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1、(10)申请公布号 CN 104327175 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104327175 A (21)申请号 201410315033.5 (22)申请日 2014.07.03 C07K 14/435(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (71)申请人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区朝晖六区 潮王路 18 号 (72)发明人 金志敏 周奎 栗金权 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 王晓普 (54) 发明名称 一种分离抗菌肽的方法 (57) 摘。
2、要 本发明公开了一种分离抗菌肽的方法 ： 以家 蝇蛹粗提液为原料， 向家蝇蛹粗提液中加入硅藻 土接枝的单宁， 添加比例为， 每 10mL 家蝇蛹粗提 液中加入 0.8 1.2g 硅藻土接枝的单宁， 充分搅 拌成悬浮液， 并保持 1 2h， 然后高速离心， 取沉 淀物加入体积百分含量5080丙酮水溶液中， 在 25 50温度下浸提 1 2h， 然后高速离心， 取上清液， 采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮， 制得抗菌肽。本发明采用硅藻土接枝单宁共沉淀 法来分离抗菌肽， 抗菌肽得率在 0.73 1.5之 间， 硅藻土接枝单宁可以重复使用， 降低了生产成 本， 利于工业放大， 所分离抗菌肽活力高， 抗。
3、菌活 力可达 80以上， 高达 90.2。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104327175 A CN 104327175 A 1/2 页 2 1. 一种分离抗菌肽的方法， 其特征在于所述方法为 ： 以家蝇蛹粗提液为原料， 向家蝇 蛹粗提液中加入硅藻土接枝的单宁， 添加比例为， 每 10mL 家蝇蛹粗提液中加入 0.8 1.2g 硅藻土接枝的单宁， 充分搅拌成悬浮液， 并保持 1 2h， 然后高速离心， 取沉淀物加入体积 百分含。
4、量5080丙酮水溶液中， 在2550温度下浸提12h， 然后高速离心， 取上清 液， 采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮， 制得所述抗菌肽。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述硅藻土接枝的单宁按以下方法制得 ： 二 甲基二氯硅烷加入无水吡啶中， 搅拌均匀配成混合液， 所述二甲基二氯硅烷、 无水吡啶的体 积比为1 ： 1516， 然后将过100目筛的硅藻土粉末加入上述混合液中， 2030下搅拌反 应 2 3 小时， 再于搅拌下缓慢加入单宁， 加完后搅拌反应 1 2 小时， 再静置 0.5 1 小 时， 离心， 取沉淀洗涤、 干燥， 制得硅藻土接枝的单宁 ； 所述单宁、 硅藻土粉末的。
