一种多烯紫杉醇纳米粒组合物 【技术领域】
本发明涉及一种可用于注射给药的组合物及其制备方法，具体地说涉及一种可用于注射给药的多烯紫杉醇纳米粒组合物及其制备方法。
背景技术
多烯紫杉醇(多西他赛、docetaxel)是一种紫杉烷类化合物，它可由欧洲红豆杉提取到的非细胞毒性前体化合物10-脱酰基浆果赤霉素II经半合成得到，1998年获美国FDA批准上市，是目前临床使用最为有效的紫杉烷类抗癌剂。自上市以来，已被广泛用于治疗多种癌症，包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、头颈部肿瘤等。目前多烯紫杉醇已成为实体肿瘤治疗中应用最为广泛的细胞毒药物之一。已上市的多烯紫杉醇主要适应症是局部晚期或转移性乳腺癌或非小细胞肺癌症。
由于多烯紫杉醇难溶于水及许多药用有机溶剂，为了达到临床注射用浓度(0.3～0.74mg/ml)的要求，目前上市的多烯紫杉醇注射剂均是采用吐温80与无水乙醇的复合溶媒制备而成。大量有机溶剂尤其是吐温80的使用易引发病人严重的过敏反应，在化疗前，病人往往需预先服用或注射抗过敏药物(皮质类激素和H2受体拮抗剂)，在输液过程中，还需连接微孔过滤器以防止药物在稀释过程中产生的结晶微粒进入病人血液循环系统，这些均给临床应用带来极大的风险和不便。为此，人们对注射用多烯紫杉醇的组合物，尤其以脂质体组合物进行了大量研究，如文献CN1813679A中公开了含多烯紫杉醇、磷脂、胆固醇等的脂质体冻干组合物；CN1146722A中公开了含有多烯紫杉醇、不饱和磷脂和负磷脂的组合物等。
脂质体系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊，也有人称脂质体为类脂小球或液晶微囊，属于较为新型的药物载体。可以以脂质体为载体，解决难溶性药物注射给药的问题。胆固醇是脂质体制备过程中常用的辅料，用来调节膜的通透性和流动性，稳定磷脂双分子层膜，减少药物的渗漏，提高制剂的稳定性，且通常其用量较大，它与磷脂的摩尔比可达1∶1甚至2∶1。但是过多的胆固醇会对机体产生不利的影响，现代研究表明，动脉粥样硬化、静脉血栓形成、胆石症等均与高胆固醇血症密切相关。因此，含有较多胆固醇的药物制剂可能会给患者尤其是伴有心脑血管疾病患者的健康带来危害。此外，部分脂质体中用到负磷脂，但是负磷脂在天然磷脂中含量极少，价格相对较高，且国内尚无药用级别的，因此限制了其临床应用。
对于脂质体体系而言，通常需要加入上述的胆固醇等物质以增加脂质体的稳定性，从而延长其体内循环时间，并使药物能够转运到病灶部位进而产生一定的天然靶向性。但对于部分肿瘤患者，例如中晚期肿瘤患者，病灶已分布全身，临床上更需要一种全身作用的治疗药物，该药物在制备、贮存、运输及给药过程中能保持高度的稳定，而在进入体内又可以迅速发挥全身作用。
【发明内容】
本发明提供一种含多烯紫杉醇和中性磷脂的纳米粒组合物，其中，中性磷脂与多烯紫杉醇的重量比为3～100∶1，优选为8～50∶1，进一步优选为12～30∶1。且该组合物中不含负磷脂和胆固醇。所述的纳米粒的平均粒径在100-300nm之间，优选在100-200nm之间。
本发明所述的中性磷脂(neutral phospholipids)包括：卵磷脂(也称为磷脂酰胆碱)，卵磷脂的来源有天然的，也有合成的。天然卵磷脂主要来自大豆和蛋黄，称为大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂，它们是由一大类磷脂酰胆碱化合物所组成的混合物，具有基本如下的结构，其中R1和R2为疏水基团；
合成卵磷脂有氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)等。除了卵磷脂外，中性磷脂还包括神经鞘磷脂(SM)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等。
优选的中性磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂中的一种或几种组成。
更优选纳米粒组合物中的中性磷脂由蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂中任选的两种不同的磷脂组成，最优选由一种天然卵磷脂和一种合成卵磷脂组成，其中天然卵磷脂与合成卵磷脂的重量比在20∶1～1∶10之间，更好在8∶1～1∶1之间。
