黑老虎果提取物作为植物雌激素的新用途.pdf

本发明公开了一种黑老虎果提取物作为植物雌激素的新用途。为了克服现有对黑老虎果的研究报道中未见有关黑老虎果含有植物雌激素及其作用等不足，本发明通过黑老虎果提取物对乳腺癌MCF-7细胞增值实验、雌激素受体结合实验、对大鼠子宫重量的影响实验等，首次证明黑老虎果提取物含有植物雌激素，可直接激动雌激素受体，可促进大鼠子宫生长，增加大鼠子宫重量，并且可使动物体内的雌激素水平上升，黑老虎果提取物具有植物雌激素的作用，是一种很有前景的天然的可治疗和/或预防雌激素分泌不足相关疾病的药物。本发明可作为治疗雌激素分泌不足相关疾病的药物应用。

权利要求书
1.  黑老虎果提取物作为植物雌激素的新用途，其特征是，黑老虎果提取物及其制剂作为治疗雌激素分泌不足相关疾病的药物的应用。

2.  根据权利要求1所述的黑老虎果提取物作为植物雌激素的新用途，其特征是：所述黑老虎果提取物的制备方法：1份干燥果实加4～10倍95%乙醇，50～60℃回流提取二次，每次2h，过滤，滤液合并，浓缩干燥即得。

3.  根据权利要求1或者2所述的黑老虎果提取物作为植物雌激素的新用途，其特征是：所述黑老虎果提取物的制剂，为包含有效量的黑老虎果提取物与药学可接受的赋形剂制备的药物组合物。

