胸腺素α-1在制备预防和治疗变态反应的药物中的应用 本发明涉及胸腺素α-1在制备预防和治疗变态反应的药物中的应用。
变态反应是一种对通常无害于人的对物质反应过度的疾病，与正常免疫应答相比，它们构成了突发性有害(paroxitic)免疫应答。机体免疫系统的功能通常是保护机体免遭病原体如细菌、病毒或毒性物质的危害。而变态反应则是免疫系统对非病原生物的超敏免疫反应。个体第一次接触引起变态反应的变应原以后，每次接触此变应原时个体即能识别此变应原。第二次和所有以后接触此变应原所产生的症状实际上不仅取决于所涉及的变应原，而且取决于受影响的机体和其免疫反应的强度。当变应原接触个体的免疫系统时，它会刺激(机体)产生能结合含组胺细胞的抗体。产生这种物质能引起病人典型的变应性症状：受影响组织搔痒、肿胀，过度分泌粘液和肌肉痉挛。这些症状的严重程度和差别具有很强的个人主观性，因为它取决于个体。
最常见的变应原有：食物、药物、化妆品中含有的某些成分、珠宝首饰所用的某些金属、昆虫的叮咬、尘螨、花粉、霉菌和宠物。
如果母亲在哺乳期间不吃某些食物，例如牛奶、鸡蛋和坚果，哺乳儿童发生接触性(contracting)变态反应(包括哮喘)的可能性较低。如果发生变态反应，只有采用适当的治疗和尽可能避免接触有关变应原才能将未来发生变态反应危险的可能性降至最小。
症状的严重程度和类型的差别取决于所述反应、受累及机体区域和病人免疫系统的敏感性。然而，有某些共同症状：鼻炎、咳嗽、呼吸问题、流泪增加、接触区(通常为眼、鼻、咽喉和皮肤)搔痒、皮疹、呕吐、腹泻、头痛。
变应性疾病是由易感个体对常见的环境抗原(变应原)产生了T辅助细胞(Th2)和IgE-特异性应答所导致。研究在预防变应原引起这些潜在过敏性不良免疫反应中，对天然的或诱导的T调节(Treg)细胞群作用的兴趣日益增高。近年来的证据提示，Treg细胞可主动地预防非特应性个体对变应原产生Th2应答，而在变态反应病人中它们的功能可能减弱。这显示通过调节Treg细胞的功能有可能进行治疗。近年来的研究目的是了解产生变应原特异性Treg细胞和发挥其功能所涉及的机制。主要目的是促进开发适合诱导持久的但同时局限化的非全身性变应原特异性抑制机制的治疗方案。
迄今，一直采用抗组胺药物和含考的松的那些抗炎药物或有时采用顺势(homeopathic)疗法来治疗变态反应。然而，用某些药物治疗可能会引起相当大的有时是严重的副作用，例如引起免疫抑制或各种代谢疾病。
鉴于以上所述，证明需要能预防和治疗变态反应但没有已知疗法缺点的新药物。
本发明人发现胸腺素α-1能有效预防和治疗变态反应而对机体没有任何毒性。
胸腺素α-1(Tα-1)是一种天然胸腺肽，已熟知可单用或与IFN-α联用来治疗某些病毒感染，也可用作免疫佐剂(Goldstein A.等，2004 Expert Opin.Biol.Ther.4：559-573)。也已知可用胸腺素α-1治疗的其它适应症，如治疗免疫缺陷症、肿瘤和AIDS。还已知胸腺素α-1可与IFN-α联用，在治疗某些病毒感染中作为生物应答的调节剂，还可用作免疫佐剂(Goldstein A.等，2004 ExpertOpin.Biol.Ther.4：559-573)。近年来的研究发现了此分子具有新的出乎意料的作用。近年业已证明Tα1能通过Toll样受体(TLR)9调节树突状细胞(DC)的功能，起着先天性和适应性免疫系统内源调节剂的作用(Romani L.等，2004，Blood103：4232-4239)。由于对DC具有这种功能活性，业已发现Tα1能在体内外诱导功能活性Treg细胞(Romani L，Blood 2006)。这些研究为将Tα1用作功能活性Treg细胞的诱导剂提供了合理的前提。面对例如目前的皮质类固醇药物疗法的全身性不加区别的免疫抑制作用，上述方法的优点是可调节高度选择性的和特定地异常免疫反应。
本发明的具体目的是用Tα1来制备预防和治疗变态反应的药物，例如，所述变态反应是由变应原，如食物(如卵清蛋白)、药物、化妆品中所含成分、珠宝首饰所用的某些金属(如镍)、昆虫的叮咬、尘螨、花粉、霉菌、宠物和真菌如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)引起的。
现在通过一些优选实施方式，并具体参见附图描述本发明，目的是说明而非限制本发明：
图1显示Tα1在ABPA(A)和OVA引起的变态反应(B)中效果的数据。无(None)代表对照小鼠。
图2显示Tα1和CpG对ABPA的效果的比较数据。
图3显示Tα1对ABPA中肺部募集单核细胞的效果的数据。
图4显示Tα1对ABPA中局部炎症病理变化的效果的数据。
实施例1：在两种实验性变态反应模型中评价胸腺素α-1的效果。一种模型包括在产生变态反应的条件下给予鸡卵清蛋白(OVA)诱导变态反应。另一种模型包括用环境变应原即烟曲霉孢子诱导变态反应。
方法
变态反应和治疗