5、质量比为 1:1.5 3， 所述二甲基二氯硅烷、 硅藻土粉末的质 量比为 1:1.25 2。 3. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于所述单宁、 硅藻土粉末的质量比为 1 ： 2.5， 所 述二甲基二氯硅烷、 硅藻土粉末的质量比为 1 ： 2。 4. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于所述单宁为分子量 1500 1750 的单宁。 5. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于每 10mL 家蝇蛹粗提液中加入 0.8 1.0g 硅 藻土接枝的单宁。 6. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于每 10mL 家蝇蛹粗提液中加入 0.9g 硅藻土接 枝的单宁。 7.如权利要求1所述的。
6、方法， 其特征在于所述沉淀物加入体积百分含量70丙酮水溶 液中进行浸提。 8. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述浸提时的温度为 40。 9. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述家蝇蛹粗提液按以下方法制得 ： 称取家蝇蛹， 用蒸馏水清洗干净， 加入 pH5.8、 50mmol/L 磷酸盐缓冲液， 匀浆处理后， 高 速离心， 取上清液， 上清液中加入 (NH4)2SO4， 高速离心， 弃沉淀， 收取上清液， 即为家蝇蛹粗 提液 ； 所述家蝇蛹、 磷酸盐缓冲液、 (NH4)2SO4的质量比为 1 ： 2 3 ： 0.5 1。 10. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述。
7、方法按以下步骤进行 ： (1) 称取家蝇蛹， 用蒸馏水清洗干净， 加入 pH5.8、 50mmol/L 磷酸盐缓冲液， 匀浆处理 后， 6000r/min 离心 25min， 取上清液， 上清液中加入 (NH4)2SO4， 8000r/min 离心 20min， 弃沉 淀， 收取上清液， 即为家蝇蛹粗提液 ； 所述家蝇蛹、 磷酸盐缓冲液、 (NH4)2SO4的质量比为 1 ： 2.2 ： 0.65 ； (2) 二甲基二氯硅烷加入无水吡啶中， 搅拌均匀配成混合液， 所述二甲基二氯硅烷、 无 水吡啶的体积比为 1 ： 16， 然后将过 100 目筛的硅藻土粉末加入上述混合液中， 30下搅拌 反应2。
8、小时， 再于搅拌下缓慢加入分子量15001750单宁， 加完后搅拌反应1h， 静置30min 后， 5000r/min 离心 5min， 取沉淀， 用蒸馏水洗涤， 40干燥， 制得硅藻土接枝的单宁 ； 所述单宁、 硅藻土粉末的质量比为 1 ： 2.5， 所述二甲基二氯硅烷、 硅藻土粉末的质量比 为 1 ： 2 ； (3) 向家蝇蛹粗提液中加入硅藻土接枝的单宁， 添加比例为， 每 10mL 家蝇蛹粗提液中 权 利 要 求 书 CN 104327175 A 2 2/2 页 3 加入 0.9g 硅藻土接枝的单宁， 充分搅拌成悬浮液， 并保持 1h， 然后 5000r/min 转速下离心 10min，。
9、 取沉淀物加入体积百分含量70丙酮水溶液中， 在40温度下浸提1h， 然后6000r/ min 离心 20min， 取上清液， 采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮， 制得抗菌肽。 权 利 要 求 书 CN 104327175 A 3 1/5 页 4 一种分离抗菌肽的方法 ( 一 ) 技术领域 0001 本发明涉及一种分离抗菌肽的方法， 具体涉及从家蝇蛹粗提液中分离出抗菌肽， 属于生物化工领域。 ( 二 ) 背景技术 0002 抗菌肽是一类由生物体产生的具有抗菌活性的碱性多肽， 由 20 60 个氨基酸残 基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、 热稳定性以及广谱抗菌等特点， 被称为 “第二防御 体系。