说明书黑老虎果提取物作为植物雌激素的新用途
技术领域
本发明涉及黑老虎果提取物及其制剂在医药领域的新用途，具体为黑老虎果提取物作为植物雌激素的新用途。
背景技术
女性雌激素水平下降可导致多种疾病，如月经紊乱、闭经、不孕不育以及围绝经期综合征（也称为女性更年期综合征）等。目前临床治疗雌激素缺乏所致的各种疾病，主要采用雌激素替代疗法，使用的药物主要是人工合成的雌激素类似物，如尼尔雌醇，倍美力等。
研究发现，人工合成的雌激素具有一系列严重的副作用，如高血凝状态、高血压、水肿等，并可增加乳腺癌及子宫内膜癌的发生风险。因此，临床亟待开发出一类疗效好而不良反应少的新型药物。
从植物中寻找这种雌激素类药物，一直是该领域技术人员的开发目标。
黑老虎果为木兰科南五味子属植物黑老虎（也称冷饭团）Kadsura coccinea的果实，可食用。黑老虎的根、茎能行气活血，消肿止痛，可治胃病，风湿骨痛，跌打瘀痛，并可用于治疗痛经，产后瘀血等妇科疾病。
目前所知，黑老虎根、茎的主要化学成分有木脂素类、三萜类（甾醇）、生物碱、挥发油成分等，已分离鉴定的单体化合物约有60余种。现代药理研究表明黑老虎根、茎具有抗炎、抗肿瘤、抗肝纤维化，预防肝损伤、止血等作用。
现有对黑老虎果的研究报道中，未见有关黑老虎果具有植物雌激素的作用。
发明内容
本发明的目的就是要针对上述不足，提供一种黑老虎果提取物作为植物雌激素的新用途，即作为治疗雌激素分泌不足相关疾病的药物的应用，本发明还要提供一种黑老虎果提取物及其制剂的制备方法。
本发明黑老虎果提取物对乳腺癌MCF-7细胞增值实验显示，0.0037～3.7mg/ml的黑老虎果提取物可促进MCF-7增殖，在0.37mg/ml达到最大值，随后下降，证明黑老虎果提取物含有植物雌激素。
雌激素受体结合实验是证明化合物是否具有雌激素作用的经典实验。本发明雌激素受体结合实验显示，0.037～3.7mg/ml的黑老虎果提取物能剂量依赖性的激活雌激素受体，表明黑老虎果提取物确实含有植物雌激素成分，可直接激动雌激素受体。
本发明黑老虎果提取物对大鼠子宫重量的影响实验表明，1～10mg/kg的黑老虎果提取物可促进大鼠子宫生长，增加大鼠子宫重量，并且可使动物体内的雌激素水平上升。
上述实验可以折算成人体剂量，该剂量范围可以为每次0.17～1.7mg/kg，按每天2次计算，每人每天每公斤体重的剂量可以为0.3～3mg。
本发明所述雌激素分泌不足相关的疾病选自：雌激素分泌不足所致月经量减少、闭经、围绝经期综合征、绝经后骨质疏松、乳腺癌。
本发明所述的黑老虎果提取物通过下述方法制备：取1份干燥果实加4～10倍95%乙醇，50～60℃回流提取二次，每次2h，过滤，滤液合并，浓缩干燥即得。
通过以上方法制备的黑老虎果提取物，可以与药学可接受的赋形剂，制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、膏剂、口服液等多种口服剂型。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明的药物中使用的“药学可接受的赋形剂”可以是药物制剂中的任何常规的赋形剂。特别赋形剂的选择取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的赋形剂包括药学领域常规的稀释剂、载体、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。必要时，还可以在药物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。
综上所述，黑老虎果提取物具有植物雌激素，可作为植物雌激素应用，即黑老虎果提取物及其制剂可作为治疗雌激素分泌不足相关疾病的药物应用，是一种很有前景的天然的可治疗和/或预防雌激素分泌不足相关疾病的药物。
具体实施方式
下面提供具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细更具体地说明之用，而不应理解为用于任何形式限制本发明。动物给药剂量与人体给药剂量之间的相互转换，根据医学实验通用原则，人体药物剂量可以为大鼠药物剂量的六分之一倍。
实施例1
黑老虎果提取物的制备：
取干燥黑老虎果5 kg，加40 L 95%乙醇，55℃回流提取二次，每次2h，过滤，滤液合并，真空浓缩干燥即得。所得为深褐色固体184.2 g，得率为3.7%。
上述黑老虎果提取物的剂量为每人每天每公斤体重12～120mg。
实施例2
黑老虎果硬明胶胶囊的制备：
组分 质量（mg/个胶囊） 黑老虎果提取物 100～200 淀粉，DF 0～50 可流动淀粉粉末 0～50 聚硅氧烷流体350厘池 0～15
该剂型按上述配比依照药学常规方法制备。
实施例3
黑老虎果片剂的制备：
组分 质量（mg/片） 黑老虎果提取物 100～200 微晶纤维素 50～100 熏制二氧化硅 10～100 硬脂酸 5～15
该剂型按上述配比依照药学常规方法制备。
实施例4
黑老虎果提取物的植物雌激素作用——细胞增值实验
乳腺癌MCF-7细胞对雌激素敏感，雌激素可剂量依赖性的促进MCF-7细胞增殖。实验过程为：MCF-7细胞用DMEM+10%碳吸附胎牛血清37℃下培养。实验前种于96孔板中，每孔200μl，30～40%融合度。12h后，给予下述不同浓度的黑老虎果提取物20μl，孵育24h。MTS法检测细胞增值水平。检测前用PBS清洗每孔，更新培养基，每孔加入20μl MTS试剂，37℃ 孵育1.5h，然后在490 nm波长下测定吸光度值。结果显示，0.0037～3.7mg/ml的黑老虎果提取物可促进MCF-7增值（与0 mg/ml对照组比较，P<0.05），在0.37mg/ml达到最大值随后下降。该实验证明黑老虎果提取物含有植物雌激素。
实施例5
黑老虎果提取物的植物雌激素作用——雌激素受体结合实验
雌激素受体结合实验是证明化合物是否具有雌激素作用的经典实验。本次实验使用Qiagen公司的ERE-报告基因质粒，该质粒预混有ERE-萤火虫荧光素酶报告基因质粒和海肾荧光素酶报告基因质粒，按40：1配比。ERE为雌激素调节元件，通常在调控基因的上游区域，雌激素及其类似物可与之结合，并促进其调控基因的转录表达。将50μl的ERE-报告基因质粒-转染试剂复合物加入到450μl的MCF-7细胞中，孵育24h。换液后，加入下述不同浓度的黑老虎果提取物50μl，孵育24h，然后进行双荧光素酶报告基因检测。每孔用萤火虫萤光/海肾萤光的比值作为结果进行分析，每组为6孔的平均值。结果显示，0.037～3.7mg/ml的黑老虎果提取物能剂量依赖性的激活ERE（与0 mg/ml对照组比较，P<0.05）。表明黑老虎果提取物确实含有植物雌激素成分，可直接激动雌激素受体。
实施例6
黑老虎果提取物的植物雌激素作用——动物实验
子宫增重实验也是评估药物是否具有雌激素作用的经典实验。
出生2周SD雌性大鼠40只，体重为35.2～45 g，随机分为5组，每组8只。第一组对照组，给予纯净水；第二组黑老虎果提取物，每次0.5mg/kg；第三组黑老虎果提取物，每次1mg/kg；第四组黑老虎果提取物，每次10mg/kg；第五组雌二醇组，每次0.01mg/kg。以上药物均每天2次，连续3天，第4天，处死大鼠，分离子宫称重，用子宫重量/大鼠体重获得相对子宫重量用于计算分析。同时抽取血浆用荧光免疫法分析大鼠血浆雌激素水平。
黑老虎果提取物对大鼠子宫重量的影响结果表明，1～10mg/kg的黑老虎果提取物可增加大鼠子宫重量（与对照组比较P<0.05）。
黑老虎果对大鼠血浆雌激素水平的影响结果表明，1～10mg/kg的黑老虎果提取物可促进大鼠子宫生长（与对照组比较P<0.05）。
以上结果显示，1～10mg/kg的黑老虎果提取物具有促进子宫生长作用，并且可使动物体内的雌激素水平上升。折算成人体剂量，该剂量范围可以为每次0.17～1.7mg/kg，按每天2次计算可以为每人每天每公斤体重0.3～3mg。本实验结果亦证明，黑老虎果中含有植物雌激素成分，具有雌激素样的促进子宫生长的作用。