靶向稀土上转换金核壳纳米粒制备方法.pdf

本发明涉及一种靶向稀土上转换金核壳纳米粒制备方法。本发明提供一种靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的制备方法。具体涉及两部分内容即1)稀土上转换-金核壳纳米粒的合成；2)将这种稀土上转换-金核壳纳米粒同巯基乙酸以及靶向分子RGD多肽复合制备靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂。相对于传统的肿瘤热疗相比，利用这种靶向稀土上转换-金核壳纳米粒进行肿瘤热疗具有诸多优势：可在短时间照射条件下，产生大量的热量，从而减少传统热疗治疗过程长的缺陷。组装得到的靶向稀土上转换-金核壳纳米粒具有结构稳定，粒径均一，光热转换效率高等优点。

权利要求书
1.  一种靶向稀土上转换金核壳光控纳米粒的制备方法，其特征是步骤如下：
1)利用各种稀土盐以及氯金酸为原料，通过溶剂热-还原法联用制备出稀土上转换-金核壳纳 米粒；
2)利用巯基乙酸，按照反相蒸发法，制备得到稀土上转换-金核壳纳米粒，接着在其表面进 行靶向分子功能化修饰最终得到靶向稀土上转换-金核壳纳米粒。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤1)方法如下：
(1)按照质量比为氯化镱：氯化钇：氯化铒＝(10～40):(10～60):1将原料加入到 反应器中，然后向反应器中加入溶剂水使上述物质完全溶解；在磁力搅拌条件，加热至沸腾 直至稀土盐溶液变成白色固体；
(2)水蒸干后，按照体积数比为油酸：十八烯＝2～6:1将二者加入反应器中使白色固体 完全溶解；
(3)冷却至40～60℃，按照质量数为NaOH：氟化铵＝1～6：5将二者加入的反应器中， 然后加入甲醇使NaOH：氟化铵完全溶解；调节温度升温到100～150℃，抽真空10～40min， 通氩气；迅速升温到250～300℃，维持反应1～3小时；然后加入丙酮离心纯化，产物上转 换纳米粒子真空干燥处理；使用的氟化铵与氯化铒的质量比＝5:1；
(4)按上转换纳米粒子：氯金酸质量数比＝1：(1～10)加入到反应器中，然后向反应器 中加入溶剂水使上述物质完全分散，搅拌1～4小时；
(5)用氢氧化钠将溶液pH值调节到8～10，将羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中， 其中羟基胺与上转换纳米粒子的质量份数比为1～5:1；
(6)反应1～4小时后，加入丙酮离心纯化，产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处 理；得到的稀土上转换-金核壳纳米粒颗粒。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤2)方法如下：
(1)按稀土上转换-金核壳纳米粒：巯基乙胺质量份数比＝1：(50～200)将原料加入到 反应器中，然后向反应器中加入溶剂水使上述物质分散；
(2)磁力搅拌条件下加热到30～50℃，反应1～3小时，反应完全后离心纯化，产物巯 基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒，真空干燥处理；
(3)按照物质的质量份数比为靶向分子RGD多肽：巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳 纳米粒＝1～20：50将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂水使上述物质分散；
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，其中EDC与巯基 乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒的质量比为1～3：50；
(5)在磁力搅拌条件下，反应1～3小时；反应完全后离心纯化，最终产物靶向稀土上 转换-金核壳纳米粒。

说明书靶向稀土上转换金核壳纳米粒制备方法
技术领域
本发明涉及一种靶向稀土上转换金核壳纳米粒制备方法，属医药技术领域。
背景技术
肿瘤，特别是恶性肿瘤，是威胁人类健康乃至生命的最重要杀手之一。目前临床 上常用的治疗手段包括手术切除、放疗、化疗。但上述方法也存在着一定的缺陷性， 如手术切除将造成肢体残缺，放疗和化疗会因副作用导致对正常组织的杀伤，所有这 些都将不可避免地降低患者的生存率和生存质量。临床上一直寻找一种既能有效杀伤 肿瘤细胞，又能确保损伤小、毒副作用低的微创甚至无创治疗方法。现代肿瘤热疗技 术是一种具有上述潜能的全新解决方法。
肿瘤热疗是指利用非电离辐射物理因子在生物组织中的热效应，即通过对肿瘤组 织细胞加热升温而将其杀灭的技术方法。肿瘤热疗已成为继手术、放疗、化疗和免疫 疗法之后的第五大疗法，是治疗肿瘤的一种新的有效手段。传统肿瘤热疗具体治疗过 程是利用物理能量直接加热人体全身或局部，使肿瘤组织温度上升到有效治疗温度， 并维持一定时间，利用正常组织和肿瘤细胞对温度耐受能力的差异，达到既能使肿瘤 细胞凋亡、又不损伤正常组织的治疗目的。目前主要应用于对于放疗、化疗或手术后 复发的晚期肿瘤病人进行单独热疗进行姑息治疗；另外对某些表浅肿瘤如乳腺癌、皮 肤癌等也可以直接热疗。
但是，同手术、放疗和化疗三种传统治疗方法相比，肿瘤热疗大多数还处于辅助 和次要的地位，究其原因重要是热疗过程中存在自身难以克服的缺陷，如1)加热设 备无法实现精准加热；2)热量穿透深度浅等这些缺陷直接限制了热疗在临床上的进 一步应用。
