活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法.pdf

本发明公开了一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，包括：穿刺部位为蟹头胸甲前缘、靠近眼睛后的区域，所述穿刺部位打磨平整，以便于取样后密封穿刺孔；同时将穿刺部位打磨变薄，以便于采用穿刺针扎入卵巢组织取样；穿刺针穿透穿刺部位取样后密封穿刺孔；取样的卵巢组织直接用肉眼观察卵巢外观，初步判断其发育情况或用于组织学、激素和分子生物学研究。本发明通过穿刺技术用穿刺针取出少量卵巢组织可用于各种生物学研究实验，还可根据卵巢的细胞学参数推算卵巢指数。本方法适合于科研和生产单位使用，在活体条件下对了解亲本的卵巢发育情况。

1、  一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，包括以下步骤：
(1)穿刺部位为蟹头胸甲前缘、靠近眼睛后的区域，所述穿刺部位打磨平整，以便于取样后密封穿刺孔；同时将穿刺部位打磨变薄，以便于采用穿刺针扎入卵巢组织取样；
(2)穿刺针穿透穿刺部位，迅速取样后密封穿刺孔；
(3)取样的卵巢组织直接用肉眼观察卵巢外观，初步判断其发育情况或用于组织学、激素和分子生物学研究。

2、  根据权利要求1所述的一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，其特征在于：步骤(1)中用砂纸或者微型抛光机将穿刺部位抛光平整，以便取样后密封穿刺孔，防止海水进入；打磨过程使穿刺部位变薄，便于穿刺针扎入蟹体内进行取样。

3、  根据权利要求2所述的一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，其特征在于：所述穿刺部位、微型抛光机、穿刺针经过消毒，防止细菌感染造成蟹的死亡。

4、  根据权利要求1所述的一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，其特征在于：步骤(2)所述穿刺孔的孔径为0.46-1.31mm。

5、  根据权利要求1所述的一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，其特征在于：步骤(2)取样完毕后用502胶和塑料片密封，等胶水固化后将蟹放回海水中。

6、  根据权利要求5所述的一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，其特征在于：所述塑料片柔软、完全贴合蟹甲壳表面，且不透水。

7、  根据权利要求5所述的一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，其特征在于：所述502胶选用凝固性佳，在5分钟内完全凝固。

8、  根据权利要求1所述的一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，其特征在于：步骤(3)中利用组织学统计卵母细胞直径，所述卵母细胞的直径是指长径，然后推算卵巢指数，是指利用卵母细胞细胞直径与卵巢指数的回归方程来计算卵巢指数。

9、  根据权利要求8所述的一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，其特征在于：用于预测雌体卵巢指数的回归方程的回归曲线统计卵巢发育三期的雌体30个以上，统计优势卵母细胞的长径，所述卵巢发育三期主要为外源性卵黄合成期的卵母细胞。

10、  根据权利要求9所述的一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，其特征在于：所述优势卵母细胞是指同一个体的切片中，该类型的细胞必需占细胞总数的70％以上。

