苔藓植物作为植物外植体消毒剂的用途、及该消毒剂组合物及其制备方法和使用方法 【技术领域】
本发明涉及植物组培技术的消毒，具体涉及将苔藓植物用于植物外植体消毒剂的新用途，及该消毒剂组合物及其制备方法和使用方法。
背景技术
植物组织培养中的污染主要是由外植体带菌、接种操作污染、培养室污染等原因造成；后两者可以通过熟练操作过程和提高培养室洁净度而避免，而外植体带菌就需要选择适合的消毒方式，严格消毒处理，再经无菌操作接种到无菌培养基上。依据传统的表面灭菌处理技术，采来的外植体除去不用的部分之后，还需对其进行以下几个步骤的处理：(1)外植体表面灭菌从室外带回来的材料，要除去一些不必要的部分，洗去泥土，然后用洗洁剂浸泡、冲洗，必要时可用软刷刷洗或用脱脂棉球擦洗材料表面，然后剪成适宜的大小，通过表面灭菌可清除许多杂菌。(2)植物材料浸入70％的酒精处理。(3)用消毒剂处理，常用的表面灭菌剂有酒精、升汞、双氧水以及次氯化物。(4)无菌水漂洗。外植体的彻底消毒是组织培养成功的关键因素之一。外植体消毒剂的选择上应该既考虑到有效减少或阻止植物组织培养基的微生物污染，又要兼顾植物组织正常生长或发育。
中国专利CN1561695A公开了一种植物组培消毒方法，采用次氯酸钠和氯化汞作为植物材料消毒剂，但是，氯化汞是剧毒物质，污染环境、消毒后难以除去残余汞对外植体的杀伤作用；次氯酸盐对组织也有毒害作用。实践中出现的问题是，消毒时间长了植物材料死亡，消毒时间短了植物材料表面细菌不能杀死，致使植物材料污染死亡。中国专利CN101461329A公开了一种外植体的表面灭菌方法，采用的次氯酸钠、氯化汞、溴水作为消毒剂，但这种消毒剂对于具有内生菌的植物材料消毒效果较差，其蝴蝶兰组培的污染率多达50％，红掌组培的污染率更高达65％。中国专利CN101138317A公开了组织内带菌外植体消毒的处理方法，外植体消毒仍然采用常规的酒精浸泡和次氯酸钠消毒，在组织培养基中加入羧苄青霉素、硫酸链霉素和制菌霉素，防治组培污染，但是它不是针对植物外植体本身消毒，而是针对组培培养基，而且，抗生素会造成植物毒害或改变培养植物的行为。中国专利CN1871889A公开了一种植物内生菌脱除方法，在采集植物组织之前对植株进行农药连续喷施三次后，开始采外植体进行组培，操作不便且对于随机采集珍贵物种组培不适合，亦难以推广。
苔藓植物是一群小型的多细胞高等植物，多适生于阴湿的环境中，不被细菌、真菌或病毒所感染，具有不易腐烂，不易霉变，不被昆虫和一些动物所侵害等特点。存放在标本馆里的苔藓植物标本，不像其它高等植物那样易受寄生微生物(细菌、真菌等)的侵蚀，不需经过特别处理就可以长期存放。苔藓植物作为简单的陆生植物，形态学上防御屏障几乎没有，为适应其生存环境，发展了所谓的“化学屏障”，即能够合成具有抗微生物活性的次生代谢产物以保护自身，抵抗微生物的侵害。在民间，苔藓被广泛用于治疗外伤、烧伤、感染、肺结核、烫伤和肺炎等症。苔藓具有抗病原微生物的作用，可以在阴暗、暖湿的环境生活，免受自然界各种病菌的感染，主要原因就是苔藓内的多种抗菌活性成分，对众多细菌、真菌、病毒同时具有抑制作用，是少有的天然来源的抗真菌化合物，可谓一种天然的广谱抗菌物质。目前还未见有将苔藓植物用于植物组培消毒的相关研究和报道。
