一种无菌胶原贴敷料及其制备方法.pdf

本发明公开了一种无菌胶原贴敷料及其制备方法；无菌胶原贴敷料的制备方法为将动物的筋腱进行脱脂、切片、消毒、粉碎，再进行酸溶酶解、离心去沉淀得胶原原液；再调整胶原原液的浓度和粘度后，进行超滤纯化和浓缩得高纯度高浓度的胶原液；将其冷冻干燥、粉碎、辐照灭菌后进行配液装入含有非织造布铝箔袋中即可。本发明保持了胶原的活性，避免了胶原因辐照而变性或者发生交联反应；本发明采用超滤纯化代替传统的透析纯化，缩短了纯化的时间；采用自动化系统代替传统的半自动操作，避免了人手污染，保证了产品的洁净度、纯度、生物活性。

权利要求书
1.  一种无菌胶原贴敷料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）将新鲜或冷冻保鲜的动物筋腱组织进行除脂、除杂质，然后清洗后切片，消毒；
2）将消毒后的筋腱组织采用粉碎机进行粉碎；
3）将粉碎后的筋腱组织采用酸酶复合法进行溶解12-72h，即可提取具有三螺旋结构的胶原液；
4）将提取的胶原液经离心去除沉淀，收集上清液，即可得到胶原原液；
5）调整胶原原液的浓度及粘度后经过超滤纯化和浓缩后，即可得到高纯度和高浓度的胶原液；
6）将胶原液进行真空冷冻干燥后粉碎，制得胶原蛋白固体颗粒或者粉末或者海绵；
7）将上述胶原蛋白固体颗粒或者粉末或者海绵使用复合铝箔袋包装后进行辐照灭菌，制得无菌胶原蛋白固体颗粒或者粉末或者海绵；
8）在具备无菌过程控制的环境下，无菌胶原蛋白固体颗粒或者粉末或者海绵经过与无菌水进行配液，形成具有合适的蛋白浓度的无菌胶原成品液；
9）在具备无菌过程控制的环境下，将上述胶原成品液采用全自动灌封机灌装入已灭菌的装有非织造布的复合铝箔袋中，并热压封口，即可得到无菌胶原贴敷料。

2.  根据权利要求1所述的一种无菌胶原贴敷料的制备方法，其特征在于：步骤3）中所述酸酶复合法的具体操作为：将筋腱组织中加入80～120倍体积的0.4～0.6mol/L冰醋酸和380～420mg/L胃蛋白酶的混合液进行溶解。

