基因导入用担体和基因导入剂以及它们的制造方法、以及向细胞导入基因的方法.pdf

本发明提供一种能够更加安全且自由地导入基因的新的基因导入方法。特别是提供在脑内的特定的位置安全且自由地导入基因的方法。提供一种基因导入用担体和基因导入剂，其中，该基因导入用担体包含纳米颗粒和基因导入用载体结合物质，具备引发由细胞进行的吞噬的官能团，上述基因导入用载体结合物质经由上述官能团中的一部分与上述纳米颗粒的表面结合，上述官能团中的另外一部分以不与上述基因导入用载体结合物质结合的状态存在，该基因导入剂是将基因导入用载体与该基因导入用担体的上述基因导入用载体结合物质结合而成的。

权利要求书
1.  一种基因导入用担体，其特征在于：
包含纳米颗粒和基因导入用载体结合物质，
该基因导入用担体具备引发由细胞进行的吞噬的官能团，
所述基因导入用载体结合物质经由所述官能团中的一部分与所述纳米颗粒的表面结合，
所述官能团中的另外一部分以不与所述基因导入用载体结合物质结合的状态存在。

2.  一种基因导入剂，其特征在于：
其是将基因导入用载体与权利要求1所述的基因导入用担体的所述基因导入用载体结合物质结合而成的。

3.  如权利要求2所述的基因导入剂，其特征在于：
所述基因导入用载体为选自仙台病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒载体中的1种以上。

4.  如权利要求2或3所述的基因导入剂，其特征在于：
所述官能团带有正电荷。

5.  如权利要求2～4中任一项所述的基因导入剂，其特征在于：
所述官能团为氨基。

6.  如权利要求2～5中任一项所述的基因导入剂，其特征在于：
所述纳米颗粒的平均粒径为10nm～1000nm。

7.  如权利要求2～6中任一项所述的基因导入剂，其特征在于：
所述基因导入用载体结合物质为肝素和/或硫酸乙酰肝素。

8.  如权利要求2～7中任一项所述的基因导入剂，其特征在于：
所述纳米颗粒具有磁性。

9.  一种使用基因导入剂向细胞导入基因的方法，其特征在于：
所述基因导入剂包含纳米颗粒、基因导入用载体和基因导入用载体结合物质，且具备引发由细胞进行的吞噬的官能团，
所述基因导入用载体结合物质经由所述官能团中的一部分与所述纳米颗粒的表面结合，
所述官能团中的另外一部分以不与所述基因导入用载体结合物质结合的状态存在，
所述基因导入用载体与基因导入用载体结合物质结合。

10.  一种向细胞导入基因的方法，其特征在于：
包括使基因导入用载体与基因导入用担体的基因导入用载体结合物质结合，制备基因导入剂的步骤，
其中，所述基因导入用担体含有所述纳米颗粒和所述基因导入用载体结合物质，且具备引发由细胞进行的吞噬的所述官能团，
所述基因导入用载体结合物质经由所述官能团中的一部分与所述纳米颗粒的表面结合，
所述官能团中的另外一部分以不与所述基因导入用载体结合物质结合的状态存在。

11.  如权利要求9或10所述的基因导入方法，其特征在于：
包括通过注射将所述基因导入剂引导至靶细胞的步骤。

12.  如权利要求11所述的基因导入方法，其特征在于：
所述纳米颗粒具有磁性，该基因导入方法包括对所述基因导入剂施加磁场而保持在注射部位的步骤。

13.  一种基因导入用担体的制造方法，其特征在于：
该基因导入用担体包含纳米颗粒和基因导入用载体结合物质，
该制造方法包括在表面具备引发由细胞进行的吞噬的官能团的所 述纳米颗粒经由所述官能团中的一部分与所述基因导入用载体结合物质结合的工序。

