负载BMP丝素蛋白/胶原蛋白支架材料及其制备方法.pdf

本发明公开了一种负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料。该材料以胶原、BMP、丝素蛋白、PLGA为原料制备，制备方法包括疏松层丝素/胶原膜和致密层丝素/胶原膜的制备、载BMP的PLGA微球制备、丝素/胶原膜与微球复合等步骤。该支架是一种对机体无毒副作用、具有良好的生物相容性和组织修复能力的组织工程支架。本发明结合了丝素蛋白和胶原蛋白2种不同种类天然生物高分子良好生物相容性和生物降解性等各自优点的基础上，在支架中引入了BMP，采用的定向控缓释技术，可使BMP持续释放，有效解决了BMP体内半衰期较短、生长因子定向诱导局部缺损修复等问题，延长了其功能的充分发挥。

权利要求书
1.  一种负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料，其特征在于它以胶原蛋白、丝素蛋白、BMP、PLGA为原料制备。

2.  根据权利要求书1所述的负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料，其特征在于：由疏松层丝素/胶原膜和致密层丝素/胶原膜组成双层结构，双层中间复合包载BMP的PLGA微球。

3.  一种如权利要求书1或2所述的负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）制备丝素蛋白水溶液和胶原蛋白水溶液；
（2）取胶原蛋白水溶液和丝素蛋白水溶液，按丝素蛋白：胶原蛋白=3:7或2：8的质量比例配制混合溶液，机械搅拌混匀，混合溶液风干后在交联液中交联，去离子水冲洗，风干，得交联后的致密层丝素/胶原膜；
（3）取胶原蛋白水溶液和丝素蛋白水溶液，按丝素蛋白：胶原蛋白=7:3或8：2的质量比例配制混合溶液，机械搅拌，混合溶液真空冷冻干燥，压平，于交联液中交联后去离子水冲洗，再次真空冷冻干燥，得到交联后的疏松层丝素/胶原膜；
（4）采用复乳溶剂蒸发法制备包载BMP的PLGA微球；
（5）将交联后的疏松层丝素/胶原膜用双蒸水润湿后平铺，在其表面滴加包载BMP的PLGA微球水溶液，4-8℃风干至表面无流动液体，再将交联后的致密层丝素/胶原膜润湿后平铺于上表面，4-8℃风干，即得负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料。

4.  根据权利要求书3所述的负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料的制备方法，其特征在于所述的胶原蛋白为Ⅰ型胶原或Ⅱ型胶原蛋白。

5.  根据权利要求书3所述的负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料的制备方法，其特征在于所述胶原蛋白水溶液的质量分数为0.6%，丝素蛋白水溶液的质量分数为1.2%。

6.  根据权利要求书3所述的负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料的制备方法，其特征在于：所述交联液含有50 mmol/L EDC、20 mmol/L NHS和90%乙醇。

7.  根据权利要求书3所述的负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料的制备方法，其特征在于所述的BMP为BMP-2、BMP-4、BMP-7中的一种或两种以上混合物。

8.  根据权利要求书3所述的负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料的制备方法，其特征在于：每平方厘米支架材料中BMP含量为50-5000 ng。

9.  权利要求书1或2所述的负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料在制备骨缺损修复材料中的应用。

