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1、(10)申请公布号 CN 104357367 A (43)申请公布日 2015.02.18 CN 104357367 A (21)申请号 201410677772.9 (22)申请日 2014.11.24 CGMCC No.8075 2013.08.27 C12N 1/20(2006.01) A01P 21/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 中国烟草总公司郑州烟草研究院 地址 450001 河南省郑州市高新区枫杨街 2 号 (72)发明人 张仕祥 奚家勤 过伟民 王建伟 郭建华 周汉平 薛超群 王爱国 尹启生 张艳玲 梁太波 (74)专利代理机构 郑。
2、州中民专利代理有限公司 41110 代理人 姜振东 (54) 发明名称 一种降解邻苯二甲酸二 （2-乙基己基） 酯的菌 株及其在烟草种植中的应用 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 一 种 降 解 邻 苯 二 甲 酸 二 （2- 乙基己基）酯的菌株及其在烟草种植中 的 应 用， 属 于 农 业 生 物 技 术 应 用 领 域。 本 发 明 的 微 生 物 菌 株 为 嗜 温 鞘 氨 醇 杆 菌 （Sphingobacteriumthalpophilum） zh-x-08 菌 株， 于 2013 年 08 月 27 日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号 ： CGMCC 。
3、No.8075。本发明的菌株经发酵后得到发酵液， 发 酵液以适宜的比例添加烟草根际中可明显降低烟 草根系自毒物质邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯 的含量， 促进烟株生长。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 104357367 A CN 104357367 A 1/1 页 2 1. 一种降解邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯的菌株， 其特征在于 ： 所述降解邻苯二甲酸 二 （2- 乙基己基） 酯的菌株为嗜温鞘氨醇杆菌 （Sphin。
4、gobacterium thalpophilum） Zh-X-08 菌株， 该菌株于 2013 年 08 月 27 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心， 保藏号 ： CGMCC No.8075。 2. 根据权利要求 1 所述的降解邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯的菌株， 其特征在于 ： 该菌株在 LB 平板上圆形， 直径 1.52.5 mm， 淡黄， 表面光滑， 湿润， 低凸起， 边缘裂叶状 ； 菌 体杆状， 无鞭毛， 不运动， 大小为 （0.500.60） m（0.902.0） m ； 结合生理生化特性及 16SrDNA 序列， 可鉴定为嗜温鞘氨醇杆菌。 3. 一种利用。
5、权利要求 1 所述的菌株制备 Zh-X-08 菌株发酵液的方法， 其特征在于 ： 将 Sphingobacterium thalpophilum Zh-X-08菌株接种于无机盐培养基中， 28 培养3 d， 加 入 5 mL 无菌水， 振荡得到菌悬液 ； 将菌悬液以 5 % 的比例接种至装有 30 mL 发酵培养基的 250 mL三角瓶中进行发酵培养 ； 培养温度28 ， 摇床转速200 rpm， 培养时间72 h， 即制得 菌株 Zh-X-08 发酵液。 4. 根据权利要求 3 所述的制备 Zh-X-08 菌株发酵液的方法， 其特征在于 ： 所述无机盐 培养基成分及配制方法如下 ： Na2H。
6、PO412H2O 1.5-2.5 g， KH2PO4 0.3-0.6g， MgSO47H2O 0.15- 0.25 g， (NH4)2SO4 0.8-1.2 g， 酵母粉 0.025-0.06 g， 蒸馏水 1L， 用 4 mol/L NaOH 调节 pH 至 7.5 ； 邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯溶于丙酮后抽滤灭菌， 加到预先灭菌的无机 盐培养基中， 使邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯的浓度为 20-30 mg/L， 待丙酮挥发后使用。 5. 根据权利要求 3 所述的制备 Zh-X-08 菌株发酵液的方法， 其特征在于 ： 所述发酵 培养基组成为 ： 葡萄糖 0.05 g/L，。