负磷脂(negatively charged phospholipids)又称负电荷磷脂或酸性磷脂，包括磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)、二硬脂酰甘油磷脂(DSPG)、二棕榈酰甘油磷脂(DPPG)、二肉蔻酰甘油磷脂(DMPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇等。
本发明的纳米粒组合物进一步可含有药物赋形剂。所述的药物赋形剂选自甘露醇、氯化钠、葡萄糖、乳糖、蔗糖、水解明胶、海藻糖、葡聚糖、右旋糖酐、甘氨酸、甘氨酸钠、丙氨酸、白蛋白、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、包括磷酸二氢钠或磷酸氢二钠的磷酸盐、山梨醇、麦芽糖、环糊精、枸橼酸、枸橼酸钠、碳酸钠、木糖醇中的一种或一种以上的混合物。优选为甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、木糖醇中的一种或一种以上的混合物。赋形剂与多烯紫杉醇的重量比为4～150∶1，优选为12～80∶1，进一步优选为18～45∶1。
本发明还提供一种适合工业化生产的注射用多烯紫杉醇纳米粒组合物地方法。
本发明提供的注射用多烯紫杉醇纳米粒组合物的制备方法包括以下步骤：
1)制备有机相：将多烯紫杉醇及中性磷脂加入有机溶剂中，搅拌使其溶解均匀，作为有机相；
2)制备水相：取适量注射用水或缓冲液作为水相，如需要可将赋形剂加入水相中，搅拌溶解；
3)混合：水相保持恒温，氮气保护下注入有机相并不断搅拌，即得混悬液；
4)匀质：将混悬液匀质，除菌过滤，再无菌分装，即得多烯紫杉醇纳米粒组合物；
5)冻干：视需要，将上述步骤4)匀质分装后的组合物进行冻干。
在有机相的制备中，有机溶剂可选用乙醇、乙醚、叔丁醇等，优选乙醇作为溶剂；在混合过程中，水相的温度一般恒定保持在40～80℃之间。
本发明所述的组合物可以是液体组合物，也可以固体形式存在，优选以冻干粉末组合物的形式存在。冻干粉末组合物在使用时，可以用药学上可接受的、可相容的和可注射用的任何介质即时溶解和/或稀释。优选的该组合物可用注射用水、5％葡萄糖注射液溶解和/或稀释。
本发明纳米粒组合物包封率高，达到90％以上，粒子大小分布较均匀集中。用5％葡萄糖注射液复溶和/或稀释后(浓度约0.5mg/ml)低温(2-8℃)放置24h，其包封率仍在90％以上，粒径分布也无明显变化。
将本发明的实施例8的冻干组合物分别于高温(40℃)、光照(4500±500Lx)、室温下放置，于不同时间点分别取样检测，其稳定性见表1-表3，结果显示样品性状、包封率、含量、有关物质、平均粒径等各关键指标均无明显变化。按上述步骤4)直接制备得到的液体组合物低温(2-8℃)放置2周，未发生聚集、泄露，无沉淀或结晶析出，包封率、含量、有关物质、平均粒径等指标也均无明显变化，具体考察结果见表4。由表1到表4稳定性考察结果可以看出，本发明提供的组合物具备良好的稳定性，符合临床用药的要求。
表1高温试验考察结果(40℃)
表2光照试验考察结果(4500±500Lx)
表3室温放置考察结果
表4低温(2-8℃)放置考察结果
本发明的多烯紫杉醇纳米粒组合物采用了具有特定粒径大小的纳米粒作为多烯紫杉醇的载体，其稳定性好、用药安全性高，它优点在于以纳米粒为载体，将多烯紫杉醇包裹于其中，很好地解决了现有多烯紫杉醇因溶解度低而只能使用有机溶剂及吐温80等不安全物质的问题，另外根据上述的稳定性试验证明本发明的组合物极大地提高了药物的稳定性，解决了现有注射液稳定性差的问题。此外，与大量研究报道的多烯紫杉醇脂质体相比，该纳米粒组合物使用了不同于一般脂质体的载体形式，未添加胆固醇等物质，避免高胆固醇用量对健康可能带来的危害，提高其用药安全性。另外，与报道的负磷脂脂质体相比，本发明组合物中所用中性磷脂容易得到、价格相对低且安全性高。此外，与脂质体组合物长效，靶向性所不同的是：本发明的多烯紫杉醇纳米粒组合物在生产、贮存和运输及给药过程中能保持良好的稳定性，而在进入体内后该纳米粒能迅速释放药物而产生药效。本发明的纳米粒组合物成本低，稳定性高，安全性好，符合临床用药的要求，符合大规模生产的要求，具备良好的市场前景。
【具体实施方式】