14.  一种基因导入剂的制造方法，其特征在于：
包括使基因导入用载体与由权利要求13所述的制造方法得到的基因导入用担体的所述基因导入用载体结合物质结合的工序。

说明书基因导入用担体和基因导入剂以及它们的制造方法、以及向细胞导入基因的方法
技术领域
本发明涉及基因导入剂、使用该基因导入剂的基因导入方法、以及该基因导入剂的制造方法等，该基因导入剂的特征在于，在表面结合肝素或硫酸乙酰肝素，经由肝素或硫酸乙酰肝素结合有基因导入用载体。
背景技术
目前为止，开发了使用重组入目的基因的病毒，在作为靶标的细胞、组织和器官等中使该基因表达的基因导入方法。例如，开发了将重组入基因的病毒注入血管内，通过血流使其移动至靶器官的方法、以及使用注射器等直接注入靶器官的方法。但是，在这样的方法中，存在如下的问题：注入的病毒扩散，病毒浓度在所希望的部位降低而无法获得足够的基因表达水平，以及基因在非希望的部位表达而有可能引起不良作用。
另外，有使核酸或病毒附着于包覆了生物体分子的磁性颗粒，通过外部磁场使该磁性颗粒集聚在规定的地方而导入基因的方法(专利文献2)。另外，还有使病毒与结合有肝素的纤维状结构体结合，将该纤维状结构体导入靶器官等，由此选择性地使病毒感染与该纤维状结构体接触的细胞，从而使基因表达的方法(专利文献1)。另外，开发了附加了聚赖氨酸而具有氨基的珠(NH2残基型珠)，该珠具有神经纤维延伸作用。
但是，现在依然需要用于更为安全且自由地导入基因的技术。特别是由于需要定位手术且对患者的负担大，所以例如对帕金森氏病的基因治疗这样的向脑内的基因导入中，需要这样的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011-201793号
专利文献2：日本国际公开第2005/095621号
专利文献3：日本特开2006-88131号
专利文献4：日本特表2008-500049号
专利文献5：日本特开2008-127454号
非专利文献
非专利文献1：PNAS,Vol.106,No.1,pp44-49(2009)
非专利文献2：Infect.Immun.1984,43(2):561
非专利文献3：Infect.Immun.February 1984vol.43no.2561-566
非专利文献4：J Biomed Mater Res A.2005Mar 15；72(4):389-98
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供一种能够更加安全且自由地导入基因的新的基因导入方法。特别是在于提供一种向器官内的特定位置安全且自由地导入基因的方法。
用于解决课题的方法
为了实现上述目的，发明人使肝素经由氨基与纳米颗粒的表面结合，再使腺伴随病毒载体附着，注入大鼠脑内的特定位置，结果发现腺伴随病毒载体移动到与该纳米颗粒接触的神经细胞，然后该纳米颗粒通过巨噬细胞的吞噬作用从脑内被除去，从而完成了本发明。
基于该见解，本发明提供以下的(i)～(xiv)。
(i)一种基因导入用担体，其包含纳米颗粒和基因导入用载体结合物质，具备引发由细胞进行的吞噬的官能团，上述基因导入用载体结合物质经由上述官能团中的一部分与上述纳米颗粒的表面结合，上述官能团中的另外一部分以不与上述基因导入用载体结合物质结合的状态存在。
(ii)一种基因导入剂，其是将基因导入用载体与(i)所述的基因导入用担体的上述基因导入用载体结合物质结合而成的。
(iii)如(ii)所述的基因导入剂，其中，上述基因导入用载体为 选自仙台病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒载体中的1种以上。
(iv)如(ii)或(iii)所述的基因导入剂，其中，上述官能团带有正电荷。
(v)如(ii)～(iv)中任一项所述的基因导入剂，其中，上述官能团为氨基。
(vi)如(ii)～(v)中任一项所述的基因导入剂，其中，上述纳米颗粒平均粒径为10nm～1000nm。
(vii)如(ii)～(vi)中任一项所述的基因导入剂，其中，上述基因导入用载体结合物质为肝素和/或硫酸乙酰肝素。
(viii)如(ii)～(vii)中任一项所述的基因导入剂，其中，上述纳米颗粒具有磁性。
(ix)一种使用基因导入剂向细胞导入基因的方法，其中，该基因导入剂包含纳米颗粒、基因导入用载体和基因导入用载体结合物质，且具备引发由细胞进行的吞噬的官能团，上述基因导入用载体结合物质经由上述官能团中的一部分与上述纳米颗粒的表面结合，上述官能团中的另外一部分以不与上述基因导入用载体结合物质结合的状态存在，上述基因导入用载体与基因导入用载体结合物质结合。
(x)一种向细胞导入基因的方法，其包括使基因导入用载体与基因导入用担体的基因导入用载体结合物质结合，制备基因导入剂的步骤，其中，上述基因导入用担体包含上述纳米颗粒和上述基因导入用载体结合物质，且具备引发由细胞进行的吞噬的上述官能团，上述基因导入用载体结合物质经由上述官能团中的一部分与上述纳米颗粒的表面结合，上述官能团中的另外一部分以不与上述基因导入用载体结合物质结合的状态存在。
(xi)如(ix)或(x)所述的基因导入方法，其包括通过注射将上述基因导入剂引导至靶细胞的步骤。
(xii)如(xi)所述的基因导入方法，其中，上述纳米颗粒具有磁性，该基因导入方法包括对上述基因导入剂施加磁场而保持在注射部位的步骤。
(xiii)一种基因导入用担体的制造方法，该基因导入用担体包含 纳米颗粒和基因导入用载体结合物质，该制造方法包括在表面具备引发由细胞进行的吞噬的官能团的纳米颗粒经由上述官能团中的一部分与上述基因导入用载体结合物质结合的工序。