说明书负载BMP丝素蛋白/胶原蛋白支架材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料及其制备方法。
背景技术
胶原是细胞外基质（ECM）的主要成份，约占哺乳动物蛋白质总质量的1/3，大量存在于皮肤、韧带、软骨、肌腱等结缔组织或器官中。胶原特有的三螺旋结构赋予它良好的生物学性能，如高拉伸强度、生物降解性能、低抗原活性、低刺激性和低细胞毒性以及促进细胞生长的性能，所有这些特性都使其成为一种理想的生物医用材料和药物载体。但随着组织工程的发展，由单一成分胶原构成的三维支架材料难以完全满足组织工程对支架材料的全面要求。因此，应用复合材料的原理和方法，将两种或两种以上具有互补特性的可降解材料按一定比例和方式组合，并选择适宜的制备工艺,可构造出能够满足组织工程所需的结构和性能优化的三维支架复合材料。作为人类最早利用的天然材料之一，蚕丝是一种性能优良的天然高分子材料，近年来广泛被应用于生物技术、医药、精细化工等诸多方面，如手术后的缝合线、涂料、化妆品、药物的缓慢释放、分离膜及生物活性物的固定化和生物传感器的制作等。丝素蛋白具有来源丰富、成本低廉的特点，约占蚕丝的70%-80%，其生物相容性、细胞黏附性和生物降解性良好，无刺激及毒副作用，同时具有良好的力学性能，是一种优良的天然蛋白质。本研究将胶原蛋白与丝素蛋白复合，可在保持原有成份良好生物相容性的基础上，综合提高材料的引导组织再生功能。
骨形成蛋白(BMP)是多功能生长因子,能够在体内诱导骨和软骨的生成，是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白。BMP为种属非特异多肽成分，不同种属的BMP之间具有高度的同源性，免疫性低，一般不引起免疫排斥反应。这种低免疫属性使BMP跨种属应用成为可能。已发现BMP家族成员至少有41个，其中BMP-2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的BMP之一。在骨折愈合过程中，BMP-2的主要生物活性是：①聚集间充质细胞，并诱导其向成软骨细胞或成骨细胞方向分化；②与其他调节因子共同参与骨形成。而家族另一成员BMP-4，其主要作用是参与早期的血管形成和软骨内成骨，它又是肢芽中胚层细胞的软骨形成的启动子，对软骨的生成发育具有特异性调控。因此，以适宜量的BMP-4单独或者复合使用，并在BMP-4表达后期加以抑制，对避免或者减轻关节软骨进一步向纤维骨细胞转化方面会强于其它家族成员。
由于BMP为蛋白多肽，容易受热、pH、酶等多种因素影响，如果没有载体的保护，很容易被降解而失去生物学活性。而胶原结构疏松多孔，易于制成多种结构，它同时含有两种氨基酸以及氨基酸残基，带有正负两种电荷，所有这些特点使它易与生物活性的生长因子结合，成为活性大分子的储存库。因此，本研究利用胶原蛋白与丝素蛋白吸附和储存BMP的特点，采用复乳溶剂挥发技术制备包载BMP的PLGA微球，同时设计双层异相结构的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料，让包载BMP的PLGA微球复合于支架中间，形成类似三明治结构，可有效获得一种对BMP有定向差异释放作用、能引导软骨、骨等病缺损组织修复的良好组织工程材料。
发明内容
本发明目的在于克服现有单一胶原成份组织修复材料的不足，提供一种负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料及其制备方法。该支架是一种对机体无毒副作用、具有良好的生物相容性和组织修复能力的组织工程支架。
本发明的一种负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料，它以胶原蛋白、丝素蛋白、BMP、PLGA为原料制备。
更具体地，一种负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料由疏松层丝素/胶原膜和致密层丝素/胶原膜组成双层结构，双层中间复合包载BMP的PLGA微球。
本发明还提供了所述的负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备丝素蛋白水溶液和胶原蛋白水溶液；
（2）取胶原蛋白水溶液和丝素蛋白水溶液，按丝素蛋白：胶原蛋白=3:7或2：8的质量比例配制混合溶液，机械搅拌混匀，混合溶液风干后在交联液中交联，去离子水冲洗，风干，得交联后的致密层丝素/胶原膜；
