人呼吸道合胞病毒的裂解方法 【技术领域】
本发明涉及一种人呼吸道合胞病毒(HRSV)颗粒的裂解方法，属于生物学技术领域。
背景技术
人呼吸道合胞病毒(HRSV)是一个世界范围内严重危害婴幼儿健康的最为常见的呼吸道感染性病原体，首次感染多发生在1岁以内的幼儿，尤其是2-6个月的婴幼儿，是造成婴幼儿期住院的主要原因之一，同时也是儿童支气管哮喘发生的重要危险因素之一。HRSV也能造成成年人感染，大约50％的成人的哮喘加重是由HRSV感染引起的。该病毒经空气飞沫和密切接触传播，易于传染并形成大爆发，危害极大。目前对HRSV性哮喘可采用的静脉用免疫球蛋白和人源性中和HRSV F蛋白的单克隆抗体。抗病毒HRSV药物存在的缺陷是一旦临床症状和体征出现，病毒复制就已经开始，而抗病毒药物只在一定程度上缓解临床症状和缩短患病时间。因此，预防性给予抗病毒药物将会是最有效的措施。而目前针对HRSV病毒，尚无理想的疫苗可用。考虑到HRSV感染的发病率和死亡率，研制HRSV疫苗显得尤为突出。
由于HRSV传统的减毒活疫苗及灭活疫苗的研究都难以在短期内难有实质性的突破，因此，近年来对RSV疫苗研究主要集中在裂解纯化疫苗。HRSV编码11个蛋白质，膜表面主要有F蛋白和G蛋白两个功能蛋白，这2个膜蛋白能诱导机体产生中和性保护抗体和细胞免疫。
根据研究，用天然病毒的某些化学成分制成的亚单位疫苗，是比较安全的，同时由于仅用病毒的部分成分做疫苗，还可去除病毒颗粒中一些会引起不良反应的成分，有针对性的刺激机体的免疫反应。因此，通过筛选及优化HRSV的裂解、纯化方案，获得具用免疫原性的HRSV亚单位蛋白组分F蛋白及G蛋白，研发HRSV裂解亚单位疫苗具有重要意义，尤其是研究裂解疫苗的技术更为必要。
【发明内容】
本发明的目的就是提供一种人呼吸道合胞病毒的裂解方法，以获得具有完全免疫原性的抗原蛋白——人呼吸道合胞病毒(HRSV)的F蛋白和G蛋白，从而诱导能保护下呼吸道的中和抗体反应。
本发明通过下列技术方案完成：一种人呼吸道合胞病毒的裂解方法，其特征在于经过下列步骤：
A、将人呼吸道合胞病毒经常规沉淀、浓缩成病毒液；
B、在上述A步骤的病毒液中，加入NP-40至最终体积浓度为1～2％，或者加入去氧胆酸钠至最终质量浓度为3～4％，混合均匀后，在20～37℃下裂解90～120min，得人呼吸道合胞病毒HRSV的F蛋白和G蛋白。
所述人呼吸道合胞病毒(HRSV)采集于发病2-3天的患者咽式子，经常规方法分离后，用人二倍体KMB17细胞按常规方法培养收获而得。所述NP-40、去氧胆酸钠均为市购分析纯产品。
本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，可有效地对人呼吸道合胞病毒(HRSV)颗粒进行裂解，直接获得免疫原性较完整的目的蛋白——人呼吸道合胞病毒(HRSV)F蛋白和G蛋白，与现有的人呼吸道合胞病毒(HRSV)的重组疫苗和核酸疫苗相比免疫原性更好，可诱导机体产生有效的免疫应答，同时可以去除减毒活疫苗病毒颗粒中一些引起不良反应的成分，提高疫苗的安全性。
所得蛋白经电泳检测，从电泳图上能够观察到两条目标蛋白，且目标蛋白条带的量较多，并可通过Western-blot实验鉴别出目标蛋白具有特异的免疫原性，说明NP-40、去氧胆酸钠这2种裂解剂对人呼吸道合胞病毒(HRSV)的裂解效果较其他常用裂解剂好，可作为裂解疫苗的较佳裂解剂。
【具体实施方式】
下面通过实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
一步骤、病毒的培养
1)取现有技术中的常规人二倍体KMB17细胞致密单层，按1∶2的比例传代，37℃孵箱培养55小时；
