础的技术公开于2013年3月27日公布的韩国公开专利公报 10-2013-0030491号(“Crude drug composition for treating atopic dermatitis and acne without side  effects”)和2012年6月7日公布的韩国公开专利公报10-2012-0058202号(“Antibacterial  composition and a cosmetic composition for improving skin condition”)中。
发明内容
技术问题
用于解决以上描述的问题的本发明的目的是提供一种防过敏霜剂，在应用于患DNCB 诱导的过敏性皮炎的小鼠时，防过敏霜剂降低血液免疫球蛋白E的水平，同时抑制了肥大细 胞产生的释放组胺的量，从而对过敏性皮炎具有治疗效果。
为了检验NJY Life Science Co.,Ltd提供的防过敏霜剂对过敏性皮炎的治疗效果，该研究 在患DNCB诱导的BALB/c过敏性皮炎的小鼠中进行，以检验防过敏效力。
利用20只BALB/c小鼠按每组1只划分并完全随机分配为过敏性皮炎诱导对照组及防 过敏霜剂处理组。
在将防过敏霜剂以每天两次应用于患有严重过敏性皮炎的小鼠6天时，已经观察到皮肤 恢复至正常状态，具有干净和光滑的表面，没有角质层。并且，与DNCB诱导的过敏对照 组相比，防过敏霜剂处理组中血液中的免疫球蛋白E和组胺的水平分别显著降低57.80％和 59.41％dml(p<0.05)。还已经验证了，在与具有严重过敏性皮炎的处理组相比时，使用防过 敏霜剂处理的小鼠具有厚度恒定且表面光滑的表皮，且具有在更恒定的方向上形成的结蹄组 织，表明小鼠恢复得与正常组类似。
技术方案
为了实现以上描述的目的，本发明包括第一组分，所述第一组分包括鱼腥草(Houttuynia  cordata)、石菖蒲(Arorus gramineus Soland)、防风(Saposhnikivia divaricata Schisck)、黄芪 (Astragalus membranaceus)、枇杷叶(Eriobotrya japonica L)、苦参(Sophora flavescens Ait.)、 三白草(Saurururs chinensis baill)、黄柏(Phellodendron)皮、积雪草(Centella asiatica)、 天南星(Arisaematis Rhizoma)和紫菀(Aster yomena)；和第二组分，所述第二组分包括甘 油、辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯、向日葵籽油、丁二醇、丁二醇二辛酸酯或丁二醇二癸酸 酯、澳洲坚果籽油、聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯、PEG-4橄榄油酸酯、白芒花籽油、二甲 硅油、鲸蜡醇乙基己酸脂、氧化玉米油、鲸蜡硬脂醇、醋酸生育酚、丙烯酸甘油酯或丙烯酸 共聚物、硬脂醇甘草亭酸酯、氯化钠、丙烯酸钠或丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、藻胶、异 十六烷、辛乙二醇、聚山梨醇酯80、尿囊素、辛酰氧肟酸、丙二醇、EDTA二钠和神经酰胺 3，其中所述第一组分和所述第二组分以5:5至7:3范围内的重量比混合。