发明内容
鉴于纳米药剂在医学上的重要应用，本发明提供一种靶向稀土上转换-金核壳纳米粒 的制备方法。具体涉及两部分内容即1)稀土上转换-金核壳纳米粒的合成；2)将这种稀 土上转换-金核壳纳米粒同巯基乙酸以及靶向分子RGD多肽(商品化试剂)复合制备靶向 稀土上转换-金核壳纳米制剂。组装得到的靶向稀土上转换-金核壳纳米粒具有结构稳定， 粒径均一，光热转换效率高等优点。目前尚未发现于此相关纳米粒文章及专利的报道。
本发明的靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的制备方法技术方案
一种靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的制备方法，步骤如下，如图2所示：
1)稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成：利用各种稀土盐以及氯金酸为原料，通 过溶剂热-还原法联用制备出稀土上转换-金核壳纳米粒；
2)稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰：利用巯基乙酸，按照反相蒸发法， 制备得到稀土上转换-金核壳纳米粒，接着在其表面进行靶向分子功能化修饰最终得到靶 向稀土上转换-金核壳纳米粒。
具体说明如下：
稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成：
(1)按照质量比为氯化镱：氯化钇：氯化铒＝(10～40):(10～60):1将原料加入 到反应器中，然后向反应器中加入溶剂水使上述物质完全溶解；在磁力搅拌条件，加热至 沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体；
(2)水蒸干后，按照体积数比为油酸：十八烯＝2～6:1将二者加入反应器中使白色固 体完全溶解；
(3)冷却至40～60℃，按照质量数为NaOH：氟化铵＝1～6：5将二者加入的反应器中， 然后加入甲醇使NaOH：氟化铵完全溶解；调节温度升温到100～150℃，抽真空10～40min， 通氩气；迅速升温到250～300℃，维持反应1～3小时；然后加入丙酮离心纯化，产物上 转换纳米粒子真空干燥处理；使用的氟化铵与氯化铒的质量比＝5:1；
(4)按上转换纳米粒子：氯金酸质量数比＝1：(1～10)加入到反应器中，然后向反 应器中加入溶剂水使上述物质完全分散，搅拌1～4小时；
(5)用氢氧化钠将溶液pH值调节到8～10，将羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中， 其中羟基胺与上转换纳米粒子的质量份数比为1～5:1；
(6)反应1～4小时后，加入丙酮离心纯化，产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干 燥处理；得到的稀土上转换-金核壳纳米粒颗粒。
稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰：
(1)按稀土上转换-金核壳纳米粒：巯基乙胺质量份数比＝1：(50～200)将原料加入 到反应器中，然后向反应器中加入溶剂水使上述物质分散；
(2)磁力搅拌条件下加热到30～50℃，反应1～3小时，反应完全后离心纯化，产物 巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒，真空干燥处理；
(3)按照物质的质量份数比为靶向分子RGD多肽：巯基乙胺保护的稀土上转换-金核 壳纳米粒＝1～20：50将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂水使上述物质分散；
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，其中EDC与巯 基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒的质量比为1～3：50；
(5)在磁力搅拌条件下，反应1～3小时；反应完全后离心纯化，最终产物靶向稀土 上转换-金核壳纳米粒。
本发明的有益效果：
1)本发明涉及的靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂的主要优势包括：操作简便，适用 性强，成本低，在水中具有较好的分散性，光热转化效率高。
2)本发明涉及的靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂的主要性能指标包括：a)有效粒 径在20～80nm之间，粒径更均匀，且可以根据制剂的组成成分，实验条件等进行调节；b) 稳定性好，可在水溶液中保存至少2个月以上；c)表面含有大量靶向分子RGD多肽，易 于制剂在肿瘤组织处聚集；制备得到表面靶向分子RGD的密度为：0.4～1.3mmol/g。
d)整个制备过程简单快捷，制备周期短，产率高，适合大批量生产。
本发明同传统的传统胶体金热疗制剂相比具有如下优势：