活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法
技术领域
本发明涉及一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，属于发育生物学和海水养殖技术领域。
背景技术
自20世纪80年代以来，经济蟹类(中华绒螯蟹、锯缘青蟹、远海梭子蟹和三疣梭子蟹等)养殖在我国迅速发展，据统计2007年全国蟹类养殖总产量近70万吨，我国的蟹类养殖已经取得举世瞩目的成就。蟹的主要可食部分为肌肉、卵巢和肝胰腺，其中卵巢具有较高的营养价值。因此在蟹类养殖生产中，卵巢发育良好的雌蟹，俗称红膏蟹，经济价值比卵巢发育差的雌蟹要高很多。另一方面，雌蟹卵巢发育的好坏直接影响着雌蟹的生殖能力，在蟹类育苗中需要挑选卵巢发育良好的雌蟹作为亲本，这对于蟹类育苗生产显得十分重要。此外，研究蟹类卵巢发育一直是甲壳动物发育生物学上的一个重要的研究内容。因此，判断蟹类卵巢发育情况对于了解其发育生物学、育苗、养殖和商品蟹流通均具有重要的理论意义和现实意义。
对虾类的卵巢位于半透明的头胸甲内，通常通过肉眼即可观察甲壳内的卵巢发育情况，蟹类的卵巢位于不透明的头胸甲内，故肉眼难以观察。经验的判断方法是，在一定光照条件下观察蟹的卵巢是否充满头胸甲，如果卵巢充满头胸甲，则说明卵巢发育较成熟，但是这种方法的准确性较差，且不可对卵巢组织取样进行深入的研究。
判断卵巢发育情况较为可靠的方法是解剖雌蟹，取出卵巢观察发育情况，但这样就必须杀死雌蟹，故这种方法在育苗生产和商品蟹销售过程中并不可取。我们先前的技术“采用微型电钻钻孔，然后用镊子活体直接取出少量组织，最后密封穿刺孔”，那种取样方法对主要适用于卵巢发育成熟(五期)的蟹，而且对蟹的伤害较大，容易产生的应激反应，例如停食和躁动等，从而导致蟹体内发生一系列生理变化(如血糖和雌二醇等含量升高)，甚至造成蟹的应激死亡。由于那种采样方法会导致卵巢发育至三期的雌蟹卵巢停止发育，因此那种方法仅适合于检查卵巢发育成熟或者接近成熟的雌蟹，了解其卵巢发育情况，从而预报其产卵期，不适合于研究卵巢发育早期(四期之前)的蟹。本发明通过使用穿刺技术较好的解决了这一问题，能够精确取样卵巢发育早期(三期)的卵巢组织，而且对蟹的伤害小，不会影响蟹的卵巢进一步发育，所取的卵巢组织可以用于多种生物学研究，如组织学、激素测定、生物化学和分子生物学等。
此外，在以往的科研工作中，为了计算蟹的卵巢指数，首先需要称重蟹的体重，然后处死蟹，再解剖取出所有卵巢组织，最后称重卵巢，根据这些来计算卵巢指数(％)＝100×卵巢重量/雌蟹体重。由于亲本蟹价格昂贵，显然处死亲本蟹的方法不仅增加了科研成本，而且也无法满足对同一个体不同卵巢发育阶段进行连续采样的需要，同时还不利于动物福利的开展。
以往解剖蟹对卵巢组织进行取样步骤繁琐，操作过程耗时较长，对于提取RNA等分子生物学实验不利，稍有不慎便会使RNA降解，导致实验失败。同时解剖过程中，蟹的应激反应会导致蟹体内生理指标的产生变化，对于激素测定结果会造成较大不良影响。而采用穿刺技术对蟹卵巢组织进行采样，不仅操作简便和迅速，而且对蟹伤害小，能避免这些不良影响。
远海梭子蟹(Portunus pelagicus)又称远洋梭子蟹，属于暖水性蟹类，主要分布在我国福建、台湾、广东和广西海域，该蟹最大个体达187mm，可食用部分大、营养丰富，是一种优质的经济蟹类；另一方面，该蟹生长迅速、繁殖能力强、抗病能力强、卵巢发育周期短、在适宜条件下可以全年连续产卵，所以该蟹具有广阔的养殖前景，同时又可以作为研究蟹类卵巢发育的模式动物。因此，本实验室利用远海梭子蟹作为实验动物，建立了活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，且通过实践验证了其可行性。
