一种利用溴化己二甲胺提高基因转染猪皮转染效率的方法.pdf

本发明涉及一种利用溴化己二甲铵提高基因转染猪皮转染效率的方法，包括如下步骤：1)制备待转染的猪皮肤；2)使用浓度为5000-15000μg/ml溴化己二甲铵对108PFU/ml Ad5重组腺病毒载体进行震荡混合，孵育后制备成转染液；3)将步骤2)制备的转染液对步骤1)制备的猪皮肤进行转染。本发明中溴化己二甲铵与Ad5重组腺病毒载体混合后转染猪皮肤细胞时，其携带的阳离子可中和腺病毒载体和细胞表面的阴离子，降低了腺病毒载体和细胞表面之间的静电排斥力，从而增加腺病毒载体与猪皮肤细胞的相互接触，提高腺病毒载体对猪皮肤的转染效率。

1、  一种利用溴化己二甲铵提高基因转染猪皮转染效率的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)制备待转染的猪皮肤；
2)使用浓度为5000-15000μg/ml溴化己二甲铵对10⁸PFU/ml Ad5重组腺病毒载体进行震荡混合，孵育后制备成转染液；
3)将步骤2)制备的转染液对步骤1)制备的猪皮肤进行转染。

2、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪皮肤是巴马香猪皮肤。

3、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪皮肤是小于6个月猪龄的猪皮肤。

4、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪皮肤是4-6月龄的巴马香猪皮肤。

5、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪皮肤的厚度为0.1-1.0毫米。

6、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)中所述Ad5重组腺病毒载体含有CTLA4Ig重组基因。

7、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)中所述孵育具体为：4℃孵育10-20分钟。

8、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中所述转染具体是在CO₂培养箱内37℃转染1-3小时。

9、  权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)具体为：将步骤2)制备的转染液按0.8-2.2ml/cm²的比例对步骤1)制备的猪皮肤在CO₂培养箱内37℃转染1-3小时。

10、  权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)具体为：将步骤2)制备的转染液按1ml/cm²的比例对步骤1)制备的猪皮肤在CO₂培养箱内37℃转染2小时。