本发明涉及一种靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的制备方法，有助于解决上述热疗中 无法解决的缺陷。这种制剂主要成分包括三方面：1)靶向分子RGD多肽修饰的高分子脂 质体层；2)稀土上转换-金核壳纳米粒。其热疗的基本原理是：1)将制备好的靶向稀土 上转换-金核壳纳米粒通过静脉注射或局部注射的方式给药；2)当制剂在靶向分子的作用 下聚集到肿瘤部位后，在特定的部位用使用够穿透深部组织的近红外(波长980nm)激光 直接照射靶部位；3)穿透深部组织的激光首先被上转换纳米核吸收，从而产生相应的可 见光；4)可见光被金壳吸收产生热量，从而杀伤肿瘤。靶向稀土上转换-金核壳纳米粒在 肿瘤热疗中应用机理图如图1所示。
相对于传统的肿瘤热疗相比，利用这种靶向稀土上转换-金核壳纳米粒进行肿瘤热 疗具有诸多优势：
1)利用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒靶向聚集作用，能够实现在肿瘤部位的精准加 热。
2)利用近红外(波长980nm)激光作为激发源，可穿透深部组织，有效实现对深部肿 瘤组织的治疗。
3)光热转换效率高，可在短时间照射条件下，产生大量的热量，从而减少传统热疗 治疗过程长的缺陷。
4)此外，靶向稀土上转换-金核壳纳米粒具有荧光成像功能，可实现热疗过程的可视 化。
附图说明
图1：靶向稀土上转换-金核壳纳米粒在肿瘤热疗中应用机理图；
图2：靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂制备方法流程示意图；
图3：按照实施例1合成的稀土上转换-金核壳纳米粒(左)和热疗用靶向稀土上转换 -金核壳纳米粒(右)投射电子显微镜照片(形貌分析)。
图4：按照实施例1制备的热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的粒径分布图(尺寸 分析)。
图5：热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒红外光谱谱图(结构分析)。
图6：热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒细胞毒性MTT实验结果(安全性分析)。
图7：热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒细胞内吞共聚焦照片(靶向性分析)。
图8：热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒光热治疗细胞抑制率结果。(肿瘤细胞杀 伤效果分析)
本发明首先利用溶剂热-还原法联用制备稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)，如图3 投射电镜测试结果显示，制备的上转换纳米粒(左图)粒径小于50nm，粒度分布均匀，制 备的稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)(右图)粒径小于50nm，粒度分布均匀。接着利 用反相蒸发法对制备的核壳纳米粒进行亲水性改性，如图4粒径分析表明，制备好的稀土 上转换-金核壳纳米粒颗粒尺寸为112nm。如图5红外结构分析所示，制备好的稀土上转换 -金核壳纳米粒表面包覆一层有机分子，且表面成功键联了靶向分子RGD多肽。如图6进 行细胞毒性实验结果表明，制备的稀土上转换-金核壳纳米粒细胞毒性非常低。如图7进 行细胞内吞实验结果表明，制备得到的靶向稀土上转换-金核壳纳米粒能够有效进入肿瘤 细胞，在细胞内富集。如图8进行热疗杀伤效果实验后表明，靶向稀土上转换-金核壳纳 米粒能够有效地通过光热杀伤肿瘤细胞，经30分钟照射后，80％的肿瘤细胞被杀死，有效 抑制了肿瘤细胞的生长。
具体实施方式
下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施例1：
1、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成：
(1)分别取40mg氯化镱、10mg氯化钇和1mg氯化铒，将上述三种物质加入到四毫升 水中，在磁力搅拌条件，加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。
(2)水蒸干后，用移液管加入6mL油酸配体溶剂及1mL十八烯配体溶剂使白色固体 完全溶解；
(3)冷却至60℃，加入6mgNaOH、5mg氟化铵，用五毫升甲醇溶解；调节温度升温到 150℃，采用油泵抽真空40min，通氩气；迅速升温到270℃，维持反应3小时；结束后加 入丙酮离心纯化，产物上转换纳米粒真空干燥处理。
(4)分别取10mg上转换纳米粒子、10mg氯金酸，将上述两种物质加入到4mL吐温 80水溶液中(吐温浓度为2mg/mL)，搅拌3小时。
(5)接着将溶液pH值调节到9，将50mg的羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中。
(6)反应3.5小时后，加入丙酮离心纯化，产物上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。 组装的到的颗粒尺寸为：56nm。图3：按照实施例1合成的稀土上转换-金核壳纳米粒(左) 和热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒(右)投射电子显微镜照片(形貌分析)。
2、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰：
