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1、(10)申请公布号 CN 104293916 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293916 A (21)申请号 201410466632.7 (22)申请日 2014.09.12 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 广东华美众源生物科技有限公司 地址 528000 广东省佛山市禅城区季华二路 国家火炬创新创业园 申请人 无锡中德美联生物技术有限公司 (72)发明人 郑卫国 胡琦 王於建 杜蔚安 孟祥和 郭育林 葛海鹏 高静 王邦超 (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 44205 代理人 郑莹 (54) 发明名称 一种 G6PD 缺。
2、乏症基因检测试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种 G6PD 缺乏症基因检测试 剂盒， 包括 ： 片段扩增引物及其复合扩增体系 ； 检测 G6PD 突变 SNP 位点的探针 （分为特异探 针和共用探针） ； 还包括标签连接反应模板 （包 括特异外挂结合区和标签探针结合区） 、 标签探针 （可带有不同荧光标记） 、 连接反应体系。本发明选 择G6PD缺乏症的致病基因g6pd为检测对象， 可直 接对受测试者的基因型进行确诊， 显著降低女性 杂合子的漏诊率， 测试准确性超过其他常规测试 方法。另外， 本发明的最短测试时间仅 3 小时， 是 一种高效、 准确、 操作简便的新型 G6PD 缺乏症诊 断。
3、办法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 10 页 序列表 8 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书10页 序列表8页 附图5页 (10)申请公布号 CN 104293916 A CN 104293916 A 1/3 页 2 1. 一种 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒含有 ： 用于特异性扩增 G6PD基因上 7 个多态性位点的引物对、 用于检测各多态性位点的探针、 标签探针和标签连 接反应模板 ； 所述7个多态性位点为 ： 1388、 1376、 1024、 1004、 871、 95。
4、、 392 ； 所述用于检测各 多态性位点的探针包括 ： 共用探针、 分型识别探针 ； 所述分型识别探针包括野生型特异探 针和突变型特异探针。 2. 根据权利要求 1 所述的 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒， 其特征在于， G6PD 基因上 7 个 多态性位点对应的引物对如下表所示 ： 。 3. 根据权利要求 1 所述的 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒， 其特征在于， 所述分型探针从 5 至 3 端依次为多态性位点特异结合区、 长度调整区， 所述长度调节区是通过不同的序列 长度来指示不同位点的不同基因型 ； 所述共用探针从 5 至 3 端依次为外挂区、 共用识别 区， 所述外挂区的作用是与标签。
5、连接反应模板右侧特异性结合。 4. 根据权利要求 1 所述的 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒， 其特征在于， 所述分型探针从 5 至 3 端依次为 ： 外挂区、 长度调整区、 多态性位点特异结合区， 所述外挂区的作用是与标 签连接反应模板右侧特异性结合， 所述长度调节区是通过不同的序列长度来指示不同位点 的不同基因型 ； 所述共用探针包括靶序列特异接合区。 5. 根据权利要求 1 或 3 或 4 所述的 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒， 其特征在于， 所述分 型探针 5 端第 2-5 位可以引入单碱基突变， 或者是在探针序列中加入锁核酸 （LNA） 或肽核 酸 （PNA） 修饰， 以提高连接酶。
6、识别的特异性。 6. 根据权利要求 1 所述的 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒， 其特征在于， 所述用于检测各 多态性位点的探针如下表所示 ： 权 利 要 求 书 CN 104293916 A 2 2/3 页 3 F 代表上游共用探针， W 代表野生型特异探针， M 代表突变型特异探针。 7. 根据权利要求 1 或 3 或 4 或 6 所述的 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒， 其特征在于， 所 述共用探针和分型识别探针进行 5 磷酸化处理。 8. 根据权利要求 1 所述的 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒， 其特征在于， 所述标签连接反 应模板是由两段人工序列组成的寡核苷酸序列， 左侧部分作用是。
