一种靶向c-myc癌基因的外指引序列 【技术领域】
本发明涉及一种生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种新的靶向外指引序列及其用途。
背景技术
外指引序列(External Guided Sequence，以下均简称EGS)技术于80年代后期首先发现，其主要功能是体内定向灭活功能基因，EGS为小分子RNA功能分子，因而应该属于广义的RNA干扰技术(RNAi)。但与目前流行的RNAi技术不同的是，EGS采用更短的RNA分子(10mer)，即可特异作用于靶基因，从而导致靶基因定向灭活。目前针对EGS的国际专利已存在，但美国专利说明书US6,057,153、US6,783,981和US5,877,162等主要是针对单个EGS分子的设计。目前仍没有实用的可用于高通量EGS的筛选的EGS文库(简称LEGS)，而这种文库的产生将有益于针对特殊疾病如爱滋病、肝炎及癌症等的基因新药的开发。
【发明内容】
本发明首先是通过EGS文库的构建，得到了EGS文库，然后通过此文库进行筛选，得到了一种新的靶向c-myc癌基因的外指引序列，通过一系列实验，证明此序列可以显著地抑制c-myc癌基因在蛋白质水平上的表达，从而可以用于制备预防和/或治疗c-myc癌基因高表达疾病药物。
【附图说明】
图1为EGS文库设计图，其中：
图1-1：“3/4 EGS”设计框架来源于大肠杆菌酪氨酸转运RNA的前体序列；
图1-2：外指引序列文库，外指引序列识别结构域由随机碱基组成；为了避免“CCA”序列直接暴露给核酸酶，“UUU”序列连接在它的3′末端；
图1-3：外指引序列文库与潜在的靶标RNA形成的复合体，箭头指示了核酸酶P的切割位点。
图2为引物FLEGSp和RLEGSp示意图；部分随机化的寡聚核苷酸FLEGSp和RLEGSp由两部分组成，一部分用于扩增pET28a-D载体(除了不包含T7启动子和T7终止子之间的片段以外，可等同于pET28a载体)，另一部分用于扩增外指引序列文库表达框；
图3为EGS文库构建示意图，其中：
图3-1：pET28a-LEGS构建的流程图；
图3-2：pET28a-LEGS的PCR产物鉴定图，箭头指示了大小为5-kb的DNA条带；
图4为EGS文库鉴定示意图，其中：
图4-1：pET28a-EGS克隆酶切鉴定模式图，RV1泳道为含一个HincII酶切位点的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切示意图，RV2泳道为含二或三个HincII酶切位点的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切示意图，V泳道为pET28a被HincII酶切后的酶切示意图，箭头指示了大小为5-kb的DNA条带；
图4-2：pET28a-EGS克隆酶切鉴定图，1到42号泳道均为含一个HincII酶切位点的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切图谱，V泳道为pET28a被HincII酶切后的酶切图谱，箭头指示了大小为5-kb的DNA条带；
图4-3：pET28a-EGS克隆酶切鉴定图，1号泳道均为为含两个或三个HincII酶切位点的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切图谱，V泳道为pET28a被HincII酶切后的酶切图谱，箭头指示了大小为5-kb的DNA条带；
图4-4：部分EGS表达框序列的多重比较结果。
图5为体外转录制备EGS示意图，其中
图5-1：EGS制备流程图；
图5-2：EGS的体外转录模板鉴定图；
图5-3：转录制备的EGS产物；
图6为EGS文库功能筛选意图，其中：
图6-1：体外筛选功能性EGS示意图；
图6-2：功能性EGS体内验证示意图；
图7为EGS-c-myc功能鉴定示意图，其中：
图7-1：为EGS-c-myc结构示意图；
图7-2：为EGS-D-c-myc结构示意图(EGS-c-myc的阴性对照)，园形标记标示了碱基突变；
图7-3：为c-myc mRNA被RNaseP体外切割所产生的产物的示意图，泳道M为RNA Marker，箭头指示了大小为2-kb的RNA条带，星号指示了大小为0.5-kb的RNA条带，泳道1为c-myc mRNA被RNaseP体外切割所产生的产物；
图7-4为c-myc表达水平检测结果，其中：
图7-4-1为荧光实时定量PCR检测结果，
图7-4-2：为Western blota检测结果；
图7-5为细胞凋亡检测结果，其中：
图7-5-1：为EGS-D-c-myc所导致的凋亡率；
图7-5-2：EGS-c-myc所导致的凋亡率。
【具体实施方式】
1、EGS文库的设计
