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1、(10)申请公布号 CN 104293687 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293687 A (21)申请号 201410453817.4 (22)申请日 2014.09.06 C12N 1/19(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 吴雪昌 张黎杰 郑道琼 张珂 高克慧 方雅红 靳心娜 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 李世玉 (54) 发明名称 一种提高酿酒酵母。
2、菌株乙酸耐受性的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种提高酿酒酵母菌株乙酸耐 受性的方法， 所述方法是将酿酒酵母的 ARX1 基因 敲除 ； 本发明方法可以高效地获得对乙酸耐性显 著提升的酿酒酵母工程菌株， 在高浓度乙酸 (3g/ l 以上 ) 存在时， 乙醇发酵速率明显提高， 发酵时 间缩短 24h 以上。本发明方法获得的酿酒酵母工 程菌株较亲株适用于发酵培养基存在高浓度乙酸 ( 染菌或原料预处理过程中产生 ) 时的燃料乙醇 发酵生产工艺。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权。
3、利要求书1页 说明书5页 序列表7页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104293687 A CN 104293687 A 1/1 页 2 1. 一种提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性的方法， 其特征在于所述方法是将酿酒酵母的 ARX1 基因敲除。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述 ARX1 基因敲除是以 PUG6 载体质粒为模 板， 在引物 ARX1S 和引物 ARX1A 的作用下进行 PCR 扩增， 获得 1930bp 的 DNA 片段作为基因 敲除组件， 然后将敲除组件转入酿酒酵母进行同源重组， 即获得提高乙酸耐受性的酿酒酵 母 ； 引物 ARX1S 为 ： 5-TAGCA。
4、CAGCCAACCCATAATGCCTTCTAAAAACTCCATCAACAGATTGTACTGAGAGTG-3 ； 引物 ARX1A 为 ： 5-TCTCCTAATATACATAAACCGAGCCATTCCTACTATACAAGATACCGCTCGCCGCAGCC-3。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于酿酒酵母为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)BY4741。 权 利 要 求 书 CN 104293687 A 2 1/5 页 3 一种提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性的方法 ( 一 ) 技术领域 0001 本发明涉及微生物菌株乙酸耐受性的方法， 特别涉及一种。
5、提高酿酒酵母菌株乙酸 耐受性的方法。 ( 二 ) 背景技术 0002 近些年来， 全球经济快速增长， 石油等化石能源的消耗量大幅增加， 价格持续走 高， 同时面临着资源枯竭的危机及各种环境问题。由于生物燃料 ( 醇类、 碳氢化合物及生物 柴油 ) 具有补充化石燃料资源、 可再生、 环保等优势， 受到了各国的广泛关注。燃料乙醇是 世界上生产和使用量最大的生物燃料， 我国已成为世界上第三大燃料乙醇生产应用国。 0003 燃料乙醇对缓解能源紧张和改善环境质量起到了重要作用， 因此提高燃料乙醇的 产量和改进乙醇生产工艺显得尤为重要。在燃料乙醇生产过程中， 乙酸是酿酒酵母面临的 一种重要的胁迫因子。乙酸。
6、是酿酒酵母发酵葡萄糖生产乙醇过程中一种代谢副产物。同时 纤维素原料在蒸汽爆破和酸水解预处理过程， 以及细菌污染同样也会产生乙酸。随着乙酸 在醪液中不断积累， 会抑制酵母的生长繁殖， 最终影响发酵结果， 是限制酵母乙醇发酵效率 的主要原因之一。因此， 选育耐高浓度乙酸的酿酒酵母菌株是提高燃料乙醇发酵效率的重 要途径之一。 ( 三 ) 发明内容 0004 本发明目的是提供一种提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性的方法。 0005 本发明采用的技术方案是 ： 0006 本发明提供一种提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性的方法， 所述方法是将酿酒酵母的 ARX1 基因敲除 ( 所述 ARX1 基因的核苷酸序列为 SEQ 。
7、ID NO:2 所示， ARX1 基因的核苷酸序 列上下游延长 1000bp 为 SEQ ID NO:3 所示 )。 0007 进一步， 所述 ARX1 基因敲除是以 PUG6 载体质粒为 PCR 模板， 在引物 ARX1S 和引物 ARX1A的作用下进行PCR扩增， 获得1930bp的DNA片段作为基因敲除组件， 然后将敲除转入 酿酒酵母进行同源重组， 即获得提高乙酸耐受性的酿酒酵母 ； 0008 引物 ARX1S 为 ： 0009 5-TAGCACAGCCAACCCATAATGCCTTCTAAAAACTCCATCAACAGATTGTACTGAGAGTG-3 ； 0010 引物 ARX1A 。