2)当细胞面积为90％单层时，在250cm2塑料培养瓶中接种1.5ml人呼吸道合胞病毒HRSV种子，并加入常规细胞维持液150ml，静置于37℃孵箱中培养，每次均设立正常细胞对照；其中：该人呼吸道合胞病毒HRSV种子是按常规采集于发病2天的患者咽式子，经常规方法分离纯化而得，并已适应人二倍体KMB17细胞，其病毒滴度为6.5logCCID50；
3)显微镜下观察细胞病变达80％时，收获病毒液冻存于-20℃备用。
二步骤、病毒液初纯和浓缩
(1)将600ml一步骤3)的病毒收获液融化后，收集于离心管中，以3000rpm的转速在4℃下离心30min，弃沉淀，取上清；
(2)在步骤(1)获得的上清中加入NaCl至终浓度达到0.6mol/L，再加入PEG-6000至最终质量浓度达10％，充分混匀溶解，静置于4℃冰箱沉淀过夜；
(3)将步骤(2)中经过沉淀的病毒液，以10000rpm的转速在4℃下离心2h，弃上清，取沉淀；
(4)按30倍浓缩的比例将步骤(3)的沉淀用0.01M PBS溶液溶解，制成粗纯浓缩病毒液，存于-70℃备用。
三步骤、病毒裂解
取二步骤(4)的粗纯浓缩病毒液100ml，在其中加入2ml NP-40，使最终体积浓度达到2％，充分混合后，在35℃下裂解90min，得裂解物。
四步骤、SDS-PAGE蛋白电泳分析
(1)清洁蛋白电泳所用胶条、玻璃板、瓷板和制胶槽均为常规产品，按说明书安装垂直板电泳槽，并检漏；
(2)制备分离胶
按常规配制10ml质量浓度为10％地分离胶，混匀该分离胶后，用吸管将分离胶溶液加至瓷板与玻璃板间的缝隙内，约4.5cm高，吸取少量蒸馏水进行密封；30min后，倒掉蒸馏水，得分离胶；
(3)制备浓缩胶
按常规配制质量浓度为5％的浓缩胶溶液3ml，混匀后将浓缩胶溶液加到上述(2)的分离胶上，将制胶梳齿插入浓缩胶内，避免带入气泡，15min后浓缩胶聚合凝固，拔去制胶梳齿，得带齿孔的浓缩胶。
(4)样品处理及加样
将三步骤的裂解物与4×蛋白电泳缓冲液按体积比为3∶1的比例混匀，沸水浴加热5min，冷却后将裂解物用微量移液器加至四步骤(3)的浓缩胶齿孔(即样品孔)中，加样体积为10μL(含2μg蛋白质)。
(5)加电泳缓冲液
将pH 8.3，稀释5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(工作液为1×Tris-甘氨酸缓冲液)倒入电泳槽中。
(6)电泳
打开直流稳压电泳仪开关，将电压调至80V后开始电泳，待电泳样品进入分离胶时，再将电流调至120V，当蛋白电泳缓冲液中溴酚蓝指示剂迁移至底部时，关闭电源，终止电泳，取出电泳凝胶，在它的一端切除一角作为标记，移入培养皿内。
(7)染色及脱色
在培养皿中倒入染色液，使用空气浴摇床染色1h，取出电泳凝胶，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液对其脱色2h，期间更换脱色液数次，直到蛋白区带清晰后取出，观察出现在电泳凝胶上63KD和32KD的蛋白条带，分析裂解结果。
五步骤、Western-blot法鉴定裂解后的F蛋白和G蛋白
(1)SDS-PAGE
采用四步骤所得的质量浓度为10％的分离胶，质量浓度为5％的浓缩胶，预染Marker作蛋白Marker，基本方法同步骤四，在裂解样品电泳完成后，无需考马斯亮蓝染色和丽春红染色。
(2)尼龙膜(PVDF膜)和滤纸的预处理
剪裁出与上一步电泳所得凝胶大小一致的PVDF膜浸泡在100％甲醇溶液中，待此膜变为半透明时取出，用蒸馏水洗涤数次，再浸泡在Western-blot转移缓冲溶液里，中和平衡至少5min，备用；再剪裁同样大小的滤纸数张，用转移缓冲液浸湿备用。
(3)半干法转膜