7、 酵母粉 0.05 g/L， KH2PO4 0.6 g/L， (NH4)2SO4 1.5 g/L， MgSO47H2O 0.3 g/L， pH7.5。 6. 一种权利要求 1 所述的降解邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯的菌株在烟草种植中的 应用， 其特征在于 ： 将由Zh-X-08菌株制备的ZH-X-08菌株发酵液添加烟草根际中可明显降 低土壤邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯的含量， 促进烟株生长。 7. 根据权利要求 6 所述的降解邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯的菌株在烟草种植中的 应用， 其特征在于 ： 将发酵液稀释 4-8 倍后， 在烟草移栽时， 每株烟草浇灌 100ml 。
8、稀释液。 权 利 要 求 书 CN 104357367 A 2 1/4 页 3 一种降解邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯的菌株及其在烟 草种植中的应用 0001 技术领域 ： 本发明涉及一种降解邻苯二甲酸二 （2-乙基己基） 酯的菌株及其在烟草种植中的应用， 属于农业生物技术应用领域。 0002 背景技术 ： 邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯 di-(2-ethylhexyl) phthalate， DEHP 是酞酸酯类化 合物 （phthalic acid esters， PAEs） 中最为常用的一种， 作为增塑剂应用于生产聚氯乙烯 树脂 （PVC） 。PAEs 全球年产量约为 60。
9、0 万 T， DEHP 产量约占 PAEs 总量的 （80-85） %， 在终端 产品中含量可达到 75% 左右。塑料制品的广泛应用， 使 PAEs 成为全球最普遍的环境有机污 染物。 0003 环境介质中存在的 DEHP 极少部分源于自然， 绝大多数源自人类活动的释放。塑料 制品在使用和处理过程中释放出 DEHP 能污染大气、 水体、 土壤以及食物等， DEHP 已成为水 体和土壤中最常被检出的内分泌干扰素类优控有机污染物， 多年前就有在包括人体在内的 很多生物体中均有被检出的报道。 0004 DEHP 在环境中化学性质稳定， 难被降解， 具有生物积累效应 （聂湘平 , 李桂英 , 吴志辉 。
10、, 等 . 4 种酞酸酯在龙须菜 - 篮子鱼食物链中的积累放大研究 J. 海洋科学 , 2008, 32(1): 19-23.） 。土壤中的 DEHP 不仅影响植物的生理代谢， 降低产质量， 而且还抑 制植物种子萌发和幼苗生长， 是一种较为典型的化感物质， 并可被吸收积累于植物体内， 通 过食物链传递。土壤中的 DEHP 能够降低蚯蚓的体重， 且下降程度与土壤中 DEHP 浓度呈现 线性相关 （陈强 , 孙红文 , 王兵 , 等 . 邻苯二甲酸二异辛酯 (DEHP) 对土壤中微生物和动 物的影响 J. 农业环境科学学报 , 2004, 23(6): 1156-1159.） 。动物实验表明， D。
11、EHP 能 降低雌性动物的雌激素水平和受孕率， 损伤雄性动物的睾丸， 具有较强的生殖毒性， 还具有 致畸性和胚胎毒性， 也是导致男性不育的可疑诱因之一。 0005 微生物的降解作用被认为是 DEHP 从自然环境中消除的主要途径。DEHP 在好 氧条件下的生物降解比较快， 半衰期 2-3 周， 在厌氧条件下的半衰期约 300 天 （Arias E. Effects of the peroxisome proliferator di(2-ethylhexyl)phthalate on cell turnover and peroxisome proliferation in primary chi。
12、ck embryo hepatocytesJ. Environmental Toxicology and Chemistry, 2012, 31(12): 2856-2860.） 。 0006 国内外就 DEHP 的微生物降解做了大量的工作， 目前已筛选到的能降解 DEHP 的微 生物菌株主要属于假单胞菌属 （Pseudomonas sp.） （柴素芬 , 曾锋 , 傅家谟 . DEHP 的微 生物降解性研究 J. 中山大学学报 ( 自然科学版 ), 2000, 39(4): 57-60.） 、 微球菌属 （Micrococcus sp.） 、 棒状杆菌属 （Corynebacterium s。
13、p） 、 鞘胺醇单胞菌属 (Sphigomonas sp.) 等， 另外铜绿微囊藻对水体中 DEHP 亦具有明显的降解作用 （迟杰 , 董林林 , 李金 娟 . 铜绿微囊藻对 DBP 和 DEHP 的富集和降解特性 J. 天津大学学报 , 2006, 39(12): 1395-1398.） 。鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonas) 是由 Yabuuchi 在 1990 年首先提出划 分的一个新属， 是一类丰富的新型微生物资源， 能够降解高分子有机污染物 （胡杰 , 何晓 说 明 书 CN 104357367 A 3 2/4 页 4 红 , 李大平 , 等 . 鞘氨醇单胞菌研究进展 J. 。