发明内容
本发明采用活体穿刺技术在活蟹体内取出少量卵巢组织，然后用小塑料板和502胶迅速封住穿刺留下的穿刺孔，这样极大减少了采样对于蟹造成的伤害，能保证采样后蟹卵巢正常发育。本方法克服了“采用微型电钻钻孔，然后用镊子活体直接取样”容易造成“对蟹的的伤害大，造成较强应激反应，仅是适合于研究卵巢发育晚期的蟹”等缺陷。活体穿刺技术取样不仅对蟹的伤害小，而且可以取样发育早期的卵巢组织，也可以对同一个体进行连续采样等。该方法简单易行，适合于科研和生产单位使用，在活体条件下了解亲本的卵巢发育情况，以及分析卵巢发育不同时期激素含量，抽提DNA和RNA等对样品进行分子生物学研究。该技术适用于远海梭子蟹、三疣梭子蟹、中华绒螯蟹和锯缘青蟹等蟹类。
穿刺技术是利用穿刺针刺入动物机体的脏器、体腔，用于获取组织和器官样品进行诊断，也可对器官中的积气、积液进行排泻，或者注入药物，在医学被广泛应用，穿刺技术的优点在于可以在体外对活体进行组织取样，不需要手术，对正常组织的破坏少。
将穿刺技术用于蟹类卵巢取样基于以下几点考虑。
一、蟹类的卵巢位于其头胸甲内，头胸甲不透明，很难用肉眼直接观察头胸甲内的卵巢发育情况，经验的方法在一定光照条件下观察卵巢是否充满头胸甲的判断方法准确性差，无法了解卵巢发育的准确状况。
二、蟹类卵巢在体内所处区域相对固定，位于甲壳中轴两侧呈Y型分布，用穿刺针采样时的可以准确定位。
三、传统的蟹类卵巢组织取样方法必需先处死蟹，然后打开头胸甲取样卵巢组织，这种方法不仅需要处死蟹，增加成本，而且无法对同一个体不同卵巢发育阶段进行连续跟踪采样。
四、“采用微型电钻钻孔，然后用镊子活体直接取样”的办法容易伤害蟹的真皮层，造成对蟹的应激反应，甚至导致早期卵巢停止发育，甚至死亡，因此仅适合于研究卵巢发育晚期(五期)的蟹。利用穿刺技术采样，穿刺针直接刺过真皮层，创口小，对蟹造成的伤害少，能够满足对同一个体连续采样的需要，极大提高了采样精确度和可靠性。
五、穿刺针采样迅速，能保证分子生物学实验对取样的速度要求，因为RNA极容易降解。
六、穿刺技术造成蟹的应激反应小，能减少因为应激反应导致的蟹体内激素水平的变化，从而提高实验的准确性。
七、在科研中利用穿刺技术取样卵巢判断其发育情况，不仅对蟹的伤害小，而且可以减少科研工作中需要处死和解剖蟹的数量，从而有利于开展动物福利的工作。
八、在生产上利用穿刺技术判断卵巢发育情况，可以指导膏蟹培育和亲本选择等，从而提高养殖生产的经济效益和社会效益。
本发明需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现。
一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，包括以下步骤：
(1)穿刺部位为蟹头胸甲前缘、靠近眼睛后的区域，所述穿刺部位打磨平整，以便于取样后密封穿刺孔；同时将穿刺部位打磨变薄，以便于采用穿刺针扎入卵巢组织取样；
(2)穿刺针穿透穿刺部位，迅速取样后密封穿刺孔；
(3)取样的卵巢组织直接用肉眼观察卵巢外观，初步判断其发育情况或用于组织学、激素和分子生物学研究。
步骤(1)中所述穿刺部位必须严格遵守图版说明中的区域，控制在头胸甲前缘，靠近眼睛后的区域，在卵巢发育早期(三期)时也能采到样品，而且不会对心脏、胃造成损伤，所述穿刺部位的甲壳比较平整，取样后容易密封穿刺孔。
步骤(1)中用砂纸或者微型抛光机将穿刺部位抛光平整，以便取样后密封穿刺孔，防止海水进入；打磨过程使穿刺部位变薄，便于穿刺针扎入蟹体内进行取样。
