一种结冷胶组合物及其制备方法和用途 【技术领域】
本发明涉及一种结冷胶组合物，其制备方法以及其用途：如美容或医疗时作为注射和/或植入软组织填充物，以及药物分子和其他治疗剂的释药系统应用。
背景技术
人类追求自身完美的努力从未间断过，注射美容技术也在不断进步。
注射肉毒杆菌毒素是目前去除动力性皱纹的较好方法。肉毒杆菌毒素是一种具有强神经毒性的蛋白质，能够阻断神经和肌肉间“信号传导”，使过度收缩的肌肉放松舒展。将其稀释后可用于人面部早期的、不太明显的皱纹去除，如一般鱼尾纹、额头纹、颈部皱纹，注射一次产生的除皱效果可维持4～6个月，要达到长期效果通常一年需要注射3～4次。由于广泛存在的生物差异性，各人机体对这种肉毒杆菌毒素的毒性反应大小不同，特别对重症肌无力、多发性硬化症、上睑下垂、身体非常瘦弱、心肝肾等内脏有疾病、过敏体质等人群应慎用。
另一类注射美容则是通过注射填充物增加组织量的方式来填充面部皱纹，达到使凹陷隆起，面部轮廓改形等功效。这类注射美容方式具有更悠久的发展历史，注射的材料和注射方式的不断改进。目前已达到甚至在一些方面还优于注射肉毒杆菌毒素的效果，且禁忌症明显减少。
注射用填充物有选用非生物材料的，如早期的液体石蜡、硅胶等，由于它们的渗漏会引起体内多处炎症，且渗漏物经手术也不易彻底清除，现在基本淘汰；后来发展了医用聚丙烯酰胺水凝胶、膨体聚四氟乙烯等材料，它们具有较好的组织相容性、无毒、不被机体降解吸收。这类非生物材料也可以和组织相容性更好的生物材料相混合，例如聚甲基丙基酸甲脂和胶原蛋白的混合物，在被引入体内后，一方面生物材料被机体逐渐吸收，另一方面非生物材料可作为支架，使宿主细胞逐渐长入由于生物材料的逐渐被吸收而空出的微小空隙，从而保持填充效果的稳定性。但是注射美容的直接对象是活体的面部皱纹、凹陷、不适轮廓，它们的外形特征是内外多重因素相互作用的结果，会随时间的改变而在逐渐改变，所以在某一时期设定的注射美容方案，也将随时间推移而失去其最优化的特征。另外非生物材料在体内长期存留，并与机体逐渐长入的细胞混合在一起，当面部特征变化需要调整时，将为新美容方案的实施制造不利因素，且不能被彻底清除。
填充式注射美容还可以选用生物材料，该类材料是天然的，其优点是组织相容性好，即与宿主排斥反应小，且可被机体逐渐吸收，不产生终身效应。早在1981年，美国FDA批准使用牛胶原作为填充剂注射到宿主真皮层，以达到相应美容要求，该材料能在组织内留存6～9个月；但由于对人体而言这是异种蛋白质，有少量宿主皮肤测试过敏，即使在皮试测试阴性后仍有少量宿主出现过敏现象。稍后出现取自人尸体的无细胞的胶原、弹性硬蛋白，糖胺多糖混合物作为填充物，它与牛胶原相似，黏性较大，作用较持久，没有使用牛胶原时的过敏反应；但该材料来源很有限，且存在传播乙肝、HIV病毒的风险。后来开发的填充物取自宿主自体皮肤，经制备或者培养生成的胶原蛋白，有的还含有自体成纤维细胞，该填充物无免疫原性、安全有效，存活的成纤维细胞在1～2年后仍可继续分泌胶原，维持填充效果；但是这种对具体宿主个别培养，来获得自体胶原蛋白的方式，操作要求高、耗时长，成本高，不利于工业化生产和利用。