一种利用溴化己二甲铵提高基因转染猪皮转染效率的方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种提高携带外源基因的重组腺病毒载体转染猪皮效率的方法。
背景技术
烧伤是一类发生率及致残率均较高的特殊类型创伤，其根本问题就是创面问题，如果烧伤创面得不到及时有效的覆盖、封闭，必将引起患者机体内环境的紊乱、感染及多脏器功能障碍的发生；此外，还可能出现创面的非生理性愈合，使疤痕形成增加，残疾程度加剧。因此，对烧伤创面进行皮肤移植的研究是现代烧伤治疗的迫切需要；也是烧伤研究的热点及难点。
深度烧伤创面需经皮肤移植才能愈合，而大面积、特大面积烧伤患者自体皮源严重不足，需经非自体(同种异体或异种)皮覆盖创面方能取得较好的临床效果，同种异体皮(主要是尸体皮)是目前烧伤创面治疗中公认效果较好的生物敷料，但由于来源和伦理等多种条件限制，同种异体皮无法满足临床需求。猪皮由于与人皮在组织结构和生理功能上的高度相似性，是临床使用最为广泛的异种皮肤，但由于猪和人之间的种属差异，其排斥反应比较严重，无法起到长期覆盖作用。
专利申请号为00103528.2，发明名称是“一种用重组基因转染的异体皮肤”的专利申请公开了利用传统的Ad5腺病毒载体携带免疫抑制基因CTLA4Ig对猪皮肤进行体外转染，可使CTLA4Ig蛋白在猪皮组织活细胞内表达，从而起到抑制免疫排斥的发生，在烧伤创面诱导移植皮肤局部特异性免疫耐受，达到延长移植异种皮肤成活的目的。
但是，由于Ad5腺病毒载体和被转染细胞表面均带负电荷，相互之间存在静电排斥力，所以上述利用Ad5腺病毒载体携带免疫抑制基因CTLA4Ig对猪皮肤组织细胞的转染效率较低，需要较高滴度的病毒感染才能发挥效果，使得基因转染猪皮的生产成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高基因转染猪皮转染效率的方法，该方法可以提高Ad5重组腺病毒载体对猪皮肤细胞的转染效率。
实现本发明目的的技术方案如下：
一种利用溴化己二甲铵提高基因转染猪皮转染效率的方法，包括如下步骤：
1)制备待转染的猪皮肤；
2)使用浓度为5000-15000μg/ml溴化己二甲铵对10⁸PFU/ml Ad5重组腺病毒载体进行震荡混合，孵育后制备成转染液；
3)将步骤2)制备的转染液对步骤1)制备的猪皮肤进行转染。
其中，步骤1)所述猪皮肤是任何一种品系的猪皮肤，优选巴马香猪皮肤，进一步优选小于6个月猪龄的猪皮肤，最优选4-6月龄的巴马香猪皮肤。所述猪皮肤的厚度为0.1-1.0毫米，优选0.4-0.6毫米。
其中，步骤2)中所述Ad5重组腺病毒载体含有CTLA4Ig重组基因，可按照专利申请号为00103528，发明名称是“一种用重组基因转染的异体皮肤”的专利申请公开的方法制备CTLA4Ig重组基因和含有CTLA4Ig重组基因的Ad5腺病毒载体。
其中，步骤2)中所述孵育具体为：4℃孵育10-20分钟。
其中，步骤3)中所述转染具体是在CO₂培养箱内37℃转染1-3小时。
其中，步骤3)具体为：将步骤2)中处理后的转染液按0.8-2.2ml/cm²的比例对步骤1)中处理后的猪皮肤在CO₂培养箱内37℃转染1-3小时。
其中步骤3)优选将步骤2)制备的转染液按1ml/cm2的比例对步骤1)制备的猪皮肤在CO2培养箱内37℃转染2小时。
本发明中使用的溴化己二甲铵(hexadimethrin bromide)具有中和肝素的作用，溶解后产生许多正电荷，凝聚胺(Polybrene)是溴化己二甲胺多聚物，带有多价阳离子。当溴化己二甲铵与Ad5重组腺病毒载体采用适合的比例混合后转染猪皮肤细胞时，可中和腺病毒载体和细胞表面的阴离子基团，降低了腺病毒载体和细胞表面之间的静电排斥力，从而增加腺病毒与细胞的相互接触，提高腺病毒载体对猪皮肤细胞的转染效率。
本发明在体外利用溴化己二甲铵对Ad5重组腺病毒载体转染液进行处理，以此处理后的腺病毒转染液对猪皮组织进行转染，与未经处理的腺病毒转染相比，发现可以提高转染效率4-12倍，大大的提高了基因转染的效率，降低了生产成本。而且试验表明，溴化己二甲铵不会引起腺病毒载体和细胞的变性或失活，因此可以很好地发挥协助腺病毒载体对猪皮肤的转染作用。
附图说明
图1为CTLA4Ig标准品的吸光值标准曲线图。
具体实施方式
以下通过实施例详细说明本发明。在下面的实施例中所涉及的实验材料如无特别说明均可通过市场购得或通过本领域常规的制备方法获得。本发明所使用的含有CTLA4Ig重组基因的Ad5腺病毒载体，可按照专利申请号为00103528，发明名称是“一种用重组基因转染的异体皮肤”的专利申请公开的方法制备。