所述穿刺部位必须打磨平整，有条件可使用微型抛光机；无条件的单位或者农户可以用砂纸打磨，打磨时需要注意不能伤及真皮层，因为真皮层中有感觉神经末梢，易引起蟹的应激反应，取样后容易密封穿刺孔，需要保证穿刺孔密封完全，以防止海水进入蟹体内。打磨时不得伤及真皮层，只能在角质化的外层进行，以免对蟹造成伤害。
所述穿刺部位、微型抛光机、穿刺针经过消毒，防止细菌感染造成蟹的死亡。
步骤(2)中穿刺针进入蟹体内后严禁搅动，接上无菌注射器抽取少量样品后应迅速笔直抽出，以免对卵巢造成较大损伤。
步骤(2)所述穿刺孔的孔径为0.46-1.31mm。
步骤(2)取样完毕后用502胶和塑料片密封，等胶水固化后将蟹放回海水中。
所述塑料片柔软、完全贴合蟹甲壳表面，且不透水。
所述502胶选用凝固性佳，在5分钟内完全凝固。
步骤(3)肉眼观察卵巢样品，卵巢的不同颜色代表不同的卵巢成熟阶段，以远海梭子蟹为例，颜色达到黄色代表卵巢发育达到三期或者三期以后，卵巢桔红色通常为四期或者五期。若需更加精确的了解卵巢发育情况，则需通过石蜡切片和HE染色技术对卵巢进行组织学观察，如果卵巢中以外源性卵黄合成期细胞为主说明卵巢发育处于三期，卵巢中以近成熟细胞为主说明卵巢发育处于四期，卵巢中以成熟细胞为主说明卵巢发育达到五期。
步骤(3)中利用组织学统计卵母细胞直径，所述卵母细胞的直径是指长径，然后推算卵巢指数，是指利用卵母细胞细胞直径与卵巢指数的回归方程来计算卵巢指数。
计算卵巢指数，需要从组织切片中统计卵巢中卵母细胞直径(长径)，然后将平均细胞直径(长径)代入回归方程(参见图9)，即可算出卵巢指数。根据卵母细胞直径推算卵巢指数的方法源于本实验室建立的远海梭子蟹卵母细胞直径和卵巢指数的回归方程y＝0.3464^e0.0114x。
用于预测雌体卵巢指数的回归方程的回归曲线统计卵巢发育三期的雌体30个以上，统计优势卵母细胞的长径，所述卵巢发育三期主要为外源性卵黄合成期的卵母细胞。
所述优势卵母细胞是指同一个体的切片中，该类型的细胞必需占细胞总数的70％以上。
若所取样品用于孕酮和雌二醇含量测定，需要事先准备好抽提激素的1.5毫升离心管中(离心管中装有1毫升乙酸乙酯)参见图5，步骤(3)取样后的卵巢组织需要迅速放入离心管中。
若所取样品用于分子生物学实验，需事先准备好液氮及相关保存容器，步骤(3)取样后的卵巢组织需要迅速放入液氮中，防止RNA降解。
具体结果：
采用本方法取样卵巢组织，蟹的成活率可达到90％以上，科研上可以节约采样成本60％以上，本试验室的实践证明本方法切实可行；利用本方法建立的远海梭子蟹卵巢指数预报方程(y＝0.3464^e0.0114x)，卵巢指数预报的准确率在85％以上，预报值和实际解剖测定数值相差仅18.85％左右。
本发明的原理：
本发明通过穿刺技术准确取样卵巢组织，取样后迅速密封穿刺孔，这样种方法对蟹的伤害极小，而且可以连续跟踪研究同一个体的卵巢发育情况。这种方法克服了传统办法“取样卵巢样品必须处死蟹”的问题，而且克服了“采用微型电钻钻孔，然后用镊子活体直接取样”的办法容易“伤害蟹的真皮层，造成对蟹的应激反应，甚至造成卵巢停止发育和死亡”的缺点，可以在科研和生产单位进行广泛使用。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果：
1、此方法在不杀死蟹的情况下即能取得卵巢组织用于组织学、激素测定、分子生物学等实验，不仅可以节约采样成本，而且可以对同一个体不同卵巢发育阶段进行连续采样；
2、穿刺技术可以准确取样蟹卵巢发育三期及三期以后的卵巢组织，对蟹的伤害极小，有利于实现动物福利，减轻人类科研和生产活动对蟹造成的痛苦和伤害；