【发明内容】
本发明要解决的是现有的用于植物组培的消毒剂杀菌效果不理想或容易使植物本身受到毒害的技术问题，而首次将苔藓植物用作植物外植体消毒的消毒剂，并提供这种消毒剂组合物，该组合物含有苔藓植物杀菌抑菌活性成分，用于植物外植体消毒，降低植物组培微生物污染，具有安全无毒、杀菌性能好的优点，本发明还提供了这种消毒剂组合物的制备方法和使用方法。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：一种用于植物外植体的消毒剂组合物，其特征在于，该组合物包括活性成分、渗透剂、稳定剂和助溶剂，所述活性成分为苔藓植物，其中各组分重量比为：
苔藓植物：85-100重量份，
渗透剂：2-5重量份，
稳定剂：5-10重量份，
助溶剂：0.5-1重量份。
所述苔藓植物的重量为苔藓植物经烘干、研磨制得的干粉的重量。
所述苔藓植物为鞭苔属(Bazzania)、耳叶苔属(Frullania)、羽苔属(Plagiochiala)、光萼苔属(Porella)、扁萼苔属(Radula)、蛇苔属(Conocephalum)、地钱属(Marchantia)、仙鹤藓属(Artichum)、曲尾藓属(Dicranum)、提灯藓属(Mnium)、金发藓属(Poylrtiehum)或泥炭藓属(Sphagnum)植物，所述苔藓植物为上述一种苔藓植物的或两种以上苔藓植物混合物。所述活性成分为苔藓植物制成干粉并用95％乙醇提取的苔藓植物提取液。
所述渗透剂为烷基酚聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物、月桂醇醚硫酸盐或月桂氮卓酮中的一种或两种以上的混合物。所述稳定剂为环氧化甲基硬脂酸酯、甘油单硬脂酸酯、烷基丁二酸酯磺酸盐、羟基苄基磷酸酯或改性蓖麻油中的一种或两种以上的混合物。所述助溶剂为丙二醇、丙酮或环己酮中的一种或两种以上的混合物。
本发明还提供了上述用于植物外植体的消毒剂组合物地制备方法，包括如下步骤：
1)清洗、研磨：将苔藓植物用蒸馏水洗净，于烘箱内40℃下烘干，研磨粉碎20-40目颗粒；
2)溶解：将苔藓植物溶于相当于其5-20倍重量的提取液中，提取液为95％乙醇；
3)逆渗、浸提：在0.04-0.07Mpa、20-60℃条件下提取上述溶液10-30分钟；
4)超声波助溶：频率20kHz的超声波，震荡时间5-30分钟；
5)超滤：选用孔径为0.8μm或1.2μm的超滤膜过滤，在0.04-0.07Mpa压力下，超滤5-20分钟，得苔藓植物提取液；
6)混合：按所述比例先后添加渗透剂、助溶剂、稳定剂至苔藓植物提取液，混合均匀，静置后即为消毒剂组合物成品。
本发明进一步提供了用于植物外植体的消毒剂组合物的使用方法，按照如下步骤使用：
1)将所述消毒剂组合物用无菌水稀释至浓度为5％-60％的消毒剂溶液，待用；
2)取植物外植体的离体植物器官，经流水冲洗去表面尘土，用70％酒精处理10-60秒；
3)取步骤1)中的消毒剂溶液对植物外植体浸泡消毒5-30分钟，用无菌水冲洗至清，用滤纸吸取多余水分，接种到相应的培养基中即可。
本发明所能达到的有益效果是：