(xiv)一种基因导入剂的制造方法，其包括使基因导入用载体与通过(xiii)所述的制造方法得到的基因导入用担体的上述基因导入用载体结合物质结合的工序。
另外，本发明还提供以下[1]～[13]。
[1]一种基因导入剂，其包含纳米颗粒，该基因导入剂用于在靶细胞、靶组织、或靶器官中导入基因，该纳米颗粒的特征在于，在表面经由键与肝素或硫酸乙酰肝素结合，经由肝素或硫酸乙酰肝素与基因导入用载体结合。
[2]如[1]所述的基因导入剂，其中，键为经由纳米颗粒上的氨基、巯基或者活性酯基的化学键、或者物理键。
[3]如[1]或[2]所述的基因导入剂，其中，纳米颗粒的大小为10nm～1000nm。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的基因导入剂，其中，纳米颗粒为磁性颗粒。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的基因导入剂，其中，基因导入用载体选自仙台病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒载体。
[6]一种基因导入方法，其使用纳米颗粒向非人哺乳动物或所分离的靶细胞中导入基因，其中，该纳米颗粒的特征在于，在表面经由键与肝素或硫酸乙酰肝素结合，经由肝素或硫酸乙酰肝素与基因导入用载体结合。
[7]如[6]所述的基因导入方法，其中，键为经由氨基、巯基或活性酯基的化学键、或者物理键。
[8]如[6]或[7]所述的基因导入方法，其中，纳米颗粒的大小为10nm～1000nm。
[9]如[6]～[8]中任一项所述的基因导入方法，其包括通过注射将纳米颗粒引导至靶细胞的步骤。
[10]如[6]～[9]中任一项所述的基因导入方法，其中，纳 米颗粒为磁性颗粒，该基因导入方法还包括施加磁场，将该磁性颗粒引导至靶细胞的工序。
[11]如[6]～[10]中任一项所述的基因导入方法，其中，基因导入用载体选自仙台病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒载体。
[12]一种包含纳米颗粒的基因导入剂的制造方法，其特征在于，包括：
(i)使供氨基化合物或供巯基化合物与纳米颗粒反应，使氨基或巯基与纳米颗粒表面结合的工序；
(ii)使肝素或硫酸乙酰肝素与结合了氨基或巯基的纳米颗粒结合的工序；和
(iii)经由肝素或硫酸乙酰肝素，使基因导入用载体结合的工序。
[13]如[12]记载的制造方法，其中，基因导入用载体选自仙台病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒载体。
本发明中，“引发由细胞进行的吞噬的官能团”是指被巨噬细胞系细胞识别并能够引发该细胞的吞噬作用的官能团。“引发由细胞进行的吞噬的官能团”在存在于基因导入剂内的情况下，引发识别该官能团的巨噬细胞系细胞捕食作为生物体内异物的基因导入剂。“引发由细胞进行的吞噬的官能团”为了使巨噬细胞系细胞识别，优选表现为正电荷，作为这样的官能团，可以列举例如氨基。此外，巨噬细胞系细胞根据本发明涉及的基因导入用担体和基因导入剂的靶细胞、组织和器官的不同而会不同，但例如可以为巨噬细胞、小胶质细胞、枯否细胞等。
“纳米颗粒”是指平均粒径为10nm～1000nm的颗粒状物质。平均粒径是指分散溶剂中的水中粒径。水中粒径能够通过现有公知的动态光散射法计算测量。“纳米颗粒”需要设为巨噬细胞系细胞可捕食范围的大小。“纳米颗粒”的材料和形状没有特别限定，但优选由具有一定硬度的材料形成，在生物体内经历一定期间能够维持形状。本说明书中，“纳米颗粒”有时被称为“纳米珠”，或者仅称为“颗粒”或“珠”。
“基因导入用载体结合物质”只要是与基因导入用载体具有结合 性的物质即可，没有特别限定。“基因导入用载体结合物质”中，例如在将载体设为病毒载体的情况下，可以使用肝素或硫酸乙酰肝素。
“基因导入用载体”没有特别限制，能够使用本技术领域中已知的载体，例如能够使用病毒载体。“病毒载体”没有特别限制，是指利用病毒感染细胞的机理或被维持在细胞中的机理的基因导入用载体，包括公知的任意的病毒载体。本发明中，例如可以使用仙台病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒(Adeno-associated virus(AAV))载体等。本发明中，优选使用AAV1～8型，特别优选使用AAV2型。
发明的效果
根据本发明涉及的基因导入剂，能够在生物体内的所希望的位置导入基因导入用载体，因此就能够位置特异性地导入基因。另外，由于本发明涉及的基因导入剂很快被巨噬细胞系细胞吞噬而从体内除去，因此能够提高基因导入的安全性。
根据本发明涉及的基因导入剂，基因导入用载体不会被破坏，在组织中能够长时间维持基因导入用担体与基因导入用载体的稳定的结合。因此，能够选择性地仅使病毒感染与基因导入剂接触的细胞，从而能够在体内的特定部位中选择性且有效地表达所希望的基因。另外，在in vitro(体外)体系中，也能够使病毒感染特定的部位，因此能够使基因选择性地在靶标部位表达。
附图说明
图1是说明本发明涉及的基因导入用担体和基因导入剂的构成的示意图。
图2表示添加结合了重组有GFP基因的腺伴随病毒载体的基因导入剂经过2周后的培养海马神经细胞(绿色：GFP，红色：纳米珠)。
图3是用放射光CT对注入氨基化荧光磁性珠经过2周后的大鼠脑进行超高分辨率拍摄得到的照片(红色箭头所示的白色部分：氨基化荧光磁性珠)。
图4A是注入氨基化荧光磁性珠经过2周后的大鼠脑(图3的红色 箭头部位)的免疫组织化学染色图像(紫色：星形胶质细胞(astrocyte)，绿色：小胶质细胞，红色：氨基化荧光磁性珠)。白色箭头是指大量吞噬了氨基化荧光磁性珠的小胶质细胞。B是注入非氨基化荧光磁性珠或氨基化荧光磁性珠经过2周后的大鼠脑的免疫组织化学染色图像(红色：小胶质细胞，蓝色：荧光磁性珠)。