通过下述实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例1
处方：多烯紫杉醇 1g
氢化大豆卵磷脂 70g
0.01NpH6.5磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钠或？？，应该具体)870ml
制备工艺：
1.将处方量多烯紫杉醇与氢化大豆卵磷脂溶于80ml乙醇中，作为有机相；
2.取870ml0.01N pH6.5磷酸盐缓冲液，加热至65℃恒温，作为水相；
3.氮气保护并搅拌下将有机相缓慢注入水相，充分搅拌30分钟后，即得纳米粒混悬液；
4.将纳米粒混悬液通入高压匀质机匀化5次后，除菌过滤，无菌分装。
实施例2
处方：多烯紫杉醇 1g
蛋黄卵磷脂 30g
蔗糖 60g
制备工艺：
1.将处方量多烯紫杉醇与蛋黄卵磷脂溶于22ml乙醇中，作为有机相；
2.取处方量蔗糖，加入230ml注射用水溶解作为水相；
3.将水相恒温加热至40℃，氮气保护并搅拌下往其中缓慢注入有机相，并剪切30分钟即得纳米粒混悬液；
4.将纳米粒混悬液通入高压匀质机匀化5次后，除菌过滤，分装入西林瓶中进行冻干，包装。
实施例3
处方：多烯紫杉醇 1g
氢化大豆卵磷脂 25g
大豆卵磷脂 15g
麦芽糖 45g
制备工艺：
1.将处方量多烯紫杉醇与氢化大豆卵磷脂及大豆卵磷脂溶于35ml乙醇中，作为有机相；
2.取处方量麦芽糖，加450ml注射用水溶解作为水相；
3.将水相恒温加热至70℃，氮气保护并搅拌下往其中缓慢注入有机相，再剪切20分钟即得纳米粒混悬液；
4.将纳米粒混悬液通入挤出仪挤出6次后，除菌过滤，分装入西林瓶中进行冻干，包装。
实施例4
处方：多烯紫杉醇 2g
氢化大豆卵磷脂 12g
二硬脂酰磷脂酰胆碱 4g
葡萄糖 24g
制备工艺：
1.将处方量多烯紫杉醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱及氢化大豆卵磷脂溶于20ml乙醇中，作为有机相；
2.取处方量葡萄糖，加入注射用水200ml溶解作为水相；
3.将水相恒温加热至70℃，氮气保护并搅拌下往其中缓慢注入有机相，再搅拌30分钟，即得纳米粒混悬液；
4.将纳米粒混悬液通入挤出仪挤出6次后，除菌过滤，分装入西林瓶中进行冻干，包装。
实施例5
处方：多烯紫杉醇 1g
蛋黄卵磷脂 50g
蔗糖 50g
甘露醇 30g
制备工艺：
1.将处方量多烯紫杉醇与蛋黄卵磷脂溶于40ml乙醇中，作为有机相；
2.取处方量蔗糖和甘露醇，加入400ml注射用水溶解作为水相；
3.将水相恒温加热至50摄氏度，氮气保护并搅拌下往其中缓慢注入有机相，再搅拌20分钟，即得纳米粒混悬液；
4.将纳米粒混悬液通入挤出仪挤出4次后，除菌过滤，分装入西林瓶中进行冻干，包装。
实施例6
处方：多烯紫杉醇 0.5g
大豆卵磷脂 50g
乳糖 25g
甘露醇 50g
制备工艺：
1.将处方量多烯紫杉醇与大豆卵磷脂溶于40ml乙醇中，作为有机相；
2.取处方量乳糖和甘露醇，加入400ml注射用水溶解作为水相；
3.将水相恒温加热至55摄氏度，氮气保护并搅拌下往其中缓慢注入有机相，再搅拌30分钟即得纳米粒混悬液；
4.将纳米粒混悬液通入挤出仪挤出6次后，除菌过滤，分装入西林瓶中进行冻干，包装。
实施例7
处方：多烯紫杉醇 2g
二硬脂酰磷脂酰胆碱 6g
海藻糖 8g
制备工艺：
1.将处方量多烯紫杉醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱溶于8ml乙醇中，作为有机相；
2.取处方量海藻糖，加入注射用水90ml溶解作为水相；
3.将水相恒温加热至70摄氏度，氮气保护并搅拌下往其中缓慢注入有机相，并搅拌15分钟即得纳米粒混悬液；
4.将纳米粒混悬液通入挤出仪挤出5次后，除菌过滤，再分装入西林瓶中，冻干，包装。
实施例8
处方：多烯紫杉醇 2g
氢化蛋黄卵磷脂 8g
蛋黄卵磷脂 16g
甘露醇 36g
制备工艺：
1.将处方量多烯紫杉醇与氢化蛋黄卵磷脂及蛋黄卵磷脂溶于24ml乙醇中，作为有机相；
2.取处方量甘露醇，加入250ml注射用水溶解作为水相；
3.将水相恒温加热至60摄氏度，氮气保护并搅拌下往其中缓慢注入有机相，再剪切20分钟即得纳米粒混悬液；
4.将纳米粒混悬液通入高压匀质机匀化5次后，除菌过滤，分装入西林瓶中进行冻干，包装。
实施例9
处方：多烯紫杉醇 1g
蛋黄卵磷脂 15g