另外，所述第一组分包括55至65重量份的蒸馏水、7至9重量份的鱼腥草提取物、4 至6重量份的石菖蒲根或茎提取物、3至5重量份的防风提取物、2至4重量份的黄芪提取 物、5至7重量份的枇杷叶提取物、2至4重量份的苦参提取物、4至6重量份的三白草提 取物、3至5重量份的黄柏皮提取物、1至3重量份的积雪草提取物、0.5至1.5重量份的天 南星提取物和0.5至1.5重量份的紫菀提取物。
另外，所述第二组分包括8至10重量份的甘油、辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯、4至6 重量份的向日葵籽油、3至5重量份的丁二醇、3至5重量份的丁二醇二辛酸酯或丁二醇二 癸酸酯、1至3重量份的澳洲坚果籽油、0.5至1.5重量份的聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯、 0.5至1.5重量份的PEG-4橄榄油酸酯、0.5至1.5重量份的白芒花籽油、0.5至1.5重量份的 二甲硅油、0.5至1.5重量份的鲸蜡醇乙基己酸脂、0.4至1.4重量份的氧化玉米油、0.3至 1.3重量份的鲸蜡硬脂醇、0.3至0.7重量份的醋酸生育酚、0.3至0.7重量份的丙烯酸甘油酯 或丙烯酸共聚物、0.3至0.7重量份的硬脂醇甘草亭酸酯、0.3至0.7重量份的氯化钠、0.3至 0.7重量份的丙烯酸钠或丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、0.3至0.7重量份的藻胶、0.2至0.4 重量份的异十六烷、0.2至0.4重量份的辛乙二醇、0.1至0.3重量份的聚山梨醇酯80、0.1 重量份的尿囊素、0.1重量份的辛酰氧肟酸、0.1重量份的丙二醇、0.05重量份的EDTA二钠 和0.05重量份的神经酰胺3。
有益效果
根据以上描述的本发明，在防过敏霜剂应用于患DNCB诱导的过敏性皮炎的小鼠时， 血液免疫球蛋白E减少，同时抑制了肥大细胞产生的释放组胺的量，从而使提供对过敏性皮 炎具有治疗效果的防过敏霜剂成为可能。
附图说明
图1a至1d为示出根据本发明的优选示例的防过敏霜剂在患DNCB诱导的过敏性皮炎 的小鼠中的治疗效果的图像。
图2a至2c为示出用皮肤显微镜比较根据本发明实施例的优选示例的防过敏霜剂在患 DNCB诱导的过敏性皮炎的小鼠中的治疗效果的图像。
具体实施方式
概要
为了检验NJY Life Science Co.,Ltd提供的防过敏霜剂对过敏性皮炎的治疗效果，该研究 在患DNCB诱导的BALB/c过敏性皮炎的小鼠中进行，以检验防过敏效力。
利用20只BALB/c小鼠按每组1只划分并完全随机分配为过敏性皮炎诱导对照组及防 过敏霜剂处理组。
在将防过敏霜剂以每天两次应用于患有严重过敏性皮炎的小鼠6天时，已经观察到皮肤 恢复至正常状态，具有干净和光滑的表面，没有角质层。并且，与DNCB诱导的过敏对照 组相比，防过敏霜剂处理组中血液中的免疫球蛋白E和组胺的水平分别显著降低57.80％和 59.41％dml(p<0.05)。还已经验证了，在与具有严重过敏性皮炎的处理组相比时，使用防过 敏霜剂处理的小鼠具有厚度恒定且表面光滑的表皮，且具有在更恒定的方向上形成的结蹄组 织，表明小鼠恢复得与正常组类似。
发明方式
引言
最近，在韩国患有过敏性皮炎的婴儿和青少年患者的数量迅速增长。
根据2008年公共卫生和营养研究报告，年龄在1至5岁之间的儿童中的19.2％(即约 五个儿童中的一个)患有过敏性皮炎(NHNS，2009)。