1.1选择“3/4 EGS”(图1-1)作为EGS文库的设计框架。“3/4 EGS”的一级结构(核酸序列)和二级结构来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的酪氨酸转运RNA(tRNATyr)，其已被广泛采用并被大量实验结果验证。
1.2“3/4 EGS”的靶标配对区域由随机碱基组成，这就是EGS的理论文库(图1-2)。
1.3在“3/4 EGS”最3′端的“CCA”序列的末端添加“UUU”序列以避免“CCA”序列直接暴露于核酸酶(RNAase)(图1-2)。
因该文库包含了靶向任何靶标RNA的功能性EGS(图1-3)，故该文库也可被称为EGS随机文库。
2、EGS文库的构建策略
通过替换T7终止子和T7启动子之间地区域，EGS文库的表达框被克隆至pET28a载体而构建pET28a-LEGS。pET28a-LEGS为含有EGS文库表达框的重组载体，其中EGS文库表达框的转录受T7终止子和T7启动子的控制。把pET28a-LEGS转化至DH5α感受态细胞中以筛选pET28a-EGS-clone——含有某一特定EGS表达框的重组载体，其中EGS文库表达框的转录受T7终止子和T7启动子的控制(图3-1)。
此策略基于PCR技术直接把EGS文库表达框克隆至目标载体，这可避免EGS文库中某些表达框被遗漏。
3、EGS文库的构建方法：
3.1利用VectorNTI软件设计引物：FLEGSp SEQ ID NO：1和RLEGSp SEQ ID NO：2(图2)，第二个引物是RLEGSp。
这对引物由两部分组成，一部分用于扩增pET28a-D载体(除了不包含T7启动子和T7终止子之间的片段以外，可等同于pET28a载体)，另一部分用于扩增外指引序列文库表达框。这可通过PCR技术直接把EGS文库表达框克隆至目标载体。
3.2利用9700 DNA synthesizer(Applied biosystem)合成FLEGSp和FLEGSp，并对它们的5′端进行磷酸化修饰。
3.3利用PhusionTM High-Fidelity PCR Kit(NEB)按照以下反应体系和反应程序在9700 Thermal cycler(Applied biosystem)进行PCR扩增(图3-2)。通过PCR扩增把EGS的理论文库的表达框克隆至pET28a载体(MERCK公司)而制备pET28a-LEGSL。
图3-2结果显示PCR产物大小与理论预测一致。
反应体系：
反应程序
3.4利用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit(Omega)纯化PCR产物(图3)。用紫外分光光度计DU530(Beckman)测量纯化的PCR产物的浓度。
3.5利用T4 DNA Ligase(NEB)对纯化的PCR产物进行分子内连接。DNA浓度越稀，越容易发生分子内连接，参照以下计算式：51.1/(DNA浓度：g/l)÷(分子量：dalton)0.5＞2，计算连接反应体系内PCR产物的浓度为1ng/μl。根据计算结果，取1μgpET28a-LEGSL进行连接，反应体积为1ml，连接反应条件为15℃，16h。
3.6连接产物进行乙醇沉淀纯化，纯化的连接产物按照一定比例(小于或等于1∶10)与感受态细胞(DH5α：购置于Invitrogen公司)充分混匀，冰浴30min；42℃，45S，冰浴2-3min；加入10体积LB培养基，37℃，225r/min，振荡培养1h；取小量上述培养物(剩余培养物放置4℃保存)进行梯度稀释并分别涂布于含30μg/ml Kanamycin的LB平板，37℃，哺乳动物倒扣培养约14h。观察计算上述培养板的克隆数。根据计算结果，把剩余培养物进行稀释(使每个平板长出约300个克隆)并涂布于的若干个LB平板(含30μg/ml Kanamycin)。
pET28a-LEGSL的理论大小为5143bp，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析——pET28a-LEGSL的片段长度均符合理论大小(图3-2)；对纯化的pET28a-LEGSL进行分子内连接；连接产物分别转化至感受态细胞DH5α，转化产物在含30μg/ml的LB平板上进行克隆筛选。其转化效率为3.72×107/μg。
3.7利用Vector NTI软件对pET28a-LEGS的序列进行酶切位点分析——选择限制性内切酶HincII对上述质粒分别进行酶切鉴定(图4-2)。
3.8利用Vector NTI软件设计测序引物，用Terminator v3.1 CycleSequenceing Kit(ABI)和3730 DNA Analyzer(ABI)进行双向测序分析(图4)，测序结果见图4-3。