7、与标签探针特异结合， 右 侧部分是与共用探针或分型识别探针的外挂序列特异结合 ； 所述标签探针是指用荧光染料 标记的一段寡核苷酸序列， 其作用是与标签连接反应模板中的左侧特异结合， 所述荧光染 料可以是 FAM、 HEX、 TAMARA、 ROX、 Siz 或 vig。 9. 根据权利要求 1 或 8 所述的 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒， 其特征在于， 所述标签探 针的序列如下所示 ： AGTGCCAGCAAGATCCAATCTCA ； 所述标签连接反应模板序列如下所示 ： tc caacccttagggaacccTGAGATTGGATCTTGCTGGCACT。 权 利 要 求 书 CN 。
8、104293916 A 3 3/3 页 4 10.根据权利要求1所述的G6PD缺乏症基因检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中还 含有 PCR 复合扩增体系和连接反应体系。 权 利 要 求 书 CN 104293916 A 4 1/10 页 5 一种 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒 技术领域 0001 本发明属于生物体外诊断技术领域， 具体涉及一种 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒。 背景技术 0002 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶 (glucose-6-phosphate dehydroge-nase,G6PD) 缺乏症 是全球最常见的一种遗传性 X 连锁不完全显性酶缺乏症。全球约 4 亿人罹。
9、患此病。G6PD 基因位于 X 染色体， 基因长约 18Kb， 有 13 个外显子和 12 个内含子， 由 515 个氨基酸组成。 我国是 G6PD 缺乏症高发区之一， 呈南高北低的分布特点， 患病率为 0.2-44.8。主要分 布在长江以南各省， 以海南、 广东、 广西、 云南、 贵州、 四川等省为高。迄今全球已发现 G6PD 基因突变型 126 种， 在我国发现过其中 15 种 ： 1376GT、 1388GA、 95AG、 1311CT、 392GT、 1024CT、 592CT、 1004CT、 493AG、 487GA、 1360CT、 835AT、 1381GA、 1387GT、 。
10、871GA。 本 发明选取了其中7种高致病型位点(1388GA、 1376GT、 1024CT、 1004CT、 871GA、 95AG以 及 392GT) 进行检测。 0003 G6PD缺乏症发病原因是由于G6PD基因突变， 导致G6PD酶活性降低， 红细胞不能抵 抗氧化损伤而遭受破坏， 引起溶血性贫血。其临床表现与一般溶血性贫血大致相同。分新 生儿黄疸、 蚕豆病、 药物性溶血、 感染性溶血、 非球形细胞溶血性贫血等临床类型。 本病临床 表现的轻重程度不同， 多数患者， 特别是女性杂合子， 平时不发病， 无自觉症状， 部分患者可 表现为慢性溶血性贫血症状。 G6PD缺乏症同时也是新生儿病理性。
11、黄疸的主要原因。 据中山 医大的一项统计表明， 患 G6PD 缺乏症的新生儿中， 约 50的患儿会出现新生儿黄疸， 其中 约 12可发展为核黄疸， 导致脑部损害， 引起智力低下。 0004 G6PD 基因定位于 X 染色体长臂 2 区 8 带 (Xq28)， 一旦发生突变， 男性患者均表现 为 G6PD 严重缺乏 ； 女性患者拥有 2 条 X 染色体， 若两条染色体都有 G6PD 基因缺陷， 也表现 为 G6PD 严重缺乏 ； 若只有一条染色体 G6PD 基因缺陷， 则临床表现变化很大， G6PD 酶的活性 可能从正常到完全缺乏， 这将给检测带来极大的难度。 0005 多年来， G6PD 缺乏。
12、症的检测方法在不断更新， 目前主要有 ： 四氮唑蓝纸片定性法、 变性珠蛋白小体生成试验、 高铁血红蛋白还原试验 (MHb-RT)、 荧光斑点法 (FST)、 G6PD 活性 测定等检测方法。这些方法操作简便、 价格低廉， 但是准确性不高， 极易产生假阳性或假阴 性， 尤其在测试女性杂合子时， 很容易发生漏诊。 发明内容 0006 鉴于目前市面上 G6PD 缺乏症的检测方法普遍存在准确性低、 高成本、 操作复杂等 缺点， 本发明旨在提供一种准确性高、 低成本、 操作简便的检测试剂盒， 以弥补现有检测方 法容易漏诊女性杂合子的情况， 帮助检出 G6PD 缺乏症携带者并对他们进行及时地治疗， 为 优。