过敏性皮炎是特征为发痒症和炎症作为主要症状的慢性炎症性皮肤病。已知的过敏性皮 炎的发作机制是：在过敏原(引起过敏的物质)从外部进入体内时，引起血液中B细胞中免 疫球蛋白E的产生，然后免疫球蛋白E被输送至肥大细胞，与嗜碱细胞(白细胞)结合， 以形成和存储组胺，且在人重复地暴露于过敏原时，因为组胺被释放，所以出现过敏症状。
引起过敏性皮炎的原因还没有清楚地确定，但是似乎是由于遗传因素、免疫因素和环境 因素的组合作用而产生的。
与搔抓行为有关的发痒症的治疗被认为是治疗过敏性皮炎的有效方法。
显示出抗组胺治疗不足以抑制患有过敏性皮炎的患者的发痒症，且由于甾类的常见的副 作用，甾类的应用不适合用于长期使用(参见Jiang等，2009；Yun等，2008；Koblenzer， 1999；Mihara等，2004)。
用于从天然物质开发防过敏材料的研究正在进行，且已经报道了黄芩的热水提取物、杜 仲提取物、仙人掌提取物、泡菜提取物、枇杷叶提取物和三白草提取物具有防过敏效果(参 见Kwon等，011；Choi等，2010；Lee等，2008；Shon和Nam，2007；Kim等，2007；Kim 和Park，2006)。
传统上，已知植物(例如鱼腥草、石菖蒲、防风、黄芪、枇杷叶、苦参和三白草)具有 各种药理效果，包括抗炎。
已经已知鱼腥草槲皮素、石菖蒲细辛脑、防风香豆素、刺芒柄花素、黄芪的黄芪甙、萜 类、苦杏仁苷、枇杷叶皂苷、槲皮素、三白草槲皮甙和苦参类黄酮作为主要药理组分(参见 Jung和Cho，2010；Ferreres等，2009；Jeong等，2009；Kwon和Shin 2009；Kim等，2005； Ro等，1998)，且NJY Life Science Co.,Ltd.通过将这些植物提取物混合而制备防过敏霜剂。
为了检验NJY Life Science Co.,Ltd提供的防过敏霜剂对过敏性皮炎的治疗效果，该研究 在患DNCB诱导的BALB/c过敏性皮炎的小鼠中进行，以检验防过敏效力。
材料和方法
实验材料
防过敏霜剂由NJY Life Science Co.,Ltd.提供。防过敏霜剂由第一组分和第二组分组成。
第一组分包括鱼腥草、石菖蒲、防风、黄芪、枇杷叶、苦参、三白草、黄柏皮、积雪草、 天南星和紫菀。
第一组分包括55至65重量份的蒸馏水、7至9重量份的鱼腥草提取物、4至6重量份 的石菖蒲根或茎提取物、3至5重量份的防风提取物、2至4重量份的黄芪提取物、5至7 重量份的枇杷叶提取物、2至4重量份的苦参提取物、4至6重量份的三白草提取物、3至5 重量份的黄柏皮提取物、1至3重量份的积雪草提取物、0.5至1.5重量份的天南星提取物和 0.5至1.5重量份的紫菀提取物。
第二组分包括甘油、辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯、向日葵籽油、丁二醇、丁二醇二辛 酸酯或丁二醇二癸酸酯、澳洲坚果籽油、聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯、PEG-4橄榄油酸酯、 白芒花籽油、二甲硅油、鲸蜡醇乙基己酸脂、氧化玉米油、鲸蜡硬脂醇、醋酸生育酚、丙烯 酸甘油酯或丙烯酸共聚物、硬脂醇甘草亭酸酯、氯化钠、丙烯酸钠或丙烯酰二甲基牛磺酸钠 共聚物、藻胶、异十六烷、辛乙二醇、聚山梨醇酯80、尿囊素、辛酰氧肟酸、丙二醇、EDTA 二钠和神经酰胺3。
