《一株高效2,4,6三氯酚降解菌及其分离方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株高效2,4,6三氯酚降解菌及其分离方法.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410777385.2 (22)申请日 2014.12.17 CGMCC NO9686 2014.09.19 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/38(2006.01) (71)申请人 湘潭大学 地址 411105 湖南省湘潭市雨湖区羊牯塘 27 号 (72)发明人 戴友芝 杨基成 陈跃辉 万丽 (54) 发明名称 一株高效 2,4,6- 三氯酚降解菌及其分离方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种高效氯酚降解菌的分离方 法， 并通过此方法分离得到一株高效氯酚降解菌 Pseudomonassp.TB-1， 保藏号为 。
2、CGMCCNo.9686。 发明人从造纸废水内循环厌氧处理反应器中取厌 氧活性污泥， 经过长期驯化和筛选， 分离得到一株 通过还原脱氯高效降解2,4,6-三氯酚的细菌。 该 菌可在72小时内使浓度为30mg/L的2,4,6-三氯 酚完全降解， 在 2,4,6- 三氯酚 （2,4,6-TCP） 浓度 高达 150mg/L 时降解率仍达到 72%。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104388365 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 10438。
3、8365 A 1/1 页 2 1.一种用于2,4,6-三氯酚生物处理的菌株， 所述菌株为Pseudomonas sp. TB-1， 保藏 号为 CGMCC No. 9686， 能通过还原脱氯降解 2,4,6- 三氯酚。 2. 如权利要求 1 所述的菌株， 其特征在于该菌适合培养条件为 ： 培养基含 30 mg 2,4,6- 三氯酚， 0.5 g NH4NO3， 3 g KH2PO4， 0.2 g MgSO4， 2 g Na2S2O3， 1 g NaCl， 0.5 g 丙酮 酸钠 , 2 g NaHCO3， 5 ml 微量元素溶液， 1 L 无菌蒸馏水， pH 6.0-8.0， 30-40 。 。
4、3. 一种分离培养权利要求 1 所述菌株的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 采集造纸废 水内循环厌氧处理反应器中活性污泥， 取一定体积半流体状该活性厌氧污泥和相同体积的 驯化培养基加入至驯化培养瓶中， 调节驯化体系 pH 在 6.0-8.0 区间 ； 在严格厌氧的环境中 在 30-40 下进行富集驯化， 使驯化污泥对 2,4,6- 三氯酚的降解速率达到 3 mg/(Ld) 以 上 ； 将驯化好的污泥按稀释梯度接种于含有 30 mg/L 2,4,6- 三氯酚的固体筛选培养基中， 分离纯化得到具有 30 mg/L 2,4,6- 三氯酚降解能力的菌株 ； 挑取已纯化的纯培养菌株， 接 种于 2,4。
5、,6- 三氯酚浓度为 30-150 mg/L 的脱氯降解培养基中， 筛选得到高效 2,4,6- 三氯 酚降解菌。 4.如权利要求3所述的方法， 其特征在于 ： 30 mg 2,4,6-TCP， 0.5 g NH4NO3， 3 g KH2PO4， 0.2 g MgSO4， 2 g Na2S2O3， 1 g NaCl， 0.5 g 丙酮酸钠 , 2 g NaHCO3， 5 ml 微量元素溶液， 1 L 无菌蒸馏水， pH 6.0-8.0 ； 所述固体筛选培养基为在驯化培养基的基础上加入 15-20 g 琼 脂粉 ； 所述脱氯降解培养基中 2,4,6-TCP 浓度为 30-150 mg/L， 其余组。
6、成同驯化培养基。 权 利 要 求 书 CN 104388365 A 2 1/3 页 3 一株高效 2,4,6- 三氯酚降解菌及其分离方法 技术领域 0001 本发明涉及一种高毒性有机污染物的生物处理技术， 特别涉及一株高效 2,4,6- 三氯酚降解细菌及其分离方法。 背景技术 0002 氯酚类有机物是一类废水中普遍存在的难降解有机污染物， 该类物质作为一类重 要的有机化学工业原料， 广泛应用于医药、 化工等领域 ； 由于其具有抗菌、 杀菌和杀虫的功 效而作为杀虫剂、 防腐剂、 除草剂等， 应用于林业和农业等行业。 氯酚具有强生物毒性、 生物 积累性和生物难降解性， 以及 “致癌、 致畸、 致突。