3.  根据权利要求1所述的一种无菌胶原贴敷料的制备方法，其特征在于：步骤5）中调整胶原原液的浓度为0.5～3.0mg/ml。

4.  根据权利要求1所述的一种无菌胶原贴敷料的制备方法，其特征在于：步骤7）中辐照灭菌的辐照剂量为15～40kGy。

5.  根据权利要求1所述的一种无菌胶原贴敷料的制备方法，其特征在于：步骤8）中合适的蛋白浓度为1.0～3.0mg/ml。

6.  权利要求1~5中任一制备的无菌胶原贴敷料在制备皮肤创面修复产品、医学美容产品或化妆品中的应用。

说明书一种无菌胶原贴敷料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种无菌胶原贴敷料及其制备方法。
背景技术
胶原（Collagen）是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白， 是构成细胞外基质的骨架。胶原在细胞外基质中形成半晶体的纤维，给细胞提供抗张力和弹性,并在细胞的迁移和发育中起作用。胶原在各种动物中都有存在。脊椎动物中腱、软骨和骨中的胶原非常丰富，几乎占了蛋白总重的一半。胶原由三条肽链拧成螺旋形的纤维状的细胞外蛋白质，占全身蛋白质的30% 以上，具有独特的生理活性。胶原蛋白富含人体必需的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸，是细胞外基质中最重要的组成部分，具有强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使骨腱、软骨和皮肤具有一定的机械强度，且由于其微弱的抗原性和良好的生物相容性，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、硬组织修复、创面止血等医药卫生领域用途广泛。
目前，胶原的提取方法主要有碱法、酸法、盐法及酶法。 酸酶混合法是目前生产上常用的提取方法，胶原产品疗效在临床应用上进一步证明了其有效性及安全性，因此，临床上对于此类产品的需求量迅速上升且对产品的安全性提出了更高的要求，目前企业能够规模化生产胶原相关产品，但产品多数只能以达到微生物限度级别，即使少数能够达到无菌级别，但也只能以干品的形式提供给临床应用，导致了液体胶原类产品在临床上的应用受到限制。
针对上述存在的问题，本发明建立了一种大规模、批量生产无菌液体胶原的方法；实现大规模生产无菌的液体胶原产品，且在保证胶原活性的前提下生产无菌的液体胶原产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无菌胶原贴敷料的制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种无菌胶原贴敷料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）将新鲜或冷冻保鲜的动物筋腱组织进行除脂、除杂质，然后清洗后切片，消毒；
2）将消毒后的筋腱组织采用粉碎机进行粉碎；
3）将粉碎后的筋腱组织采用酸酶复合法进行溶解12-72h，即可提取具有三螺旋结构的胶原液；
4）将提取的胶原液经离心去除沉淀，收集上清液，即可得到胶原原液；
5）调整胶原原液的浓度及粘度后经过超滤纯化和浓缩后，即可得到高纯度和高浓度的胶原液；
6）将胶原液进行真空冷冻干燥后粉碎，制得胶原蛋白固体颗粒/粉末/海绵；
7）将上述胶原蛋白固体颗粒/粉末/海绵使用复合铝箔袋包装后进行辐照灭菌，制得无菌胶原蛋白固体颗粒/粉末/海绵；
8）在具备无菌过程控制的环境下，无菌胶原蛋白固体颗粒/粉末/海绵经过与无菌水进行配液，形成具有合适的蛋白浓度的无菌胶原成品液；
9）在具备无菌过程控制的环境下，将上述胶原成品液采用全自动灌封机灌装入已灭菌的装有非织造布的复合铝箔袋中，并热压封口，即可得到无菌胶原贴敷料。
进一步的，步骤3）中所述酸酶复合法的具体操作为：将筋腱组织中加入80～120倍体积的0.4～0.6mol/L冰醋酸和380～420mg/L胃蛋白酶的混合液进行溶解。
进一步的，步骤5）中调整胶原原液的浓度为0.5～3.0mg/ml。
进一步的，步骤7）中辐照灭菌的辐照剂量为15～40kGy。
进一步的，步骤8）中合适的蛋白浓度为1.0～3.0mg/ml。
上述制备的无菌胶原贴敷料在制备皮肤创面修复产品、医学美容产品或化妆品中的应用。
本发明的有益效果是：
1）本发明采用低温提取的胶原液经过冷冻干燥后进行辐照灭菌，可使原料达到无菌（无菌保证水平SAL=10-6）。同时，在固体状态下进行辐照灭菌，可避免胶原在辐照过程中变性或者发生交联反应，保证了胶原的活性。
2）本发明采用超滤纯化代替传统的透析纯化，效果是缩短了纯化的时间，另外采用自动化系统代替传统的半自动操作，避免了人手污染，保证了产品的洁净度、纯度、生物活性。
3）本发明将动物组织在超低温条件下进行粉碎，破碎组织成粉末状或细丝状，使组织在酸溶酶解的过程中大大的增加了反应的接触面积，使反应的时间缩短且提高产率，有利于胶原保持完好的生物活性。
附图说明
图1为实施例1制备无菌胶原贴敷料进行SDS-PAGE电泳检测图。
具体实施方式
    下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