透明质酸是另一种使用较多的生物材料类填充物。早期从鸡冠内提取的透明质酸有较好的弹性，目前多采用微生物发酵制备的较黏稠透明质酸。透明质酸在用于人体时比人工合成凝胶具有更少的炎症反应、肉芽瘤，微生物发酵的生产工艺使成本下降，产量极大提高，应用更广泛。这类凝胶使用时，先制成悬浮液，然后经细针孔注射。如果悬浮颗粒太小，在宿主体内易发生移动或者被吞噬，达不到定点填充的效果；颗粒过大或颗粒形状不规则，则给细针孔注射带来困难，特别是为适当延长填充效果而特制的高交联度的凝胶尤为困难。
此外，在制备凝胶与水溶性药物的混合物时，通常先将水溶性药物溶液投入所选凝胶，在混合器上混合约24h，再冷冻干燥，或者乙醇沉淀后再真空干燥，得到干燥的凝胶与水溶性药物混合物；添加适量无菌盐水或者缓冲液，混合器上混合约24h，达到所需凝胶与水溶性药物的合适浓度(中国专利200480039183.2)。上述制备凝胶与水溶性药物的混合物的方法操作繁琐，能耗高，处理时间长药物活性易受损。
因此，需要一种对生物体没有毒性，植入生物体后最终能被机体吸收，非动物来源，状态可调易于操作的新凝胶组合物。
结冷胶是由四糖单位-β(1→3)-D-葡萄糖β(1→4)-D-葡萄糖醛酸β(1→4)-D-葡萄糖α(1→4)-L-鼠李糖，相互连接构成的多糖。发明人通过研究发现：高乙酰度结冷胶能形成不透明的柔软弹性胶，低乙酰度结冷胶形成透明的脆性结冷胶。在去离子水中加入适量结冷胶，加热能使其水化成溶液状态，此时加入适量阳离子，并冷却至适当温度，该溶液能形成凝胶，且该凝胶能在加热作用下再回复至溶液状态，液化点的温度高于凝胶化点的温度。改变结冷胶浓度和加入阳离子的浓度，能够改变形成凝胶的温度。在结冷胶组成上适当调节高乙酰度结冷胶、低乙酰度结冷胶比例，和/或加入黄原胶、淀粉等物质配伍，可以使最后形成的凝胶性质由脆到弹性任意改变。本发明正是基于结冷胶的上述特性，提供了一种具有明显优势的结冷胶组合物，可用于注射美容、组织填充物和作为药物地释药系统。
【发明内容】
本发明的目的是根据结冷胶溶液在适宜温度下与合适的阳离子作用，来控制凝胶形成的性质，提供一种具有高度黏弹性的结冷胶组合物，该组合物可以以溶液状态进行诸如注射、混匀等操作，克服直接用凝胶注射、混匀等操作的困难，再在需要的时候逐渐完成凝胶化，使注射凝胶填充物、混匀含药凝胶等变得简易、可控。
本发明的另一目的是提供上述结冷胶组合物的制备、使用方法和用于注射美容、组织填充物和作为药物的释药系统的用途。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明结冷胶组合物由高乙酰度结冷胶和/或低乙酰度结冷胶为主形成，其中高乙酰度结冷胶和低乙酰度结冷胶的质量比为100∶0～0∶100，优选95∶15～50∶50，首选80∶20或90∶10。
上述组合物中含有生物相容性溶剂，例如去离子水、缓冲液、糖溶液或类似物等，其中生物相容性溶剂中包含一种或多种生物活性试剂。所述的生物活性试剂为细胞、基因、蛋白质、抗体、多肽和/或药物等，其中药物不限于局部麻醉剂：利多卡因、普鲁卡因、布比卡因、可卡因、丁卡因和/或上述的盐，优选盐酸利多卡因。
上述组合物中含有改性物质，例如黄原胶和/或淀粉等。
本发明组合物可用于注射美容、组织填充物或作为药物释药系统。
本发明组合物用于注射美容或组织填充物可通过以下步骤实现：
(1)按比例称取高乙酰度结冷胶和/或低乙酰度结冷胶，混合，得到混合物料；
(2)物料中加入生物相容性溶剂，加热并搅拌至高乙酰度结冷胶和/或低乙酰度结冷胶完全水化至溶液状态，得到处于溶液状态的结冷胶组合物；