第二组分包括20至25重量份的甘油、10至15重量份的辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯、 10至15重量份的向日葵籽油、7至12重量份的丁二醇、7至12重量份的丁二醇二辛酸酯 或丁二醇二癸酸酯、2至7重量份的澳洲坚果籽油、1.5至3.5重量份的聚甘油-3甲基葡糖二 硬脂酸酯、1.5至3.5重量份的PEG-4橄榄油酸酯、1.5至3.5重量份的白芒花籽油、1.5至 3.5重量份的二甲硅油、1.5至3.5重量份的鲸蜡醇乙基己酸脂、1.4至3.4重量份的氧化玉米 油、0.7至2.3重量份的鲸蜡硬脂醇、0.7至1.5重量份的醋酸生育酚、0.7至1.5重量份的丙 烯酸甘油酯或丙烯酸共聚物、0.7至1.5重量份的硬脂醇甘草亭酸酯、0.7至1.5重量份的氯 化钠、0.7至1.5重量份的丙烯酸钠或丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、0.7至1.5重量份的藻 胶、0.6至1.2重量份的异十六烷、0.6至1.0重量份的辛乙二醇、0.2至0.6重量份的聚山梨 醇酯80、0.25重量份的尿囊素、0.25重量份的辛酰氧肟酸、0.25重量份的丙二醇、0.17重 量份的EDTA二钠和0.17重量份的神经酰胺3。
另外，第一组分和第二组分以5:5至7:3范围内的重量比混合。
并且，防过敏霜剂通过将制备的液态第一组分干燥和纳米粉碎，然后将粉碎至纳米尺寸 的第一组分与液态第二组分以5:5至7:3范围内的重量比混合而制备。
另外，第一组分中的天南星根的顶部含有有毒的生物碱，且天南星的根、叶和茎还含有 强毒素，由此优选在通过将天南星浸泡在溶于水中的明矾中一个月，接着在生姜汁中沸腾而 除去毒性之后使用。
用于粉碎干燥的第一组分的纳米粉碎机是已知技术，由此省略对纳米粉碎机的详细说 明。
试验动物
包括动物的所有实验规程遵守European Experimental Animal Handling License (SCT-w94058)提供的准则，且在得到江原国立大学的动物实验伦理委员会的批准之后进 行。
从DBL Co.,Ltd.购买20只5周龄的无特定病原体动物雄性BALB/c小鼠，且在使小鼠 适应环境且给小鼠喂常规颗粒饮食一周之后进行实验。
关于实验处理，划分为过敏性皮炎诱导的对照组和防过敏霜剂处理组并完全随机分配。 对于每个处理组以10只小鼠按个体反复使用。
用于实验动物的饲养室的温度保持在20±2℃，相对湿度为60±5％，且将照明调节至12 小时光照周期。
特别地，考虑到小白鼠作为夜行动物的生理特征，使光照周期变暗(09:00-21:00)，以 便最小化由于实验规程而产生的小白鼠应激。
关于实验饮食，基于AIN-76的纯化饮食被制备且然后被粒化。
纯化饮食的构成由20.0％酪蛋白、15.0％玉米淀粉、50.0％糖、5.0％a-纤维素、5.0％玉 米油、3.5％复合矿物质、1.0％复合维生素、0.2％酒石酸氢胆碱、和0.3％DL-甲硫氨酸组成， 且饮食能量和蛋白质含量以相同方式调节。
实验饲料和水的供应没有限制，且其他饲养的管理根据江原大学的常规方法进行。
皮炎诱导和样品处理
将BALB/c小鼠的背部上的毛发完全除去，且将小鼠放置24小时，以便可以治愈其上 的任何微小的皮肤损伤。