(1)分别取10mg稀土上转换-金核壳纳米粒、500mg巯基乙胺，将上述两种原料加入 十毫升水中完全溶解。
(2)磁力搅拌条件下加热到30℃，反应2小时。反应完全后离心纯化，基乙胺保护 的稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。
(3)分别取10mg靶向分子RGD多肽(商品化)和50mg巯基乙胺保护的稀土上转换- 金核壳纳米粒，将上述两种原料加入五毫升水中。
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC，商品化) 1mg。
(5)接着磁力搅拌条件下，反3小时。反应完全后离心纯化，最终产物真空干燥处 理后保存。制备得到表面靶向分子RGD的密度为：0.8mmol/g。
实施例2：
1、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成：
(1)分别取10mg氯化镱、60mg氯化钇和1mg氯化铒，将上述三种物质加入到四毫升 水中，在磁力搅拌条件，加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。
(2)水蒸干后，用移液管加入20mL油酸配体溶剂及10mL十八烯配体溶剂使白色固 体溶解；
(3)冷却至40℃，加入20mgNaOH、5mg氟化铵，用五毫升甲醇溶解；调节温度升温 到100℃，采用油泵抽真空10min，通氩气；迅速升温到250℃，维持反应2小时；结束后 加入丙酮离心纯化，产物上转换纳米粒真空干燥处理。
(4)分别取5mg上转换纳米粒子、50mg氯金酸，将上述两种物质加入到四毫升吐温 80水溶液中(吐温浓度为2mg/mL)，搅拌1小时。
(5)接着将溶液pH值调节到10，将5mg的羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中。
(6)反应1小时后，加入丙酮离心纯化，产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处 理。组装的到的颗粒尺寸为20nm。
2、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰：
(1)分别取10mg稀土上转换-金核壳纳米粒、2000mg巯基乙胺，将上述两种原料加 入十毫升水中完全溶解。
(2)磁力搅拌条件下加热到42℃，反应3小时。反应完全后离心纯化，产物巯基乙 胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。
(3)分别取20mg靶向分子RGD多肽(商品化)和50mg巯基乙胺保护的稀土上转换- 金核壳纳米粒，将上述两种原料加入五毫升水中。
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC，商品化) 3mg。
(5)接着磁力搅拌条件下，反应1小时。反应完全后离心纯化，最终产物真空干燥 处理后保存。制备得到表面靶向分子RGD的密度为1.3mmol/g。
实施例3：
1、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成：
(1)分别取20mg氯化镱、40mg氯化钇和1mg氯化铒，将上述三种物质加入到四毫升 水中，在磁力搅拌条件，加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。
(2)水蒸干后，用移液管加入20mL油酸配体溶剂及5mL十八烯配体溶剂使白色固体 完全溶解；
(3)冷却至60℃，加入1mgNaOH、5mg氟化铵，用五毫升甲醇溶解；调节温度升温到 150℃，采用油泵抽真空30min，通氩气；迅速升温到300℃，维持反应1小时；结束后加 入丙酮离心纯化，产物真空上转换纳米粒子干燥处理。
(4)分别取5mg上转换纳米粒子、5mg氯金酸，将上述两种物质加入到四毫升吐温 80水溶液中(吐温浓度为2mg/mL)，搅拌4小时。
(5)接着将溶液pH值调节到8，将20mg的羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中。
(6)反应4小时后，加入丙酮离心纯化，产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处 理。组装得到的稀土上转换-金核壳纳米粒颗粒尺寸为80nm。
2、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰：
(1)分别取10mg稀土上转换-金核壳纳米粒、1000mg巯基乙胺，将上述两种原料加 入十毫升水中完全溶解。
(2)接着磁力搅拌条件下加热到50℃，反应1小时。反应完全后离心纯化，产物巯 基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。
(3)分别取2mg靶向分子RGD多肽(商品化)和50mg巯基乙胺保护的稀土上转换- 金核壳纳米粒，将上述两种原料加入五毫升水中。
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC，商品化) 2mg。
(5)接着磁力搅拌条件下，反应2小时。反应完全后离心纯化，产物靶向稀土上转 换-金核壳纳米粒真空干燥处理后保存。制备得到表面靶向分子RGD的密度为：0.4mmol/g。
实施例4：