(3)将所得处于溶液状态的结冷胶组合物冷却至适宜温度，并以溶液状态注射入待填充部位。
本发明组合物用于注射美容或组织填充物还可通过以下步骤实现：
(1)按比例称取高乙酰度结冷胶和/或低乙酰度结冷胶，混合，得到混合物料；
(2)物料中加入生物相容性溶剂，加热并搅拌至高乙酰度结冷胶和/或低乙酰度结冷胶完全水化至溶液状态，然后加入适量CaCl2(CaCl2可被其他可提供阳离子的盐替代，优选MgCl2、NaCl或KCl)，搅拌至完全溶化，得到处于溶液状态的结冷胶组合物；
(3)将所得处于溶液状态的结冷胶组合物冷却至高于该结冷胶组合物凝胶化点温度0～15℃(最好是0～1℃)时，把溶液状态的凝胶注射入待填充部位。
(4)如有必要，可在该溶液状态凝胶在皮下凝胶化前，借助外力对填充外形适当调整以达到美容要求。
本发明组合物作为药物释药系统可通过以下步骤实现：
(1)按比例称取高乙酰度结冷胶和/或低乙酰度结冷胶，混合，得到混合物料；
(2)物料中加入生物相容性溶剂，加热并搅拌至高乙酰度结冷胶和/或低乙酰度结冷胶完全水化至溶液状态，得到处于溶液状态的结冷胶组合物；然后冷却至适宜温度，添加一种或多种水溶性药物，搅拌使溶解完全，得到处于溶液状态的结冷胶与药物组合物；
(3)结冷胶与药物组合物中加入CaCl2(CaCl2可被其他可提供阳离子的盐替代，优选MgCl2、NaCl或KCl)，搅拌至完全溶解，补充去离子水，定容并混匀，冷却使该结冷胶与药物组合物溶液凝胶化。
本发明组合物作为药物释药系统还可通过以下步骤实现：
(1)按比例称取高乙酰度结冷胶和/或低乙酰度结冷胶，混合，得到混合物料；
(2)物料中加入适量生物相容性溶剂，加热并搅拌至高乙酰度结冷胶和/或低乙酰度结冷胶完全水化至溶液状态，得到处于溶液状态的结冷胶组合物；然后加入CaCl2(CaCl2可被其他可提供阳离子的盐替代，优选MgCl2、NaCl或KCl)，搅拌至完全溶解，得到处于溶液状态的凝胶；
(3)冷却溶液状态的结冷胶组合物至适宜温度，添加一种或多种水溶性药物，搅拌使溶解完全，补充去离子水，定容并混匀，冷却形成水溶性药物凝胶。
本发明结冷胶组合物对于注射填充的体积较小的适应症，选用不添加阳离子的结冷胶组合物，使用时以溶液状态推注，然后在受试者被注射部位组织间渗出的阳离子作用下凝胶化；对于注射填充的体积较大的适应症，选用添加过阳离子且含更多高乙酰度结冷胶的结冷胶组合物，使用时加热至液化状态，再冷却至略高于凝胶化点温度时，以溶液状态推注，然后随局部热敷的温度下降至处于常温的凝胶化点温度，而逐渐凝胶化。
对于释药用的结冷胶组合物与水溶性药物混合物制备，选用未添加或添加阳离子的结冷胶组合物均可，前者直接与水溶性药物相溶再使凝胶化；后者加热解除凝胶化后降温至高于凝胶化点的合适温度，再与水溶性药物相溶，然后降低温度使凝胶化。
本发明组合物的用途不同，所显现的优势亦不同。以下进一步举例说明。
1.本发明结冷胶组合物用于细小皱纹的填充
取适量高乙酰度结冷胶、低乙酰度的结冷胶以适当比例混合，需要时可添加黄原胶、淀粉等改性物质配伍。再添加适量的去离子水，加热，使结冷胶为主的溶质水化成溶液状态，然后补充去离子水并定容。按需要分装，并采用湿热灭菌。在进一步的实施方案中，该结冷胶组合物溶液将用于细小皱纹的填充和修复。选用30号针头采用多点斜面式注射，把该结冷胶组合物溶液注入需要填充的真皮层部位。在结冷胶组合物溶液所充盈的组织间隙，将渗出适量的Ca2+、Mg2+、Na+和K+等阳离子，使填充入的结冷胶溶液逐渐凝胶化，达到填充美容的效果。