13、生优育、 提高国民身体素质做出一份贡献。 0007 本发明所采取的技术方案是 ： 0008 一种G6PD缺乏症基因检测试剂盒， 其含有 ： 用于特异性扩增G6PD基因上7个多态 说 明 书 CN 104293916 A 5 2/10 页 6 性位点的引物对、 用于检测各多态性位点的探针、 标签探针和标签连接反应模板 ； 所述 7 个 多态性位点为 ： 1388、 1376、 1024、 1004、 871、 95、 392 ； 所述用于检测各多态性位点的探针包 括 ： 共用探针、 分型识别探针 ； 所述分型识别探针包括野生型特异探针和突变型特异探针。 0009 G6PD 基因上 7 个多态性位。
14、点对应的引物对如下表所示 ： 0010 0011 所述分型探针从 5 至 3 端依次为多态性位点特异结合区、 长度调整区， 所述长度 调节区是通过不同的序列长度来指示不同位点的不同基因型 ； 所述共用探针从 5 至 3 端 依次为外挂区、 共用识别区， 所述外挂区的作用是与标签连接反应模板右侧特异性结合。 0012 所述分型探针从 5 至 3 端依次为 ： 外挂区、 长度调整区、 多态性位点特异结合区， 所述外挂区的作用是与标签连接反应模板右侧特异性结合， 所述长度调节区是通过不同的 序列长度来指示不同位点的不同基因型 ； 所述共用探针包括靶序列特异接合区。 0013 所述分型探针 5 端第 。
15、2-5 位可以引入单碱基突变， 或者是在探针序列中加入锁核 酸 (LNA) 或肽核酸 (PNA) 修饰， 以提高连接酶识别的特异性。 0014 所述用于检测各多态性位点的探针如下表所示 ： 0015 说 明 书 CN 104293916 A 6 3/10 页 7 0016 F 代表上游共用探针， W 代表野生型特异探针， M 代表突变型特异探针。 0017 所述共用探针和分型识别探针进行 5 磷酸化处理。 0018 所述标签连接反应模板是由两段人工序列组成的寡核苷酸序列， 左侧部分作用是 与标签探针特异结合， 右侧部分是与共用探针或分型识别探针的外挂序列特异结合 ； 所述 标签探针是指用荧光染。
16、料标记的一段寡核苷酸序列， 其作用是与标签连接反应模板中的左 侧特异结合， 所述荧光染料可以是 FAM、 HEX、 TAMARA、 ROX、 Siz 或 vig。 0019 所述标签探针的序列如下所示 ： AGTGCCAGCAAGATCCAATCTCA ； 所述标签连接反应 说 明 书 CN 104293916 A 7 4/10 页 8 模板序列如下所示 ： tccaacccttagggaacccTGAGATTGGATCTTGCTGGCACT。 0020 所述试剂盒中还含有 PCR 复合扩增体系和连接反应体系。 0021 本发明的有益效果是 ： 0022 (1)本发明能够准确判别受检人员的基因。
17、型， 明确他们是杂合突变或纯合突变。 可 降低漏诊杂合突变携带者的概率。 0023 (2) 本发明中的 PCR 扩增体系， 可以免除提取 DNA 的步骤， 直接从血滤纸、 FTA 卡、 唾液卡等检材上扩增出待测片段， 省时省力。 0024 (3) 基于高效特异多重连接反应进行的 SNP 检测准确性得到显著提高。 0025 (4) 为了提高连接酶连接的特异性， 本发明在特异探针的 5 端第 2 至 4 个碱基处 人为引入单碱基错配 ( 如图 3a 所示 )。人为引入单碱基错配的原则是 ： 若 5 端为中等错配 (A-A， C-C， G-G， T-T)， 则需引入中等错配， 若 5 端是强错配 (。
18、G-A， T-C) 则引入弱错配 (G-T， A-C) ； 若 5 端为弱错配， 则引入强错配。同理， 特异探针的 3 端第 2 至 4 个碱基处也可以 按照引入单碱基错配原则进行修饰 ( 如图 3b 所示 )， 以提高连接酶连接的特异性。 0026 (5) 多种荧光标签探针与毛细管电泳结合使用， 一次电泳可以同时检测 5 位受检 人员， 检测效率高。 附图说明 0027 图 1 是一种 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒检测位点的排布图 ； 0028 图 2 是探针结构原理示意图， 其中 a 是待测 SNP 位点位于共用探针 5 末端时的原 理示意图 ； b 是待测 SNP 位点位于特异探针 3。
19、 末端时的原理示意图 ； 0029 图3是人为引入单碱基突变的示意图， 其中a是共用探针引入单碱基突变示意图， b 是特异探针引入单碱基突变示意图 ； 0030 图 4 是 95AG 的毛细管电泳结果图， 其中 a 是未引入单碱基突变时的电泳结果 ； b 是引入单碱基突变后的电泳结果 ； 0031 图 5 是高效特异多重连接反应检测 SNP 原理示意图 ； 0032 图6是本发明实施例检测G6PD基因野生型的样本结果示例， 被测试基因型均为W/ W， 被测试者患病概率与人群中患病概率一致， 患病可能性很小 ； 0033 图7是本发明实施例是人工构建的G6PD基因突变的样本结果示例， 被测试基因。