实施例1利用本发明方法制备CTLA4Ig基因转染猪皮
步骤1：取皮消毒
将猪处死后用洗衣粉清洗外部皮肤，手术刀刮毛，再用5％碘伏消毒，酒精脱色后无菌取皮，在洁净环境下用皮鼓将猪皮剖成厚度层为0.6mm厚度皮块备用。
步骤2：溴化己二甲铵对Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体的处理
使用浓度为5000-15000μg/ml的溴化己二甲铵(FLUKA公司产品)对10⁸PFU/ml Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体进行震荡混合，在4℃下孵育10-20分钟，制备成转染液。
步骤3：腺病毒载体转染
将步骤2中处理后的转染液按1ml/1cm²的比例对步骤1中处理后的皮片进行转染，转染条件为：CO₂培养箱内37℃转染2h，同时以未经溴化己二甲铵处理的腺病毒转染液为对照对步骤1中处理后的皮片进行转染，对照组处理措施除腺病毒转染液未经溴化己二甲铵处理外，其余处理措施及转染条件和溴化己二甲铵处理组完全一致。
实施例2溴化己二甲铵处理组与对照组的目的基因转入量比较
提取实施例1中溴化己二甲铵处理组和对照组中的基因组总DNA(提取方法参照《分子克隆实验指南》(第3版)：463-471。科学出版社)。然后进行目的基因转染的定量检测，以确定目的基因的转入量。目的基因转染的定量检测的方法如下：
用目的引物与内参引物分别对样品DNA进行扩增。
目的引物：5’AGGTCAAGTTCAACTGGTACG 3’，见SEQ ID NO：1。
          5’CTTGTACTCCTTGCCATTCA 3’，见SEQ ID NO：2。
内参引物：5’TTTAACTCTGGCAAAGTGGAC 3’，见SEQ ID NO：3。
          5’GGTGGAATCATACTGGAACAT 3’，见SEQ ID NO：4。
定量PCR反应程序：
95℃    3min
94℃    30s
60℃    30s
读板
40个循环
72℃    3min
95℃    1min
55℃    1min
熔解曲线从55℃到95℃，每0.5℃循环一次10s。
目的基因的量比上内参基因的量即为目的基因的导入量。实验结果表明经用溴化己二甲铵处理的腺病毒转染猪皮后目的基因导入量较未经处理的腺病毒转染猪皮提高了4-12倍。
实施例3ELISA检测溴化己二甲铵处理组和对照组的腺病毒转染猪皮后猪皮组织中CTLA4Ig的表达量的比较
1)样品准备
将实施例1转染后的猪皮组织继续培养48小时，然后将不同处理的猪皮组织在灭菌烧杯或一次性培养皿中用灭菌PBS漂洗三次，在一次性培养皿内剪碎，每张皮片加1.5ml灭菌PBS用匀浆器在离心管内制备匀浆，再离心5000r/min，3min取上清作为样品；培养皮片后的培养基也作为样品。
2)ELISA检测
CTLA4Ig标准品标定曲线：用CTLA4Ig标准品(R&D System USA)制做标定曲线和曲线方程，结果见表1，根据表1结果制作CTLA4Ig标准品的吸光值标准曲线图，见图1。表明随标准品浓度增加，吸光值也随之增加，并呈线性相关趋势，相关系数R²＝0.9622，表明相关程度较高，说明利用此图可以准确检测样品中0-24μg的CTLA4Ig浓度。
样品中CTLA4Ig测试：酶标板每孔加入100μl(1μg/ml)大鼠抗CTLA4Ig的一抗(Abnova)，4℃包被过夜，洗板，然后每孔加入200μl封闭液(1％BSA+0.02％Tween-20+PBS)4℃过夜，洗板，每孔加入100μl样品室温反应2h，洗板，每孔加入100μl(1μg/ml)羊抗大鼠二抗(southern biotech)，室温反应2h，洗板，每孔加入100μl底物显色液(双氧水+邻苯二胺)，室温反应30min，加入100μl 2MH₂SO₄，用酶标仪在490nm波长测定吸光度。。
实验结果见表2，将表2数值带入CTLA4Ig标准品的吸光值标准曲线方程(Y＝0.0444X+0.1621)，得出溴化己二甲铵处理组匀浆中表达CTLA4Ig量为139ng/ml；对照组匀浆中含量为130ng/ml，说明溴化己二甲铵处理组的Ad5-CTLA4Ig腺病毒转染猪皮组织匀浆中表达CTLA4Ig量比对照组的高9ng/ml；溴化己二甲铵处理组的Ad5-CTLA4Ig腺病毒转染猪皮组织培养基中分泌的CTLA4Ig为135ng/ml，对照组的培养基中分泌的CTLA4Ig为70ng/ml，处理组比对照组多65ng/ml。
表1用CTLA4Ig标准品3次重复测试吸光值

表2溴化己二甲铵处理组与对照组转染猪皮CTLA4Ig吸光值比较