说明书一种土沉香组织培养再生体系的建立方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种土沉香组织培养再生体系的建立方法。
背景技术
土沉香（Aquilaria sinensis）又称白木香、莞香、女儿香等，为瑞香科沉香属多年生常绿乔木，是我国特有而珍贵的药用植物和香料植物,也是我国生产沉香的唯一植物资源。目前零星分布于广东、广西、福建、海南、台湾等地。土沉香不但具有极高的药用与经济价值,而且树形美观、树姿优雅、枝繁叶茂、四季常绿,是一种观赏价值颇高的园林绿化树种。近年来由于人们对沉香的无度索取,致使土沉香天然林遭到严重破坏,加之天然林更新能力弱,国内土沉香野生资源已近枯竭,现仅有零星散生分布,资源现状不容乐观，已被列为国家二级重点保护野生植物。
近年来,土沉香人工林得到迅猛发展,但一般采用种子苗造林。因遗传变异大,生产量差异较大。此外，土沉香野生优树结实率低,不易获得大量优质种子,且种子不宜保存,易丧失活力,使得通过有性繁殖经营及发展人工林的进程变得缓慢和困难。采用植物组织培养繁殖技术,可以在一定程度上保留母本的优良性状,增加良种的繁育能力和数量，已经成为保护和繁殖珍贵树种的有效措施之一。因此，通过植物组织培养技术,能够有效解决种子不足问题,为土沉香资源保存和开发利用开辟新的途径,也为土沉香无性系育种提供一种技术手段。本发明以土沉香当年生顶芽为外植体，通过愈伤组织诱导培养、分化、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程成功获得了土沉香离体再植株，建立土沉香组织培养快速繁殖技术体系，为无性系育种及有效保护土沉香资源,加速组培苗生产,满足市场需求做出贡献。
发明内容
本发明的目的在于提供出一种土沉香组织培养再生体系的建立方法，本发明以土沉香当年生顶芽为外植体，通过愈伤组织诱导培养、分化、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程成功获得了土沉香离体再植株，建立土沉香组织培养快速繁殖技术体系，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种土沉香组织培养再生体系的建立方法，包括以下的步骤：
（1）外植体消毒：选取生长旺盛、健壮、无病虫害的2年生海南种源土沉香苗木的顶芽。用3%的洗衣粉水清洗10～30min,流水冲洗30～60min。在超净工作台中，以70%～80%乙醇溶液浸泡20s～60s，无菌水冲洗4～6次，再用0.1%～0.2%升汞溶液消毒5～15min，然后用无菌水冲洗外植体至无泡沫为止。把消毒好的外植体置于铺有无菌滤纸的盘中,吸干材料表面的水分。
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）消毒好的顶芽切掉末端与药液接触的部分,再切成3.0cm 左右的小段并接种到诱导培养基进行愈伤组织诱导培养。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养30天后统计诱导情况。
（3）分化培养：将步骤（2）诱导得到的愈伤组织取出切成直径大小约0.5cm的块接种至分化培养基进行分化培养。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养30天后统计分化情况。
（4）增殖培养：选取步骤（3）分化培养得到的不定芽接种至增殖培养基进行继代培养。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养30天后统计增殖情况。
（5）生根培养：从基部切取步骤（4）增殖培养中获的健壮不定芽接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养30天后统计生根情况。
（6）炼苗移栽：将生根培养基上获得的具备移栽条件的瓶苗进行炼苗，瓶苗移至常温下 4～5天后，打开瓶盖 2～3天，然后洗去附着于苗根系上的培养基，移栽至盛有由泥炭土:蛭石＝1:1组成的移栽培养基质的容器袋中进行培养，移栽前5天用0.3%高猛酸钾溶液对基质喷淋消毒并加盖薄膜,3天后打开薄膜,翻动基质，移栽前1天将基质淋透水。移栽时需将基质压实，并进行单株套袋，早晚喷雾，保证生长环境潮湿。移栽7天后剪去塑料袋两角，14天后完全脱袋，移栽30天后统计成活率。
上述步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+0.05～0.2mg/L NAA+0.5～2.0mg/L 6-BA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（3）所述的分化培养基为：MS+0.1～1.0mg/L 6-BA+0.01～0.1mg/LNAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（4）所述的增殖培养基为：MS+0.1～1.0mg/L KT+0.01～0.1mg/LNAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（5）所述的生根培养基为：1/2MS+1.0～2.0mg/L ABT5+0.01～0.1mg/L NAA+0.1～1.0mg/L IBA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂+1～3g/L蛋白胨+50～100ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8。
本发明的优点是：土沉香（Aquilaria sinensis）为瑞香科沉香属多年生常绿乔木,是我国特有珍贵的药用树种,具有较高的经济价值及园林、绿化等生态价值。因过度的采集沉香,野生土沉香趋于濒危,已被列入国家珍稀濒危三级保护植物以及国家二级重点保护野生植物名录。因此，为了更好地保护土沉香树种,研究和建立完善的组培快繁体系具有重要的现实意义。本发明以土沉香当年生顶芽为外植体，通过愈伤组织诱导培养、分化、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程成功获得了土沉香离体再植株，建立土沉香组织培养快速繁殖技术体系，为无性系育种及有效保护土沉香资源,加速组培苗生产,满足市场需求做出贡献。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