图5是将结合了重组有视紫红质通道蛋白2-GFP嵌合基因的腺伴随病毒载体的基因导入剂注入大鼠的脑内经过4周后的脑切片的照片。
图6是将结合了重组有视紫红质通道蛋白2-GFP嵌合基因的腺伴随病毒载体的基因导入剂注入大鼠的脑内经过4周后，在神经细胞中刺入记录电极并照射蓝色光时的图谱。
图7是将结合了重组有视紫红质通道蛋白2-GFP嵌合基因的腺伴随病毒载体的基因导入剂注入大鼠的脑内，用荧光显微镜拍摄经过2周后的大鼠脑得到的照片(A；红色：基因导入剂，B；绿色：GFP，C；A+B的多重荧光图像)。
图8是将重组有视紫红质通道蛋白2-GFP嵌合基因的腺伴随病毒载体直接注射进大鼠脑，用荧光显微镜拍摄经过4周后的大鼠脑得到的照片。
图9是将结合了重组有GFP基因的AAV的磁性纳米线(wire)载置在细胞上，用光学显微镜(A)和荧光显微镜(B)拍摄培养3周后的培养皿得到的照片、以及将该磁性纳米线注入大鼠的脑内用放射光CT进行超高分辨率拍摄得到的照片(C)。
具体实施方式
本发明涉及基因导入剂、使用该基因导入剂的基因导入方法、以及该基因导入剂的制造方法等，该基因导入剂的特征在于，在表面经由键与肝素或硫酸乙酰肝素结合，经由肝素或硫酸乙酰肝素与基因导入用载体结合。
1.基因导入用担体、基因导入剂
[基因导入剂]
图1示意性地表示本发明涉及的基因导入用担体和基因导入剂的构成。图(A)中符号1所示的基因导入剂包含基因导入用担体2和与 其结合的基因导入用载体3。
[基因导入用载体]
基因导入用载体3是在作为靶标的器官、组织或者细胞(以下称为“靶器官等”)中重组入表达基因的载体。基因导入用载体3能够使用例如病毒载体。作为病毒载体，能够使用仙台病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒(Adeno-associated virus(AAV))载体等。基因导入用载体3优选使用AAV1～8型，特别优选使用AAV2型。
[基因导入用担体]
基因导入用担体2包含纳米颗粒21和基因导入用载体结合物质22。上述基因导入用载体3与基因导入用载体结合物质22结合。其中，图中，为了简化，表示了一个与基因导入用载体结合物质22结合的基因导入用载体3，但基因导入用载体结合物质22也可以结合多个基因导入用载体3。
[纳米颗粒]
纳米颗粒21可以为平均粒径10nm～1000nm的大小，但为了易于被巨噬细胞系细胞吞噬，优选设为粒径150nm～300nm的大小，更优选设为粒径100nm～200nm的大小。
纳米颗粒21可以具有磁性。通过对纳米颗粒21赋予磁性，能够通过外部磁场使导入了靶器官等的基因导入剂1集聚在规定的地方。作为具有磁性的纳米颗粒21，能够使用由金属构成的颗粒或由高分子构成的颗粒等本技术领域已知的磁性纳米颗粒。
虽然不是限定的内容，但本发明中，从具有不易凝集的优点考虑，能够使用专利文献3中记载的表面由聚合物构成的聚合物包覆磁性珠。聚合物能够使用通过苯乙烯单体与甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)单体的聚合所形成的聚合物。由于疏水性强的苯乙烯聚合得到的聚苯乙烯具有适度的硬度，所以优选作为珠的主要构成材料。另外，GMA的缩水甘油基(环氧基)经常与氨基等反应，因此能够取代为氨基等，或者能够使以下说明的基因导入用载体结合物质、连接体与取代的氨基等结合。
用于形成包覆磁性珠的聚合物所使用的单体只要是具有能够自由 基聚合的官能团的单体，就没有特别限定。作为单体，能够列举苯乙烯、α-甲基苯乙烯、邻乙烯基甲苯、间乙烯基甲苯、对乙烯基甲苯、二乙烯基苯等芳香族乙烯基化合物；(甲基)丙烯酸、巴豆酸等不饱和羧酸类；(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸正丙酯、(甲基)丙烯酸异丙酯、(甲基)丙烯酸正丁酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯、(甲基)丙烯酸正己酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(聚)乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、(聚)丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯等(甲基)丙烯酸酯类；(甲基)丙烯腈、偏氰化乙烯等氰化乙烯基化合物；氯乙烯、偏二氯乙烯、氟乙烯、偏二氟乙烯、四氟乙烯等卤化乙烯基化合物等。这些单体中，特别优选芳香族乙烯基化合物、(甲基)丙烯酸酯类。另外，这些单体能够单独使用或混合2种以上使用。这些单体的至少1种优选在聚合物形成后的聚合物包覆的表面具有以下说明的官能团23a、23b，或者具有能够与官能团23a、23b取代的官能团。
[基因导入用载体结合物质]
基因导入用载体结合物质22只要是与基因导入用载体3具有结合性的物质即可，没有特别限定。基因导入用载体结合物质22中，在例如将载体设为病毒载体的情况下，可以使用肝素或硫酸乙酰肝素。
[官能团]
纳米颗粒21具备引发由细胞进行的吞噬的官能团23a、23b。官能团23a、23b是被巨噬细胞系细胞识别并引发该细胞捕食作为生物体内异物的基因导入剂1的官能团，例如设为氨基等(参照非专利文献3、4)。官能团23a、23b可以相同也可以不同。其中，在图中，为了简化，表示了各一个官能团23a、23b，但纳米颗粒21具备多个官能团23a、23b。