将200μL 2.5％2,4-二硝基氯苯(DNCB)溶液(Sigm,St.Louis,MO,USA)(通过将丙酮 和橄榄油以3:1的比例混合而制备的免疫破坏物质)涂覆于小鼠的背部上，以诱导免疫应答。
3天之后且继续，3天一次将150μL 1.0％DNCB溶液涂覆于小鼠的背部，以诱导过敏 性皮炎。
因为痂皮在将NCB溶液涂覆于小鼠的背部上2次之后2天开始形成，搔抓行为变得更 严重，且因为背部上的痂皮变得脱落，诱导过敏性皮炎症状。
第四次涂覆之后，过敏性皮炎症状变得更严重，且从那以后将防过敏霜剂充分地涂覆至 具有炎症的区域。
将防过敏霜剂每日涂覆2次(在11:00和17:00)。
在涂覆防过敏霜剂期间，3天一次(在10:00)将150μL 1.0％DNCB溶液涂覆至小鼠的 背部，以避免由于自然愈合而产生的误差。
收集血液和皮肤组织
在实验最后一天使用乙醚将小鼠轻轻麻醉。使用血清分离管(SST)从小鼠的心脏收集 1.0mL血液，将血液在室温下放置约20分钟，以允许血液凝固。
将凝固的血液在3,000rpm下离心10分钟，以分离血清，然后，将血清在保持在-196℃ 的液氮中迅速冷冻，且在-20℃下存储。
通过颈椎脱位立即使小鼠安乐死，且在将背部上的皮肤组织切割成1x 2cm2的尺寸之 后，收集背部上的皮肤组织。
血液免疫球蛋白E的测量
血液中免疫球蛋白E的浓度通过使用小鼠免疫球蛋白E ELISA试剂盒(Shibayagi Co., Ltd，Gunma，日本)且如以下描述地反应且与标准溶液的吸光度比较而计算。
将孔板和所有试剂保持在室温下，且使用蒸馏水将浓缩洗涤溶液稀释至10倍。
使用免疫球蛋白E标准物质和缓冲溶液分别制备免疫球蛋白E标准浓度(0、1.0、10、 25、50、75和100ng-mL)。
使用洗涤溶液填充96孔板，且洗涤涂布抗体的板3次。
分别分配50μL稀释样品和标准溶液，且将板在板振动器中缓慢摇动(800rpm，10秒×3 次)。
将混合物在室温下培养2小时，且将反应混合物丢弃。
使用洗涤溶液将板洗涤3次，且在板的每个孔中加入50μL生物素标记的抗免疫球蛋白 E抗体，且如以上描述地摇动板的每个孔。
将混合物在室温下培养2小时，且将反应混合物丢弃且以以上描述的相同方式处理。
在分配50μL HRP标记的抗生物素蛋白之后，将板以以上描述的相同方式摇动，且将板 在室温下培养1小时。
在将反应混合物丢弃之后，将板洗涤3次，加入50μL显色底物试剂，以以上描述的相 同方式摇动，且在室温下培养20分钟。
在所有孔中加入50μL反应终止剂，且如以上描述地摇动板。
在30分钟内，使用酶标仪(Molecular Devices Inc，New York，USA)测量每个孔的吸 光度。
免疫球蛋白E的测量进行两次。
血液组胺的测量
血液中的组胺使用小鼠组胺ELISA试剂盒(IBL-America,Inc.，Minneapolis，MN，USA) 测量，如以下描述的。
将100μL血清加入酰化管，加入50μL酰化缓冲液且在18℃下放置30分钟。将50μL 酰化的血浆加入抗组胺抗体所附着的96孔，加入200μL酶交联物，且在4℃下培养18小 时。
在抽吸试孔中的内容物之后，将孔使用洗涤溶液洗涤3次，加入200μL显色底物试剂， 且在暗处在室温下反应20分钟。
使用50μL反应终止剂终止酶反应，使用酶标仪(Molecular Devices Inc，New York， USA)测量450nm处的吸光度，且计算组胺的浓度。