1、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成：
(1)分别取50mg氯化镱、60mg氯化钇和2mg氯化铒，将上述三种物质加入到四毫升 水中，在磁力搅拌条件，加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。
(2)水蒸干后，用移液管加入20mL油酸配体溶剂及10mL十八烯配体溶剂使白色固 体完全溶解；
(3)冷却至45℃，加入10mgNaOH、10mg氟化铵，用五毫升甲醇溶解；调节温度升温 到120℃，采用油泵抽真空30min，通氩气；迅速升温到280℃，维持反应1.5小时；结束 后加入丙酮离心纯化，产物真空上转换纳米粒子干燥处理。
(4)分别取6mg上转换纳米粒子、9mg氯金酸，将上述两种物质加入到四毫升吐温 80水溶液中(吐温浓度为2mg/mL)，搅拌2小时。
(5)接着将溶液pH值调节到8.5，将12mg的羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中。
(6)反应2小时后，加入丙酮离心纯化，产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处 理。组装得到的稀土上转换-金核壳纳米粒颗粒尺寸为70nm。
2、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰：
(1)分别取5mg稀土上转换-金核壳纳米粒、500mg巯基乙胺，将上述两种原料加入 十毫升水中完全溶解。
(2)接着磁力搅拌条件下加热到45℃，反应2.5小时。反应完全后离心纯化，产物 巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。
(3)分别取10mg靶向分子RGD多肽(商品化)和50mg巯基乙胺保护的稀土上转换- 金核壳纳米粒，将上述两种原料加入五毫升水中。
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC，商品化) 2.5mg。
(5)接着磁力搅拌条件下，反应2.5小时。反应完全后离心纯化，产物靶向稀土上 转换-金核壳纳米粒真空干燥处理后保存。制备得到表面靶向分子RGD的密度为：1mmol/g。
实施例5：
1、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成：
(1)分别取10mg氯化镱、10mg氯化钇和0.5mg氯化铒，将上述三种物质加入到四毫 升水中，在磁力搅拌条件，加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。
(2)水蒸干后，用移液管加入24mL油酸配体溶剂及6mL十八烯配体溶剂使白色固体 完全溶解；
(3)冷却至50℃，加入3mgNaOH、2.5mg氟化铵，用五毫升甲醇溶解；调节温度升温 到100℃，采用油泵抽真空35min，通氩气；迅速升温到260℃，维持反应2小时；结束后 加入丙酮离心纯化，产物真空上转换纳米粒子干燥处理。
(4)分别取8mg上转换纳米粒子、16mg氯金酸，将上述两种物质加入到四毫升吐温 80水溶液中(吐温浓度为2mg/mL)，搅拌2小时。
(5)接着将溶液pH值调节到9，将16mg的羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中。
(6)反应3小时后，加入丙酮离心纯化，产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处 理。组装得到的稀土上转换-金核壳纳米粒颗粒尺寸为65nm。
2、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰：
(1)分别取5mg稀土上转换-金核壳纳米粒、300mg巯基乙胺，将上述两种原料加入 十毫升水中完全溶解。
(2)接着磁力搅拌条件下加热到45℃，反应2.5小时。反应完全后离心纯化，产物 巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。
(3)分别取15mg靶向分子RGD多肽(商品化)和50mg巯基乙胺保护的稀土上转换- 金核壳纳米粒，将上述两种原料加入五毫升水中。
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC，商品化) 2mg。
(5)接着磁力搅拌条件下，反应2小时。反应完全后离心纯化，产物靶向稀土上转 换-金核壳纳米粒真空干燥处理后保存。制备得到表面靶向分子RGD的密度为：0.8mmol/g。
实施例6：
1、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成：
(1)分别取25mg氯化镱、40mg氯化钇和1mg氯化铒，将上述三种物质加入到四毫升 水中，在磁力搅拌条件，加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。
(2)水蒸干后，用移液管加入18mL油酸配体溶剂及6mL十八烯配体溶剂使白色固体 完全溶解；
(3)冷却至55℃，加入4mgNaOH、5mg氟化铵，用五毫升甲醇溶解；调节温度升温到 130℃，采用油泵抽真空20min，通氩气；迅速升温到260℃，维持反应2小时；结束后加 入丙酮离心纯化，产物真空上转换纳米粒子干燥处理。