14、应用与环境生物学报 , 2007, 13(3): 431-437.） ， 已成为微生物研究的热点之一 （ZHOU Lisha, LI Hui, ZHANG Ying, et al. Development of genus-specifi c primers for better understanding the diversity and population structure of Sphingomonas in soilsJ. J Basic Microbiol, 2014, 54(8): 880-888. ； YANG Suijuan, ZHang Xinghai, CAO Zha。
15、oyun, et al. Growth-promoting Sphingomonas paucimobilis ZJSH1 associated with Dendrobium officinale through phytohormone production and nitrogen fixationJ. Microb Biotechnol, 2014.） 。 0007 但尚未见嗜温鞘氨醇杆菌 （Sphingobacterium thalpophilum） 可降解 DEHP 的研 究报道。 0008 发明内容 ： 本发明的目的在于针对现有技术的不足提供一种降解邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基。
16、） 酯 的菌株及其在烟草种植中的应用， 该菌株是发明人从郑州郊区塑料废弃物中分离并筛选出 来， 是具有降解邻苯二甲酸二 （2-乙基己基） 酯能力的菌株， 经发酵后应用于烟草种植中， 可 明显促进烟株生长。 0009 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 ： 一种降解邻苯二甲酸二 （2- 乙基己 基） 酯的菌株， 为嗜温鞘氨醇杆菌 （Sphingobacterium thalpophilum） Zh-X-08 菌株， 该菌 株于 2013 年 08 月 27 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏单位 地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所，。
17、 邮编为 100101， 保 藏号 ： CGMCC No.8075。 0010 所述 Zh-X-08 菌株在 LB 平板上圆形， 直径 1.52.5 mm， 淡黄， 表面光滑， 湿润， 低 凸起， 边缘裂叶状。菌体杆状， 无鞭毛， 不运动， 大小为 （0.500.60） m（0.902.0） m; 结合生理生化特性 （革兰氏染色、 柠檬酸盐利用、 硝酸盐还原以及碳源与利用等指标） 及 16SrDNA 序列， 可鉴定为嗜温鞘氨醇杆菌。 0011 将Sphingobacterium thalpophilum ZH-X-08菌株接种于无机盐培养基中， 28 培养 3 d， 加入 5 mL 无菌水， 。
18、振荡得到菌悬液 ； 将菌悬液以 5-7 % 的比例接种至装有 30-50 mL 发酵培养基的 250 mL 三角瓶中进行发酵培养 ； 培养温度 28-30 ， 摇床转速 200 rpm， 培养时间 72 h， 即制得菌株 ZH-X-08 发酵液。 0012 将由 Zh-X-08 菌株制备的 ZH-X-08 菌株发酵液稀释 4-8 倍后， 在烟草移栽时， 每株 烟草浇灌稀释液 100 ml 至根系周围， 可明显降低土壤中邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯的 含量， 促进烟株生长。 0013 所述无机盐培养基成分及配制方法如下 ： Na2HPO412H2O 1.5-2.5 g， KH2PO4 0。
19、.3-0.6g， MgSO47H2O 0.15- 0.25 g， (NH4)2SO4 0.8-1.2 g， 酵母粉 0.025-0.06 g， 蒸 馏水 1L， 用 4 mol/L NaOH 调节 pH 至 7.5 ； 邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯 （作为底物， 能够 保持并提升菌株降解活性） ， 溶于丙酮后抽滤灭菌， 加到预先灭菌的无机盐培养基中， 使邻 苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯的浓度为 20-30 mg/L， 待丙酮挥发后使用。 0014 所述发酵培养基组成为 ： 葡萄糖 0.05 g/L， 酵母粉 0.05 g/L， KH2PO4 0.6 g/L， (NH4)2SO4 。