7、变” 三致效应， 对人类健康和生态环境构成 严重威胁。 氯酚生物降解处理技术是一种低成本、 低能耗、 易操作， 无二次污染的方法， 但常 规生物法对较高浓度的氯酚类废水耐受性不好， 处理效果差。分离得到高效氯酚降解菌应 用于氯酚的生物处理是研究人员致力开展的一项工作。国内外关于氯酚生物降解的报道 较多， 已分离得到多种具有氯酚降解能力的细菌， 主要有假单胞菌 （Pseudomonas sp.） 、 芽 孢杆菌 （Bacillus sp.） 、 脱卤脱亚硫酸菌 （ Desulfi tobacterium sp.） 、 贪铜菌 （Cupriavidus sp.） 、 放线菌 （Actinobact。
8、eria sp.） 等， 尤其假单胞菌降解氯酚类有机物的研究报道较多。 但这些微生物对氯酚的耐受浓度普遍不高， 且大多数报道都是在好氧条件下降解氯酚类物 质。 然而， 迄今为止， 还未有关于假单胞菌在厌氧条件下通过还原脱氯降解氯酚类有机物的 报道。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种新的氯酚降解菌分离方法， 并利用该方法分离得到高 效的氯酚降解菌， 应用于氯酚类污染物的生物处理。发明人从造纸废水内循环厌氧处理 反应器中取活性污泥， 经过驯化、 分离、 筛选， 得到一株通过还原脱氯降解 2,4,6- 三氯酚 （2,4,6-TCP） 的细菌， 经生理生化特性及16S rDNA分析鉴定为P。
9、seudomonas属的菌株， 命名 为Pseudomonas sp. TB-1。该菌已于 2014 年 9 月 19 日提交中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心 （CGMCC） 保藏， 保藏地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号。保藏号为 CGMCC No. 9686。本发明中， 驯化、 分离、 筛选Pseudomonas sp. TB-1 的过程为 ： 采集造纸 废水内循环厌氧处理反应器中活性污泥， 取一定体积半流体状该活性厌氧污泥和相同体积 的驯化培养基加入至驯化培养瓶中， 调节驯化体系 pH 在 6.0-8.0 区间。然后在驯化培养瓶 中充满氮气， 最后将驯化培养瓶置。
10、于厌氧生化培养箱中在 30-40 下进行 2,4,6-TCP 降解 菌的富集驯化培养。 富集驯化完成后， 结合稀释平板法和划线分离法， 在固体筛选培养基平 板上分离得到具有 2,4,6-TCP 降解能力的纯培养菌株。将所分离得到纯培养菌株接种至脱 氯降解培养基中， 根据各菌株的 2,4,6-TCP 降解效率， 筛选得到高效的氯酚降解菌。所述驯 化培养基组成为 ： 30 mg 2,4,6-TCP， 0.5 g NH4NO3， 3 g KH2PO4， 0.2 g MgSO4， 2 g Na2S2O3， 1 g NaCl， 0.5 g 丙酮酸钠 , 2 g NaHCO3， 5 ml 微量元素溶液， 。
11、1 L 无菌蒸馏水， pH 6.0-8.0。 所述固体筛选培养基为在驯化培养基的基础上加入 15-20 g 琼脂粉。所述脱氯降解培养基 说 明 书 CN 104388365 A 3 2/3 页 4 中 2,4,6-TCP 浓度为 30-150 mg/L， 其余组成同驯化培养基。 附图说明 0004 图 1 ： 驯化过程 2,4,6-TCP 的降解速率 ； 图 2 ： 本发明菌株细胞形态图 ； 图 3 ： 本发明菌株基于 16S rDNA 的系统发育树 ； 图 4 ： 本发明菌株降解 2,4,6-TCP 效果图 ； 图 5 ： 本发明菌株还原脱氯降解 2,4,6-TCP 过程。 具体实施方式 0。
12、005 实施例 1 ： 本发明中氯酚降解菌驯化、 分离及筛选 采集湖南某造纸厂废水内循环厌氧处理反应器中活性污泥， 量取半流体状该污泥 1 L 加入至驯化培养瓶中， 再加入 1 L 驯化培养基， 调节 pH 至 6.0-8.0 之间。往驯化培养瓶中 充满氮气， 用带导气管的橡胶塞密封， 导气管在瓶内一头被插入液面以下， 瓶外一头插入 至氢氧化钠溶液中进行液封。将整套驯化装置置于厌氧生化培养箱中在 30-40 下进行 驯化培养。驯化过程中， 定时取样测定驯化样品中 2,4,6-TCP 的残留浓度， 当驯化体系中 2,4,6-TCP 浓度为 0 时更换新的驯化培养基， 直至驯化体系对 2,4,6-。
