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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410768055.7 (22)申请日 2014.12.12 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 南华大学 地址 421001 湖南省衡阳市常胜西路 28 号 (72)发明人 周翠兰 徐惠芬 张安迪 李文 张佳 李凯 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 32103 代理人 范晴 (54) 发明名称 通过插入部分摇摆寡核苷酸检测基因突变耐 受能力的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种通过插入部分摇摆寡核 苷酸检测基因突变耐受能力的方法， 包括如下步 骤:采用合成的 NNT 和 / 或 NNC 串。
2、联核酸片段， 在 其末端加上限制性内切酶位点， 直接连接经酶切 处理后的载体片段， 将载体导入宿主细胞， 宿主细 胞经表达产生一系可以长度不等和序列不同的突 变核酸， 通过检验突变核酸的表达活性， 来评估检 测基因突变耐受能力。本发明具有的优点包括可 以测试待测基因是否出现碱基使用的偏向性 ； 另 外还可以测试待测基因对插入长度是否有严格限 制。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104450919 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 10445091。
3、9 A 1/1 页 2 1. 一种通过插入部分摇摆寡核苷酸检测基因突变耐受能力的方法， 其特征在于， 包括 如下步骤 ： (1) 采用合成的 NNT 和 / 或 NNC 串联核酸片段， 在其末端加上限制性内切酶的酶切位 点， (2) 直接连接经酶切处理后的载体片段。将载体导入宿主细胞， (3) 宿主细胞产生一系可以长度不等和序列不同的突变核酸， (5) 通过检验突变核酸的表达活性， 来评估检测基因突变耐受能力。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤 (1) 中合成的 NNT 和 / 或 NNC 串联核酸片段 , 其重复次数为 1-30。 3. 根据权利要求 1 所述的。
4、方法， 其特征在于， 所述的 NNT 和 / 或 NNC 中的 N 选自 A， T， C， G。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的载体为具有表达能力完整结构的 载体。 5. 一种通过插入部分摇摆寡核苷酸检测基因突变耐受能力的方法， 用来检测基因耐受 突变能力。 6. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于， 所述基因耐受突变能力是指摇摆碱基部 位在突变体中选用特定 A,T,C,G 的能力。 7. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于， 所述基因耐受突变能力是指摇摆碱基的 重复次数在突变体中的变化情况。 权 利 要 求 书 CN 104450919 A 2 1。
5、/10 页 3 通过插入部分摇摆寡核苷酸检测基因突变耐受能力的方法 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学技术领域， 具体涉及一种对靶点进行评估和筛选的方法， 特别涉及一种利用部分摇摆寡核苷酸插入检测基因突变耐受能力的方法。 背景技术 0002 锌指核酸酶 (Zinc fi nger nuclease)， 归巢核酸酶 (meganuclease)， 反因子核酸 酶(TAL nuclease)和CRISPR-Cas核酸酶等基因工程酶， 都是可以进行基因编辑的新酶类， 在基因编辑中具有十分重要的作用， 可用于物种基因的改造、 动物模型的制备、 细胞株的制 备， 以及基因治疗研究和临床应用。 00。
6、03 然而随着基因治疗研究的广泛开展， 对其剪切效率和和脱靶效应的评估问题日益 突出， 基因编辑核酸酶用于人类疾病的基因治疗其剪切效率相当于传统小分子药物工作效 率， 而其脱靶效应则相当于毒副作用， 在药物进入临床前必须予以评估。 目前缺乏高效的基 因工程酶的脱靶效应检测技术， 包括高通量测序在内的几种靶效应或酶活力检测技术可用 于检测明显的脱靶效应， 但对发生频率较低的脱靶效应， 则无法检测。 0004 然而随着基因治疗研究的不断发展， 越来越多的治疗靶点需要进行评估和筛选， 这就为基因治疗核酸酶评估方法的广泛代表性造成了困难。目前对于方法的评估， 多是采 用检验若干靶点即推断为对所有靶点的。
