《一种大肠杆菌色氨酸酶突变体及其编码基因.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种大肠杆菌色氨酸酶突变体及其编码基因.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 104263714 A (43)申请公布日 2015.01.07 CN 104263714 A (21)申请号 201410494789.0 (22)申请日 2014.09.24 C12N 9/88(2006.01) C12N 15/60(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12Q 1/527(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人 安徽丰原发酵技术工程研究有限公 司 地址 233030 安徽省蚌埠市淮上区怀五路南 侧 (72)发明人 徐斌 杨为华 邓远德 杨金环 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 。
2、公司 11002 代理人 王文君 (54) 发明名称 一种大肠杆菌色氨酸酶突变体及其编码基因 (57) 摘要 本发明通过易错 PCR 的方法对野生型色氨酸 酶基因进行改造， 得到了一种大肠杆菌色氨酸酶 突变体， 该色氨酸酶突变体的酶活力相对于出发 菌株提高了 120 倍。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表4页 (10)申请公布号 CN 104263714 A CN 104263714 A 1/1 页 2 1.一种大肠杆菌色氨酸酶突变体， 其氨基酸序列如SEQ。
3、 ID NO.1所示或该序列经替换、 缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由 SEQ ID NO.1 衍生的氨基酸序列。 2. 编码权利要求 1 所述大肠杆菌色氨酸酶突变体的基因。 3. 根据权利要求 2 所述的基因， 其特征在于， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 4. 含有权利要求 2 或 3 所述基因的载体。 5. 含有权利要求 2 或 3 所述基因或权利要求 4 所述载体的宿主细胞。 6. 权利要求 1 所述色氨酸酶突变体的筛选方法， 其特征在于， 具体包括以下步骤 : (1) 从 E.coli JM109 基因组 DNA 中， 利用引物扩增色氨酸酶的编码基因 ； 。
4、(2) 采用易错 PCR 技术， 以色氨酸酶的编码基因为模板， 扩增获得色氨酸酶突变体基 因 ； (3) 将步骤 (2) 所得易错 PCR 产物及表达质粒 pET28a+ 用 Sac I 和 Not I 双酶切后连 接， 连接产物转入大肠杆菌 BL21 感受态细胞， 涂布至含卡那霉素的 LB 平板， 将平板置 37 恒温培养箱培养， 即得构建好的重组色氨酸酶基因突变库 ； (4)LB 平板上长出菌落， 挑取其中的 100 个单克隆， 转接到 LB 液体培养基中， 37摇床 培养， 待菌液OD600长至0.5时， 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导， 37摇床继续培养2h后， 收集菌体， 超声。
5、破碎， 测定色氨酸酶突变体酶活， 挑选酶活力最高的一株。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 (1) 中的引物为 ： 正向引物 ： 5 -GATCGAGCTCATGGAAAACTTTAAACATCTCC-3 ； 反向引物 ： 5 -GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGTTTTGC-3 。 8. 权利要求 1 所述色氨酸酶突变体的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (1) 利用引物 PCR 扩增色氨酸酶突变体基因 ； (2) 将步骤 (1) 所得 PCR 产物连接表达载体 pET-28a(+) ； (3) 连接产物转入大肠杆菌感受态细胞， 获得。
6、表达产物。 9. 根据权利要求 8 所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 (1) 中所用引物为 ： 正向引物 ： 5 -GATCGAGCTCATGGAAAACTTTAAACATCTCC-3 ； 反向引物 ： 5 -GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGTTTTGC-3 。 权 利 要 求 书 CN 104263714 A 2 1/4 页 3 一种大肠杆菌色氨酸酶突变体及其编码基因 技术领域 0001 本发明涉及生物技术制药领域， 具体地， 涉及一种大肠杆菌色氨酸酶突变体及其 编码基因。 背景技术 0002 L- 色氨酸是人和动物体内的重要必需氨基酸， 在医药、 食品和饲料添。