10、” 。瑞典科学家 G.Boman 等人在研究北美天蚕的免疫机制时， 发现其滞育蛹经注射阴沟 通杆菌及大肠杆菌等外界刺激诱导后， 其血淋巴中产生了具有抑菌活性作用的多肽物质， 由此分离获得世界上第一个抗菌多肽天蚕素(Cecropins)。 此后， 人们从其他昆虫以及两 栖类动物、 哺乳动物中也分离到结构相似的抗菌多肽， 已有几十种抗菌多肽的结构被测定， 对其作用机理进行了大量研究。 一般认为抗菌肽作用过程如下 ： 抗菌肽作用于细胞膜， 在膜 上形成跨膜的离子通道， 破坏了细胞膜的完整性， 引起细胞膜通透性改变， 造成细胞内小分 子物质泄漏， 破坏了细胞正常渗透压平衡， 从而杀死细胞。 0003 。
11、抗菌肽属于生物体非专一性免疫应答的产物， 能够抑杀多种细菌、 真菌， 能够加速 免疫过程， 并且对正常细胞无损伤。人们利用抗菌肽的特性， 将其应用于不同领域。抗菌肽 在日化用品中起到杀菌消炎作用 ； 在植物病虫害防治方面， 以其对真菌的强大杀伤作用而 得以应用 ； 利用其稳定性可以作为绿色饲料的添加剂 ； 在医药方面， 由于其抗菌活性高和 不宜引起抗药性， 已经成为了人们对抗病原细菌和真菌感染的药物之一 ； 抗菌肽还在生物 农药方面有所应用， 成为对环境无污染的友好产品。 随着人们对抗菌肽研究的深入， 其应用 必将愈加广泛。 0004 专利 CN201110392455.9 公开了一种分离天蚕。
12、素抗菌肽的方法， 将含有天蚕素抗 菌肽的发酵液经微滤膜过滤， 收集微滤透过物 ； 对微滤透过物进行超滤膜过滤， 收集超滤透 过物 ； 对透过物进一步纳滤膜过滤， 收集纳滤截留物， 即得到天蚕素抗菌肽。此发明采用膜 过滤的方法实现了对抗菌肽的浓缩分离， 具有能耗低， 收率高的特点， 但所获得纳滤截留物 浓度较低， 产品纯度有待进一步提高。专利 CN201110345856.9 公开了一种从诸葛菜中提 取抗菌肽的方法， 将诸葛菜研磨成浆， 加入可溶蛋白提取缓冲液， 处理后获得上清液， 加入 (NH4)2SO4溶液除去杂蛋白等物质， 然后采用离子交换层析、 透析等操作获得抗菌肽浓缩液， 之后过分子筛。
13、获得活性诸葛菜抗菌肽。 此法以诸葛菜为原材料， 降低了成本， 利用离子交换 层析、 透析等操作浓缩抗菌肽， 提高了提取效率， 但离子交换层析在工业化生产中不宜大规 模应用。专利 CN200710176477.5 公开了一种提取猪血抗菌肽的方法， 将猪血溶于缓冲液 中， 利用木瓜蛋白酶进行酶解， 使用氯仿和亚硫酸氢钠对酶解液脱色， 获得猪血抗菌肽的粗 提物。精制过程如下 ： 将粗提物过凝胶型阳离子交换柱， 对离子交换柱进行洗脱， 收集洗脱 液， 进行真空冷冻干燥。此方法操作简单， 成本较低， 操作条件温和， 反应条件易于控制， 适 于少量抗菌肽的提取， 并且还需要对酶解产物进一步的确定。专利 C。
14、N200810218932.8 公开 了家蝇蛹天然抗菌肽制品及其制备方法和应用， 此专利以家蝇蛹为原材料， 经过酸过夜和 说 明 书 CN 104327175 A 4 2/5 页 5 热处理后得到上清液 ； 上清液经分子筛过滤和超滤处理， 然后进行喷雾干燥后得到抗菌肽 制品。 以此发明来制备抗菌肽及其制品， 具有工艺简便快速的特点， 适于对于抗菌肽产品质 量要求低的制品。专利 CN200710200375.2 公开了一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其 产品和应用， 将抗菌肽粗提液进行透析， 透析内液经固相萃取， 洗脱组分经超滤分离， 活性 组分用反相高效液相色谱纯化， 即得家蝇分泌型抗菌肽。 。