20、型 均为 M/M， 为阳性参照品 ； 0034 图8是本发明实施例检测出单一G6PD基因杂合突变的样本结果示例， 其突变基因 型为 871W/M， 被测试者是携带者， 需要进一步检测确定是否患病 ； 0035 图9是本发明实施例检测出双G6PD基因杂合突变的样本结果示例， 其突变基因型 为 95W/M， 1388W/M ； ， 被测试者是患病者 ； 0036 图 10 是本发明实施例检测出单一 G6PD 基因纯合突变的样本结果示例， 其突变基 因型为 1024M/M， 被测试者是患病者。 具体实施方式 0037 下面结合实施例对本发明作进一步的说明， 但并不局限于此。 0038 实施例 说 明。
21、 书 CN 104293916 A 8 5/10 页 9 0039 一、 本发明所针对的 G6PD 基因上 7 个多态性位点的信息如下 ： 0040 本发明所选的 G6PD 基因多态性位点包括 ： 1388G A、 1376G T、 1024C T、 1004C T、 871G A、 95A G、 392G T。各位点的排布如图 1 所示。这 7 个检测位点涵 盖了致病因素的 86以上。 0041 二、 检测试剂盒的主要成分 ： 0042 1、 针对 7 个多态性位点的扩增引物 ： 0043 0044 F 表示上游引物 ； R 表示下游引物。其中 1388 和 1376 位点相距较近， 可在同。
22、一个 扩增片段上检测 ； 1024、 1004、 871 也可以在同一个扩增片段上检测， 所以它们共用片段扩 增引物。 0045 2、 针对多态性位点的探针 ： 0046 0047 说 明 书 CN 104293916 A 9 6/10 页 10 0048 F 表示共用探针， 以待测 SNP 位点位于特异探针 5 末端为例， 共用探针由外挂区 ( 可与标签连接反应模板的左侧外挂探针结合区碱基互补的一段外源序列， 已用小写字母 标记 ) 和共用识别区构成。 0049 分型识别探针， 以待测 SNP 位点位于其 5 末端为例， 包括特异野生型探针 (W) 和 特异突变型探针 (M)， 探针中的长度。
23、调整区已用小写字母标记， 以区别检测条带的大小， 每 组的 M 均比 W 大 3bp。 0050 共用探针和分型识别探针探针进行 5 磷酸化处理。 0051 为了进一步增加连接的特异性， 可在下游探针 5 第 2-5 个碱基上引入错配 ( 在 5 第 3 位引入单碱基错配为例 )， 引入的错配遵循以下原则 ： 若 5 端为中等错配 (A-A， C-C， G-G， T-T)， 则需引入中等错配 ； 若 5 端是强错配 (G-A， T-C) 则引入弱错配 (G-T， A-C) ； 若 说 明 书 CN 104293916 A 10 7/10 页 11 5 端为弱错配 (G-T， A-C)， 则引入。
24、强错配 (G-A， T-C)。 0052 3、 标签连接反应模板和标签探针 0053 0054 标签连接模板中用小写字母表示的是外挂结合区， 大写字母部分是标签探针结合 区 ； 标签探针 5 端被不同的荧光基团 (* 表示荧光基团 ) 所修饰。 0055 4、 复合扩增体系 0056 0057 5、 连接体系 ： 0058 0059 三、 本发明试剂盒的具体实施步骤 ： 0060 1、 样本 DNA 的提取 0061 根据样本的实际情况， 选择合适的方法提取样本 DNA， 常见的方法有 ： 磁珠法、 碱 裂解法、 阴离子交换树脂法等等。若是样本是以血滤纸、 FTA 卡、 唾液卡等形式存在时， 。
25、可简 化步骤， 取适量检材直接扩增。需要注意的是， 不论是提取 DNA 样本或是直接扩增检材， 当 用于片段复合扩增时， 需保证每个反应中 DNA 含量达到 0.1-2.0ng。 0062 2、 片段复合扩增 0063 分别在待测 SNP 位点上下游 200 至 300bp 处设计合适的片段扩增引物， 通过琼脂 说 明 书 CN 104293916 A 11 8/10 页 12 糖电泳测试各个引物的特异性及扩增效率 ； 将通过检测的片段扩增引物组合成复合扩增引 物。按照下表在 200L PCR 管中配置复合扩增体系反应液。配置完成后， 将 PCR 管在涡旋 震荡器上震荡混匀， 并瞬时离心。 0。
26、064 复合扩增体系 ： 0065 0066 按下表设定扩增程序， 最后将反应体系体积设定为 25L， 启动程序。 0067 扩增程序 ： 0068 0069 3、 高效特异多重连接反应 0070 按下表配置反应所需的各种组分。体系中的 probes 指的是 5 磷酸化处理的左侧 和共用探针， 在一个反应中， 两者分别加入 0.2L， 总计 0.4L。按下表在 200L PCR 管 中配置高效特异多重连接反应体系。配置完成后， 将 PCR 管震荡混匀， 并瞬时离心。 0071 连接体系 ： 0072 0073 将 PCR 管放入 PCR 仪， 设定连接程序， 最后将反应体系体积设定为 10L，。