1）  将新鲜的动物筋腱组织进行除脂、除杂质，然后清洗后切片，消毒；
2）  将消毒后的筋腱组织采用粉碎机进行粉碎；
3）  将粉碎后的筋腱组织采用酸酶复合法进行溶解12～72h，即在筋腱组织中加入100倍体积的0.5mol/L的冰醋酸和400mg/L的胃蛋白酶的混合液溶解12～72h，即可提取具有三螺旋结构的胶原液；
4）  将提取的胶原液经离心去除沉淀，收集上清液，即可得到胶原原液；
5）  调整胶原原液的浓度及粘度，浓度调整为2.5mg/ml（浓度范围可以定为0.5～3.0mg/ml）后经过超滤纯化和浓缩后，即可得到高纯度和高浓度的胶原液；
6）  将胶原液进行真空冷冻干燥后粉碎，制得胶原蛋白固体颗粒、粉末或海绵；
7）  将上述胶原蛋白固体颗粒使用复合铝箔袋包装后进行15～40 kGy辐照灭菌，制得无菌胶原蛋白固体颗粒；
8）  在无菌条件下，将无菌胶原蛋白固体与无菌水进行配液，形成具有合适的蛋白浓度1.0～3.0mg/ml的无菌胶原成品液；
9）  在无菌条件下，将上述胶原成品液采用全自动灌封机灌装入已灭菌的装有非织造布的复合铝箔袋中，并热压封口，即可得到无菌胶原贴敷料。
上述制备的无菌胶原贴敷料可应用于多种创面的修复，如烧伤创面、烫伤创面的修复或激光美容的术后恢复等方面。
实施例2
1）  将新鲜的动物筋腱组织进行除脂、除杂质，然后清洗后切片，消毒；
2）  将消毒后的筋腱组织采用粉碎机进行粉碎；
3）  将粉碎后的筋腱组织采用酸酶复合法进行溶解50h，即在筋腱组织中加入80倍体积的0.6mol/L的冰醋酸和420mg/L的胃蛋白酶的混合液溶解50h，即可提取具有三螺旋结构的胶原液；
4）  将提取的胶原液经离心去除沉淀，收集上清液，即可得到胶原原液；
5）  调整胶原原液的浓度及粘度，浓度调整为2.5mg/ml（浓度范围可以定为0.5～3.0mg/ml）后经过超滤纯化和浓缩后，即可得到高纯度和高浓度的胶原液；
6）  将胶原液进行真空冷冻干燥后粉碎，制得胶原蛋白固体颗粒、粉末或海绵；
7）  将上述胶原蛋白固体颗粒、粉末或海绵使用复合铝箔袋包装后进行40 kGy辐照灭菌，制得无菌胶原蛋白固体颗粒、粉末或海绵；
8）  在无菌条件下，将无菌胶原蛋白固体颗粒、粉末或海绵与无菌水进行配液，形成具有合适的蛋白浓度1.0mg/ml的无菌胶原成品液；
9）  在无菌条件下，将上述胶原成品液采用全自动灌封机灌装入已灭菌的装有非织造布的复合铝箔袋中，并热压封口，即可得到无菌胶原贴敷料。
上述制备的无菌胶原贴敷料可应用于多种创面的修复，如烧伤创面、烫伤创面的修复或激光美容的术后恢复等方面。
实施例3
1）  将新鲜的动物筋腱组织进行除脂、除杂质，然后清洗后切片，消毒；
2）  将消毒后的筋腱组织采用粉碎机进行粉碎；
3）  将粉碎后的筋腱组织采用酸酶复合法进行溶解12h，即在筋腱组织中加入120倍体积的0.4mol/L的冰醋酸和390mg/L的胃蛋白酶的混合液溶解12h，即可提取具有三螺旋结构的胶原液；
4）  将提取的胶原液经离心去除沉淀，收集上清液，即可得到胶原原液；
5）  调整胶原原液的浓度及粘度，浓度调整为2.5mg/ml（浓度范围可以定为0.5～3.0mg/ml）后经过超滤纯化和浓缩后，即可得到高纯度和高浓度的胶原液；
6）  将胶原液进行真空冷冻干燥后粉碎，制得胶原蛋白固体颗粒、粉末或海绵；
7）  将上述胶原蛋白固体颗粒、粉末或海绵使用复合铝箔袋包装后进行15kGy辐照灭菌，制得无菌胶原蛋白固体颗粒、粉末或海绵；
8）  在无菌条件下，将无菌胶原蛋白固体颗粒、粉末或海绵与无菌水进行配液，形成具有合适的蛋白浓度3.0mg/ml的无菌胶原成品液；
9）  在无菌条件下，将上述胶原成品液采用全自动灌封机灌装入已灭菌的装有非织造布的复合铝箔袋中，并热压封口，即可得到无菌胶原贴敷料。
上述制备的无菌胶原贴敷料可应用于多种创面的修复，如烧伤创面、烫伤创面的修复或激光美容的术后恢复等方面。
SDS-PAGE电泳检测
下面分别对实施例1制备无菌胶原贴敷料进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如果图1所示。从图1中可以看出，本发明制备的胶原液和胶原贴敷料中胶原蛋白具有良好的纯度。
细胞毒性检测
对上述实施例制备的具有生物活性的无菌胶原贴敷料进行生物性能检测，结果显示其细胞毒性计分不大于1，无致敏反应，无皮内刺激反应或极轻微刺激，无亚慢性全身毒性，且无遗传毒性。
微生物及化学性能检测
对上述实施例制备的无菌胶原贴敷料进行微生物检测，结果显示无菌。
对上述实施例制备的无菌胶原贴敷料进行化学性能检测，结果显示，具有典型的I型胶原蛋白电泳图谱，其重金属总量不大于10μg/g。
创面修复作用检测
利用上述实施例制备的无菌胶原贴敷料治疗浅II度烧伤创面随机、对照、多中心临床实验结果：本试验样本量为160例，共选择6家临床试验机构进行实验，试验器械为胶原贴敷料，对照器械为凡士林敷料，实验结果显示胶原贴敷料能较快缩短浅II度烧伤创面的愈合时间、改善局部症状体征，促进创面愈合，提高创面的综合愈合率，从而减轻患者在创面修复过程中的痛苦，值得临床推广应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。