20、1.5 g/L， MgSO47H2O 0.3 g/L， pH7.5。 0015 本发明的最大特点是 ： 利用 Zh-X-08 菌株经摇瓶发酵所得菌悬液， 在烟草种植中 说 明 书 CN 104357367 A 4 3/4 页 5 能够降低烟草自毒物质邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯含量、 促进烟株生长。 0016 具体实施方式 ： 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 下述实施例中实验方法， 如 无特殊说明， 均为常规方法。以下实施例中的试验， 均设置三次重复， 结果取平均值。 0017 实施例 1 将Sphingobacterium thalpophilum Zh-X-。
21、08 菌株按照 5% 接种量接种于无机盐培养 基 （Na2HPO412H2O 2.0 g， KH2PO4 0.5g， MgSO47H2O 0.2 g， (NH4)2SO4 1.0 g， 酵母粉 0.05 g， 邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯 30 mg/L） 中， 28 培养 3 d， 加入 5 mL 无菌水， 振荡得 到菌悬液。将菌悬液以 5 % 的比例接种至装有 30 mL 发酵培养基的 250 mL 三角瓶中进行 发酵培养。培养温度 28 ， 摇床转速 200 rpm， 培养时间 72 h。即制得菌株 ZH-X-08 发酵 液。 0018 发酵培养基组成 ： 葡萄糖 0.05 g/。
22、L， 酵母粉 0.05 g/L， KH2PO4 0.6 g/L， (NH4)2SO4 1.5 g/L， MgSO47H2O 0.3 g/L， pH 7.5。 0019 以土壤盆栽方式进行验证试验， 试验在郑州烟草研究院温室内进行。盆栽土壤采 自郑州市郊， 土壤有机质含量为 20.33 gkg-1， 总氮 2.63 gkg-1， pH 值 6.89（土水比为 1 ， ）5.2有效磷 26.31 mg kg-1， 速效钾 96.72 mg kg-1， DEHP 含量为4.23 mg kg-1。土壤风 干后过 20 目筛， 在盆栽前一周采用掺土法拌入 NH4NO3、 KH2PO4、 KNO3和 K2。
23、SO4 等化学纯试剂， 使土壤含N量达1.0 g/kg干土，m(N)m(P2O5)m(K2O)=1 ，31同时采用掺土法设置5.0 mg/kg 和 10 mg/kg 两个 DEHP 添加水平， 每盆装入土壤 2.0 kg。将发酵稀释 4 倍和 8 倍后作稀释 液备用。施用方式 1 ： 在装盆时采用掺土法将稀释液 100 ml 均匀拌入盆栽土壤中 （掺土法） ； 施用方式 2 ： 将 100 ml 稀释液在移栽时以灌根方式浇灌在烟草根部土壤周围 （灌根法） 。同 时设置空白对照， 重复 3 次， 试验共计 30 盆。盆栽每 3 天浇 200 ml 去离子水 1 次， 移栽后 30 d 采用破坏性。
24、取样， 分别采集土壤和烟株样品， 测定土壤中 DEHP 含量和烟草生物量 （地 上部和根系） 。试验结果详见表 1。该菌株发酵液能够降低土壤中邻苯二甲酸二 （2- 乙基己 基） 酯含量 15 % 以上， 较对照提高烟草生物量 10 % 以上。 0020 实施例 2 将Sphingobacterium thalpophilum Zh-X-08 菌株按照 5% 接种量接种于无机盐培养 基 （Na2HPO412H2O 1.5 g， KH2PO4 0.4 g， MgSO47H2O 0.15 g， (NH4)2SO4 1.2 g， 酵母粉 0.04 g， 邻苯二甲酸二 （2- 乙基己基） 酯 25 mg。
25、/L） ， 中， 28培养 3 d， 加入 5 mL 无菌水， 振荡得到 说 明 书 CN 104357367 A 5 4/4 页 6 菌悬液。将菌悬液以 6 % 的比例接种至装有 30 mL 发酵培养基的 250 mL 三角瓶中进行发 酵培养。培养温度 28 ， 摇床转速 200 rpm， 培养时间 72 h。即制得菌株 ZH-X-08 发酵液。 0021 发酵培养基组成 ： 葡萄糖 0.04 g/L， 酵母粉 0.04 g/L ， KH2PO4 0.5 g/L， (NH4)2SO4 1.2 g/L， MgSO47H2O 0.2 g/L， pH 7.5。 0022 以大田小区方式进行验证试验。
26、。在河南襄城烟区内进行， 试验地土壤有机质含量 为 23.33 gkg-1， 总氮 2.48 gkg-1， pH 值 7.03（土水比为 1 ， ）5.2有效磷 42.13 mgkg-1， 速效钾 108.92 mgkg-1， DEHP 含量为 1.49 mgkg-1。氮肥施肥量为纯氮 75.0 kg/ha， m(N)m(P2O5)m(K2O)=1 ，5.28.0移栽烟草行株距为 120 cm60 cm。将发酵液稀释 4 倍和 8 倍后， 在移栽后对烟株根部浇 100 ml 稀释液， 每个浓度处理处理 4 株烟草， 同时设置空白。 移栽后 30 d 采集烟草根际土壤 （抖土法） 和烟株样品， 测定土壤中 DEHP 含量和烟草植株生 物量。结果详见表 2。结果表明该菌株发酵液能够降低根际土壤中邻苯二甲酸二 （2- 乙基 己基） 酯含量 20 % 以上， 烟草生物量高于对照 8 % 以上。 0023 注 ：（+） 表示增加或提高，（-） 表示减少或降低。 说 明 书 CN 104357367 A 6 。