27、 启动程 序， 进行高效特异多重连接反应。 0074 连接程序 ： 说 明 书 CN 104293916 A 12 9/10 页 13 0075 0076 如图 4 实施例所示未引入单碱基错配时， G6PD-95-M-R 引物由于结合效率较高， 所 以当待测人员是 W 纯合子时， 会出现代表 SNP 突变的 M 峰， 容易产生诊断错误 ； 引入单碱基 错配后， 降低了 G6PD-95-M-R 的结合效率， 提高了诊断的准确性。具体引物序列如下 ( 共用 探针序列中的小写字母表示外挂区， 特异探针序列中的小写字母表示长度调整区 ) ： 0077 0078 0079 表示引入突变的位点。 0080。
28、 4、 电泳检测 0081 12.0L去离子甲酰胺与0.5L分子量内标混合。 再加入1.0L连接产物， 涡旋 混匀 2000r/min 离心 1min， 除去溶液内的气泡， 用遗传分析仪进行电泳检测。 0082 结果检测时， 也可以不局限于毛细管荧光电泳， 根据实际情况选择合适的电泳方 法即可， 如 PEAG 胶电泳等。 0083 实施例 2 0084 1、 标准图谱的建立 0085 利用实施 1 的试剂盒和方法对已知 G6PD 基因野生型样本 7 个位点进行检测， 检测 说 明 书 CN 104293916 A 13 10/10 页 14 图谱见图 6。利用实施 3 的方法对已知 PKU 基。
29、因突变型样本 7 个位点进行检测， 检测图谱见 图 7。 0086 2、 实际应用例 0087 利用实施例 3 的方法对样品 1-3 进行检测， 检测结果分别见图 8-10。由检测结果 可知， 样品 1 突变基因型为 871W/M ； 样品 2 突变基因型为 95W/M， 1388W/M ； 样品 31024M/M。 以上检测结果均与序列测序结果相一致， 表明本发明的试剂盒及检测方法具有准确性高、 高通量的优点。 0088 以上实施例仅为介绍本发明的优选案例， 对于本领域技术人员来说， 在不背离本 发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进， 都应被视为本发明的一部分。 说 明 书 CN。
30、 104293916 A 14 1/8 页 15 广东华美众源生物科技有限公司 ； 无锡中德美联生物技术有限公司 一种 G6PD 缺乏症基因检测试剂盒 34 PatentIn version 3.5 1 20 DNA 人工序列 1 tggagcccag agccagcagt 20 2 20 DNA 人工序列 2 tagcaggagc gggaggagga 20 3 22 DNA 人工序列 3 caggcagtgg catcagcaag ac 22 4 23 DNA 人工序列 4 aggtgccctc atactggaaa ccc 23 序 列 表 CN 104293916 A 15 2/8 页。
31、 16 5 23 DNA 人工序列 5 ctcaacaccc aaggagccca ttc 23 6 23 DNA 人工序列 6 aaggcatcac ctaccatccc acc 23 7 20 DNA 人工序列 7 ggcagaacac acacggactc 20 8 20 DNA 人工序列 8 aacaccgcct ttccgctctg 20 9 43 DNA 人工序列 9 gggttcccta agggttggaa tgccttccat cagtcggata cac 43 序 列 表 CN 104293916 A 16 3/8 页 17 10 45 DNA 人工序列 10 acctat。
32、tcat catcatgggt gcatctcaca ttaattgcgt tgcgc 45 11 48 DNA 人工序列 11 gcctattcat catcatgggt gcatctcaca ttaattgcgt tgcgctca 48 12 43 DNA 人工序列 12 gggttcccta agggttggac ccttggcttt ctctcaggtc aag 43 13 51 DNA 人工序列 13 gtgttgaaat gcatctcaga ggtgctcaca ttaattgcgt tgcgctcact g 51 14 54 DNA 人工序列 14 atgttgaaat gca。
33、tctcaga ggtgctcaca ttaattgcgt tgcgctcact gccc 54 序 列 表 CN 104293916 A 17 4/8 页 18 15 43 DNA 人工序列 15 gggttcccta agggttggac cgggcatgtt cttcaacccc gag 43 16 57 DNA 人工序列 16 gagtcggagc tggacctgac ctacctcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgct 57 17 60 DNA 人工序列 17 tagtcggagc tggacctgac ctacctcaca ttaattgcgt tgc。
