用银纹夜蛾幼虫繁殖蜡蚧轮枝菌恢复其活力的方法.pdf

用银纹夜蛾幼虫繁殖蜡蚧轮枝菌恢复其活力的方法，属生物技术。饲养银纹夜蛾；培养蜡蚧轮枝菌；制备蜡蚧轮枝菌的分生孢子液；将制备的分生孢子液制成悬浮液；将悬浮液均匀喷于银纹夜蛾幼虫体至体表面湿润，再把幼虫放入无菌人工气候室内饲养至虫体长满菌丝；收集上步的虫体，脱水干燥，贮存于－78℃～－95℃的冰箱。经过本发明技术繁殖的蜡蚧轮枝菌，繁殖续代过程中能够长时间保持菌株孢子活力及其感染能力，也可利用该方法对感染力及活力严重下降的菌株进行活力及感染能力恢复。

权利要求书
1.  一种用银纹夜蛾幼虫繁殖蜡蚧轮枝菌恢复其活力的方法，其特征在于按如下步骤：
一、饲养银纹夜蛾；
二、制备蜡蚧轮枝菌菌种：
(1)、培养蜡蚧轮枝菌：将蜡蚧轮枝菌KMZW－1菌株接种到PDA培养基上，放入25±0.5℃的恒温培养箱培养8～10天；
(2)、制备蜡蚧轮枝菌的分生孢子液：取在PDA培养基上长好的KMZW－1菌落，用无菌水将孢子洗下并过滤，定量滤液内蜡蚧轮枝菌的分生孢子数到100～120孢子/ml，得到分生孢子液；
(3)、接种及繁育：
A、将制备的分生孢子液加入占其重量1％～5％的吐温－80和5％～12％的甘油，于20℃～35℃下制成悬浮液；
B、将悬浮液均匀喷于银纹夜蛾幼虫体表至体表面湿润，再把幼虫放入无菌人工气候室内，于24～26℃、不低于RH85％、光照L∶D＝16h∶8h的条件下，饲养银纹夜蛾9－15天至虫体长满菌丝；
C、收集上步的虫体，于4℃～10℃的密闭环境下，使用干燥剂进行脱水干燥，干燥至虫体水分含量≤12％，将干燥后的虫体贮存于－78℃～－95℃的冰箱。

2.  如权利要求1所述的用银纹夜蛾幼虫繁殖蜡蚧轮枝菌恢复其活力的方法，其特征在于饲养银纹夜蛾的方法为：从野外采集银纹夜蛾的健康幼虫，在室温24～26℃、相对湿度75％～80％、光照条件L∶D＝16∶8的环境下，使用以紫茎泽兰干粉为主要原料的半人工饲料对银纹夜蛾进行饲养，幼虫饲养至3～7天时备用。

