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1、(10)申请公布号 CN 104356231 A (43)申请公布日 2015.02.18 CN 104356231 A (21)申请号 201410626556.1 (22)申请日 2014.11.10 C07K 16/00(2006.01) C07K 1/30(2006.01) (71)申请人 北海开元生物科技有限公司 地址 536000 广西壮族自治区北海市海城区 北海大道 126 号 804 室 (72)发明人 莫丽影 吴志捷 袁小琴 (74)专利代理机构 北海市海城区佳旺专利代理 事务所 ( 普通合伙 ) 45115 代理人 黄建中 (54) 发明名称 一种有效去除人免疫球蛋白多聚体。
2、的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种有效去除人免疫球蛋白多 聚体的方法。 免疫球蛋白提纯工艺中降低多聚体， 十分必要。目前公开报道能去除人免疫球蛋白多 聚体的方法有聚乙二醇法和柱层析法， 但这两种 方法存在添加物难以去除、 处理量小、 设备昂贵的 问题， 推广应用较困难。本发明利用辛酸钠沉淀 法， 选取在溶液 pH 值 5.4, 辛酸盐浓度 6-8mmol/L 的条件下， 沉淀去除 IgG 多聚体， 能够有效地去除 多聚体60%以上， 使多聚体降低到3%以下， 免疫蛋 白的损失甚微， 多聚体含量稳定， 放置 2 年后仍可 以达到 中国药典 和国外相关药典的要求。 (51)Int.Cl. 权。
3、利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 104356231 A CN 104356231 A 1/1 页 2 1. 一种有效去除人免疫球蛋白多聚体的方法， 其特征在于包括如下步骤 ： （1） 调整蛋白液蛋白质含量 4 7g/L， 调整溶液 pH 值 5.35 5.55 ； （2） 加入辛酸钠溶液， 使辛酸钠最终含量达到 6 8mmol/L， 加入速度 10 15L/h， 加毕 搅拌 4 小时以上 , 复测溶液 pH 值为 5.35 5.55， 否则用 pH4.0 醋酸缓冲液调整至该范围 。
4、内， 温度控制在 15 25 ； （3） 静置 2 小时后压滤分离沉淀， 收集上清液， 进行超滤透析即为原液， 稀释配制后除 菌分装。 2. 根据权利要求书 1 中所述的一种有效去除人免疫球蛋白多聚体的方法， 其特征在 于 ： 步骤 （1） 所述的蛋白液， 为 FII 沉淀经溶解后或巴氏灭活后的蛋白液经超滤透析后的溶 液。 3. 根据权利要求书 1 中所述的一种有效去除人免疫球蛋白多聚体的方法， 其特征在 于 ： 步骤 （2） 所述的辛酸钠溶液为浓度为 1mol/L 的水溶液。 权 利 要 求 书 CN 104356231 A 2 1/3 页 3 一种有效去除人免疫球蛋白多聚体的方法 0001。
5、 技术领域 0002 本发明涉及生物制药领域， 特别是一种有效去除人免疫球蛋白多聚体的方法。 背景技术 0003 免疫球蛋白是一组具有抗体活性的蛋白质， 分为 IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE 五类。经 输注后， 能迅速提高受者血液中的 IgG 水平， 增强机体的抗感染能力和免疫调节功能。现公 开报道人免疫球蛋白提取方法大都采用 E.J.Cohn 教授创立的低温乙醇分级沉淀技术， 或 在Cohn氏工艺分级基础上结合一步或多步离子交换层系统， 或结合辛酸沉淀-层析达到提 纯而成 ； 病毒灭活方法大都采用经典的巴氏灭活法、 有机溶剂法、 低pH孵放法等。 但无论采 用哪种方法， 在制。
6、备过程由于乙醇的作用， 或加热等步骤等影响， 都会产生多聚体。IgG 多 聚体为 C1q 提供两个以上的结合位点， 在没有结合抗原的情况下， 激活了补体造成补体的 消耗， 使机体的免疫防御能力下降。 同时， 由于补体系统的激活， 产生大量过敏毒素、 过敏介 质， 引起炎症反应， 从而引起少数患者出现不良反应， 头疼、 潮红、 恶心、 休克等症状， 所以产 品中多聚体含量的多少决定了免疫球蛋白的质量。为此在各国药典中， 人免疫球蛋白明确 规定了多聚体的含量要求 : *: 中国药典中仅规定了单体及二聚体的含量。 0004 英国药典 2007 版、 欧洲药典 8.0 版中， 人免疫球蛋白中多聚体含量。
7、要求小于 10%， 静注人免疫球蛋白 （pH4） 不高于 3%。而现行的中国药典中仅规定了单体及二聚体的要求与 发达国家相比还有一定的差距。 而稳定考察的数据表明， 若多聚体含量小于3.0%， 在以后的 储存中， 多聚体的增加很缓慢， 在有效期内一直处于稳定的状态。 0005 因而在免疫球蛋白提纯工艺中降低多聚体， 显得十分迫切。 经检索文献， 目前公开 报道能去除人免疫球蛋白多聚体的方法有聚乙二醇法和柱层析法， 这两种方法都能降低多 聚体的含量， 但这两种方法存在添加物难以去除、 处理量小、 设备昂贵的问题， 推广应用较 困难。而本发明所使用设备简单， 几乎无费用增加， 添加物辛酸钠的去除方。