2.本发明结冷胶组合物用于皮肤凹痕等较深瘢痕的填充和轮廓改形
称取适当比例的高乙酰度结冷胶和低乙酰度结冷胶，需要时可加入黄原胶、淀粉等改性物质配伍，混合。加入适量去离子水，加热搅拌使该结冷胶为主的固体逐渐液化，成为液体状态。取少量CaCl2，或者MgCl2、NaCl和KCl等可提供阳离子的盐类，投入上述溶液，搅拌至完全溶解，补充去离子水并定容。按需求分装，湿热灭菌。在进一步的实施方案中，取呈现凝胶状态的结冷胶组合物加热液化，并迅速转移至略高于凝胶化点温度的环境，保持结冷胶组合物的溶液状态。对需要较大体积填充的部位进行局部升温，可采用热敷等可被机体接受的加热方式，使局部体温略高于结冷胶组合物的凝胶化点温度，此时进行注射填充。液化状态的结冷胶组合物将随环境温度下降而逐步在皮下凝胶化。如有必要，可在结冷胶组合物在皮下凝胶化前，借助外力对填充外形适当调整以达到美容要求。
与现有注射美容技术相比，本发明的结冷胶组合物在推注时不再是颗粒悬浮物，而是以溶液状态存在，明显降低推注阻力，减少操作难度，降低操作意外发生率。在另一方面，本发明的结冷胶组合物是以溶液状态进入宿主体内，并充盈在被填充部位，这样该组合物很容易黏到周围细胞等基质上，再逐步形成合适形状的凝胶，这样不仅可在凝胶化前有机会通过外力适度调整外形，还能以整体方式结成凝胶，即不发生相对移动，从而使填充效果保持更久。在另一方面，本发明的结冷胶组合物能通过调整组成比例和配伍情况，来调节凝胶化点的温度和所成凝胶的弹性大小，使该组合物满足不断变化的美容或医疗填充的操作要求和效果要求。
3.本发明结冷胶组合物用于水溶性药物的释药系统
取适量高乙酰度结冷胶和低乙酰度结冷胶，必要时可添加黄原胶、淀粉等改性物质配伍，混合。向该混合物中加入去离子水，加热搅拌使完全水化成溶液状态，并迅速转移至略高于该结冷胶组合物溶液凝胶化点温度的环境，以下操作均在该温度下操作。在灭菌处理条件下可以向结冷胶组合物溶液中添加适量水溶性药物，然后再加入促使结冷胶组合物溶液凝胶化的CaCl2，或者MgCl2、NaCl和KCl等可提供阳离子的盐类，只需普通搅拌至完全溶解，再补充去离子水并定容，按需求分装即可。
4.本发明结冷胶组合物用于水溶性药物的释药系统
取适量高乙酰度结冷胶和低乙酰度结冷胶，必要时可添加黄原胶、淀粉等改性物质配伍，混合。向该混合物中加入去离子水，加热搅拌使完全水化成溶液状态，并迅速转移至略高于该结冷胶组合物溶液凝胶化点温度的环境，以下操作均在该温度下操作。在灭菌处理条件下可以向结冷胶组合物溶液中添加CaCl2，或者MgCl2、NaCl和KCl等可提供阳离子的盐类，然后加入适量水溶性药物，只需普通搅拌至完全溶解，再补充去离子水并定容，按需求分装即可。
与现有用于释药的凝胶与水溶性药物混合物相比，凝胶与水溶性药物的均匀混合需要乳匀机长时间混匀，操作成本高，还限制了凝胶与不稳定药物所成混合物的制备；本发明的结冷胶组合物能以溶液状态与水溶性药物容易地混合均匀，再在需要的时候形成凝胶。
因此，本发明的凝胶组合物性能优越，可以广泛用作注射美容的凝胶填充剂，例如面部细小皱纹、体表凹痕、轮廓改型等，还可以用于便捷制备凝胶与水溶性药物的混合物。