基因导入用载体结合物质22经由官能团23a结合于纳米颗粒21的表面。官能团23a与基因导入用载体结合物质22的结合可以为化学键或物理键。其中，化学键是指分子或结晶中的原子之间的连接，可分类为共价键、离子键、金属键和配位键。本发明中，虽然不进行限定，但可以列举例如：经由氨基、巯基、或活性酯基的结合、硫键、以及二硫键。物理键是指通过范德华力或静电进行吸附的状态。
官能团23a以化学键或物理键与基因导入用载体结合物质22结合的结果，可以丧失引发由细胞进行的吞噬的能力。另一方面，官能团23b可以以不与基因导入用载体结合物质22结合的状态存在。因此，官能团23b维持着引发由细胞进行的吞噬的能力。
[基因导入剂的效果]
基因导入剂1中，基因导入用载体结合物质22经由官能团23a与纳米颗粒21结合，基因导入用载体结合物质22进一步结合基因导入用载体3，使基因导入用载体3保持在纳米颗粒21上。因此，在将基因导入剂1导入靶器官等的情况下，纳米颗粒21上所保持的基因导入用载体3不扩散而留在导入部位。因此，在利用基因导入剂1进行的基因导入中，能够使目的基因在靶器官等中仅在基因导入剂1的导入部位表达。
进而，基因导入剂1中，不与基因导入用载体结合物质22结合而存在的官能团23b引发细胞对基因导入剂1的吞噬。因此，在通过基因导入剂1进行的基因导入中，能够通过巨噬细胞系细胞吞噬使目的基因在靶器官等的特定的部位表达后的基因导入剂1，从而将其从体内除去。
为了促进巨噬细胞系细胞对基因导入剂1的吞噬，也能够使官能团23a或者与官能团23b相同的官能团(氨基等)预先与基因导入用载体结合物质22结合。
[连接体]
官能团23a、23b，如图(B)所示，可以经由连接体24在纳米颗粒21上存在。连接体24中，没有特别限定，能够使用在分子结构中具有“-CH2-CH2-O-”单元的乙二醇(EG)、具有“-CH(CH3)-CH2-O-”单元的丙二醇、具有“-CH(CH3)-CH2-CH2-O-”单元的丁二醇等的亲水性分子。通过导入连接体24，能够使纳米颗粒21的水合性提高，抑制纳米颗粒21的凝集，提高基因导入剂1的溶剂分散性。
乙二醇链(EG链)由“-(CH2-CH2-O)m-”(m是表示聚合度的整数)表示，有时将m为2以上的EG链称为聚乙二醇链(PEG链)。作为连接体24，优选在分子结构中含有EG链、在末端具有环氧基或氨基、羧基、马来酰亚胺基、羟基、琥珀酰亚胺基、叠氮基、炔基、双 吖丙啶基等反应性官能团的化合物。连接体24优选m为1以上5以下且在分子两末端具有缩水甘油基等环氧基的乙二醇系化合物，特别优选m为1且在分子量末端具有缩水甘油醚的乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)。
2.基因导入用担体、基因导入剂的制造方法
(1)基因导入用担体的制造方法
[官能团的结合工序]
为了制备基因导入用担体2，首先，使具有引发由细胞进行的吞噬的官能团23a，23b的化合物与纳米颗粒21反应，进行使官能团23a，23b与纳米颗粒21的表面结合的处理。以下，以将官能团23a，23b设为氨基，将具有官能团23a，23b的化合物设为供氨基化合物的情况为例进行说明。
作为供氨基化合物，没有限定，能够使用例如氨、赖氨酸或精氨酸等碱性氨基酸以及聚赖氨酸或聚精氨酸等碱性多肽等。对于使氨基结合的处理中所采用的溶剂、温度、反应时间等反应条件而言，只要是本领域技术人员就能够根据纳米颗粒21和/或供氨基化合物适当设定。
此外，在作为纳米颗粒21使用由在主链或侧链中具有氨基的高分子构成的纳米珠那样的、即使不进行本处理也具有氨基的纳米珠的情况下，有时也可以省略本工序。
[基因导入用载体结合物质的结合工序]
接着，对于纳米颗粒21，进行经由官能团23a使基因导入用载体结合物质22结合的处理。由此，作为附加了官能团23a，23b和基因导入用载体结合物质22的纳米颗粒21，得到基因导入用担体2。以下，以将基因导入用载体结合物质22设为肝素的情况为例进行说明。
肝素结合处理中能够使用公知的肝素结合方法，例如，能够使用使肝素与有机化合物等结合的市售的试剂通过化学处理使其结合。通过这样的处理，肝素经由氨基(官能团23a)与纳米颗粒21表面结合。也可以代替肝素使用硫酸乙酰肝素。另外，纳米颗粒21和肝素也能够利用活性酯基来结合。
在经由纳米颗粒21表面的氨基使肝素结合的情况下，如下述式1 所示，纳米颗粒21表面的氨基(NH2)与肝素中的甲酰基(CHO)结合，形成亚胺(R－N＝CH－R)，接着，通过将该亚胺还原，得到胺。R′·NH2+R″·CHO→R′·N＝CH·R″→R′·NH·CH2·R"   式1
此外，亚胺的形成为平衡反应(式1的第1阶段)，亚胺的还原(式1的第2阶段)为不可逆反应。
由于肝素的分子大小以及氨基和甲酰基的反应效率，所以纳米颗粒21表面的氨基与肝素的结合并不在纳米颗粒21表面存在的全部氨基产生。因此，在结合反应后的纳米颗粒21表面，形成与肝素的结合的氨基(官能团23a)和不与肝素结合而存在的氨基(官能团23b)以一定的比率存在。这在将官能团23a，23b设为氨基以外的官能团、将基因导入用载体结合物质22设为肝素以外的物质的情况下也是同样的。本工序后的纳米颗粒21表面中，与基因导入用载体结合物质22形成结合的官能团23a和不结合而存在的官能团23b的比率根据基因导入用载体结合物质22的种类和反应条件而不同，为5：5～1：9左右。
(2)基因导入剂的制造方法
[基因导入用载体的结合工序]