说明书用银纹夜蛾幼虫繁殖蜡蚧轮枝菌恢复其活力的方法
技术领域
本发明属生物技术。
背景技术
蜡蚧轮枝菌[Verticillium lecanii(Zimm)]是一种常见的虫生真菌,隶属真菌门半知菌亚门丝孢纲丝孢目。该菌地理分布和寄主范围广，对蚜虫、粉虱、蚧、蓟马和害螨等农业害虫均具有良好的寄生效果，是一种相对成熟的生物农药。在以往的研究过程中，蜡蚧轮枝菌往往以固体或者液体培养基的方式大范围繁殖。蜡蚧轮枝菌KMZW-1是本专利申请人筛选并获得专利权(ZL200810233784.7)的一株针对蝇类昆虫具有高毒力的菌株，在续代繁殖的过程中发现，培养基法繁殖4～5代后其孢子活力明显开始下降，经研究发现其它蜡蚧轮枝菌也存在培养基培养续代后对宿主的感染能力及孢子活力下降的问题。文献检索未发现有恢复蜡蚧轮枝菌活力及感染能力技术方案的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用银纹夜蛾幼虫繁殖蜡蚧轮枝菌恢复其活力的方法。
本说明书所述的百分比，若没有特别说明，均为重量比。
本发明方法如下：
1、饲养银纹夜蛾；
2、制备蜡蚧轮枝菌菌种:
(1)、培养蜡蚧轮枝菌：将蜡蚧轮枝菌KMZW-1菌株接种到PDA培养基上，放入25±0.5℃的恒温培养箱培养8～10天；
(2)、制备蜡蚧轮枝菌的分生孢子液：取在PDA培养基上长好的KMZW-1菌落，用无菌水将孢子洗下并过滤，定量滤液内蜡蚧轮枝菌的分生孢子数到100～120孢子/ml，得到分生孢子液；
(3)、接种及繁育：
A、将制备的分生孢子液加入占其重量1％～5％的吐温-80和5％～12％的甘油，于20℃～35℃下制成悬浮液；
B、将悬浮液均匀喷于银纹夜蛾幼虫体至体表面湿润，再把幼虫放入无菌人工气候室内，于24～26℃、不低于RH85％、光照L∶D＝16h∶8h的条件下，饲养银纹夜蛾9-15天至虫体长满菌丝；
C、收集上步的虫体，于4℃～10℃的密闭环境下，使用干燥剂进行脱水干燥，干燥至虫体水分含量≤12％，将干燥后的虫体贮存于-78℃～-95℃的冰箱。
所说饲养银纹夜蛾的方法为现有技术，但最好采用如下方法：从野外采集 银纹夜蛾的健康幼虫，在室温24～26℃、相对湿度75％～80％、光照条件L∶D＝16∶8的环境下，使用以紫茎泽兰干粉为主要原料的半人工饲料对银纹夜蛾进行饲养，幼虫饲养至3～7天时备用。所说以紫茎泽兰干粉为主要原料的半人工饲料见中国专利文件ZL201410125557.8。
用银纹夜蛾为寄主昆虫繁殖的蜡蚧轮枝菌可以这样用作生物农药：将本发明方法所得贮存于冰箱的虫体置于常温，粉碎至40～100目，取1克干粉兑0.2～0.5公斤水，并加入1％吐温-80，搅拌均匀，在室温放置2小时，再搅拌均匀，置于喷雾器内进行喷雾，对蚜虫、粉虱、蚧、蓟马和害螨等农业害虫均具有良好的寄生效果，
经过本发明技术繁殖的蜡蚧轮枝菌，繁殖续代过程中能够长时间保持菌株孢子活力及其感染能力，也可利用该方法对感染力及活力严重下降的菌株进行活力及感染能力恢复。
以下是对比实验：
将PDA培养基上续代5代的蜡蚧轮枝菌，分作两份，一份继续PDA培养续代培养(称作PDA-1)，一份使用本发明方法培养(称作YE-1)，分别收集孢子进行对比。所述本发明方法培养的具体过程如下：
1、饲养中间寄主银纹夜蛾：从野外采集银纹夜蛾的健康幼虫，在室温25℃、相对湿度78％、光照条件L∶D＝16∶8的环境下，使用以紫茎泽兰干粉为主要原料的银纹夜蛾半人工饲料(按专利文件ZL201410125557.8)进行饲养，幼虫饲养至6天时备用。
2、制备蜡蚧轮枝菌菌种:
(1)、培养蜡蚧轮枝菌：将蜡蚧轮枝菌KMZW-1菌株接种到PDA培养基上，放入25±0.5℃的恒温培养箱培养9天；
(2)、制备蜡蚧轮枝菌的分生孢子液：取在PDA培养基上长好的KMZW-1菌落，用无菌水将孢子洗下并过滤，定量滤液内蜡蚧轮枝菌的分生孢子数到108孢子/ml，得到分生孢子液；
(3)、接种及繁育：
A、将制备的分生孢子液加入占其重量3％的吐温-80和8％的甘油，于28℃下制成悬浮液；
B、将悬浮液均匀喷于银纹夜蛾幼虫体表至体表面湿润，再把幼虫放入无菌人工气候室内，于25℃、RH80％、光照L∶D＝16h∶8h的条件下，继续用紫茎泽兰干粉为主要原料的银纹夜蛾半人工饲料进行饲养12天，此时虫体长满菌丝。
C、收集上步的虫体，于7℃的密闭环境下，使用干燥剂进行脱水干燥，干燥至虫体水分含量10％，将干燥后的虫体贮存于-80℃的冰箱。
蜡蚧轮枝菌的孢子活性实验

以上数据表明同样为第六代培养，本发明方法的孢子活性显著高于PDA培养基培养。
蜡蚧轮枝菌对害虫虫体的感染能力实验(使用预混孢子液喷雾)