(4)分别取5mg上转换纳米粒子、25mg氯金酸，将上述两种物质加入到四毫升吐温 80水溶液中(吐温浓度为2mg/mL)，搅拌2小时。
(5)接着将溶液pH值调节到9，将10mg的羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中。
(6)反应2小时后，加入丙酮离心纯化，产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处 理。组装得到的稀土上转换-金核壳纳米粒颗粒尺寸为60nm。
2、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰：
(1)分别取3mg稀土上转换-金核壳纳米粒、360mg巯基乙胺，将上述两种原料加入 十毫升水中完全溶解。
(2)接着磁力搅拌条件下加热到45℃，反应1.5小时。反应完全后离心纯化，产物 巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。
(3)分别取20mg靶向分子RGD多肽(商品化)和100mg巯基乙胺保护的稀土上转换 -金核壳纳米粒，将上述两种原料加入五毫升水中。
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC，商品化) 4mg。
(5)接着磁力搅拌条件下，反应1.5小时。反应完全后离心纯化，产物靶向稀土上 转换-金核壳纳米粒真空干燥处理后保存。制备得到表面靶向分子RGD的密度为： 0.9mmol/g。
形态观察、粒径及其分布测定：
取样品溶液经超速离心分离后，取出沉淀物，加蒸馏水少量使分散，滴于碳支持膜上 制样，在透射电镜下观察其形貌状态并拍照。透射电镜下观察到靶向稀土上转换-金核壳 纳米制剂颗粒呈均匀规则的球形粒子。实验测得的靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂粒径 分布均匀，在20—80nm范围内可控。
MTT法测试热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的细胞毒性：
1)取处于对数生长期的小鼠成纤维细胞，0.125％胰蛋白酶消化后充分吹打成单细胞悬 液，计数后调整细胞浓度为5×104/m1。
2)向96孔板的每孔中加入100μl细胞悬液，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
3)将120μl含有一定浓度的热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒溶液加入到新鲜培 养基中，并在37℃，5％CO2培养箱中通细胞共培养24h。
4)24h后取出培养板，向每个孔中加入10μl MTT溶液，在37℃，5％CO2培养箱中继 续培养4h后，小心吸取培养孔中的培养基，向每个孔中加入200μl DMSO(二甲基亚砜) 溶液，在摇床上摇动20min，使DMSO溶液充分地溶解Formazan晶体。
5)用酶联免疫检测仪在570nm波长处，以空白管调零，测定各孔的吸光值A，按下式 计算细胞存活率。每组设8个平行，计算其平均值。
细胞存活率(％)＝实验细胞组吸光值(A2)/空白细胞组吸光值(A1)*100％
图6：热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒细胞毒性MTT实验结果(安全性分析)。 热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的体外热疗效果实验：
1)取处于对数生长期的Hela细胞，0.125％胰蛋白酶消化后充分吹打成单细胞悬液， 计数后调整细胞浓度为5×104/m1。
2)向96孔板的每孔中加入100μl细胞悬液，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
3)将120μl含有一定浓度的聚马来酸酐-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米光敏制剂溶液 加入到新鲜培养基中，并在37℃，5％CO2培养箱中通细胞共培养3h。
4)3h后取出培养板，向96孔板中加入等量新鲜培养基。
5)用980nm近红外激光器连续激光器，在2M条件下，照射细胞10分钟。
6)接着向每个孔中加入10μlMTT溶液，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h后， 小心吸取培养孔中的培养基，向每个孔中加入200μl DMSO(二甲基亚砜)溶液，在摇床 上摇动20min，使DMSO溶液充分地溶解Formazan晶体。
6)用酶联免疫检测仪在570nm波长处，以空白管调零，测定各孔的吸光值A，按下式 计算细胞存活率。每组设8个平行，计算其平均值。
细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率
＝100％-[实验细胞组吸光值(A2)/空白细胞组吸光值(A1)*100％]
图7：热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒细胞内吞共聚焦照片(靶向性分析)。图 8：热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒光热治疗细胞抑制率结果。(肿瘤细胞杀伤效果 分析)