pET28a载体具有两个HincII酶切位点，其中一个位于被EGS文库表达框替换的T7prometer和T7 terminator之间的区域内，但EGS表达框以不同的概率引入0，1或2个HincII酶切位点。理论上，大概98％pET28a-EGS-clone只有1个HincII酶切位点，其HincII酶切图谱为(图4-1，laneRV1)，大概2％pET28a-EGS-clone具有2个或3个HincII酶切位点，它们的HincII酶切图谱为(图4-1，laneRV2)。为了检验EGS文库的克隆效率是否符合理论设计，随机挑取pET28a-EGS-clone进行限制性内切酶(HincII)分析。大概96％pET28a-EGS-clone的HincII酶切图谱与理论预测一致，其中94％pET28a-EGS-clone的HincII酶切图谱(图4-2)与图4-1，laneRV1一致，其中6％pET28a-EGS-clone的HincII酶切图谱(图4-3，lane1)与图4-1，laneRV2一致。上述酶切分析表明EGS文库克隆效率基本满足理论设计要求。为了检验EGS文库的EGS表达框的组成是否符合理论设计，随机挑取pET28a-EGS-clone进行测序及比对分析。大概94％pET28a-EGS-clone具有序列玩全正确的EGS表达框。对这些EGS表达框的序列进行比对分析(图4-4)表明，EGS表达框的组成满足理论设计。
EGS文库应用实例：
一、EGS文库筛选程序的建立
1、以EGS克隆(pET28a-EGS-clone)为模板，对EGS表达框进行PCR扩增(图5-1)；
2、以上述纯化的PCR产物为模板，对EGS进行转录制备(图5-1)；EGS-clone的制备流程如图5-1所示。PCR扩增EGS-clone-IVTT。EGS-clone-IVTT理论大小为826bp。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析——EGS-clone-IVTT(图5-2)的片段大小符合理论预测。以纯化的EGS-clone-IVTT为模板，通过体外转录制备EGS-clone。EGS-clone的理论大小为71bp，对所制备的EGS进行琼脂糖凝胶电泳分析——EGS-clone(图5-3)的片段大小符合理论预测。
3、把上述纯化的体外转录产物与靶标RNA(爱滋病、肝癌相关的致病基因)以及RNase P混合反应，以体外筛选功能EGS(图6-1)；
3.1RNaseP制备
RNaseP由C5蛋白和M1 RNA组成，参考文献报道(Lundblad EW，Xiao G，Ko JH，AltmanS.Rapid selection of accessible and cleavable sites in RNA by Escherichia coli RNase P andrandom external guide sequences.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2008；105：2354-2357.)方法进行制备。
3.2靶标RNA制备
获取靶标RNA的体外转录模板(5′端含有T7启动子)，通过体外转录制备靶标RNA。
3.3RNA纯化
利用RNA纯化试剂盒(QIAGEN)，对体外转录产物进行纯化。
3.4反应条件
3.5反应产物分析
对反应产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(胶浓度为8％，含7M尿素)分析，以判断靶标RNA是否被特异性切割。
上述所述实验步骤为EGS体外筛选策略，如图6-1所示。
4、把上述筛选到得功能性EGS转染至相应的细胞模型，并对其所导致的表型(增殖抑制、促进凋亡、抑制病毒感染)进行验证分析(图6-2)。
4.1EGS转染
利用转染试剂：Lipofectamine 2000(Invitrogen)，被EGS转染至靶标细胞，详细操作见转染试剂说明书。
4.2细胞增殖检测
利用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(Beyotime)进行细胞增殖检测，详细操作见试剂盒说明书。
4.3细胞凋亡检测
利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Beyotime)进行细胞凋亡检测，详细操作见试剂盒说明书。
4.4病毒拷贝数检测(以HIV为例)
利用慢病毒基因组RNA拷贝数检测试剂盒：Lenti-XTM qRT-PCR Titration Kit对HIV基因组RNA拷贝数进行检测，以评价HIV的增殖情况。
上述所述实验步骤为EGS体内验证策略，如图6-2所示。
二、EGS文库筛选结果
通过上述筛选程序，体外筛选到靶向肝癌c-myc癌基因的EGS-c-myc SEQ ID NO.3；体内实验结果表明：EGS-c-myc能够有效干扰肝癌细胞系HepG2中c-myc的表达，并诱导HepG2发生凋亡(图7)。
1、体外筛选靶向c-myc癌基因的EGS-c-myc(图7-1)
利用上述体外筛选程序，筛选到在体外可诱导RNase P对c-myc癌基因进行有效识别切割的EGS-c-myc(图7-1)，EGS-c-myc能够在体外指导RNaseP对c-myc mRNA进行特异性切割，其切割产物鉴定如图7-3所示。