3、在养殖生产中利用此方法可以取少量卵巢组织，从而判断膏蟹的等级，有利于提高养殖的经济效益；
4、方法简单，容易掌握。仅需要砂纸、穿刺针和502胶等简单用具，就可以取样蟹的卵巢组织。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明。
图1成体远海梭子蟹卵巢的位置，红线内为成熟卵巢的位置，黄色区域为可以钻孔的区域。
图2所用微型抛光机的打磨头
图3采样用穿刺针。
图4取样后封孔的远海梭子蟹背甲。
图5将穿刺获得的卵巢样品放入乙酸乙酯后，可以用于激素提取和测定。
图6将穿刺获得的卵巢样品转移至液氮中保存，可以用于RNA提取等分子生物学实验。
图7将穿刺获得的卵巢样品用改良的Bouin氏液固定，以便进行组织学研究。
图8远海梭子蟹成熟卵巢组织学照片
图9远海梭子蟹卵母细胞直径与卵巢指数的回归曲线。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
实施例1  科研单位使用
工具和试剂的准备：微型抛光机(施力特P-600A，宁波高桥施力特工具厂)参见图2；穿刺针7#0.46mm，9#0.71mm，12#1.31mm，(棱牌，腰椎穿刺针，上海埃斯埃医械塑料制品有限公司)参见图3；502胶(广东爱必达胶粘剂公司)；1.5毫升离心管若干(预先装有1毫升乙酸乙酯)，参见图5；液氮罐；-80℃超低温冰箱；电光源解剖镜(Leica Zoom-2000，Meyer Instruments，Inc，Houston，TX 77084)；电光源显微镜(江南XS-212-201，南京江南永新光学有限公司)；C1型目测微尺(C1型，上海越磁电子科技有限公司)；75％酒精(上海凌峰化学试剂有限公司)；组织切片机(Leica RM 2016，LeicaMicrosystems Inc.，Bannockburn，IL，USA)；改良的Bouin氏固定液(2.4毫升饱和苦味酸溶液、64.5毫升福尔马林、12.5毫升冰醋酸溶液和190毫升蒸馏水)；干毛巾和棉球。
活体取样：取出实验用的远海梭子蟹，用干毛巾擦干甲壳上的水分，用酒精棉球对穿刺部位进行消毒，穿刺部位为图中红色区域，参见图1；然后用微型抛光机在甲壳上打磨，参见图2；然后用酒精棉球消毒过的穿刺针进行穿刺，插入蟹体内1cm即可，参见图3，穿刺孔的孔径为0.46-1.31mm。拔出穿刺针衬芯，接上无菌注射器，略微旋转穿刺针，拉动注射器，抽出少许卵巢组织。取出穿刺针后，迅速用502胶和0.5mm厚的塑料板密封采样后的穿刺孔，参见图4，防止海水进入或者细菌感染导致蟹的死亡。
激素测定的样品保存：抽出的少许卵巢组织置于含有离心管中(离心管中装有1毫升乙酸乙酯，用于抽提激素)参见图5，离心后取上清夜立即可以用于测定孕酮和雌二醇含量，或者放入-20℃冰箱保存待测定。
用于提取RNA和卵黄蛋白纯化等的样品保存：取出少量卵巢组织置于离心管中，迅速放入液氮罐中，参见图6，也可以直接置于-80℃超低温冰箱中保存。
组织学样品固定和切片：将取出的卵巢组织用改良的Bouin氏液进行固定，参见图7；常规石蜡切片、HE染色，在显微镜下观察卵巢发育的组织学情况，参见图8，组织学观察的内容主要为卵巢中卵母细胞的组成、直径、卵黄物质积累情况。根据卵巢中优势卵母细胞的组成可以确定卵巢发育分期，如果卵巢中以外源性卵黄合成期细胞为主说明卵巢发育处于三期，卵巢中以近成熟细胞为主说明卵巢发育处于四期，卵巢中以成熟细胞为主说明卵巢发育达到五期。所述优势卵母细胞是指同一个体的切片中，该类型的细胞必需占细胞总数的70％以上。