8、为 ： 0011 5-TCTCCTAATATACATAAACCGAGCCATTCCTACTATACAAGATACCGCTCGCCGCAGCC-3。 0012 更进一步， 所述酿酒酵母为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)BY4741( 购自 ATCC， 编号 ATCC 201388)。 0013 本发明所述提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性的方法按如下步骤进行 ： 0014 (1)基因敲除组件的构建 ： 以PUG6载体质粒(GenBank号 ： AF298793.1)为模板， 在 引物 ARX1S 和引物 ARX1A 的作用下进行 PCR 扩增， 获得 1930bp 的 DN。
9、A 片段 ( 即基因敲除组 件， 核苷酸序列为 SEQ ID NO:1 所示 ) ； 说 明 书 CN 104293687 A 3 2/5 页 4 0015 引物 ARX1S 为 ： 0016 5-TAGCACAGCCAACCCATAATGCCTTCTAAAAACTCCATCAACAGATTGTACTGAGAGTG-3 ； 0017 引物 ARX1A 为 ： 0018 5-TCTCCTAATATACATAAACCGAGCCATTCCTACTATACAAGATACCGCTCGCCGCAGCC-3 ； 0019 (2) 乙酸耐受性酿酒酵母菌株的获得 ： 将酿酒酵母 (Saccharomyces c。
10、erevisiae) BY4741菌体细胞约108个， 1mg/ml鲑鱼精DNA50l， 0.5g/ml的聚乙二醇水溶液240l(聚 乙二醇分子量为 3350)， 1.0M 醋酸锂溶液 36l， 步骤 (1) 获得的 1930bp 的 DNA 片段 25l 混合， 枪头吹打混匀， 30培养半小时后， 42水浴热击 40min， 12000rpm 离心 1min， 去上 清， 沉淀用 1ml YPD 液体培养基重悬， 30、 120rpm 培养 2-3h， 吸取 100l 培养液涂布于 含终浓度 300g/ml 新霉素 (geneticin,G418 ； 购自默克公司 ) 的 YPD 平板， 3。
11、0培养 2 天 后， 取平板上长出来的菌落提取基因组为模板， 分别以敲除验证引物和 ARX1 基因内部引物 进行 PCR 反应， 所述敲除验证引物为 KS 和 AARX1， ARX1 基因内部引物为 ARX1-S 和 ARX1-A ； 电泳检测 ARX1 基因内部引物扩增无条带而敲除验证引物扩增的单一条带为 1129bp， 判断 为 ARX1 基因缺失的酿酒酵母菌株 ； 0020 引物 KS 为 5-GATCGCGTATTTCGTCTCG-3 ； 0021 引物 AARX1 为 5-TAATCAGCTTCGGCGGT AT-3 ； 0022 引物 ARX1-S 为 5-TGG ACAAATCG。
12、C ACAAACT-3 ； 0023 引物 ARX1-A 为 5-GAATGGATA AACGCCTTGT-3。 0024 所述酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)BY4741 菌体细胞制备方法为 ： 挑 取 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae)BY4741(MATa ； his31 ； leu20 ； met150 ； ura30)接种至20ml YPAD液体培养基(10g/l酵母粉， 20g/l蛋白粉， 20g/l葡萄糖， 80mg/ l 腺嘌呤半硫酸， 溶剂为去离子水， pH 值 5.5) 中， 30、 200rpm 培养 12-。
13、16h。吸取 1ml 培养 液转接到 25ml 2YPAD 液体培养基 (20g/l 酵母粉， 40g/l 蛋白粉， 40g/l 葡萄糖， 160mg/l 腺嘌呤半硫酸， 溶剂为去离子水， pH 值 5.5) 中， 30、 200rpm 培养 2-3h(OD600 值为 3)， 然 后取 1ml 培养液离心， 沉淀用无菌水洗两遍， 获得菌体细胞。 0025 与现有技术相比， 本发明的有益效果主要体现在 ： 本发明方法可以高效地获得对 乙酸耐性显著提升的酿酒酵母工程菌株， 在高浓度乙酸(3g/L以上)存在时， 乙醇发酵时间 缩短 24h 以上。本发明方法获得的酿酒酵母工程菌株较亲株适用于发酵培养。
14、基存在高浓度 乙酸 ( 染菌或原料预处理过程中产生 ) 时的燃料乙醇发酵生产工艺。 ( 四 ) 附图说明 0026 图 1 为 ARX1 基因敲除组件示意图。 0027 图2为敲除组件和阳性转化子电泳验证图， 泳道1为实施例1引物ARX1S和ARX1A 扩增产物， 泳道 2 为实施例 2 敲除验证引物 (KS 和 AARX1) 扩增产物， 泳道 3 为实施例 2ARX1 基因内部引物 (ARX1-S 和 ARX1-A) 扩增产物。 0028 图 3 为菌株 BY4741 与 BYarx1 乙酸耐受性比较， a 表示菌体浓度 3107cells/ ml， b 表示菌体浓度 3106cells/m。
15、l， c 表示菌体浓度 3105cells/ml。 0029 图 4 为菌株 BY4741 与 BYarx1 在发酵条件下 CO2失重比较。 说 明 书 CN 104293687 A 4 3/5 页 5 ( 五 ) 具体实施方式 0030 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0031 YPAD 液体培养基组成 ： 10g/l 酵母粉， 20g/l 蛋白粉， 20g/l 葡萄糖， 80mg/l 腺嘌呤 半硫酸， 溶剂为去离子水， pH 值为 5.5。 0032 YPD液体培养基组成 ： 葡萄糖20g/L、 蛋白胨20g/L、 酵母提取物10g/L， 。