【具体实施方式】
以下实施例是为了更好的说明本发明，绝不是对本发明的限制。实施例1：0.05％结冷胶组合物的制备及其对细小皱纹填充的应用
精密称取40mg高乙酰度结冷胶，10mg低乙酰度结冷胶，混合。向该混合物中加入去离子水80mL，沸水浴加热并搅拌使完全水化成溶液状态，然后补充去离子水并定容至100mL，按1mL/支分装安瓿，湿热灭菌。需进行面部细小皱纹填充美容的受试者，在经血尿便常规、心电图、肝肾功能、HIV、HbsAg指标检测正常后，再进行皮试(同青霉素皮试方法)无免疫反应。选用30号针头采用多点斜面式注射，把结冷胶组合物溶液注入受试者眼角计划注射部位真皮层。手术后，注意不要挤压注射部位。在受试者被注射部位组织间隙的Ca2+、Mg2+、Na+和K+等阳离子作用下，注射填充入的结冷胶溶液逐渐在位凝胶化，达到填充美容的效果。注射部位可以出现局部肿胀、疼痛，一般在2周内基本消除，填充物的填充效果能维持约6个月左右。
实施例2：0.06％结冷胶组合物的制备及其对皮肤凹痕填充的应用
精密称取54mg高乙酰度结冷胶，6mg低乙酰度结冷胶，混合。向该混合物中加入去离子水80mL，沸水浴加热并搅拌使完全水化成溶液状态。向该结冷胶溶液中加入CaCl20.4440g，搅拌至完全溶解，补充去离子水定容至100mL，按1mL/支分装安瓿，湿热灭菌。需进行面部皮肤凹陷填充的受试者，经血尿便常规、心电图、肝肾功能、HIV、HbsAg指标检测正常后，准备接受结冷胶填充物皮试。在沸水浴上加热1mL/支的结冷胶凝胶安瓿，使该凝胶液化成溶液状态，并迅速转移至45℃恒温干燥操作橱。用1mL注射器吸取溶液状态结冷胶，对受试者进行皮试(同青霉素皮试方法)无免疫反应。然后对需要填充的皮肤凹痕部位进行局部热敷，或者在45℃小环境保温，进行局部注射填充，在达到所需填充程度后再移开保温环境。液化状态的结冷胶随环境温度下降而逐步在皮下凝胶化。注射部位可以出现局部肿胀、疼痛，该现象一般在2周内基本消除，填充物的填充效果能维持约6个月左右。
实施例3：用于释药的0.05％结冷胶组合物
精密称取40mg高乙酰度结冷胶，10mg低乙酰度结冷胶，混合。向该混合物中加入去离子水50mL，沸水浴加热并搅拌使完全水化成溶液状态，然后转移至45℃水浴保温，以下操作均在该温度下进行。在灭菌处理条件下可以向该结冷胶溶液中添加：抗肿瘤药物如紫杉醇(25.00mL，5mg/mL)；甾体类抗炎药溶液如地塞米松(5.00mL，25mg/mL)等。然后向该结冷胶与药物的混合溶液中加入NaCl 0.2340g，搅拌至完全溶解，再补充去离子水定容至100mL，按25mL/支分装。冷却至室温时形成含均匀分布药物的凝胶，必要时可以湿热灭菌。
实施例4：用于释药的0.05％结冷胶凝胶与水溶性药物的组合物
精密称取40mg高乙酰度结冷胶，10mg低乙酰度结冷胶，混合。向该混合物中加入去离子水50mL，沸水浴加热并搅拌使完全水化成溶液状态，然后转移至45℃水浴保温，以下操作均在该温度下进行。在灭菌处理条件下可以向该结冷胶溶液中添加NaCl 0.2340g，搅拌至完全溶解；再加入抗肿瘤药物，如紫杉醇(25.00mL，5mg/mL)、甾体类抗炎药溶液如地塞米松(5.00mL，25mg/mL)等。然后再补充去离子水定容至100mL，按25mL/支分装。冷却至室温时形成含均匀分布药物的凝胶，必要时可以湿热灭菌。