15、此发明提供了一条高效、 抗菌活性 稳定性较好的抗菌肽提取路线， 提高了分离纯化的效率。但采用反相高效液相色谱纯化不 适于工业规模化生产。 0005 随着人们对抗菌肽需求量的不断增加， 对其纯度和抗菌活性的要求也在不断提 高。其来源主要有三个方面 ： 天然提取、 化学合成、 基因工程。由于抗菌肽分子量小， 天然 抗菌肽含量较少， 分离纯化困难， 提取产率低， 在生产实践中面临许多困难。化学合成可以 避免分离纯化问题， 但是化学合成成本较高。 利用基因工程方法， 可以降低合成抗菌肽的成 本， 但基因工程同样遇到一些瓶颈， 例如依然存在表达产物少等问题。 0006 为此我们提出一种分离抗菌肽的方法 。
16、： 单宁接枝硅藻土选择性共沉淀法。 0007 单宁酸又名单宁、 鞣质， 是一类具有一定聚合度的多元酚类化合物， 其传统定义 指分子量 500 3000。单宁在制革、 医药、 食品、 分离纯化等方面有着广泛的应用， 尤其在 分离纯化方面是一个比较新的方向。本发明基于单宁蛋白质间的结合反应是由两者间 多点疏水键和氢键共同作用的结果。E.Haslam.Tannins 在 polyphenols and Molecular Complexation 文章中指出疏水作用是单宁蛋白质反应的驱动力， 单宁的酚羟基与蛋白质 的极性基 ( 主要是肽基 , 此外还有胍基、 羟基、 羰基等 ) 发生两点氢键结合 ,。
17、 酚羟基作为氢 键的同时， 使单宁蛋白质反应进一步加强 , 此后单宁以多点结合的方式在蛋白质分子间 形成疏水层 , 使蛋白质分子聚集导致沉淀。高聚合度鞣质分子能使蛋白质变性而沉淀， 低 聚合度鞣酸分子与蛋白质作用较弱， 不会使蛋白质沉淀。 聚合度过高会使蛋白质变性， 因此 在利用其分离蛋白质时， 需要对其酚羟基进行适当的修饰。本发明就是采用硅藻土对其活 性进行修饰， 硅藻土表面具有大量的羟基， 可以用来接枝单宁， 采用硅藻土接枝单宁来沉淀 抗菌肽。单宁与蛋白质之间通过非共价键结合在一起， 作用力较弱， 在加入丙酮溶液后， 不 仅断裂了单宁与蛋白质之间的作用， 还会竞争性地与单宁形成氢键， 将抗。
18、菌肽解离出来。 从 而实现了对抗菌肽的分离。本发明利用硅藻土接枝单宁共沉淀法来分离抗菌肽， 通过此方 法可以获得高抗菌活力的抗菌肽， 分离效率高， 降低了生产成本， 适合工业化放大， 对蛋白 质的分离具有一定的意义。 ( 三 ) 发明内容 0008 本发明是针对现有抗菌肽分离的现状， 在综合分析各种分离方法优缺点之后， 提 供了一种分离抗菌肽的方法 ： 硅藻土接枝单宁共沉淀法。该方法工艺简单， 成本低， 所提取 抗菌肽抗菌活力高。 0009 为解决本发明技术问题， 本发明采用如下技术方案 ： 0010 一种分离抗菌肽的方法， 所述方法以家蝇蛹粗提液为原料， 向家蝇蛹粗提液中加 入硅藻土接枝的单。
19、宁， 添加比例为， 每 10mL 家蝇蛹粗提液中加入 0.8 1.2g 硅藻土接枝的 单宁， 充分搅拌成悬浮液， 并保持 1 2h， 然后高速离心， 取沉淀物加入体积百分含量 50 80丙酮水溶液中， 在 25 50温度下浸提 1 2h， 然后高速离心， 取上清液， 采用真空冷 说 明 书 CN 104327175 A 5 3/5 页 6 冻干燥法除去水分和丙酮， 制得抗菌肽。 0011 所述方法中， 每 10mL 家蝇蛹粗提液中加入 0.8 1.2g 硅藻土接枝的单宁， 优选每 10mL 家蝇蛹粗提液中加入 0.8 1.0g 硅藻土接枝的单宁， 更优选每 10mL 家蝇蛹粗提液中 加入 0.。