34、gctcact gcccgctttc 60 18 43 DNA 人工序列 18 gggttcccta agggttggac ggtgccccgc gggtccacca ccg 43 19 63 DNA 人工序列 19 序 列 表 CN 104293916 A 18 5/8 页 19 ccacttttgc agccgtcgtc ctctctcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 60 cag 63 20 66 DNA 人工序列 20 tcacttttgc agccgtcgtc ctctctcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgcttt。
35、c 60 cagtcg 66 21 43 DNA 人工序列 21 gggttcccta agggttggat tcaaccccga ggagtcggag ctg 43 22 69 DNA 人工序列 22 gacctgacct acggcaacag atacctcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 60 cagtcggga 69 23 72 DNA 人工序列 23 aacctgacct acggcaacag atacctcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 60 cagtcgggaa ac 72 序 列 表 CN 104。
36、293916 A 19 6/8 页 20 24 43 DNA 人工序列 24 gggttcccta agggttggaa ccgccacttt tgcagccgtc gtc 43 25 75 DNA 人工序列 25 ctctatgtgg agaatgagag gtggctcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 60 cagtcgggaa acctg 75 26 78 DNA 人工序列 26 ttctatgtgg agaatgagag gtggctcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 60 cagtcgggaa acctg。
37、tcg 78 27 43 DNA 人工序列 27 gggttcccta agggttggag ccacatgaat gccctccacc tgg 43 28 序 列 表 CN 104293916 A 20 7/8 页 21 81 DNA 人工序列 28 ggtcacaggc caaccgcctc ttctctcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 60 cagtcgggaa acctgtcgtg c 81 29 84 DNA 人工序列 29 tgtcacaggc caaccgcctc ttctctcaca ttaattgcgt tgcgctcact gccc。
38、gctttc 60 cagtcgggaa acctgtcgtg ccag 84 30 42 DNA 人工序列 30 tccaaccctt agggaaccct gagattggat cttgctggca ct 42 31 23 DNA 人工序列 31 agtgccagca agatccaatc tca 23 32 43 DNA 人工序列 序 列 表 CN 104293916 A 21 8/8 页 22 32 gggttcccta agggttggaa tgccttccat cagtcggata cac 43 33 45 DNA 人工序列 33 acctattcat catcatgggt gca。
39、tctcaca ttaattgcgt tgcgc 45 34 48 DNA 人工序列 34 gcctattcat catcatgggt gcatctcaca ttaattgcgt tgcgctca 48 序 列 表 CN 104293916 A 22 1/5 页 23 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104293916 A 23 2/5 页 24 图 3 说 明 书 附 图 CN 104293916 A 24 3/5 页 25 图 4 说 明 书 附 图 CN 104293916 A 25 4/5 页 26 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 104293916 A 26 5/5 页 27 图 8 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 104293916 A 27 。