16、溶剂为去离 子水， pH 值为 5.5。 0033 实施例 1 PUG6 敲除组件的构建 0034 根据已报道的酿酒酵母 ARX1 基因及其侧翼序列 (GenBank 号 :NC_001136.10)， 以及 PUG6 质粒 loxp 位点上下游部分基因序列 (GenBank 号 ： AF298793.1)， 设计一对引 物 ARX1S 和 ARX1A， 以 pUG6 质粒为模板扩增敲除组件 ( 引物由上海桑尼生物科技合成 )， 组件的构成为 ARX1 基因同源序列 (41bp)+PUG6 匹配序列 (18bp)+loxp+G418 筛选标记 +loxp+PUG6 匹配序列 (18bp)+AR。
17、X1 同源序列 (41bp)。 0035 ARX1S 为 ： 0036 5-TAGCACAGCCAACCCATAATGCCTTCTAAAAACTCCATCAACAGATTGTACTGAGAGTG-3 ； 0037 ARX1A 为 ： 0038 5-TCTCCTAATATACATAAACCGAGCCATTCCTACTATACAAGATACCGCTCGCCGCAGCC-3。 0039 以质粒 PUG6 为模板进行 PCR 扩增， PCR 反应体系为 ： 5buffer 10l， dNTP 3l， 模板2l， 引物2l(已各取1l混合稀释到10l沸水浴5min)， DNA聚合酶(Prime star。
18、 ； 宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 )0.5l， ddH2O32.5l， PCR 反应条件为 ： 95预变性 5min ； 98变性 10s ； 61.9退火 15s ； 72延伸 2min。得到 PCR 扩增产物， PCR 清洁回收试 剂盒 (AXYGEN 生物技术有限公司 ) 回收后， 琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物片段 ( 图 2 泳道 1)， 结果表明长度为 1930bp 的敲除组件构建成功， 敲除组件的序列为 SEQ ID NO:1 所示 ： 0040 GCTAAAACTATCATGGCTCTAGCTATCTCCCACGAGGATACTCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTG。
19、CACC ATATGGACATATTGTCGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGA CACTATAGAACGCGGCCGCCAGCTGAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTA TGCTATACGAAGTTATTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGG AGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTG。
20、TCGCCCGTACATTTAG CCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTC CTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGA GAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGT TCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAGGAAAAGACTCA。
21、CGTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAAC ATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTA TGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGG TCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGG TTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCC。
22、AGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGT TGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTAT TTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGC TGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGA 说 明 书 CN 104293687 A 5 4/。
23、5 页 6 TTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAG ACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAA AAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGTACT GACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTA。
24、GTTGTTCTATTTTAATC AAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAA TATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCAGTGTCG AAAACGAGCTCTCGAGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTGATATCAGATCC ACTAGTGGCCTATGCGGCCGCGGATCTGCCGGTCTCCCTATAGTGAGT。