卵巢指数的推算：每个蟹通常需要统计30-50个优势卵母细胞的直径(长径)，然后计算平均值，将平均值带入回归曲线方程(图9，y＝0.3464^e0.0114x)，即可推算出卵巢指数。建立“雌体卵巢指数和卵母细胞直径的回归曲线”时，必需随机统计卵巢发育三期的雌体30个以上，根据他们的卵巢指数和卵母细胞直径(长径)建立回归曲线和回归方程，所述卵巢发育三期的雌体主要指卵巢中70％以上为外源性卵黄合成期的卵母细胞。
实施例2  生产单位使用
蟹类卵巢发育情况的确定对于成蟹养殖(评估蟹的食用价值，卵巢发育越好，价格越高)和育苗(卵巢发育好的蟹才能用于育苗)都具有重要的现实意义。在生产中采用穿刺技术对卵巢取样，不仅可以评定膏蟹等级，而且可以辅助进行育苗亲本的选择。
工具和试剂准备：砂纸；穿刺针7#0.46mm，9#0.71mm，12#1.31mm，(棱牌腰椎穿刺针，规格9，上海埃斯埃医械塑料制品有限公司)，参见图3；电光源解剖镜(Leica Zoom-2000，Meyer Instruments，Inc，Houston，TX 77084)；75％酒精(上海凌峰化学试剂有限公司)；502胶(广东爱必达胶粘剂有限公司)；干毛巾和棉球。
活体取样：取出待检查的远海梭子蟹，用干毛巾擦干甲壳上的水分，用酒精棉球对穿刺部位进行消毒，参见图1；砂纸在甲壳上打磨；然后用酒精棉球消毒过的穿刺针进行穿刺，插入蟹体内1cm即可，参见图3，穿刺孔的孔径为0.46-1.31mm。拔出穿刺针衬芯，接上无菌注射器，略微旋转穿刺针，拉动注射器，抽出少许卵巢组织，用502胶和0.5mm厚的塑料板密封采样用的小孔，参见图4，防止海水进入或者细菌感染导致蟹的死亡。
膏蟹等级判断：将穿刺取得的卵巢样品用肉眼观察后，然后置于电光源解剖镜下观察，根据卵巢颜色、卵母细胞直径等可以判断蟹卵巢发育情况，用图9的方程推算卵巢指数，如果卵巢为桔红色，卵母细胞直径(长径)大于300微米，卵巢指数大于10％为一级膏蟹；如果卵巢为桔红色或者深黄色，卵母细胞直径(长径)在250-300微米，卵巢指数在7-10％为二级膏蟹；如果卵巢为深黄色或者黄色，卵母细胞直径(长径)在200-250微米，卵巢指数在4-7％为三级膏蟹；如果卵巢为黄色或者淡黄色，卵母细胞直径(长径)在100-200微米，卵巢指数在1-4％，为四级膏蟹。
育苗中的亲本选择：将穿刺取得的样品采用肉眼和电光源解剖镜观察颜色，卵母细胞大小，卵黄颗粒的分布情况，然后统计30-50个卵母细胞的平均直径(长径)，用图9的方程推算卵巢指数，如果卵巢为桔红色，卵母细胞直径(长径)大于280微米，卵黄颗粒分布比较均匀，卵巢指数大于8％雌蟹，通常可以作为人工育肥亲本，这些雌体的生殖产卵量大，生殖性能比较稳定。
本发明通过穿刺技术取出少量卵巢组织可用于各种生物学研究实验，还可根据卵巢的细胞学参数推算卵巢指数。该技术取样的主要优点是对蟹的伤害较小，不会影响蟹卵巢的正常生长发育，可以对同一个体进行连续采样。该方法的关键在于用穿刺针取出少量卵巢组织，然后可以用于多种生物学研究(激素测定、分子生物学和组织学研究等)。蟹类卵巢发育情况的确定对于成蟹养殖(评估蟹的食用价值，卵巢发育越好，价格越高)、育苗(卵巢发育好的蟹才能用于育苗)和资源评估(了解卵巢发育情况才能评估生殖群体的情况)都有重要意义，同时蟹类发育状况及卵巢指数对于科学研究上是十分重要的指标。本方法适合于科研和生产单位使用，在活体条件下对卵巢组织进行采样，并可以进一步了解亲本的卵巢发育情况。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。