千层纸素苷在制备抗肿瘤转移药中的应用.pdf

本发明属于抗肿瘤药领域，公开了千层纸素苷在制备抗肿瘤转移药中的应用。根据本发明提出了千层纸素苷在制备抗肿瘤转移药中的应用，可将千层纸素苷制备成各种剂型的抗肿瘤转移的药物，为肿瘤病人提供了更好的选择。

权利要求书
1.  千层纸素苷在制备抗肿瘤转移药中的应用。

2.  根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤是肝癌。

3.  根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的抗肿瘤转移是指抑制肿瘤细胞 侵袭和迁移。

说明书千层纸素苷在制备抗肿瘤转移药中的应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤药领域，涉及千层纸素苷在制备抗肿瘤转移药中的应用。
背景技术
肿瘤转移是一个多阶段复杂的过程，其中包括肿瘤细胞的脱落、迁移、黏附、生长 等，每一阶段都受着不同因素的影响和调控，涉及到多种粘附分子、基质蛋白酶、细胞 因子以及相应的信号转导机制和相关的基因改变。如肿瘤细胞在转移的早期依靠多种蛋 白酶，尤其是基质金属蛋白酶和尿激酶降解细胞外基质和基底膜。随后，肿瘤细胞借助 不同粘附分子作用产生的外力和自身的一些运动相关蛋白而脱离原来的组织，侵入血管 或淋巴管内并游向远处器官和组织，此时粘附分子协助肿瘤细胞附壁并最终游出管壁， 从而形成一个转移灶。但是，并不是所有的抗肿瘤药都是通过抗肿瘤转移机制发挥作用 的，有些药物对原发病灶具有较好的治疗效果，但没有抑制肿瘤远处转移的作用，有些 药物有较好的抑制肿瘤转移作用，但对原发病灶肿瘤的治疗作用不佳，比如只是影响肿 瘤细胞的脱落、迁移、粘附等阶段的某一因素，而没有影响肿瘤细胞的生长，故可抑制 肿瘤转移但不一定抑制肿瘤生长。另外，肿瘤的转移与肿瘤细胞本身的生物学特性是有 一定关系的，有些肿瘤如头颈部肿瘤以局部浸润和复发为主，鲜有转移，而某些肿瘤如 小细胞肺癌、骨肉瘤等则极易发生转移。另外，肿瘤的类型不同，转移的途径亦不同， 一般来说，癌以淋巴道转移多见，而肉瘤则以血道转移为多见，有些肿瘤则通过种植转 移形式，这些差别均对肿瘤的治疗与预后产生不同的影响，因此，合理选用相应药物是 肿瘤成功治疗的关键，能够明确药物属于哪一类抗肿瘤药有助于针对不同类型的肿瘤进 行合理用药。
千层纸素是黄芩的活性组分之一，具有明显的抗肿瘤作用，是一个具有广阔应用前 景的天然抗肿瘤药物。然而，千层纸素药理作用广泛，其抗肿瘤作用的机制目前尚未完 全阐明。千层纸素A-7-葡萄糖醛酸苷(千层纸素苷，Oroxyloside，OAG)也是黄芩的活性 组分之一，与千层纸素并非同一物质，目前对千层纸素苷的研究较少，相关药理作用的 研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供千层纸素苷在制备抗肿瘤药中的应用。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
千层纸素苷在制备抗肿瘤转移药中的应用，尤其是针对肝癌的抗肿瘤转移药，其发 挥抗肿瘤转移作用的机制是千层纸素苷针对肿瘤细胞具有抑制肿瘤细胞侵袭和迁移的 能力。其制剂可以是药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、丸剂、 口服液、注射剂、膜剂、胶囊剂、脂质体等。千层纸素苷的用量可根据用药途径、患者 年龄、体重、体表面积、所治疗的疾病类型和严重程度及疗程安排等变化，其日剂量可 以是200-8000mg，可以一次或多次施用。
本发明有益效果：
千层纸素苷具有较好的抑制肿瘤细胞侵袭和迁移的能力，可用于制备抗肿瘤转移的 药物，可制备成各种剂型的抗肿瘤转移的药物，为肿瘤病人提供了更好的选择。
附图说明
图1.OAG对人肝癌细胞HepG2迁移的影响。
图2.OAG对人肝癌细胞HepG2侵袭的影响。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
药效实施例1：OAG对人肝癌细胞HepG2迁移的影响(细胞迁移实验)
1、实验材料
(1)药物
千层纸素A-7-葡萄糖醛酸苷(千层纸素苷，Oroxyloside，OAG)从市场购得，浅黄色 粉末。含量：90％，用DMSO配成母液，置于-20℃保存。临用前用RPMI-1640培养液 配成所需浓度。
(2)细胞株
人肝癌细胞HepG2来自中国科学院上海生命科学研究所生物化学与细胞生物学研 究所细胞库，用含10％小牛血清的1640培养液培养。
(3)试剂
1)培养液：RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司产品。取RPMI-1640粉末10.4g 溶于1000mL灭菌三蒸水中，用NaHCO3调pH值至7.3～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌、 分装，4℃冰箱保存。使用前加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素。
2)小牛血清：杭州四季青生物工程公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保 存于-20℃低温冰箱中。
3)PBS缓冲液：称取NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na2HPO4·H2O 1.56g、KH2PO42.0g， 溶于1000mL三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。
4)0.02％EDTA溶液：称取EDTA 20mg，溶于100mL PBS缓冲液中，低速搅拌， 调pH值至7.3～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。
5)0.25％胰酶：称取胰酶0.25g，溶于100mL PBS缓冲液中，高压灭菌。