7、加剂等方面 具有广泛的用途。 其生产方法主要有蛋白水解提取法、 化学合成法、 微生物发酵法和酶促转 化法四种， 其中酶促转化法是目前较为有效的工业化方法。转化途径主要涉及色氨酸合成 酶及色氨酸酶， 二者均可催化 L- 丝氨酸和吲哚合成 L- 色氨酸。但吲哚对前者具有强烈的 抑制作用， 而色氨酸酶对吲哚具有良好的稳定性， 因此近年来人们更为关注色氨酸酶， 并将 其用于 L- 色氨酸的生物合成。 发明内容 0003 为了解决现有技术中存在的问题， 本发明目的是提供一种大肠杆菌色氨酸酶突变 体及其编码基因。 0004 本发明提供一种大肠杆菌色氨酸酶突变体， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所。
8、示或 该序列经替换、 缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由 SEQ ID NO.1 衍生的氨 基酸序列。 0005 所述色氨酸酶突变体与野生型的色氨酸酶相比， 具体的氨基酸序列的改变是 ： T60A( 第 60 位苏氨酸变为丙氨酸 )， V188Y( 第 188 位缬氨酸变为酪氨酸 )， A272S( 第 272 位丙氨酸变为丝氨酸 )， I348P( 第 348 位异亮氨酸变为脯氨酸 )。 0006 本发明还提供了编码所述大肠杆菌色氨酸酶突变体的基因。 0007 进一步地， 所述基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 0008 本发明还提供了含有所述基因的载体。 0009。
9、 本发明还提供了含有所述基因或所述载体的宿主细胞。 0010 本发明还提供了前述大肠杆菌色氨酸酶突变体的筛选方法， 包括以下步骤 : 0011 (1) 从 E.coli JM109 基因组 DNA 中， 利用引物扩增色氨酸酶的编码基因 ； 0012 (2) 采用易错 PCR 技术， 以色氨酸酶的编码基因为模板， 扩增获得色氨酸酶突变体 基因 ； 0013 (3) 将步骤 (2) 所得易错 PCR 产物及表达质粒 pET28a+ 用 Sac I 和 Not I 双酶切 后连接， 连接产物转入大肠杆菌 BL21 感受态细胞， 涂布至含卡那霉素的 LB 平板， 将平板置 37恒温培养箱培养， 即得构。
10、建好的重组色氨酸酶基因突变库 ； 0014 (4)LB 平板上长出菌落， 挑取其中的 100 个单克隆， 转接到 LB 液体培养基中， 37 摇床培养， 待菌液 OD600长至 0.5 时， 加入终浓度为 0.1mM 的 IPTG 诱导， 37摇床继续培养 2h 后， 收集菌体， 超声破碎， 测定色氨酸酶突变体酶活， 挑选酶活力最高的一株， 并测定其基 因序列， 分别为 SEQ ID NO.2 所示的基因序列和 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列。 说 明 书 CN 104263714 A 3 2/4 页 4 0015 更进一步地， 所述步骤 (1) 中的引物为 ： 0016 正向引物 。
11、： 5 -GATCGAGCTCATGGAAAACTTTAAACATCTCC-3 ； 0017 反向引物 ： 5 -GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGTTTTGC-3 。 0018 本发明还提供了前述色氨酸酶突变体的制备方法， 包括以下步骤 ： 0019 (1) 利用引物 PCR 扩增色氨酸酶突变体基因 ； 0020 (2) 将步骤 (1) 所得 PCR 产物连接表达载体 pET-28a(+) ； 0021 (3) 连接产物转入大肠杆菌感受态细胞， 获得表达产物。 0022 进一步地， 所述步骤 (1) 中所用引物为 ： 0023 正向引物 ： 5 -GATCGAGCTCAT。
12、GGAAAACTTTAAACATCTCC-3 ； 0024 反向引物 ： 5 -GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGTTTTGC-3 。 0025 本发明的有益效果在于 ： 0026 本发明通过易错 PCR 的方法对野生型色氨酸酶基因进行改造， 并且构建了高效表 达载体， 重组表达的色氨酸酶活力达到了原始出发菌株色氨酸酶活力的约 120 倍， 从而为 L- 色氨酸的酶法生产奠定了良好的基础。 具体实施方式 0027 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。若 。