1、本发明消毒剂组合物专门用于乙醇处理后的植物外植体的消毒，是将苔藓植物的杀菌抑菌活性成分首次应用在植物外植体消毒上，并按照一定比例混合达到协同增效作用，并借助调节渗透剂，对植物外植体具有的多种微生物有效杀灭及抑制；
2、本发明组合物来自于天然植物，安全无毒，对环境和植物组织无害，试验证明植物外植体消毒剂浸泡后可以大大降低植物组织培养的污染率，植物组织正常生长或发育，使用效果好；
3、本发明组合物杀菌抑菌活性成分来源于植物，能与植物外植体组织形成较好的亲和关系，能够渗透到植物内部对植物内生菌有较强的杀灭作用，同时对植物材料无伤害；
4、本发明组合物制备方法简单、原料易得、价格便宜、便于推广应用。
【具体实施方式】
第一实施例
本发明第一实施例用于植物外植体的消毒剂组合物，包括如下重量的各组分：
组成 具体物质 重量 苔藓植物 鞭苔 85g 渗透剂 烷基酚聚氧乙烯醚 2g 稳定剂 改性蓖麻油 6g 助溶剂 丙二醇 0.6g
其中苔藓植物的重量为苔藓植物制成干粉的重量(以下实施例相同)。
该植物外植体消毒剂组合物的制备过程为：
1)清洗、研磨：将新鲜鞭苔用蒸馏水洗净，于烘箱内40℃下烘干，研磨粉碎成20目颗粒；
2)溶解：将85g鞭苔干粉溶于425g95％乙醇溶液中；
3)逆渗、浸提：在0.04Mpa、60℃条件下将上述溶液提取10分钟；
4)超声波助溶：频率20kHz的超声波，震荡时间5分钟；
5)超滤：选用孔径为0.8μm的超滤膜过滤，在0.04Mpa压力下，超滤20分钟，得鞭苔提取液；
6)混合：按所述重量先后添加渗透剂、助溶剂、稳定剂至鞭苔提取液，混合均匀，静置后即为消毒剂组合物成品。
该植物外植体消毒剂组合物用于蝴蝶兰花梗组培消毒的使用方法为：
1)将上述消毒剂组合物用无菌水配置成浓度为5％的消毒剂溶液，待用；
2)蝴蝶兰花梗经流水冲洗去表面尘土，70％酒精处理10秒，
3)在步骤1的溶液浸泡蝴蝶兰花梗，浸泡消毒30分钟，用无菌水冲洗至清，用滤纸吸取多余水分，接种到MS培养基中即可。
第二实施例
本发明第二实施例用于植物外植体的消毒剂组合物，包括如下重量的各组分：
组成 具体物质 重量 苔藓植物 羽苔 90g
渗透剂 月桂醇醚硫酸盐 3g 稳定剂 羟基苄基磷酸酯 5g 助溶剂 丙酮 0.5g
该植物外植体消毒剂组合物的制备过程为：
1)清洗、研磨：将新鲜羽苔用蒸馏水洗净，于烘箱内40℃下烘干，研磨粉碎成30目颗粒；
2)溶解：将90g羽苔干粉溶于900g95％乙醇溶液中；
3)逆渗、浸提：在0.07Mpa、20℃条件下将上述溶液提取12分钟；
4)超声波助溶：频率20kHz的超声波，震荡时间8分钟；
5)超滤：选用孔径为0.8μm的超滤膜过滤，在0.07Mpa压力下，超滤5分钟，得羽苔提取液；
6)混合：按所述重量先后添加渗透剂、助溶剂、稳定剂至羽苔提取液，混合均匀，静置后即为消毒剂组合物成品。
该植物外植体消毒剂组合物用于樱花茎尖组培消毒的使用方法为：
1)将上述消毒剂组合物用无菌水配置成浓度为30％的消毒剂溶液，待用；
2)樱花茎尖经流水冲洗去表面尘土，70％酒精处理10秒，
3)在步骤1的溶液浸泡樱花茎尖，浸泡消毒20分钟，用无菌水冲洗至清，用滤纸吸取多余水分，接种到MS培养基中即可。
第三实施例
本发明第三实施例用于植物外植体的消毒剂组合物，包括如下重量的各组分：