7、工作状态， 这类操作方法容易造成漏评的现象， 若 要做到全面评估， 则工作量巨大。 0005 因此急需开发一种具有广泛代表性的检验方法， 用于对核酸酶评估方法的评估。 本发明由此而来。 发明内容 0006 本发明所要解决的第一方面的技术问题， 在于克服现有技术中治疗靶点进行评估 和筛选存在的问题， 提供一种通过插入部分摇摆寡核苷酸检测基因突变耐受能力的方法。 0007 为了解决上述的技术问题， 本发明提供一种通过插入部分摇摆寡核苷酸检测基因 突变耐受能力的方法， 其特点在于， 包括如下步骤 ： 0008 (1)采用合成的NNT和/或NNC串联核酸片段， 在其末端加上限制性内切酶的酶切 位点， 。
8、0009 (2) 直接连接经酶切处理后的载体片段， 将载体导入宿主细胞， 0010 (3) 宿主细胞产生一系可以长度不等和序列不同的突变核酸， 0011 (5) 通过检验突变核酸的表达活性， 来评估检测基因突变耐受能力。 0012 本发明的一优选技术方案， 所述的步骤 (1) 中合成的 NNT 和 / 或 NNC 串联核酸片 段 , 其重复次数为 1-30。 0013 本发明的一优选技术方案， 所述的 NNT 和 / 或 NNC 中的 N 选自 A， T， C， G。 0014 本发明的一优选技术方案， 所述的载体为具有表达能力完整结构的载体 , 包括但 不限于质粒载体， 也可用病毒载体或其他。
9、目标基因构建的载体。 说 明 书 CN 104450919 A 3 2/10 页 4 0015 本发明的第二方面， 提供一种利用部分摇摆寡核苷酸插入检测基因突变耐受能力 的方法用来检测基因耐受突变能力。 0016 本发明的一优选技术方案， 所述基因耐受突变能力是指摇摆碱基部位在突变体中 选用特定 A,T,C,G 的能力。 0017 本发明的一优选技术方案， 所述基因耐受突变能力是指摇摆碱基的重复次数在突 变体中的变化情况。 0018 在实际操作层面上， 无论是时间还是经济的考量， 都不可能对数以万计的基因工 程酶的靶点序列逐一进行验证。通过本发明提供的突变能力检测技术， 则可以对其进行总 体突。
10、变耐受能力的评价。 0019 本发明采用重复的 NNC 和 NNT， 避免了 TAA， TAG， 和 TGA， 从而达到了避免出现终止 密码子的情形。这里的 N 代表 A,T,C,G 中的任意一种， 这表示一个 NNT 或 NNC 即可以有 4X4 种序列， 16种密码子。 如果采用NNT或NNC串联形成的核酸片段作为插入片段， 则每个片段 中可以有 (44X4)n种可能， 也即可以随机得到编码不同氨基酸的 16n种三联密码子。一旦我 们所评估的方法对于该类核酸片段的插入不显示任何的偏好性， 则可代表在今后的应用中 对于特定的靶点序列其不存在特殊性碱基选择偏好。 0020 综上所述， 该方法具。
11、有便捷、 经济的优点， 一次实验即可代表多次操作检验， 且该 方法实用性广， 不但可用于核酸酶评估方法的评估， 在其他领域如蛋白质研究中， 也可一次 试验造成大量突变， 使实验高通量进行。 0021 本发明中相关术语的说明及解释 0022 根据本发明， 术语 “基因” 是指含特定遗传信息的核苷酸序列， 是遗传物质的最小 功能单位。 0023 根据本发明， 术语 “基因突变” 一词指的是， 基因组 DNA 分子发生的突然的、 可遗传 的变异现象。从分子水平上看， 基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的 改变。 0024 根据本发明， 术语 “人工基因治疗” 一词指的是， 将外源基因导。
12、入靶细胞， 以纠正或 补偿因基因缺陷和异常引起的疾病， 或破坏正常基因， 以达到治疗疾病的目的。 0025 根据本发明， 术语 “基因编辑” 是指近年来发展起来的可以对基因组完成精确修 饰的一种技术， 可完成基因定点突变、 敲入、 多位点同时突变和小片段的删失等。与传统的 TALEN 和 ZFN 技术相比， CRISPR/Cas9 系统更便捷、 高效， 应用也更广泛， 目前该技术成功应 用于人类细胞、 斑马鱼、 小鼠以及细菌的基因组精确修饰。 0026 根据本发明， 术语 “基因工程酶” 是应用于基因工程的各种酶的总称。 0027 根据本发明， 术语 “靶效应” 在这里指具有基因编辑功能的基因。
13、工程酶对靶序列的 剪切作用。 0028 根据本发明， 术语 “脱靶效应” 在这里指具有基因编辑功能的基因工程酶对与靶序 列相似的非靶序列的剪切作用。 0029 根据本发明， 术语 “碱基” ： 指嘌呤和嘧啶的衍生物， 是核酸、 核苷、 核苷酸的成分。 核酸中也有一些含量很少的稀有碱基。 0030 根据本发明， 术语 “载体” ： 指含有自身复制能力 , 多克隆位点 , 选择基因等结构的 非染色体 DNA。 说 明 书 CN 104450919 A 4 3/10 页 5 0031 据本发明， 术语 “寡核苷酸” 是一类只有数个至数十个碱基的短链核苷酸的总称 ( 包括脱氧核糖核酸 DNA 或核糖核。