8、便彻底， 更易推 广和应用。目前公开发表的静注人免疫球蛋白分离方法中， 与采用辛酸钠沉淀有关的专利 （CN95109051.8、 CN201210041098、 CN201210071691、 CN201110174857.1） 多用在 FII 沉淀的 粗制过程中， 即用来去除 FII 加 FIII 中的 FIII， 而没有在精制过程中采用辛酸钠降低人免 说 明 书 CN 104356231 A 3 2/3 页 4 疫球蛋白中多聚体的报道。为此申请人经过很多实验， 发明了一种采用辛酸钠沉淀法去除 人免疫球蛋白多聚体的方法， 该方法能够有效降低多聚体含量， 而且蛋白质损失小， 是一种 十分有意义。
9、的方法。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种有效去除人免疫球蛋白多聚体的方法， 利用辛酸钠沉 淀法去除人免疫球蛋白多聚体， 有效降低人免疫球蛋白多聚体的含量， 克服传统方法所存 在的不足。 0007 为实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案是 ： （1） FII 溶解后的蛋白液， 或巴氏灭活后蛋白液经超滤透析后的蛋白液， 调整蛋白液蛋 白质含量 4 7g/L， 调整溶液 pH 值 5.35 5.55 ； （2） 加入 1mol/L 的辛酸钠使最终辛酸钠含量达到 6 8mmol/L， 加入速度 10 15L/h， 加毕搅拌 4 小时以上 , 复测溶液 pH 值为 5.35 5.55，。
10、 否则用 pH4.0 醋酸缓冲液调整至该 范围中， 温度控制在 15 25 ； （3） 静置 2 小时后压滤分离沉淀， 收集上清液， 进行超滤透析即为原液， 稀释配制后除 菌分装。 0008 采取上述措施的本发明， 经过多次试验， 选取最佳参数 ： 辛酸钠浓度 6 8mmol/L pH值 ： 5.355.55。 本发明采用辛酸盐沉淀法， 不需要增加额外的设备， 耗能少。 通过调整 辛酸盐浓度， 溶液pH值等参数， 能使多聚体降低到3%以下， 并且产品在储存条件下放置， 多 聚体含量稳定， 放置 2 年后仍可以达到 中国药典 和国外相关药典的要求， 而蛋白质损失 仅在 8% 以下， 究其原因在于。
11、溶液 pH 值远离免疫球蛋白等电点 7.0， 而辛酸钠浓度， 溶液 pH 值在多聚体和蛋白损失之间做动态平衡。 具体实施方式 0009 实施例 1 1. 将 FII 溶解液， 经超滤脱醇后调整蛋白液蛋白质含量 4 7g/L， 调整溶液 pH 值 5.35 5.55。 0010 2. 加入 1mol/L 的辛酸钠使最终辛酸钠含量达到 6 8mmol/L， 加入速度 10 15L/h， 毕搅拌 4 小时以上 , 复测溶液 pH 值为 5.35 5.55， 否则用 pH4.0 醋酸缓冲液调整 至该范围中。温度控制在 15 25。 0011 3. 用 7mmol/L 辛酸钠平衡液 （含辛酸钠 7mmo。
12、l/L、 氯化钠 ： 1.25g/L、 pH5.35 5.55， 温度 15 25.0） 400 600L， 加硅藻土 4Kg 对压滤机上滤板循环清洗， 清洗后压 滤， 出液温度 10 15。压滤完后用预冷洁净空气吹干滤板 30 40 分钟。用 7mmol/L 的辛酸钠平衡液 400 600L 清洗滤板 1 2 次， 回收洗液稀释制品。收集上清， 沉淀弃。 0012 4超滤脱盐， 将压滤液用 3 4 倍 2 8注射用水连续等体积透析， 浓缩至蛋白 浓度 60 80g/L。进行原液检定、 稀释配制后除菌分装。 0013 去除多聚体的效果 ： 步骤实施例 1 未增加去除多聚体步骤 脱醇后蛋白液多聚。
13、体含量 （%）6.11%6.11% 压滤后多聚体含量 （%）1.61%/ 说 明 书 CN 104356231 A 4 3/3 页 5 成品多聚体含量 （%）1.63%6.72% 人免疫球蛋白收率 （g/ FII）213230 实施例 2 1. 将巴氏灭活后蛋白液， 用 2 8注射用水连续等体积透析至电导率 100s/cm2 以下， 蛋白含量浓缩至 10g/L。 调整蛋白液蛋白质含量 4 7g/L， 用 pH4.0 醋酸缓冲液或 0.5mol/L 氢氧化钠调整溶液 pH 值 5.35 5.55。 0014 2. 以下同实施例 1 中 2,3,4 步骤。 步骤实施例 1 未增加去除多聚体步骤 脱。
14、醇后蛋白液多聚体含量 （%）9.43%9.43% 压滤后多聚体含量 （%）2.73%/ 成品多聚体含量 （%）2.74%10.11% 人免疫球蛋白收率 （g/ FII）206219 0015 实施例 3 把样品置于 2-8环境中放置， 测定其多聚体数据， 测量方法采用 中国药典三部 2010 年版附录 VI R 人免疫球蛋白类制品单体加二聚体测定法， 结果如下 ： 时间 样品 1 样品 2 0 月 1.63% 2.74% 3 月 1.62% 2.74% 6 月 1.68% 2.76% 9 月 1.71% 2.80% 12 月 1.77% 2.78% 24 月 1.85% 2.79% 由上述留样测定可知， 本发明方法所得产品， 样品质量稳定， 多聚体含量稳定。 说 明 书 CN 104356231 A 5 。