进行使基因导入用载体3与基因导入用担体2结合的处理。例如，将附加了氨基和肝素的基因导入用担体2加入柱子，添加病毒粗精制样品，由此能够得到病毒载体与肝素结合的基因导入剂1。此外，基因导入用载体3的构建和精制能够通过使用市售的试剂等以公知的方法进行。由于基因导入用担体2中能够结合重组有目的基因的、任意选择的基因导入用载体3，所以能够根据基因导入的目的和靶细胞的种类等容易地制备所希望的基因导入剂1。
另外，在本发明的一个方式中，除了基因导入用载体3以外，也可以任意将与肝素或硫酸乙酰肝素具有结合性的粘附分子(层粘连蛋白等)或体液因子(趋化因子等的诱导、营养、刺激因子等)，与基因导入用载体3混合添加，使这些分子经由肝素或硫酸乙酰肝素与基因导入剂1结合。
例如，利用体液因子诱导或活化特定的细胞，或者利用粘附因子使细胞粘附，由此能够增加靶细胞与病毒载体的接触机会，使病毒载体的感染效率提高。
此外，即使在不使与肝素或硫酸乙酰肝素具有结合性的分子与病毒载体一起结合的情况下，作为基因导入靶标的细胞或组织等具有的肝素结合性蛋白质也与纳米颗粒21表面残存的肝素残基结合，因此，比仅为纳米颗粒21的情况，病毒载体的感染效率提高。
在本发明涉及的基因导入用担体、基因导入剂的制造方法中，作为官能团23a，有时也能够代替氨基而使用巯基。此时，代替上述供氨基化合物而使用供巯基化合物。作为供巯基化合物，虽然不进行限定，但能够使用例如半胱氨酸、羧基二硫化物(Carboxy disulfide)、直链型巯基试剂、芳香环型二巯基试剂等。基因导入用载体结合物质22通过经由巯基的硫键或二硫键与纳米颗粒21表面结合。
3.向靶细胞、靶组织或靶器官导入基因的方法
本发明中“靶细胞”没有特别限制，可以为任意的细胞。例如，作为靶细胞，可以包括生物体的组织或器官的细胞以及各种培养细胞等。另外，本发明中“靶组织”和“靶器官”没有特别限制，可以为任意的组织和器官。虽然不进行限定，但作为靶器官可以包括例如脑、肝脏、心脏、肾脏、肌肉、肺、卵巣、子宫、睾丸、消化道和血管等。
本发明涉及的基因导入方法不仅能够在in vitro(体外)使用，也可以在in vivo(体内)和ex vivo(离体)的基因导入中使用。因此，本发明，作为其他的方式，也能够提供包括以本发明的基因导入方法进行基因导入的工序的基因治疗方法。本发明的方法能够应用于人和非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠等啮齿类)。作为在基因治疗中导入的基因，虽然不进行限定，但可以列举例如疾病的致病基因或光响应基因。例如，如果使用本发明将光响应基因导入靶器官等，就能够通过光控制器官的功能。
由于基因导入剂1使用纳米颗粒21，所以能够利用注射器或导管(catheter)通过注射局部导入所希望的位置。
如果将基因导入剂1导入靶器官等，则与结合于纳米颗粒21表面的基因导入用载体3接触的细胞将基因导入用载体3摄入细胞内，从 而表达所希望的基因。
在本发明涉及的基因导入方法中，能够将局部注入的基因导入剂1保持局部化的状态，即，能够使基因导入用载体3长时间局部存在于所希望的部位，因此，与导入的基因导入用载体3发生扩散的以往的基因导入法相比，基因的表达效率得以改善。另外，在本发明涉及的基因导入方法中，与以往的基因导入法相比，基因导入用载体3向非希望部位(目的以外的部位)的扩散极少，所以能够抑制目的以外的部位的基因表达，使不希望出现的作用降低。
此外，如果将纳米颗粒21设为磁性颗粒，则从外部施加磁场，能够使导入的基因导入剂1移动到所希望的位置，或者使其局部留在所希望的位置(注射的部位)。为了从外部施加磁场，可以使用例如专利文献1所公开的由引导针、控制部和磁体构成的磁场控制装置。其中，磁体是产生磁场的磁场产生物体，该磁场诱导磁性颗粒，引导针是在前端部分提高由磁体产生的磁场得到的磁通密度的针。另外，控制部控制磁体与引导针之间的磁场。
在将纳米颗粒21设为磁性颗粒的情况下，由于能够用X射线CT检测基因导入剂1，所以能够确认基因导入剂1被正确地导入目的位置，以及确认基因导入剂1从导入的位置被除去。
4.通过巨噬细胞系细胞除去基因导入剂
基因导入剂1在投与生物体之后，如果经过一段时间，则会受到巨噬细胞系细胞的吞噬而从投与部位除去。这被认为是因为官能团22b发挥作为对于巨噬细胞系细胞的吞噬信号的功能的缘故。另外，基因导入用载体3被摄入细胞后，基因导入用载体结合物质22被溶解，由此，在纳米颗粒21表面露出的官能团22a也存在发挥作为吞噬信号的功能的可能性。
此外，为了促进巨噬细胞系细胞对基因导入剂1的吞噬，也可以在基因导入用载体结合物质22中结合与官能团23a或官能团23b相同的官能团(氨基等)。
本发明涉及的基因导入方法由于向生物体投与后，随着时间的经过，基因导入剂1从体内被除去，所以，与以往的基因导入法相比安全性高。
以下，通过实施例更加详细地说明本发明，但这些实施例并不限制本发明。
实施例
1.基因导入用担体的制备
(1)磁性珠(FG珠)的制作
作为磁性珠的芯，选择平均粒径约为40nm的铁素体颗粒。在铁素体颗粒的分散液中添加0.5mmol的10-十一碳烯酸(10-Undecenoic acid)，将铁素体颗粒的表面完全疏水化。进而，添加作为非离子性表面活性剂的Emulgen 1150S-60(花王株式会社)60％水溶液0.47g，实施超声波处理，由此将铁素体颗粒再亲水化。其结果，能够使其在水溶液中以粒径约90nm分散。
接着，在铁素体颗粒的分散液中分别添加苯乙烯单体、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)单体、二乙烯基苯(DVB)单体2.7g、0.3g、0.04g，加水将总重量设为240g。在70℃的恒温槽中进行搅拌，20分钟后添加溶解有聚合引发剂V-50(和光纯药工业)60mg的水溶液10g，进行聚合反应。在聚合开始2小时后，添加GMA 0.3g，然后从该时刻开始进行16小时聚合反应。通过离心分离(20,000G，20min)回收反应后的磁性珠(FG珠)，进行3次利用50ml超纯水的清洗。清洗操作后，将珠分散在10ml的超纯水中之后，进行3次对2L超纯水的透析处理。磁性珠的平均粒径为200nm。