（3）取胶原蛋白水溶液和丝素蛋白水溶液，按丝素蛋白：胶原蛋白=7:3或8：2的质量比例配制混合溶液，机械搅拌，混合溶液真空冷冻干燥，压平，于交联液中交联后去离子水冲洗，再次真空冷冻干燥，得到交联后的疏松层丝素/胶原膜；
（4）采用复乳溶剂蒸发法制备包载BMP的PLGA微球；
（5）将交联后的疏松层丝素/胶原膜用双蒸水润湿后平铺，在其表面滴加包载BMP的PLGA微球水溶液，4-8℃风干至表面无流动液体，再将交联后的致密层丝素/胶原膜润湿后平铺于上表面，4-8℃风干，即得负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料。
所述的胶原蛋白为Ⅰ型胶原或Ⅱ型胶原蛋白。
所述胶原蛋白水溶液的质量分数为0.6%，丝素蛋白水溶液的质量分数为1.2%。
所述交联液含有50 mmol/L EDC、20 mmol/L NHS和90%乙醇。
所述的BMP为BMP-2、BMP-4、BMP-7中的一种或两种以上混合物。
每平方厘米支架材料中BMP含量为50-5000 ng。
本发明还保护了所述的负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料在制备骨缺损修复材料中的应用。
本发明所提供的负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料可用于引导软骨、骨等缺损组织的修复。该支架对所负载的BMP有定向控缓释作用。所述的定向差异控缓释作用体现为：BMP分别经由疏松层丝素/胶原膜和经由致密层丝素/胶原膜向释放液释放的速率不同。
本发明的显著优点在于：结合了丝素蛋白和胶原蛋白2种不同种类天然生物高分子良好生物相容性和生物降解性等各自优点的基础上，在支架中引入了BMP，可有效诱导创伤局部自体细胞生长，促进软骨、骨等病缺损组织的修复；采用的定向控缓释技术，可使BMP持续释放，有效解决了BMP体内半衰期较短、生长因子定向诱导局部缺损修复等问题，延长了其功能的充分发挥。
附图说明
图1为负载BMP的PLGA微球的场扫描电镜图。
图2 为负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料场扫描电镜图。
图3为负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料Hoechst33258荧光染色图；其中a表示单纯胶原蛋白支架材料组，b表示负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料致密层向上组，c表示负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料疏松层向上组。
具体实施方式
实施例1：疏松层丝素/胶原膜和致密层丝素/胶原膜的制备
1、丝素蛋白的制备
蚕茧剪碎，放入0.5% Na2CO3溶液中，在98±2℃的恒温水浴箱30 min，共两次。取出后，开水洗两次，然后再用去离子水清洗8次。在60℃烘箱烘干，得到干燥丝素蛋白。称取蚕丝脱胶后的丝素丝，用CaCl2/H2O/C2H5OH溶液（摩尔比1:8:2）在（78±2）℃恒温水浴箱溶解，浴比1:25。用纱布过滤得到丝素蛋白原液。用截流分子量为8000 D-14000 D的纤维半透膜透析袋透析3天，以除去氯化钙和乙醇。过滤，得到丝素蛋白溶液。
2、胶原蛋白的制备
将鱼皮剪碎，用蒸馏水洗净后，加入其质量20倍的体积分数1％的过氧化氢和0.01 mol/L氢氧化钠的混合溶液，机械搅拌24 h，每8 h更换一次；加入10 wt％的异丙醇溶液，机械搅拌4 h；加入2.5％的氯化钠溶液，机械搅拌12h；加入鱼皮质量的2.5％胃蛋白酶醋酸溶液（0.5 mol/L, PH=2.0）， 4℃下酶解16-24 h，（重复2次提更多的胶原）；离心，透析，冻干。
3、疏松层丝素/胶原膜和致密层丝素/胶原膜的制备 
取0.6%胶原溶液和1.2%丝素溶液，按丝素蛋白：胶原蛋白3:7比例配制混合溶液，机械搅拌30 min。混合溶液风干后的丝素/胶原膜在交联液中交联8 h，去离子水冲洗6遍，风干，得致密层丝素/胶原膜。
取0.6%胶原溶液和1.2%丝素溶液，按丝素蛋白：胶原蛋白7:3比例配制混合溶液，机械搅拌30 min。混合溶液真空冷冻干燥，压平，于交联液中交联8 h，去离子水冲洗6遍后再次冷冻干燥，得到疏松层丝素/胶原膜。