20、8 0.9g 硅藻土接枝的单宁， 最优选每 10mL 家蝇蛹粗提液中加入 0.9g 硅藻土接枝 的单宁。 0012 所述沉淀物优选加入体积百分含量 70丙酮水溶液中。 0013 浸提时的温度优选 40。 0014 所述体积百分含量 50 80丙酮水溶液的体积用量优选为家蝇蛹粗提液体积的 0.5 2 倍， 更优选为 0.8 1.2 倍。 0015 所述方法中， 接枝剂为二氯二甲基硅烷， 溶剂为吡啶。 0016 所述家蝇蛹粗提液可按以下方法制得 ： 0017 称取家蝇蛹， 用蒸馏水清洗干净， 加入 pH5.8、 50mmol/L 磷酸盐缓冲液， 匀浆处理 后， 高速离心， 取上清液， 上清液中加入。
21、 (NH4)2SO4， 高速离心， 弃沉淀， 收取上清液， 即为家蝇 蛹粗提液 ； 0018 所述家蝇蛹、 磷酸盐缓冲液、 (NH4)2SO4的质量比为 1 ： 2 3 ： 0.5 1， 优选为 1 ： 2.2 ： 0.65。 0019 本发明所述硅藻土接枝的单宁按以下方法制得 ： 二甲基二氯硅烷加入无水吡啶 中， 搅拌均匀配成混合液， 所述二甲基二氯硅烷、 无水吡啶的体积比为 1 ： 15 16， 然后将过 100 目筛的硅藻土粉末加入上述混合液中， 20 30下 ( 优选 30下 ) 搅拌反应 2 3 小 时， 再于搅拌下缓慢加入单宁， 加完后搅拌反应 1 2 小时， 再静置 0.5 1 。
22、小时， 离心， 取 沉淀洗涤、 干燥， 制得硅藻土接枝的单宁 ； 0020 所述单宁、 硅藻土粉末的质量比为 1:1.5 3， 优选 1 ： 2.5， 所述二甲基二氯硅烷、 硅藻土粉末的质量比为 1:1.25 2， 优选 1 ： 2。 0021 所述硅藻土粉末的比表面积一般为 30 65m2/g， 优选为 65m2/g ； 。 0022 所述单宁的分子量优选为15001750。 可直接从市场上购买分子量15001750 的单宁， 或者也可以自行提取制备 1500 1750 分子量的单宁。 0023 本发明实施例中所用的单宁按照专利 CN201110187501.1 制备获得， 制得的余甘 子鞣。
23、质即为单宁。也可从其他原料中提取获得单宁。 0024 所述方法中， 接枝剂为二氯二甲基硅烷， 溶剂为吡啶。 0025 所述硅藻土与单宁进行接枝的反应式原理如附图 1 所示， 硅藻土接枝的单宁与抗 菌肽的吸附结合反应如附图 2 所示。 0026 进一步， 本发明所述分离抗菌肽的方法优选按以下步骤进行 ： 0027 (1) 称取家蝇蛹， 用蒸馏水清洗干净， 加入 pH5.8、 50mmol/L 磷酸盐缓冲液， 匀浆处 理后， 6000r/min 离心 25min， 取上清液， 上清液中加入 (NH4)2SO4， 8000r/min 离心 20min， 弃 沉淀， 收取上清液， 即为家蝇蛹粗提液 ；。
24、 所述家蝇蛹、 磷酸盐缓冲液、 (NH4)2SO4的质量比为 1 ： 2.2 ： 0.65 ； 0028 (2) 二甲基二氯硅烷加入无水吡啶中， 搅拌均匀配成混合液， 所述二甲基二氯硅 烷、 无水吡啶的体积比为 1 ： 16， 然后将过 100 目筛的硅藻土粉末加入上述混合液中， 30下 搅拌反应 2 小时， 再于搅拌下缓慢加入分子量 1500 1750 单宁， 加完后搅拌反应 1h， 静置 说 明 书 CN 104327175 A 6 4/5 页 7 30min 后， 5000r/min 离心 5min， 取沉淀， 用蒸馏水洗涤， 40干燥， 制得硅藻土接枝的单宁 ； 0029 所述单宁、 。