(2)连接体和氨基向磁性珠的导入
(i)连接体结合磁性珠(EGDE珠)的制备
使磁性珠(FG珠)1.0g分散在100ml的氨水溶液(pH11.0)中，一边在70℃搅拌24小时，一边进行反应。反应后，通过离心分离(20,000G，20min)回收磁性珠，进行3次利用50ml超纯水的清洗。清洗操作后，将珠分散在10ml的超纯水中之后，进行3次对2L超纯水的透析处理。
接着，使得到的磁性珠0.2g分散在36ml的乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)水溶液中(pH11.0)，一边在30℃搅拌24小时，一边进行反应。反应后，通过离心分离(20,000G，20min)回收结合有EGDE作 为连接体的磁性珠(EGDE珠)，进行3次利用50ml超纯水的清洗。清洗操作后，将珠分散在10ml的超纯水中之后，进行3次对2L超纯水的透析处理。
(ii)氨基化磁性珠(EGDEN珠)的制备
使连接体结合磁性珠(EGDE珠)1.0g分散在45ml氨水溶液(pH11.0)中，一边在70℃搅拌24小时，一边进行反应。通过离心分离(20,000G，20min)回收反应后的氨基化磁性珠(EGDEN珠)，进行3次利用50ml超纯水的清洗。清洗操作后，将珠分散在10ml的超纯水中之后，进行3次对2L超纯水的透析处理。
在氨基化磁性珠(EGDEN珠)中，按照专利文献5中记载的方法，在高分子层吸收荧光铕配位化合物。
(3)基因导入用担体的制备
使氨基化磁性珠(EGDEN珠)与肝素结合，制备基因导入用担体。使氨基化磁性珠1.0mg分散在PBS中，离心分离后，除去上清。分别加入PBS 445μL、30mg/mL的肝素溶液(PBS)50μL、30mg/mL的NaBH3CN溶液(PBS)5.0μL，使珠分散在反应溶液中。使用混合器在室温搅拌反应溶液10天。反应后，通过离心分离将珠回收，除去上清后，加入超纯水清洗，得到基因导入用担体。
在基因导入用担体中，与肝素形成结合的氨基和没有形成结合的自由的氨基的存在比，在以上述反应条件为前提的情况下，推测自由的氨基至少为50％，最大为90％以上。
2.in vitro的基因导入
(1)基因导入剂的制备
在按照上述1制备的基因导入用担体中，添加重组有GFP基因的腺伴随病毒载体(AAV)，使AAV与肝素结合，得到基因导入剂。基因导入剂通过所封入的荧光铕配位化合物而发出红色(615nm)的荧光。
此外，AAV的复制和增殖使用AAV-2Helper Free表达体系(Cell Biolabs公司)按照该制品的操作说明书进行。
(2)向靶细胞导入基因
在培养海马神经细胞中添加上述(1)中制备的基因导入剂。在自添加起3周之后，使用荧光显微镜观察培养海马神经细胞(图2)，结 果，与基因导入剂接触的神经细胞被AAV感染而表达GFP基因，由细胞整体发出绿色荧光。基因导入剂发出红色荧光。从图2可知，AAV几乎不从珠上脱离，并且AAV以维持着活性的状态与珠结合。
3.in vivo的由导入氨基产生的效果
(1)氨基化磁性珠的制备
按照上述1(1)和(2)，制备氨基化磁性珠(EGDEN珠)。
(2)氨基化磁性珠向靶部位的局部化
在大鼠的脑内注入氨基化磁性珠。自注入起2周之后，使用放射光CT对脑进行高分辨率拍摄(图3)，结果观察到注入的珠局部存在于脑的一部分(图3，白色部分为珠)。
(3)氨基化磁性珠通过小胶质细胞的吞噬
(i)进而，将相同部位供于免疫组织化学染色，使用荧光显微镜进行观察(图4A)。使用作为一次抗体的抗GFAP抗体(Sigma，×1000)、作为二次抗体的抗小鼠抗体(Sigma，×500)将神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)染色，鉴定星形胶质细胞。另外，将小胶质细胞的细胞膜通过使用凝集素的选择性染色法染成绿色。氨基化磁性纳米珠通过含有的铕配位化合物而发出红色荧光。由图4A可知，小胶质细胞大量吞噬了珠(图4A，白色箭头)。
(ii)在大鼠的脑内注入在上述(1)中制备的氨基化磁性珠或非氨基化磁性珠(FG珠)。按照与上述(i)同样的操作程序，自注入起2周之后供于免疫组织化学染色，使用荧光显微镜观察(图4B)。纳米珠用蓝色表示，小胶质细胞的细胞膜用红色表示。氨基化磁性珠(NH2型纳米珠)几乎都被小胶质细胞(巨噬细胞)吞噬，因此，小胶质细胞细胞膨胀。另一方面，非氨基化磁性珠(非NH2型纳米珠)的情况下，大部分珠残存在注入部，小胶质细胞细胞内的珠量相比于氨基化磁性珠要少。氨基化磁性珠在4周时大量被吞噬，在8～12周后，大部分纳米珠从注入位置被除去(没有表示数据)。
从上述实验可知，搭载了氨基的磁性珠一定期间后被小胶质细胞在吞噬除去。此外，氨基化磁性珠具有很高的pH，但即便是注入脑内，也没有神经毒性，不会引发明显的炎症反应。
4.in vivo的基因导入
(1)基因导入剂的制备
在按照上述1制备的基因导入用担体中，添加导入了光响应离子通道(视紫红质通道蛋白(channelrhodopsin)2)与GFP的嵌合基因(channelrhodopsin 2-GFP)的AAV，使AAV与基因导入用担体结合，得到基因导入剂。
(2)向靶部位导入基因
在大鼠的脑内注入在上述(1)中制备的基因导入剂。自注入起4周后，将大鼠进行实验处死，制成脑切片(图5)。注入部位用蓝色箭头表示。由图5可知，基因仅在基因导入剂注入部位表达，病毒没有扩散到其他部位。