14、酸 RNA 内的核苷酸 )， 其长度一般不超过 100 个碱基。寡 核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接， 所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构， 经 常用于基因芯片、 电泳、 荧光原位杂交等过程中。 0032 据本发明， 术语 “摇摆” 是指在一群序列基本相同的核酸分子集合中， 某些特定碱 基位点上可以是多于一种碱基的情形。 0033 据本发明， 术语 “碱基部分摇摆寡核苷酸” 是指一个特定短链核苷酸集合中的一个 或几个碱基部位的碱基可以是非单一种类的碱基。 虽然单一分子的任一部位的碱基都是确 定的， 但就这一序列相似的短链核苷酸集合联合使用时， 相关反应产物可能出现同一位点 碱基不同。
15、的结果。 0034 据本发明， 术语 “碱基完全摇摆寡核苷酸” 是指一个特定短链核苷酸集合中的一个 或几个碱基部位的碱基可以是非单一种类的碱基可以同时具有 A、 T、 C、 G 四种可能。 0035 据本发明， 碱基 N 为代表含有 A、 T、 C、 G 的一种集合。 0036 本发明具有的优点 ： (1) 可以测试待测基因是否出现碱基使用的偏向性 ； (2) 可以 测试待测基因对插入长度是否有严格限制。如果碱基使用或插入片段长度完全固定， 则说 明待测试基因的突变耐受能力有限。而如果相反， 则表明其突变耐受力强大。 附图说明 0037 图 1 为 PZAA 质粒模式图， 0038 图 2 为。
16、 PZAB 质粒模式图， 0039 图 3 为 PZAB 质粒中 BaeI 位点详图， 0040 图 4 为构建 PZAA 和 PZAB 测序图， 0041 图 5 为 NNT,NNC 插入后部分克隆测序图。 具体实施方式 0042 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解， 这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。 实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家实验室的 条件做进一步调整， 未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。 0043 本发明采用碱基部分摇摆的寡核苷酸， 用于筛选可用于建立脱靶效应分析技术的 报告基因的基因突变耐受能力。当抗生素基因用于脱靶效应分析时， 如。
17、本发明的应用例博 来霉素， 可杀死不带抗性基因的原核细胞和真核细胞， 这样便有可能检测出极其微小的脱 靶效应。当基因工程酶的靶点相似序列 ( 脱靶效应的位点之一 ) 插入产生一个没有活性的 博来霉素抗性基因， 一旦该基因工程酶对非靶点的上述序列产生脱靶效应， 便有可能通过 基因编辑使无活性的博来霉素抗性基因激活， 从而保护细菌或真核细胞。 如是， 脱靶效应得 以确定。 0044 作为筛选用的报告基因， (1) 需要对靶序列表现出有无抗性的变化 ； (2) 最好具有 插入 20 到 80 个碱基的耐受能力 ； (3) 不要表现出有些序列可以插入， 而另外一些不移码的 插入序列却不能插入的序列依赖。
18、性或序列歧视现象。 0045 一、 材料及试剂 ： pPICZA质粒(购于invitrogen公司， 编号 ： 190520)， PMD-19质 说 明 书 CN 104450919 A 5 4/10 页 6 粒 ( 购于 TaKaRa 公司， 编号 ： D102A)， 引物合成及测序委托苏州金唯智公司完成。PCR 扩增 试剂盒， BaeI 酶 ( 购于 New England Biolabs 公司 )， DNA 核酸片段回收试剂盒 ( 购于天根 生化 )。T4 DNA 连接酶 ( 购于 thermoscientifi c 公司 ) 其余均为国产试剂及耗材。 0046 仪器 ： PCR 扩增仪。
19、 (ABI 公司， Sstem 9700)， 电泳仪 (Bio-Rad 生物公司 )。 0047 二、 以 PMD-19 和 pPICA 质粒构建博来霉素抗性报告基因突变体 0048 1. 构建博来霉素， 氨苄青霉素双抗质粒 PZAA 0049 1.1 设计并合成特异性引物进行重叠延伸 PCR 得到博来霉素抗性基因 0050 1.1.1 以 PMD-19 质粒为模版， 0051 引物 1 ： 5 -CCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTG-3, 对应 Seq No.1 ； 0052 引 物 2 ： 5 -GTCAACTTGGCCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTT。