25、硅藻土粉末的质量比为 1 ： 2.5， 所述二甲基二氯硅烷、 硅藻土粉末的质 量比为 1 ： 2 ； 0030 (3) 向家蝇蛹粗提液中加入硅藻土接枝的单宁， 添加比例为， 每 10mL 家蝇蛹粗提 液中加入 0.9g 硅藻土接枝的单宁， 充分搅拌成悬浮液， 并保持 1h， 然后 5000r/min 转速下 离心 10min， 取沉淀物加入体积百分含量 70丙酮水溶液中， 在 40温度下浸提 1h， 然后 6000r/min 离心 20min， 取上清液， 采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮， 制得抗菌肽。 0031 与现有技术相比， 本方法基于单宁与蛋白质结合的特性， 利用硅藻土接枝单宁来 吸。
26、附抗菌肽， 离心后共沉淀， 采用丙酮溶液解离抗菌肽， 离心除去硅藻土接枝单宁。最后采 用真空冷冻干燥技术获得高活性的抗菌肽。其优点主要在于 ： 0032 a) 制备硅藻土接枝单宁所需成本低， 利于工业放大。 0033 b)所分离抗菌肽抗菌活力高。 抗菌肽得率高达1.5， 抗菌活力可达80以上， 高 达 90.2。 0034 C) 硅藻土接枝单宁可以重复利用， 节约成本。 ( 四 ) 附图说明 0035 图 1 硅藻土与单宁接枝的反应原理示意图。 0036 图 2 硅藻土接枝的单宁与抗菌肽的吸附结合反应示意图。 ( 五 ) 具体实施方式 0037 下面以具体实施例来对本发明方案进行进一步说明， 。
27、但本发明的保护范围不限于 此。 0038 本发明实施例中的家蝇蛹粗提液按以下方法制得 ： 0039 称取 100.0g 家蝇蛹， 用蒸馏水清洗干净。加入 220ml pH5.850mmol/L 磷酸盐缓 冲液， 匀浆处理后， 6000r/min 离心 25min， 取上清液， 向上清液中加入 65.0g(NH4)2SO4， 再于 8000r/min 离心 20min。弃沉淀， 收取上清液。可获得 200ml 上清液， 即为家蝇蛹粗提液。 0040 硅藻土接枝的单宁按以下方法制得 ： 0041 量取 5.0ml 二甲基二氯硅烷加入到 80ml 无水吡啶溶液中， 磁力搅拌均匀得混合 液， 将CD0。
28、2硅藻土(购于嵊州市华力硅藻土制品有限公司)过100目标准筛后， 称取10.0g 比表面积为65m2/g的硅藻土， 缓慢加入到上述混合液中， 30搅拌条件下充分反应2h， 然后 再缓慢加入 4.0g 分子量为 1500 1750 单宁 ( 单宁按照专利 CN201110187501.1 制备 )。 添加过程中需不停搅拌， 加完后搅拌反应1h。 静置30min后， 5000r/min离心5min， 取沉淀， 用蒸馏水洗涤三次， 40干燥， 制得 16.2g 硅藻土接枝的单宁。 0042 单宁的制备方法为 ： 0043 余甘子干燥果实粉碎， 取 1kg， 放入超临界萃取装置中， 在温度为 45， 。
29、压力为 30MPa 下萃取 50min， 残留物加 5L70的乙醇溶液进行超声提取， 超声频率为 35KHz， 提取 2 次， 每次 1h， 过滤， 合并提取液， 浓缩， 加入浓度为 6明胶溶液， 搅拌至不再产生沉淀， 离 心， 沉淀物用 90丙酮水溶液溶解， 滤除明胶， 得到初步纯化液， 上 1LHPD-400 大孔树脂柱， 吸附完成后， 先用 5L 水洗脱， 在用 5L70乙醇溶液洗脱， 控制流速为 4.5mL/min， 收集含分 说 明 书 CN 104327175 A 7 5/5 页 8 子量15001750的余甘子鞣质的洗脱液， 浓缩， 冷冻干燥即得分子量为15001750单宁。 0。
30、044 抗菌活力测定方法 ： 0045 用 0.1mol/L pH6.4 的磷酸钾缓冲液从固体斜面上将金黄色葡萄球菌冲下， 配成 一定浓度的悬浊液 (OD570nm 0.3 0.5)。取 3ml 该悬浮液置于冰浴中， 再加入 50L 用 无菌水溶解的抗菌肽样品， 混匀， 测其在 570nm 处 A0值。然后将其移入 30温浴中， 反应 30min 后取出， 立即置于冰浴中 10min， 以终止反应。测其在 570nm 处 A 值。抗菌活力按 U2 (A0-A)/A 式计算。U ： 活力单位。 0046 实施例 1 ： 0047 向200ml家蝇蛹粗提液中加入16.0g硅藻土接枝的单宁， 充分搅。