进而，在基因导入剂注入部的神经细胞中插入记录电极，照射蓝色光(470nm)，则诱发神经活动(图6)。即，得知具有生理活性的AAV搭载在基因导入剂中。
另外，另行在大鼠的脑内注入在上述(1)中制备的基因导入剂，2周后使用荧光显微镜对脑进行高分辨率拍摄(图7)，结果，基因仅在基因导入剂注入部表达(红色：基因导入剂，绿色：GFP)。在绿色荧光的周围看到点状的红色荧光点，但该红色荧光点是被小胶质细胞吞噬的基因导入剂。即，完成了使命的基因导入剂被小胶质细胞除去。5.向磁性纳米线的巯基导入和肝素结合、以及该磁性纳米线向细胞的赋予和向大鼠的投与(参考例)
(1)金属纳米线的肝素结合方法
向纳米线的巯基导入和肝素结合按照以下的操作程序进行。
(i)线、聚合物的丙酮清洗
(ii)肝素反应试剂的制备
0.05M MES缓冲液(pH5.4)  (处于酸性区域时用NaOH调整)
10mg  肝素
15mg EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺
(1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimide))15分钟孵育；肝素的活化9mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide))
(iii)硅烷偶联(仅为SUS等无机基板)
(iv)在(ii)的液体中加入线、聚合物，一边在室温搅拌24小时，一 边进行孵育。
(v)清洗
以0.05M MES(2-吗啉代乙烷磺酸一水合物(2-Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate))、PBS(2小时)、4MNaCl(2小时)、蒸馏水(2小时×2次)的顺序进行清洗。其中，PBS的组成为KCl 0.2g/L、KH2PO40.2g/L、Na2HPO4·12H2O 2.9g/L、NaCl 8g/L。
(2)纳米线向细胞的赋予
肝素与磁性纳米线(照片为不锈钢极细线)结合，进而搭载AAV，使病毒载体感染培养细胞。在培养皿一面培养293细胞，在其上载置搭载了AAV的磁性纳米线的网，培养3周。由于在AAV中重组有编码荧光蛋白GFP的基因的载体，所以感染而表达GFP的细胞发出绿色荧光。
如照片所示，仅与磁性纳米线网接触的细胞发出绿色荧光(图9A和B)。这表明AAV几乎不从磁性纳米线网脱离，并且AAV以具有活性的状态与磁性纳米线结合。
(3)纳米线向大鼠脑的投与
在大鼠的脑内注入在上述(1)和(2)中制备的磁性纳米线。自注入起2周后，使用放射光CT对脑进行高分辨率拍摄(图9C)，结果，观察到注入的磁性纳米线局部存在于脑的一部分(图9C，白色部分为磁性纳米线)。
6.不使用纳米颗粒的in vivo的基因导入(比较例)
将大鼠进行全身麻醉后，用定位脑手术装置固定大鼠的头部，在大鼠脑中，(图8×记号的位置)，使用微型操作器单纯注射重组有GFP基因的AAV。4周后，通过深麻醉将大鼠处死，切出海马区域，用荧光显微镜观察(图8)。GFP基因向AAV的重组，与上述2(1)同样，使用Cell Biolabs公司制的制品。AAV不仅在注射了载体的部分，而且扩散到脑内很宽的范围，GFP基因表达。这样，在单纯注射病毒的情况下，基因在目的以外的部位也表达，所以具有因导入的基因而存在严重的副作用的危险。
7.在纳米颗粒表面直接结合肝素的基因导入剂的制备(比较例)
发明人尝试了在上述1中制备的氨基化磁性珠(EGDEN珠)的表面不经过氨基而使肝素直接结合的操作。但是，不能不破坏磁性珠而使得足够量的肝素结合(在温和的反应条件下肝素的结合量少，而在过激的反应条件下磁性珠破坏，或者荧光配位化合物流出)(没有表示数据)。
8.安全性试验
(1)in vitro试验
在按照上述1制备的基因导入用担体中，添加重组有EGFP基因的腺伴随病毒载体(AAV)，使AAV与肝素结合，得到基因导入剂。
在24孔板上接种培养海马神经细胞(4×104细胞/孔)，进行培养。培养第8天时，在培养液中添加基因导入剂(添加浓度2μg/ml)。培养第21天时，用4％PFA固定细胞，使用免疫组织化学的方法进行神经丝的观察。
对于基因导入用担体的添加组以及非添加条件组，测定神经丝的纤维长度。其结果，在两实验组之间没有确认到纤维长度的显著差别，得知本发明涉及的基因导入用担体不显示细胞毒性。
(2)in vivo试验
在上述1中制备的基因导入用担体中，添加导入了光响应离子通道(视紫红质通道蛋白(channelrhodopsin)2)的AAV，使AAV与基因导入用担体结合，得到基因导入剂。
在大鼠的脑内注入基因导入剂。自注入起2周之后，使用放射光位相差CT评价有无脑水肿。
进而，在基因导入剂的注入部的神经细胞中插入记录电极，以电生理学的方法测定照射蓝色光(470nm)时的神经细胞的兴奋，确认光响应离子通道的基因表达。
其结果，确认了在基因导入剂的注入部中，光响应离子通道的基因表达，而另一方面脑水肿没有观察到或者为极轻度。由此可知，本发明涉及的基因导入剂不具有对生物体的毒性。
产业上的可利用性
根据本发明涉及的基因导入剂，由于能够在生物体内的所希望的 位置导入基因表达用载体，而且如果经过一定时间则基因导入剂从体内被除去，所以能够在生物体的特定的位置安全且自由地导入基因。因此，根据本发明涉及的基因导入剂，能够在例如对于脑疾病的基因治疗等在现有基因导入技术中需要手术的治疗中，提供对患者的负担小的新的治疗方法。
符号说明
1：基因导入剂、2：基因导入用担体、3：基因导入用载体、21：纳米颗粒、22：基因导入用载体结合物质、23a，23b：官能团、24：连接体。