25、CGTATTAATTTCGATAAGCCAGGTTAACC TGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGTTCATTTGCTCAGAATCTTGCATTATAA TTACATTTTATTT 0041 实施例 2 ARX1 基因敲除菌株的构建 0042 (1) 酿 酒 酵 母 菌 体 细 胞 ： 挑 取 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae) BY4741(MATa ； his31 ； leu20 ； met150 ； ura30 ； 购自 ATCC， 编号 ATCC201388) 接种至 20ml YPAD液体。
26、培养基中， 30、 200rpm培养12-16h。 吸取1ml培养液转接到25ml 2YPAD 液体培养基中， 30、 200rpm 培养 2-3h(OD600 值为 3)， 然后取 1ml 培养液离心， 沉淀用无菌 水洗两遍， 获得菌体细胞。 0043 (2)ARX1基因缺失的酿酒酵母菌株构建 ： 将步骤(1)制备的菌体细胞108个， 10mg/ ml 鲑鱼精 DNA( 沸水煮 10min， 置于冰水混合物冷却 )50l， 500g/l 的 PEG3350 为 240l， 1.0M 醋酸锂溶液 36l， 扩增产物片段 25l( 实施例 1 制备 ) 混合， 枪头吹打混匀， 30培 养半小时后。
27、， 42水浴热击 40min， 12000rpm 离心 1min， 去上清， 沉淀用 1ml YPD 液体培养 基重悬， 30、 120rpm 培养 2-3h， 吸取 100l 培养液涂布于含终浓度 300g/ml 的新霉素 (geneticin,G418 ； 购自默克公司 ) 的 YPD 平板， 30培养 2 天后， 平板上长出来的菌落用 酵母基因组提取试剂盒 (Thermo Fisher Scientifi c) 提取基因组。设计转化子验证引物两 对 ： 敲除验证引物 (KS 和 AARX1) ； ARX1 基因内部引物 (ARX1-S 和 ARX1-A)。 0044 引物 KS 为 5-。
28、GATCGCGTATTTCGTCTCG-3 ； 0045 引物 AARX1 为 5-TAATCAGCTTCGGCGGT AT-3 ； 0046 引物 ARX1-S 为 5-TGG ACAAATCGC ACAAACT-3 ； 0047 引物 ARX1-A 为 5-GAATGGATA AACGCCTTGT-3。 0048 以基因组为模板进行 PCR 扩增， 反应体系为 ： 2taq 酶 10l， 引物 1l， 模板 1l， ddH2O 8l， PCR 反应条件为 ： 94预变性 5min ； 94变性 30s ； 51.9和 50.5退火 30s ； 72延伸 1.5min。通过 PCR 的方法进。
29、行验证， 电泳后 ARX1 基因内部引物 (ARX1-S 和 ARX1-A) 无条带， 而敲除验证引物 (KS 和 AARX1) 的单一条带为 1129bp， 判断为 ARX1 基因缺 失的酿酒酵母菌株， 命名为酿酒酵母菌株 BYarx1。同样条件下以等量无菌水替代扩增产 物片段作为对照。 0049 实施例 3 乙酸耐受性和发酵性能比较 0050 (1) 从斜面上挑取酿酒酵母 BY4741 和酿酒酵母 BYarx1 菌株分别接种至 25ml YPD 液体培养基中， 30过夜培养， 用无菌水将菌体调整到 3107cells/ml， 并依此 10 倍稀 释 2 个梯度。用移液枪吸取 4l 点样于 。
30、YPD 平板 ( 对照 ) 和含 3.5g/l 乙酸的 YPD 平板， 点样后 30恒温培养箱中培养观察。图 3 显示 ARX1 敲除菌株 BYarx1 在含乙酸的 YPD 平 说 明 书 CN 104293687 A 6 5/5 页 7 板上的生长明显优于出发菌株 BY4741。 0051 (2)吸取步骤(1)中BY4741和BYarx1在30培养过夜后的菌液， 6000r/min离 心， 将菌体接种至发酵培养基中 (250ml 锥形瓶， 每瓶 100ml 培养基， 组成 ： 100g/l 葡萄糖， 10g/l蛋白胨， 5g/l酵母膏， 3.5g/l乙酸， 溶剂为去离子水， pH值为4.5)。
31、， 接种后发酵液初始 菌浓度为 1OD， 34、 80rpm 摇床培养， 每隔 8h 对锥形瓶进行称重。图 4 为绘制的时间 -CO2 失重曲线。 结果显示菌株BYarx1的发酵延滞期明显短于出发菌株BY4741， 发酵时间缩短 24 小时左右。 说 明 书 CN 104293687 A 7 1/7 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 104293687 A 8 2/7 页 9 0003 序 列 表 CN 104293687 A 9 3/7 页 10 0004 序 列 表 CN 104293687 A 10 4/7 页 11 0005 序 列 表 CN 104293687 A 11 5/7 页 12 0006 序 列 表 CN 104293687 A 12 6/7 页 13 0007 序 列 表 CN 104293687 A 13 7/7 页 14 序 列 表 CN 104293687 A 14 1/2 页 15 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104293687 A 15 2/2 页 16 图 4 说 明 书 附 图 CN 104293687 A 16 。