13、TCP 降解速率达到 3 mg/(Ld) 以上 （附图 1） 。驯化完成后， 将驯化后的污泥振荡均匀， 取 1 mL 泥浆按梯度稀释 成 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7， 从 10-5、 10-6 和 10-7 稀释液中分别取 0.1 mL 接种到固体 筛选平板培养基上， 用涂布棒将菌液涂布均匀， 然后将平板置于厌氧生化培养箱中在 35 下恒温培养。 待平板长出菌落后， 挑选出生长良好的菌落， 用平板划线分离法在新的平板上 接种划线， 重复多次平板划线分离， 直到分离获得单个纯培养菌株。最后将获得的纯菌株 用甘油冷冻保藏于 -70 的超低温冰箱中。将从固体平板上筛选得。
14、到的菌株分别接种于 2,4,6-TCP 浓度为 30-150 mg/L 的脱氯降解培养基中 （其余组成同驯化培养基） ， 在培养瓶 中充满氮气后于 35 恒温厌氧生化培养箱中静置培养。每隔 1 d 取样， 用高效液相色谱 测定培养液中剩余的 2,4,6-TCP 浓度。筛选出对 2,4,6-TCP 降解效率最高的菌株。 0006 实施例 2 ： 本发明中菌株的生物学鉴定 1. 形态特征 （1） 菌落形态特征 ： 白色， 不透明， 边缘整齐， 圆形， 表明光滑且略隆起。 （2） 菌体细胞 形态特征 ： 该菌为革兰氏阴性菌， 短杆状， 大小0.50.7 m1.02.0 m， 无鞭毛， 见附图 2 ；。
15、 2. 生理生化特性 ： 能够水解葡萄糖、 蔗糖和果糖， 能产生吲哚和硫化氢， 能液化明胶和 形成生物膜， 以及过氧化氢酶、 卵磷脂酶、 酯酶试验均呈阳性 ； 但无法水解淀粉， V-P、 甲基 红、 硝酸盐还原、 反硝化试验呈阴性。适宜的生长温度为 3040 ， pH 为 6.08.0 ； 3. 16S rDNA 分子鉴定及系统发育分析 采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒， 抽提菌株基因组 DNA， 以菌株基因组 DNA 为模板， 引 物为细菌16S rDNA通用引物 （27F， 1492R） ， 扩增菌株的16S rDNA片段， 将得到16S rDNA序 列与 GenBank 中的核酸数据库。
16、进行 Blast 同源性比对。发现与数据库中Pseudomonas sp. E11、Pseudomonas sp. E9 的 16S rDNA 序列同源性达到 99%， 系统发育树见附图 3。基于以 说 明 书 CN 104388365 A 4 3/3 页 5 上结果， 再结合菌株的形态特征、 生理生化特性， 将该菌株鉴定为Pseudomonas属， 并命名 为Pseudomonas sp. TB-1。 0007 实施例 3 ： 本发明菌株对 2,4,6-TCP 的降解效果 将已纯化的 TB-1 菌株接种至驯化培养基中， 在 35 下于厌氧培养箱中静置培养 2-3 天， 按10% （V/V） 。
17、的接种量将此培养液接种至2,4,6-TCP浓度分别为30， 60， 90， 120， 150 mg/ L 的脱氯降解培养基中。在培养瓶中充满氮气， 在 35 下于厌氧培养箱中静置培养， 每隔 12 小时取样测定样品中的 2,4,6-TCP 含量， 结果见附图 4。并利用气相色谱 - 质谱联用检 测降解过程中产生的中间产物， 结果见附图 5。图 4 结果表明 TB-1 可在 72 小时内将浓度为 30 mg/L 的 2,4,6- TCP 完全降解， 在 2,4,6-TCP 浓度 150 mg/L 仍可使其部分降解。图 5 结果表明 TB-1 在厌氧条件下通过还原脱氯的方式先脱去一个氯原子使 2,4,6-TCP 降解成 2,4- 二氯酚 （2,4- DCP） ， 再脱去另一个氯原子降解成 4- 氯酚 （4-MCP） 。 说 明 书 CN 104388365 A 5 1/3 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104388365 A 6 2/3 页 7 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104388365 A 7 3/3 页 8 图 5 说 明 书 附 图 CN 104388365 A 8 。