以上数据显示，本发明方法培育的蜡蚧轮枝菌对害虫感染能力显著高于PDA培养基。
本发明的有益效果：经过本发明技术繁殖的蜡蚧轮枝菌，繁殖续代过程中能够长时间保持菌株孢子活力及其感染能力，也可利用该方法对感染力及活力严重下降的菌株进行活力及感染能力恢复。
具体实施方式
实施例1.方法如下：
1、饲养中间寄主银纹夜蛾：从野外采集银纹夜蛾的健康幼虫，在室温24℃、相对湿度77％、光照条件L∶D＝16∶8的环境下，使用以紫茎泽兰干粉为主要原料的银纹夜蛾半人工饲料(按专利文件ZL201410125557.8)进行饲养，幼虫饲养至4天时备用。
2、制备蜡蚧轮枝菌菌种:
(1)、培养蜡蚧轮枝菌：将蜡蚧轮枝菌KMZW-1菌株接种到PDA培养基上，放入25±0.5℃的恒温培养箱培养10天；
(2)、制备蜡蚧轮枝菌的分生孢子液：取在PDA培养基上长好的KMZW-1菌落，用无菌水将孢子洗下并过滤，定量滤液内蜡蚧轮枝菌的分生孢子数到120孢子/ml，得到分生孢子液；
(3)、接种及繁育：
A、将制备的分生孢子液加入占其重量1％的吐温-80和5％的甘油，于34℃下制成悬浮液；
B、将悬浮液均匀喷于银纹夜蛾幼虫体表至体表面湿润，再把幼虫放入无菌人工气候室内，于24℃、RH85％、光照L∶D＝16h∶8h的条件下，继续用紫茎泽兰干粉为主要原料的银纹夜蛾半人工饲料进行饲养14天，此时虫体长满菌丝。
C、收集上步的虫体，于5℃的密闭环境下，使用干燥剂进行脱水干燥，干燥至虫体水分含量12％，将干燥后的虫体贮存于-80℃的冰箱。将所得贮存于冰箱的虫体置于常温，粉碎至40目，取1克干粉兑0.2公斤水，并加入1％吐温-80，搅拌均匀，在室温放置2小时，再搅拌均匀，置于喷雾器内进行喷雾。效果：对蚜虫、粉虱、蚧、蓟马和害螨等农业害虫均具有良好的寄生效果。
实施例2.方法如下：
1、饲养中间寄主银纹夜蛾：从野外采集银纹夜蛾的健康幼虫，在室温26℃、相对湿度75％、光照条件L∶D＝16∶8的环境下，使用以紫茎泽兰干粉为主要原料的银纹夜蛾半人工饲料(按专利文件ZL201410125557.8)进行饲养，幼虫饲养至7天时备用。
2、制备蜡蚧轮枝菌菌种:
(1)、培养蜡蚧轮枝菌：将蜡蚧轮枝菌KMZW-1菌株接种到PDA培养基上，放入25±0.5℃的恒温培养箱培养8天；
(2)、制备蜡蚧轮枝菌的分生孢子液：取在PDA培养基上长好的KMZW-1菌落，用无菌水将孢子洗下并过滤，定量滤液内蜡蚧轮枝菌的分生孢子数到100孢子/ml，得到分生孢子液；
(3)、接种及繁育：
A、将制备的分生孢子液加入占其重量5％的吐温-80和11％的甘油，于22℃下制成悬浮液；
B、将悬浮液均匀喷于银纹夜蛾幼虫体表至体表面湿润，再把幼虫放入无菌人工气候室内，于25℃、RH80％、光照L∶D＝16h∶8h的条件下，继续用紫茎泽兰干粉为主要原料的银纹夜蛾半人工饲料进行饲养10天，此时虫体长满菌丝。
C、收集上步的虫体，于9℃的密闭环境下，使用干燥剂进行脱水干燥，干燥至虫体水分含量9％，将干燥后的虫体贮存于-90℃的冰箱。将所得贮存于冰箱的虫体置于常温，粉碎至100目，取1克干粉兑0.5公斤水，并加入1％吐温-80，搅拌均匀，在室温放置2小时，再搅拌均匀，置于喷雾器内进行喷雾。效果：对蚜虫、粉虱、蚧、蓟马和害螨等农业害虫均具有良好的寄生效果。