13、未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0028 实施例 1 色氨酸酶基因的获得 0029 以E.coli JM109基因组DNA为PCR反应模板， 根据NCBI数据库收录的E.coli K12 的色氨酸酶基因序列(序列号 ： EU569042.1)， 设计正向引物为5-GATCGAGCTCATGGAAAACT TTAAACATCTCC-3， 反向引物为 5 -GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGTTTTGC-3。其中斜 体字母部分分别为酶切位点 Sac I 和 Not I。PCR 反应在 50l 总体积中进行， 反应条件为 在 94变性 5m。
14、in 后开始循环， 然后 94变性 50s， 58退火 1min， 72延伸 2min， 共 30 个 循环后， 再于 72延伸 10min。取 3l PCR 扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证。取 100l PCR 产物做琼脂糖凝胶电泳， 按照胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。 0030 实施例 2 易错 PCR 扩增色氨酸酶基因 0031 利用Taq DNA聚合酶不具有3-5校对功能的性质， 在高镁离子浓度(5-9mmol/ L) 和不同浓度 dNTP 的浓度下 (1.5-3.5mmol/L)， 来控制随机突变的频率， 向目的基因中引 入随机突变， 构建突变库。实验中最优的突变率约为 0.5。 0。
15、032 易错 PCR 反应体系 (100l) ： 0033 说 明 书 CN 104263714 A 4 3/4 页 5 0034 PCR 程序为 ： 96预变性 4min， 94变性 1min， 56退火 1min， 75延伸 2min， 反 应 45 个循环， 最后 75延伸 15min。采用胶回收方法回收 PCR 产物。取 5l 产物 1琼脂 糖凝胶电泳检验， -20保存备用。 0035 实施例 3 色氨酸酶突变体表达载体的构建 0036 实施例 2 中 PCR 产物经限制性内切酶 Sac I 和 Not I 双酶切消化后， 与用 Sac I 和Not I内切酶消化的pET-28a(+)。
16、质粒进行连接反应， 构建的载体命名为pET-tnaAM， 然后 用连接产物 pET-tnaAM 混合物转化大肠杆菌 DH5-， 构建转化菌体突变库。 0037 实施例 4 构建表达突变库及高产量突变体的筛选 0038 提取转化菌体库的质粒， 分别转化大肠杆菌 BL21(DE3) 菌株， 获得转化子约 100 株， 构建表达突变体库。挑取突变菌株至含 100lkan LB 培养基的 96 孔板中， 37培养， 待 OD 值达 0.4-0.6， 加入 IPTG( 终浓度 0.1mmol/L)， 继续培养 2h， 收集菌体。超声破碎菌体 获得上清液， 并进行色氨酸酶的酶活力测定。 0039 色氨酸酶。
17、的酶活力检测 ： 在10mL三角瓶中分别添加20L0.2mg/mL的磷酸吡哆醛 (PLP) 溶液， 10L0.005M 的还原型谷胱甘肽 (GSH) 溶液， 270L 色氨酸酶液 ； 上述 0.3mL 溶液用 1mL 甲苯覆盖， 37保温 5min 后加入 100L5.0mg/mL 的 L- 色氨酸溶液， 置于 37 摇床轻缓振荡反应 10min， 然后添加 3mL 吲哚显色液中止反应， 混匀， 静置 30min 后于 570nm 测定吸光度。酶活力定义 ： 在上述反应条件下， 于 37， 10min 催化形成 0.001mol 吲哚所 需要的酶量为一个酶活力单位。 0040 野生型蛋白的酶活。
18、力为 36.53.2U/g， 经计算突变体蛋白的最高酶活力为 4520.5U/g， 结果表明， 通过易错PCR对色氨酸酶进行改造， 获得了酶活力提高了约120倍的 突变株。 0041 筛选酶活性最高的突变菌株， 挑选其克隆， 并提取质粒进行测序。 测定的基因序列 说 明 书 CN 104263714 A 5 4/4 页 6 为 SEQ ID NO.2 所示， 其对应编码的氨基酸序列为 SEQ ID NO.1 所示。 0042 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 104263714 A 6 1/4 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 104263714 A 7 2/4 页 8 0003 序 列 表 CN 104263714 A 8 3/4 页 9 0004 序 列 表 CN 104263714 A 9 4/4 页 10 序 列 表 CN 104263714 A 10 。