按表1所述，用曲霉(Aspergillus)诱导病理变态反应(称为ABPA，变应性支气管肺曲霉菌病)，用OVA诱导病理变态反应(Montagnoli C，Fallarino F，Gaziano R，Bozza S，Bellocchio S，Zelante T，Kurup WP，Pitzurra L，Puccetti P，Romani L.“对曲霉菌的免疫和耐受涉及到功能不同的调节性T细胞和色氨酸分解代谢(Immunity and tolerance to Aspergillus involve functionallydistinct regulatory T cells and tryptophan catabolism)”J.Immunol.2006，176：1712-1723)。使小鼠接受腹腔内(i.p.)和皮下(s.c.)注射5μg溶于不完全弗氏佐剂(西格玛公司(Sigma))的烟曲霉菌培养过滤物(CCFA)，然后连续接受两次鼻内注射(相隔一周)20μg CCFA。末次鼻内接触后一周，使小鼠气管内(i.t.)接受107个曲霉菌分生孢子(Aspergillus conidia)。对于OVA致敏，第0天小鼠通过i.p./s.c接受10μg OVA，然后连续接受两次鼻内注射(相隔一周)溶于灭菌盐水中的10μg OVA(VI级鸡OVA；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))和1mg Al(OH)3佐剂(注射用铝；伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce，Rockford，IL))。一周后分析小鼠的炎症和变态反应参数。对于组织学分析，将浸在石蜡中的组织切片(3-4μm)用希弗氏过碘酸(PAS)染色以评价总体形态。用50、200和400倍放大观察PAS染色的肺切片以评估变态反应的典型“杯状(Globet)”细胞。
用May-Grünwald试剂(吉姆萨(Giemsa)，西格玛公司)对变应性小鼠的肺进行染色，以便进行肺总细胞计数和差异性计数，然后进行分析。
羟脯氨酸测定
按前人(Montagnoli C，Fallarino F，Gaziano R，Bozza S，Bellocchio S，Zelante T，Kurup WP，Pitzurra L，Puccetti P，Romani L.“对曲霉菌的免疫和耐受涉及到功能不同的调节性T细胞和色氨酸分解代谢(Immunity andtolerance to Aspergillus involve functionally distinct regulatory T cells andtryptophan catabolism)”J.Immunol.2006，176：1712-1723)所述测定了肺中的胶原蛋白水平。通过羟脯氨酸标准曲线(0-100μg/ml)计算出羟脯氨酸浓度。
血清IgE测定。用酶联免疫吸附试验测定血清样品中的总IgE(Montagnoli C，Fallarino F，Gaziano R，Bozza S，Bellocchio S，Zelante T，Kurup WP，Pitzurra L，Puccetti P，Romani L.“对曲霉菌的免疫和耐受涉及到功能不同的调节性T细胞和色氨酸分解代谢”J.Immunol.2006，176：1712-1723，此文中关于用酶联免疫吸附试验测定血清样品的部分)。
用胸腺素α1治疗。提供无菌干粉形式的Tα1(购自美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St.Louis，MO，USA)；产品编号T3410；分子式C129H215N33O55)和乱序(scambled)肽。用无菌水(用标准鲎(Limulus)裂解物试验检测内毒素水平＜0,03pg/ml)重建这些干粉。按照表1和2中报告的实验设计，在ABPA模型和OVA变态反应模型中，i.p给予每公斤体重50和200微克剂量的Tα1。对照小鼠接受乱序肽。在所选的实验中，治疗小鼠，与已知能改善变态反应症状的药物：即含非甲基化CpG序列的寡脱氧核苷酸作比较。
表1
a.CCFA：烟曲霉的培养过滤物
表2
图1显示在ABPA(A)和OVA引起的变态反应(B)中Tα1效果的数据。此结果清楚地表明Tα1治疗后变应性炎症参数显著下降，即作为变应性炎症介质的羟脯氨酸和IgE抗体的局部产生显著减少。此效果为剂量依赖性，发现在200微克Tα1剂量时有效，而在更低剂量时无效，预防和实际治疗时情况相同。无代表对照小鼠。
图2显示Tα1和CpG对ABPA的效果的比较数据。此结果清楚地表明Tα1预防和治疗时降低变应性炎症参数的效果与CpG相当。无代表对照小鼠。
图3显示Tα1对ABPA中肺部募集单核细胞的效果的数据。此数据表明预防和治疗时，通过Tα1的作用显著减少了引起变态反应病理表现的嗜酸性粒细胞的募集。而且其效果与CpG相当。Tα1对其它类型细胞如中性粒细胞和单核/巨噬细胞的募集没有任何明显作用。
图4显示Tα1对ABPA中局部炎症病理变化的效果的数据。用Tα1治疗(+)或不用Tα1治疗(-)的ABPA小鼠肺切片经不同放大倍数观察显示在以下项目有显著差异：i)炎症渗出液，用Tα1预防性治疗后炎症渗出液显著减少；ii)存在粘膜下腺细胞(称为杯状细胞)的存在，这种细胞是产生粘液的主要细胞，PAS染色呈紫色。用Tα1治疗伴有这些细胞增生的减少。
总之，以上数据提示Tα1对预防和治疗变态反应均有显著的抗变态反应作用。