组成 具体物质 重量 苔藓植物 光萼苔、扁萼苔和蛇苔的混合物(重量比为1∶1∶1) 93g 渗透剂 月桂氮卓酮 3g 稳定剂 烷基丁二酸酯磺酸盐 7g 助溶剂 环己酮 0.7g
该植物外植体消毒剂组合物的制备过程为：
1)清洗、研磨：将三种新鲜苔藓用蒸馏水洗净，于烘箱内40℃下烘干，研磨粉碎成40目颗粒；
2)溶解：按取等量的三种苔藓干粉共计93g溶于1400g95％乙醇溶液中；
3)逆渗、浸提：在0.05Mpa、30℃条件下将上述溶液提取20分钟；
4)超声波助溶：频率20kHz的超声波，震荡时间20分钟；
5)超滤：选用孔径为0.8μm的超滤膜过滤，在0.05Mpa压力下，超滤15分钟，得苔藓提取液；
6)混合：按所述重量先后添加渗透剂、助溶剂、稳定剂至苔藓提取液，混合均匀，静置后即为消毒剂组合物成品。
该植物外植体消毒剂组合物用于水稻种子组培消毒的使用方法为：
1)将上述消毒剂组合物用无菌水配置成浓度为40％的消毒剂溶液，待用；
2)水稻种子经流水冲洗去表面尘土，70％酒精处理10秒，
3)在步骤1的溶液浸泡水稻种子，浸泡消毒15分钟，用无菌水冲洗至清，用滤纸吸取多余水分，接种到MS培养基中即可。
第四实施例
本发明第四实施例用于植物外植体的消毒剂组合物，包括如下重量的各组分：
组成 具体物质 重量 苔藓植物 仙鹤藓、曲尾藓属和提灯藓的混合物(重量比1∶1∶2) 95g 渗透剂 烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物和月桂醇醚硫酸盐的 混合物(重量比2∶1) 2.5g 稳定剂 环氧化甲基硬脂酸酯和甘油单硬脂酸酯的混合物 (重量比1∶2) 8g 助溶剂 丙二醇、丙酮和环己酮的混合物(重量比1∶1∶1) 0.9g
该植物外植体消毒剂组合物的制备过程为：
1)清洗、研磨：将三种新鲜苔藓植物用蒸馏水洗净，于烘箱内40℃下烘干，研磨粉碎成25目颗粒；
2)溶解：按比例将95g三种苔藓干粉溶于1900g95％乙醇溶液中；
3)逆渗、浸提：在0.06Mpa、35℃条件下将上述溶液提取25分钟；
4)超声波助溶：频率20kHz的超声波，震荡时间25分钟；
5)超滤：选用孔径为1.2μm的超滤膜过滤，在0.06Mpa压力下，超滤12分钟，得苔藓提取液；
6)混合：按所述重量先后添加渗透剂、助溶剂、稳定剂至苔藓植物提取液，混合均匀，静置后即为消毒剂组合物成品。
该植物外植体消毒剂组合物用于红掌吸芽组培消毒的使用方法为：
1)将上述消毒剂组合物用无菌水配置成浓度为60％的消毒剂溶液，待用；
2)红掌吸芽经流水冲洗去表面尘土，70％酒精处理10秒，
3)在步骤1的溶液浸泡红掌吸芽，浸泡消毒5分钟，用无菌水冲洗至清，用滤纸吸取多余水分，接种到MS培养基中即可。
第五实施例
本发明第五实施例用于植物外植体的消毒剂组合物，包括如下重量的各组分：
组成 具体物质 重量 苔藓植物 金发藓和泥炭藓的混合物(重量比1∶1) 98g 渗透剂 烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物 5g 稳定剂 甘油单硬脂酸酯和改性蓖麻油的混合物(重量 比1∶1) 9g 助溶剂 丙二醇和丙酮的混合物(重量比1∶2) 0.8g