（1）外植体消毒：选取生长旺盛、健壮、无病虫害的2年生海南种源土沉香苗木的顶芽。用3%的洗衣粉水清洗10min,流水冲洗30min。在超净工作台中，以70%乙醇溶液浸泡40s，无菌水冲洗6次，再用0.1%升汞溶液消毒15min，然后用无菌水冲洗外植体至无泡沫为止。把消毒好的外植体置于铺有无菌滤纸的盘中,吸干材料表面的水分。
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）消毒好的顶芽切掉末端与药液接触的部分,再切成3.0cm 左右的小段并接种到诱导培养基进行愈伤组织诱导培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为1000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后诱导率为86.67%。所述的诱导培养基为：MS+0.08mg/L NAA+1.2mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.5。
（3）分化培养：将步骤（2）诱导得到的愈伤组织取出切成直径大小约0.5cm的块接种至分化培养基进行分化培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后分化率为90%。所述的分化培养基为：MS+0.3mg/L 6-BA+0.05mg/LNAA+30g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.5。
（4）增殖培养：选取步骤（3）分化培养得到的不定芽接种至增殖培养基进行继代培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为1000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖系数为10.5。所述的增殖培养基为：MS+0.8mg/L KT+0.06mg/LNAA+18g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.5。
（5）生根培养：从基部切取步骤（4）增殖培养中获的健壮不定芽接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天生根率为73.4%。所述的生根培养基为：1/2MS+1.3mg/L ABT5+0.05mg/L NAA+0.7mg/L IBA+20g/L蔗糖+4.7g/L琼脂+1.5g/L蛋白胨+70ml/L椰子汁，pH为5.5。
（6）炼苗移栽：将生根培养基上获得的具备移栽条件的瓶苗进行炼苗，瓶苗移至常温下 4天后，打开瓶盖 2天，然后洗去附着于苗根系上的培养基，移栽至盛有由泥炭土:蛭石＝1:1组成的移栽培养基质的容器袋中进行培养，移栽前5天用0.3%高猛酸钾溶液对基质喷淋消毒并加盖薄膜,3天后打开薄膜,翻动基质，移栽前1天将基质淋透水。移栽时需将基质压实，并进行单株套袋，早晚喷雾，保证生长环境潮湿。移栽7天后剪去塑料袋两角，14天后完全脱袋，移栽30天后成活率为87.4%。
实施例2
（1）外植体消毒：选取生长旺盛、健壮、无病虫害的2年生海南种源土沉香苗木的顶芽。用3%的洗衣粉水清洗15min,流水冲洗50min。在超净工作台中，以75%乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗6次，再用0.1%升汞溶液消毒10min，然后用无菌水冲洗外植体至无泡沫为止。把消毒好的外植体置于铺有无菌滤纸的盘中,吸干材料表面的水分。
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）消毒好的顶芽切掉末端与药液接触的部分,再切成3.0cm 左右的小段并接种到诱导培养基进行愈伤组织诱导培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为1500lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后诱导率为83.12%。所述的诱导培养基为：MS+0.1mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH为5.7。
（3）分化培养：将步骤（2）诱导得到的愈伤组织取出切成直径大小约0.5cm的块接种至分化培养基进行分化培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后分化率为86.2%。所述的分化培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+4.8g/L琼脂，pH为5.7。
（4）增殖培养：选取步骤（3）分化培养得到的不定芽接种至增殖培养基进行继代培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖系数为8.3。所述的增殖培养基为：MS+1.0mg/L KT+0.03mg/LNAA+25g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.7。
（5）生根培养：从基部切取步骤（4）增殖培养中获的健壮不定芽接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照14小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天生根率为68.9%。所述的生根培养基为：1/2MS+1.5mg/L ABT5+0.06mg/L NAA+1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂+2.0g/L蛋白胨+100ml/L椰子汁，pH为5.7。
（6）炼苗移栽：将生根培养基上获得的具备移栽条件的瓶苗进行炼苗，瓶苗移至常温下 4天后，打开瓶盖 2天，然后洗去附着于苗根系上的培养基，移栽至盛有由泥炭土:蛭石＝1:1组成的移栽培养基质的容器袋中进行培养，移栽前5天用0.3%高猛酸钾溶液对基质喷淋消毒并加盖薄膜,3天后打开薄膜,翻动基质，移栽前1天将基质淋透水。移栽时需将基质压实，并进行单株套袋，早晚喷雾，保证生长环境潮湿。移栽7天后剪去塑料袋两角，14天后完全脱袋，移栽30天后成活率为83.9%。