2、制备EGS-c-myc的体内阴性对照：EGS-D-c-myc(图7-2)
利用制备EGS-c-myc的方法制备EGS-D-c-myc，但在对EGS-c-myc表达框进行PCR扩增时引入碱基突变(UUC→AAG)。
EGS-D-c-myc的结构示意图如图7-2所示。
3、把EGS-c-myc和EGS-D-c-myc分别转染至HepG2细胞
利用转染试剂：Lipofectamine 2000(Invitrogen)，被EGS转染至靶标细胞，详细操作见转染试剂说明书。
4、EGS-c-myc和EGS-D-c-myc对c-myc表达水平的影响
4.1荧光实时定量PCR分析(图7-4-1)
A、HepG2细胞被EGS转染72h后，利用Trizol reagent(Invitrogen)提取总RNA，详细操作见试剂说明书；
B、反转录试剂盒(QuantiTect Rev.Transcription Kit，QIAGEN)对上述提取的RNA进行反转录，详细操作见试剂盒说明书；
C、利用Q-PCR(SYBR法)试剂盒(QuantiTect SYBR Green PCR Kits，QIAGEN)对β-actin和c-myc基因进行定量，试剂盒包含对β-actin和c-myc基因进行定量的Q-PCR引物，β-actin作为内参，详细操作见试剂盒说明书。
图7-4-1结表明EGS-c-myc相比其阴性对照EGS-D-c-myc显著地抑制c-myc癌基因在转录水平上的表达。
4.2Western blot分析(图7-4-2)
A、HepG2细胞被EGS转染72h后，利用Western及IP细胞裂解液(Beyotime)制备蛋白质样品，详细操作见试剂盒说明书；
B、利用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime)对上述蛋白质样品进行浓度测定，详细操作见试剂盒说明书；
C、对上述蛋白质样品进行SDS-PAGE，上样量为10μg；
D、印迹分析：印迹膜为硝酸纤维素膜，一抗为：β-Actin(9)：sc-130301，mousemonoclonal，Santa Cruz，1∶500，用于检测β-Actin；c-Myc(A-14)：sc-789，rabbit polyclonalSanta Cruz，1∶500，用于检测c-Myc，二抗：HRP-标记的羊抗兔IgG(sc-2004，Santa Cruz，1∶2000)、HRP-标记的羊抗鼠IgG(sc-2005，Santa Cruz，1∶5000)；化学发光检测试剂盒：BeyoECL Plus(Beyotime)，详细操作见试剂说明书。
图7-4-2结果表明EGS-c-myc相比其阴性对照EGS-D-c-myc显著地抑制c-myc癌基因在蛋白质水平上的表达。
5、EGS-c-myc和EGS-D-c-myc诱导细胞凋亡的效果
利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Beyotime)检测EGS-c-myc(图7-5-1)和EGS-D-c-myc(图7-5-2)诱导细胞凋亡的效果，详细操作见试剂盒说明书。
结果表明EGS-c-myc(图7-5-1)相比其阴性对照EGS-D-c-myc(图7-5-2)显著地促进HepG2细胞的凋亡。
上述结果表明，本发明的EGS-c-myc可以用于制备预防和/或治疗c-myc癌基因高表达疾病药物，c-myc癌基因高表达疾病包括但不限于成骨肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤，肝癌。
SEQUENCE LISTING
<110>广州金琪基因技术研究发展中心
<120>一种新的外指引序列(EGS)文库(LEGS)构建技术
<130>US6057153
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(31)..(37)
<223>n is a，c，g，or t
<400>1
tctccggggt tccccaatac gattttacca nnnnnnnctt cctaagcttg gaagcttc 58
<210>2
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<222>(27)..(29)
<223>n is a，c，g，or t
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<212>DNA
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<400>3
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