氢化大豆磷脂 4g
葡萄糖 14g
甘露醇 16g
制备工艺：
1.将处方量多烯紫杉醇与蛋黄卵磷脂、氢化大豆磷脂溶于20ml乙醇中，作为有机相；
2.取处方量葡萄糖和甘露醇，加入250ml注射用水溶解作为水相；
3.将水相恒温加热至70℃，氮气保护并搅拌下往其中缓慢注入有机相，并剪切30分钟即得纳米粒混悬液；
4.将纳米粒混悬液通入挤出仪挤出6次后，除菌过滤，再分装入西林瓶中，冻干，包装。
实施例10
处方：多烯紫杉醇 1g
氢化大豆卵磷脂 15g
右旋糖酐 10g
木糖醇 10g
制备工艺：
1.将处方量多烯紫杉醇与氢化大豆卵磷脂溶于15ml乙醇中，作为有机相；
2.取处方量右旋糖酐、木糖醇，加200ml注射用水溶解作为水相；
3.将水相恒温加热至65℃，氮气保护下往其中缓慢注入有机相，再剪切20分钟即得纳米粒混悬液；
4.将纳米粒混悬液通入高压匀质机匀化5次后，除菌过滤，分装入西林瓶中进行冻干，包装。
实施例11
处方：多烯紫杉醇 0.5g
氢化大豆卵磷脂 30g
二棕榈酰磷脂酰胆碱 10g
海藻糖 40g
磷酸二氢钠 4.5g
磷酸氢二钠 5.5g
制备工艺：
1.将处方量多烯紫杉醇与氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱溶于40ml乙醇中，作为有机相；
2.取处方量海藻糖、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，加入400ml注射用水溶解作为水相；
3.将水相恒温加热至70℃，氮气保护并搅拌下往其中缓慢注入有机相，再搅拌25分钟即得纳米粒混悬液；
4.将纳米粒混悬液通入挤出仪挤出5次后，除菌过滤，再分装入西林瓶中，冻干，包装。
实施例12
将本发明实施例8方法制备得到的多烯紫杉醇冻干组合物作为受试制剂，上市多烯紫杉醇注射液(通用名：多西他赛注射液；商品名：艾素)作为参比制剂，同时动物给药试验，比较其体内行为差别：
给药方法：本发明的冻干组合物静脉推注试剂：将20mg、40mg，80mg受试制剂分别溶于50mL 5％葡萄糖注射液中，低、中、高剂量分别以1mL/100g/min匀速向大鼠给药；将100mg受试制剂溶于100mL 5％葡萄糖注射液中，分别以2mL/2kg/min匀速向beagle犬给药。
多西他赛注射液静脉推注试剂：将参比试剂40mg(2瓶)先用3mL溶剂13％乙醇溶解后，再用5％葡萄糖注射液47mL稀释备用，分别以1mL/100g/min匀速向大鼠给药；80mg(4瓶)先用6mL溶剂乙醇溶解后，再用5％葡萄糖注射液74mL稀释备用，分别以2mL/2kg/min匀速向beagle犬给药。
药代、组织分布及安全性结果如下：
按照4、8、16mg/kg本发明冻干组合物或8mg/kg多西他赛注射液iv大鼠后，在大鼠体内无性别差异，估算的半衰期t1/2分别为7.5±1.2、4.7±1.7、7.4±5.6和4.0±1.0h；MRT分别为5.6±0.8、1.7±0.6、1.2±0.3和2.6±0.7h；Cmax分别为1556±373、7772±846、31241±7071和7328±1950ng/mL；AUC0-τ分别为690±153，3020±933，10748±2560和2599±574μg·h/L。对数图显示在末端相低、中、高三种剂量的曲线近似平行，提示其呈线性消除。AUC与剂量及峰浓度与剂量关系表明AUC与剂量间呈有一定的线性关系。在本试验研究的剂量下，受试制剂与参比制剂的t1/2、AUC0-τ、Cmax和CLz均无显著性差异。
按照1mg/kg本发明冻干组合物或1mg/kg多西他赛注射液iv beagle犬后，beagle犬体内无性别差异。估算的半衰期t1/2分别为13.6±4.3和8.2±5.7h；MRT分别为1.7±0.6和2.6±0.3h；Cmax分别为1362±304和1408±339ng/mL；AUC0-τ分别为1023±231和1016±217μg·h/L。本发明冻干组合物与注射液相比较，t1/2、CLz和分别经对数转换后的Cmax、AUC0-τ均无显著性差异。
beagle犬推注多西他赛注射液(参比试剂)时出现明显的毒副反应，如皮疹、两眼充血、流涎、四肢软弱无力、大小便失禁、精神萎靡等异常反应，而推注本发明冻干组合物时则无明显的毒副反应。
动物试验结果显示：本发明组合物与上市多西他赛注射液体内药代、组织分布基本一致，但毒副作用明显减小。