该植物外植体消毒剂组合物的制备过程为：
1)清洗、研磨：将新鲜苔藓用蒸馏水洗净，于烘箱内40℃下烘干，研磨粉碎成35目颗粒；
2)溶解：按所述比例将98g上述苔藓干粉溶于780g95％乙醇溶液中；
3)逆渗、浸提：在0.045Mpa、50℃条件下将上述溶液提取30分钟；
4)超声波助溶：频率20kHz的超声波，震荡时间30分钟；
5)超滤：选用孔径为1.2μm的超滤膜过滤，在0.065Mpa压力下，超滤8分钟，得苔藓提取液；
6)混合：按所述重量先后添加渗透剂、助溶剂、稳定剂至苔藓植物提取液，混合均匀，静置后即为消毒剂组合物成品。
该植物外植体消毒剂组合物用于枣树茎段组培消毒的使用方法为：
1)将上述消毒剂组合物用无菌水配置成浓度为15％的消毒剂溶液，待用；
2)枣树茎段经流水冲洗去表面尘土，70％酒精处理10秒，
3)在步骤1的溶液浸泡枣树茎段，浸泡消毒25分钟，用无菌水冲洗至清，用滤纸吸取多余水分，接种到MS培养基中即可。
第六实施例
本发明第六实施例用于植物外植体的消毒剂组合物，包括如下重量的各组分：
组成 具体物质 重量 苔藓植物 地钱 100g 渗透剂 烷基酚聚氧乙烯醚和月桂氮卓酮的混合物(重量比1∶1) 4g 稳定剂 环氧化甲基硬脂酸酯 10g 助溶剂 环己酮 1g
该植物外植体消毒剂组合物的制备过程为：
1)清洗、研磨：将新鲜地钱用蒸馏水洗净，于烘箱内40℃下烘干，研磨粉碎成40目颗粒；
2)溶解：将100g地钱干粉溶于1200g95％乙醇溶液中；
3)逆渗、浸提：在0.06Mpa、25℃条件下将上述溶液提取35分钟；
4)超声波助溶：频率20kHz的超声波，震荡时间15分钟；
5)超滤：选用孔径为1.2μm的超滤膜过滤，在0.055Mpa压力下，超滤14分钟，得地钱提取液；
6)混合：按所述重量先后添加渗透剂、助溶剂、稳定剂至地钱提取液，混合均匀，静置后即为消毒剂组合物成品。
该植物外植体消毒剂组合物用于“六月红”芋茎尖组培消毒的使用方法为：
1)将上述消毒剂组合物用无菌水配置成浓度为25％的消毒剂溶液，待用；
2)“六月红”芋茎尖经流水冲洗去表面尘土，70％酒精处理10秒，
3)在步骤1的溶液浸泡“六月红”芋茎尖，浸泡消毒20分钟，用无菌水冲洗至清，用滤纸吸取多余水分，接种到MS培养基中即可。
为了验证本发明含苔藓植物的消毒剂组合物的杀菌效果以及对植物外植体组培的影响，对以上实施例进行了多组实验，并与本发明背景技术中的两现有技术配方进行组培实验的对比结果如下。
以下两表为上述实施例中植物外植体的消毒剂组合物对植物外植体消毒、灭菌性能评价对比，从中可以明显看出本发明具有极大的优势。
表1含氯化汞配方与本发明消毒剂组合物平均污染率和存活率对比
注：实验中，含氯化汞配方为参照本发明背景技术中CN101461329A中公开的配方。
表2含氯化汞配方与本发明的消毒剂组合物杀菌最小抑制浓度比较
注：实验中，含氯化汞配方1为参照本发明背景技术中CN101461329A中公开的配方，含氯化汞配方2为参照本发明背景技术中CN1561695A。
综上所陈，仅为本发明之较佳实施例而已，并非用来限定本发明实施之范围。即凡依本发明申请专利范围所做之均等变化与修饰，皆为本发明专利范围所涵盖。