组胺的测量进行两次。标准溶液以以上描述的相同方式处理，且与用于计算的样品的吸 光度比较。
观察皮肤组织细胞的方法
从小鼠的皮肤组织切出以损伤区域周围的、1.5×1.5cm2尺寸的皮肤组织，将切出的皮 肤组织使用10％甲醛溶液固定，且在4℃下存储，直到进行组织染色之前。
将样品使用4％戊二醛溶液(0.1M二甲胂酸盐缓冲液，pH 7.4)固定，然后经历脱水、 取代、渗透和包埋聚合、和半薄切片过程，且通过能量过滤透射电子显微术(EF-TEM,Leo  92AB,Carl Zeiss Inc.,Germany)拍照。
对皮肤组织的观察主要集中于皮肤的整体状态、肥大细胞的渗透和去粒、和嗜酸细胞的 渗透。
统计方法
分析数据的统计方法通过SAS程序进行，且得到每个处理组的平均偏差和标准偏差。 在进行变分分析之后，通过邓肯多变域试验(SAS，2000)检验出95％水平的显著性。
结果和讨论
目视观察
图1示出了通过DMNCB诱导制备的患过敏性皮炎的小鼠的图像。可以发现，在小鼠的 毛发去除(图1a)之后DNCB溶液的涂覆导致痂皮形成(图1b)，这导致小鼠难以忍受产 生的瘙痒而过分地抓挠它们的皮肤，以使痂皮脱落且伴随各种过敏性皮炎症状(包括皮肤斑 点、红斑、干皮病、苔藓化、水肿、和出血)的同时发展，从而诱导过敏性皮炎的严重状态 (图1c)。与使用防过敏霜剂处理的组相比，其上表现出严重过敏性皮炎的小鼠显示出皮肤 损伤，例如红斑、伤口糜烂、脱发、干皮病、出血、和炎症。在将防过敏霜剂在以上状态下 的小鼠上以每天2次涂覆3天时，感染皮肤区域上的皮肤皮炎迅速改善，且在防过敏霜剂涂 覆6天时，感染皮肤区域上的皮肤皮炎恢复至几乎正常的皮肤的状态，具有干净和光滑的皮 肤，没有皮肤表面上的角化组织(图1d)。瘙痒是皮肤病的一种常见症状，可以由于炎症、 癌症、代谢疾病、感染、精神疾病、调解、应激和其他因素而出现，且肥大细胞的激活使人 的过敏性皮炎恶化(参见Elenkov,2008；Paus等，2006Stander等，2003)。这由以下事实 支持：将防过敏霜剂涂覆至患有过敏性皮炎的小鼠具有减少血液中的免疫球蛋白E和抑制组 胺分泌的作用(表1)。
表1、防过敏霜剂对患有DBCB诱导的过敏性皮炎的BALB/c小鼠中的血清免疫球蛋白 E和组胺浓度(ng/mL)的作用
类别 过敏症对照组 防过敏霜剂处理组 免疫球蛋白E 56.28±5.36 23.75±2.48 组胺 40.08±3.51 16.27±4.12
平均偏差±标准偏差(观察数＝10)。*在95％置信度上显著地不同(p<0.05)。
血液中免疫球蛋白E和组胺浓度的变化
防过敏霜剂处理组中的血液中免疫球蛋白E的浓度测量显示出：与DNCB诱导的过敏 症对照组相比，每1mL血液减少32.53ng，这显著降低57.80％(p<0.05)。
血液组胺的浓度显示出：与DNCB诱导的过敏症对照组相比，每1mL血液减少23.81ng， 这显著降低59.41％(p<0.05)(表1)。
以上结果说明：将防过敏霜剂涂覆在患有过敏性皮炎的小鼠中可以降低血液中免疫球蛋 白E的产生，并且抑制组胺分泌，从而能够治疗过敏性皮炎(图1)。
已知血清中免疫球蛋白E的水平的增大是皮炎的免疫学指标，特别地，已知免疫球蛋白 E与患有过敏性皮炎的患者中的临床严重性成比例。
已经报道免疫球蛋白E与皮肤肥大细胞的白细胞结合以产生组胺，且与侵入的抗原反 应，从而引起过敏反应(参见Sung等，2006；Latvala，2005，Ban和Hetich，2001；Matsuda 等，1997；Metcalfe等，1981)。