将与转膜仪配套的塑料膜置于其底侧，按说明书依次在塑料膜的中央镂空处依次放置三层用Western-blot转移缓冲溶液浸湿的滤纸，处理过的PVDF膜和电泳凝胶，再在胶上覆盖三层同样的滤纸。
使用恒流转膜，电流大小为1cm2×0.8mA。根据目标蛋白的分子量，转膜时间应为45min。待转膜结束后，关闭电源，取出PVDF膜。若预染Marker较清晰地出现在膜上，就证明转膜成功，可以进行下一步实验。
(4)封闭
将PDVF膜放入可热塑封的塑料袋中，根据PDVF膜的面积以0.1ml/cm2的量加入封闭液，排尽气泡，密封袋口，平放于37℃温箱温育2h。
(5)抗原抗体反应
剪开塑料袋，弃封闭液，用PBST液洗涤膜3次，每次不少于10min。按说明书以1∶500的浓度用封闭液来稀释小鼠抗HRSV抗体(一抗)，仍按0.1ml/cm2的量在新的塑料袋中加入稀释过的一抗，排尽气泡，封闭袋口，平放于4℃冰箱过夜。
次日，剪开塑料袋，弃一抗稀释液，取出膜。再次用PBST洗涤膜3次，每次不少于10min。以1∶200的浓度用封闭液稀释HRP-羊抗鼠IgG抗体偶联物(二抗)。在新塑料袋中加入二抗的稀释液，排尽气泡，密封袋口，平放于37℃温箱温育60min。
(6)显色
剪开塑料袋，取出PDVF膜，用PBST液漂洗膜3次，每次10min。按显色试剂盒说明，配制成3ml显色液，将膜放入显色液中，室温遮光反应，5-15min内出现棕色特异性条带。当条带颜色深度达到要求，立即用蒸馏水洗膜终止反应，晾干后观察结果，两种裂解剂裂解的样品在63KD和32KD处均可看到有特异性蛋白条带出现。
所用溶液如下：
1.0.01M的PBS溶液：NaCl 8g，KCl 0.20g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，蒸馏水600ml混匀后调整pH值到7.4，加入蒸馏水定容到1L。
2.Western-blot转移缓冲溶液(1L)
Tris碱 3.0g
甘氨酸 14.4g
甲醇 100ml～200ml
蒸馏水 600ml
调整PH值到8.2～8.4，加蒸馏水定容到1L。
3.PBST液(1L)
NaCl 8g
KCl 0.20g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
蒸馏水 600ml
加入500ul Toween-20，混匀后调整pH值到7.4，加入蒸馏水定容到1L。
上述0.6mol/L NaCl、10％PEG-6000、Tri s-甘氨酸缓冲液、蛋白电泳缓冲液、染色液、脱色液、封闭液均为现有技术的常规用液。
上述小鼠抗HRSV抗体(一抗)、HRP-羊抗鼠IgG抗体偶联物(二抗)为市购产品。
实施例2
一步骤、病毒的培养
同实施例1。
二步骤、病毒液初纯和浓缩
同实施例2。
三步骤、病毒裂解
取二步骤(4)的粗纯浓缩病毒液100ml，在其中加入4g去氧胆酸钠使终浓度达到4％，充分混合后，在37℃下裂解90min，得裂解物。
四步骤、SDS-PAGE蛋白电泳分析
同实施例1。
五步骤、Western-blot法鉴定裂解后的F蛋白和G蛋白
同实施例1。
实施例1、2的优点
(1)从裂解剂类型方面分析，本发明所选择的NP-40和去氧胆酸钠2种裂解剂与常见的裂解剂相比，对HRSV的裂解效果恰到好处，对HRSV作用温和，容易控制裂解过程和作用条件，能同时得到HRSV病毒的F蛋白及G蛋白，且2种蛋白均能被HRSV特异抗体识别。
(2)以浓度为3-4％的去氧胆酸钠或浓度为1-2％的NP-40，在20-37℃、90-120min时的裂解效果最好，F及G蛋白2条目的蛋白的量都较大，蛋白量明显高于其他条件，且电泳图上的杂带少，有利益后续纯化工艺的实现。