4、疏松层丝素/胶原膜和致密层丝素/胶原膜的交联 
所述交联液含有50 mmol/L EDC、20 mmol/L NHS和90%乙醇。
实施例2：包载BMP-2微球的制备
称取0.25 g的PLGA，溶于2.5 mL二氯甲烷中，冰浴备用。称取100 uL、2%浓度的BMP-2溶液，5000-15000 r/min条件下乳化2 min，形成初乳，立即倒入25 mL、0.5%浓度PVA溶液，经匀浆机8000 r/min搅拌1min，形成复乳。磁力搅拌4 h挥发去有机溶剂。复乳在4℃恒温条件下，8000 rpm离心8 min，去离子水水洗5次，冷冻干燥，即可得到包载BMP-2的PLGA微球（图1）。PLGA微球粒径分布和电位呈正态分布，大部分微球粒径和Zeta电位分布比较集中。粒径平均值：1233nm，Zata电位平均值：-29.7mV。
实施例3：负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料的制备
将实施例1中制备的交联疏松层丝素/胶原膜双蒸水润湿后平铺，在其表面滴加实施例2中制备的负载BMP-2的PLGA微球水溶液，4-8℃风干至表面无流动液体，再将交联致密层丝素/胶原膜润湿后平铺于交联疏松层丝素/胶原膜上表面，4-8℃风干，即得负载BMP-2的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料（图2）。
实施例4：负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料Hoechst 33342荧光染色
分别按实施例1和实施例3制备单纯胶原蛋白支架材料和负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料，并对其按25 kGy剂量进行钴60辐照灭菌。
将上述材料按单纯胶原蛋白支架材料、负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料致密层和疏松层分别向上放置方式，分别浸入每孔含0.5 mL DMEM/F12培养基的孔板中5 h。5 h后每片材料表面分别接种1×105个细胞，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养5 h，5 h后将材料移至含新鲜培养基的孔板中继续培养，每隔2 d换液一次。
于培养第3 d，在细胞培养板中吸弃培养液，加入用0.01M PBS溶解的10 μg/mL的Hoechst 33342染色液，37℃继续孵化10 min后用荧光倒置显微镜观察，结果见图3。由图可见，单纯胶原蛋白支架材料组、负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料致密层向上组和疏松层向上组细胞均生长良好。与单纯胶原蛋白支架材料组（图3，a）比较，材料疏松层向上组（图3，c）细胞呈良好的三维立体状态，细胞数量显著增加，分布较均匀。材料致密层向上组（图3，b）细胞数量也较多，在材料表面呈集落分布生长。结果表明负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料具有良好的生物相容性，并比单一胶原蛋白支架材料有更好的促细胞生长作用。
实施例5：负载BMP的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料体外释放动力学实验
应用流池法进行检测：按实施例2和实施例3制备包载模型蛋白牛血清白蛋白（HSA，代替BMP）PLGA微球的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料，并将其裁成直径13 mm的圆片形，置于内径为13 mm的滤器内，在恒流泵作用下使释放液从双层材料流出，流出方向分别为从致密层丝素/胶原膜至疏松层丝素/胶原膜（MS）、疏松层丝素/胶原膜至致密层丝素/胶原膜（SM），释放液为0.5 μg Ⅰ型胶原酶溶液，流速为10 ml/12 h。取各时间点收集的释放液200 μl，根据蛋白测定法，测定HSA的释放量，并计算每d总收集液的蛋白含量。
在胶原酶溶液中，HSA由致密层向疏松层12 d累积释放百分率（45.6%）小于相反方向释放的累积释放百分率（52.4%），表明制备的包载HSA-PLGA微球的丝素蛋白/胶原蛋白支架材料对负载的HSA具有定向差异释放作用。