6)DMSO溶液：美国Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo)公司产品
2、实验仪器：
1)YJ-875型医用净化工作台：苏州净化设备厂生产。
2)3111型水套式CO2培养箱：美国Thermo electron公司产品。
3)OlympusIX51型倒置荧光显微镜：日本Olympus公司产品。
4)电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。
5)LD4-2普通离心机：北京医用离心机厂产品。
6)Centrifuge 5810R型离心机：德国Eppendorf公司产品。
3、实验方法：
将HepG2消化接种到6孔板，培养到密度90％时准备划痕。用一个10μl的塑料小 枪头在细胞达到要求的孔中央划一条直线，直线应同等粗细。划完后，用PBS把飘起的 细胞洗掉。各孔相应加入含不同浓度千层纸素苷(50μM,100μM,200μM)的培养基后， 放入37℃培养箱培养。分别于0h，12h，24h，36h，48h对各剂量组划痕进行拍照。 不同时间点拍照片，直观地观察HepG2在给予千层纸素苷处理前后迁移距离的变化， 结果见图1。
4、实验结果
由图1可见，千层纸素苷能抑制肝癌细胞HepG2迁移，并呈一定的时间和浓度依 赖性。
药效实施例2：对人肝癌细胞HepG2侵袭的影响(细胞侵袭实验)
1、实验材料
(1)药物
千层纸素A-7-葡萄糖醛酸苷(千层纸素苷，Oroxyloside，OAG)从市场购得，浅黄色 粉末。含量：90％，用DMSO配成母液，置于-20℃保存。临用前用RPMI-1640培养液 配成所需浓度。
(2)细胞株
人肝癌细胞HepG2来自中国科学院上海生命科学研究所生物化学与细胞生物学研 究所细胞库，用含10％小牛血清的1640培养液培养。
(3)试剂
1)培养液：RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司产品。取RPMI-1640粉末10.4g 溶于1000mL灭菌三蒸水中，用NaHCO3调pH值至7.3～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌、 分装，4℃冰箱保存。使用前加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素。
2)小牛血清：杭州四季青生物工程公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保 存于-20℃低温冰箱中。
3)PBS缓冲液：称取NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na2HPO4·H2O 1.56g、KH2PO42.0g， 溶于1000mL三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。
4)0.02％EDTA溶液：称取EDTA 20mg，溶于100mL PBS缓冲液中，低速搅拌， 调pH值至7.3～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。
5)0.25％胰酶：称取胰酶0.25g，溶于100mL PBS缓冲液中，高压灭菌。
6)DMSO溶液：美国Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo)公司产品。
7)苏木精；伊红；固定液(甲醇)。
2、实验仪器：
1)YJ-875型医用净化工作台：苏州净化设备厂生产。
2)3111型水套式CO2培养箱：美国Thermo electron公司产品。
3)OlympusIX51型倒置荧光显微镜：日本Olympus公司产品。
4)电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。
5)LD4-2普通离心机：北京医用离心机厂产品。
6)Centrifuge 5810R型离心机：德国Eppendorf公司产品。
7)transwell小室；24孔板。
3、实验方法：
细胞悬液分瓶加药处理。HepG2点入6孔板中，待密度为60％时，分别给予千层纸 素苷(25μM,50μM,100μM；200μM)，放入细胞培养箱中48h。稀释matrigel(matrigel： 无血清培养基＝1：8)，每小室加入100μl以稀释好的matrigel，37℃静置30min以上， 造模。消化经千层纸素苷处理过的HepG2细胞，用无血清的培养基重悬，将其稀释成2 ×105个细胞/ml。取出transwell小室放入24孔板孔中。每孔已有600μl含有血清的 培养基，小室上层加入细胞悬液400μl。放入孵箱培养4h。取出小室，用棉签擦去微 孔滤膜内侧未穿过的细胞。固定液固定2分钟，纯水清洗。苏木精染色15分钟，纯水 清洗；伊红染色20秒，吹水清洗，棉签擦干。显微镜下取左右上下中五个视野，拍照， 取平均值，结果见图2。
4、实验结果：
由图2可见，千层纸素苷能抑制肝癌细胞HepG2侵袭，并呈浓度依赖性。
结论：千层纸素苷具有抑制肿瘤细胞侵袭和迁移的能力。
制剂实施例1
取千层纸素苷10g，加入注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)适当辅料， 按注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)工艺制备成抗肿瘤药注射剂，每支含 千层纸素苷500mg。
制剂实施例2
取千层纸素苷10g，加入片剂(包括缓控释片，骨架片，包衣片，分散片等)适当 辅料，按片剂(包括缓控释片，骨架片，包衣片，分散片等)工艺制备成抗肿瘤药片剂， 每片含千层纸素苷300mg。
制剂实施例3
取汉千层纸素苷10g，加入胶囊剂适当辅料，按胶囊剂工艺制备成抗肿瘤药胶囊， 每粒含千层纸素苷300mg。
制剂实施例4
取千层纸素苷10g，加入口服液适当辅料，按口服液工艺制备成抗肿瘤药口服液， 每支含含千层纸素苷300mg。