31、拌至硅藻土悬浮， 保持一小时。然后 5000r/min 离心 10min， 取沉淀。用 200mL50丙酮溶液 25浸提沉淀物 1h 后， 6000r/min 离心 20min， 弃沉淀。采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮， 获得抗菌肽， 称其质量并测定抗菌活力。收得抗菌肽 1.01g， 抗菌肽得率为 1.01 ( 以家蝇蛹质量为标 准 )， 抗菌活力为 82.3。 0048 实施例 2 ： 0049 向200ml家蝇蛹粗提液中加入17.0g硅藻土接枝的单宁， 充分搅拌至硅藻土悬浮， 保持一小时。然后 5000r/min 离心 10min， 取沉淀。用 200mL60丙酮溶液 30浸提沉淀物 1。
32、h 后， 6000r/min 离心 20min， 弃沉淀。采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮， 获得抗菌肽， 称其质量并测定抗菌活力。收得抗菌肽 1.22g， 抗菌肽得率为 1.22 ( 以家蝇蛹质量为标 准 )， 抗菌活力到 86.0。 0050 实施例 3 ： 0051 向200ml家蝇蛹粗提液中加入18.0g硅藻土接枝的单宁， 充分搅拌至硅藻土悬浮， 保持一小时。5000r/min 离心 10min， 取沉淀。用 200mL70丙酮溶液 40浸提沉淀物 1h 后， 6000r/min 离心 20min， 弃沉淀。采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮， 获得抗菌肽， 称 其质量并测定抗菌活力。收。
33、得抗菌肽 1.5g， 抗菌肽得率为 1.5 ( 以家蝇蛹质量为标准 )， 抗菌活力达到 90.2。 0052 实施例 4 ： 0053 向200ml家蝇蛹粗提液中加入19.0g硅藻土接枝的单宁， 充分搅拌至硅藻土悬浮， 保持一小时。5000r/min 离心 10min， 取沉淀。用 200mL75丙酮溶液 45浸提沉淀物 1h 后， 6000r/min 离心 20min， 弃沉淀。采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮， 获得抗菌肽， 称 其质量并测定抗菌活力。收得抗菌肽 0.9g， 抗菌肽得率为 0.9 ( 以家蝇蛹质量为标准 )， 抗菌活力为 80。 0054 实施例 5 ： 0055 向200。
34、ml家蝇蛹粗提液中加入20.0g硅藻土接枝的单宁， 充分搅拌至硅藻土悬浮， 保持一小时。5000r/min 离心 10min， 取沉淀。用 200mL80丙酮溶液 50浸提沉淀物 1h 后， 6000r/min 离心 20min， 弃沉淀。采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮， 获得抗菌肽， 称 其质量并测定抗菌活力。收得抗菌肽 0.76g， 抗菌肽得率达到为 0.76 ( 以家蝇蛹质量为 标准 )， 抗菌活力为 72.6。 说 明 书 CN 104327175 A 8 1/2 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 104327175 A 9 2/2 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 104327175 A 10 。