由于免疫球蛋白E与抗原之间的反应而产生的化学递送物质(即组胺)或T淋巴细胞 产生的各种化合物，皮肤过敏反应引起血管舒张、毛细血管渗透性过高、粘液增加、和水肿 和炎症(参见Church和Levi-Schaffer.1997；Ishizaka，1984)。
在过敏性皮炎中，已经报道，与正常人相比组胺(为瘙痒的主要原因)可以在过敏症患 者中增加。
皮肤在形成外部环境与内部身体之间的边界时，通常具有与各种抗原接触的机会。
一旦过敏性皮炎出现，患有过敏性皮炎的受试者由于它的皮肤的过敏反应和瘙痒阈值的 降低而抓挠它的皮肤，且抓挠行为和炎症引起细胞因子类从皮肤角蛋白细胞分泌，以加重炎 症反应且诱导角质层改变，从而激活免疫细胞。
免疫细胞的激活诱导免疫球蛋白E的产生、抗体应答和依赖于免疫球蛋白E的组胺释 放体的活性的增加，从而促进组胺分泌。
组胺诱导嗜酸细胞的侵入和急性过敏反应和瘙痒(参见Budde等，2002；White，1990； Ennis等，1980)。
组织病理学发现
在将防过敏霜剂涂覆在皮肤表面上之后对皮肤表面的观察揭示了：与具有DNCB诱导 的过敏性皮炎的皮肤相比，处理小鼠具有在表皮层中皮肤表面的更均匀的厚度和光滑的表皮 层(图2b)，且它们的结蹄组织在更连续的方向上形成，由此被恢复(图2c)至与正常组(图 2a)类似的水平。
在真皮层的情况下，与患有严重DNCB诱导的过敏性皮炎的处理组相比，防过敏霜剂 处理组中存在滤泡和皮脂腺等的积极再形成。
显示出皮肤的上皮组织和角质组织的再生和基底层中网状层的增殖和附属器官的形成 被特殊地激活，且组织形成层变得更厚和更稠密且在一致的方向上形成。
在使用防过敏霜剂处理的组中，观察到皮肤表面为组织学上干净和光滑的，然而，使用 防过敏霜剂处理的组的皮肤组织显示出皮肤表面上的出血肥大和表皮肥大的显著水平，由此 具有比患有过敏性皮炎的小鼠厚得多的表皮(图2c)。
然而，相反，由于大量角质层，患有过敏性皮炎的小鼠组的皮肤表面显示为粗糙的，且 还显示为具有局部水肿。
在患有过敏性皮炎的小鼠的表皮内，观察到明显的基底细胞凋亡，且还在表皮层和真皮 层中观察到炎症相关的细胞，例如淋巴细胞、肥大细胞、中性粒细胞和嗜酸细胞(图2b)。
然而，这些细胞几乎不显示在应用防过敏霜剂的处理组中，且观察到表皮层的厚度恢复 至与正常对照组类似的水平(图2c)。
在患有过敏性接触性皮炎的皮肤组织中，其中产生去粒的肥大细胞和嗜酸细胞侵入组织 细胞，从而引起角化过度(Sator等，2003；Budde等，2002；Vestergaard等，1999)。
已知诱导的过敏性接触性皮炎和水分蒸发使抗原的侵入更容易，由此加重皮肤的超敏感 性，且恶化由与神经酰胺结合的基质结构蛋白形成的皮肤屏障，从而提高对感染和炎症的敏 感性。
因此，最好消除用于由于免疫应答而处理皮炎的引起刺激的抗原。然而，存在许多不可 能识别特异性抗原时的情况，由此抗生素和用于局部的甾类制剂的使用是一般疗法且对它们 长期使用报道有很多安全问题(参见Stander等，2003)。
结论
从上述描述，证实了新的事实：防过敏霜剂应用于患DNCB诱导的过敏性皮炎的小鼠 降低了血液中免疫球蛋白E的水平，同时抑制了肥大细胞产生的释放组胺的量，从而能够治 疗过敏性皮炎。
工业实用性
本发明涉及一种防过敏霜剂，该防过敏霜剂可以用于治疗过敏性皮炎。