20、ATCCG-3 , 对 应 Seq No.2 ； 25L PCR 反 应 体 系 ： 2.5L 的 10Pfu Buffer with MgSO4,0.3L 的 Pfu Polymerase(2.5U/L),0.5L 的 dNTP Mix(10mM each)， 两条特异性引物分别为 5M， 5M， 模板 40ng， 其余为水。PCR 反应条件为 ： 95预变性 5min ； 95变性 20S， 58退火 20S， 72延伸 30S， 共 35 个循环 ； 最后 72 5min。 0053 1.1.2 以 pPICA 质粒为模版， 0054 引 物 3 ： 5 -CGGATAACAATTTCA。
21、CACAGGAAACAGCTATGGCCAAGTTGAC-3 , 对 应 Seq No.3 ； 0055 引物 4: 0056 5 -NNNNGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAATCAGTCC TGCTC-3 , 对应 Seq No.4， 碱基 N 为选自 A、 T、 C、 G 中的任意一种 ； 进行 PCR 扩增 ； 0057 25L PCR 反 应 体 系 ： 2.5L 的 10Pfu Buffer with MgSO4,0.3L 的 Pfu Polymerase(2.5U/L),0.5L 的 dNTP Mix(10。
22、mM each)， 两条特异性引物分别为 5M， 5M， 模板 40ng， 其余为水。PCR 反应条件为 ： 95预变性 5min ； 95变性 20S， 58退火 20S， 72延伸 30S， 共 35 个循环 ； 最后 72 5min。 0058 1.1.3 将步骤 1.1.1 和步骤 1.1.2 中得到的两组产物产品等量混合再分装至 25L/ 管， 再进行一轮 PCR， 反应条件同上 ； 0059 1.1.4 以步骤 1.1.3 得到的产物作为模版， 以引物 1、 引物 4 进行 PCR 扩增， 得到含 有全长博来霉素基因序列的可用于插入 PMD-19 质粒的核酸片段。 0060 1.2。
23、 制备插入片段和载体片段 0061 1.2.1 电泳分离纯化目的片段， 用 DrdI 酶切 PMD-19 和步骤 1 得到的 PCR 产物， 天 根 DNA 纯化回收试剂盒分别回收目的片段 ； 0062 20l 酶切反应体系为 2L 的 10 X FastDigest Green Buffer， 限制性内切酶 DrdI1L， PCR 产物或 PMD-191g， 其余为水。反应条件为 37 30min， 65 5min ； 使用天 根 DNA 纯化回收试剂盒回收 PCR 产物酶切片段和 PMD-19 质粒酶切大片段产物 ； 0063 1.2.2 将酶切纯化产物混合构建连接体系， 进行连接反应。其。
24、连接体系为 ： 1uL 的 10T4 DNA Ligase Buffer， 0.5L的T4 DNA Ligase， 1L的PMD-19， 0.1pmol0.3pmol 的目标产物， 加水至总体积 10L， 22反应 60 分钟， 得到博来霉素 / 氨苄青霉素双抗质粒 PZAA。 0064 1.3 转化及筛选 说 明 书 CN 104450919 A 6 5/10 页 7 0065 将上述得到的双抗质粒PZAA转化DH5大肠杆菌， 在含有氨苄抗生素和含有博来 霉素抗生素的琼脂培养基上平行培养， 观察是否形成单菌落， 挑选同时抗博来霉素和氨苄 青霉素的菌落送测序， 并筛选合适菌落。 0066 2.。
25、 构建带有 BaeI 酶切位点的博来霉素报告基因 0067 2.1 以 PMD-19 质粒为模版， 0068 引物 1 ： 5 -CCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTG-3 ； 0069 引物 5: 0070 5 -CTGGTCAACTTGGCGAATTCAGATACCGAAGTTGACAAGCTTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATT GTTATCCG-3 , 对应 Seq No.5 ； 进行 PCR 扩增， 得到目的产品片段 1 ； 25L PCR 反应体系 ： 2.5L 的含硫酸镁的 10X Pfu 缓冲液 ,0.3L 的 Pfu 聚合酶 (2.5U/L),0.。
26、5L 的 dNTP 混合液 ( 每种 10mM)， 两条特异性引物分别为 5M， 5M， 模板 40ng， 其余为水。PCR 反应条 件为 ： 95预变性 5 分钟 ； 95变性 20S， 58退火 20S， 72延伸 30S， 共 35 个循环 ； 最后 72 5 分钟。 0071 2.2 以 pPICA 质粒为模版， 0072 引物 6 ： 0073 5 - ： CGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGAAGCTTGTCAACTTCGGTATCTGAATTCGCCAA GTTGACCAG-3 , 对应 Seq No.6 ； 0074 引物 4: 0075 5 -NN。
27、NNGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAATCAGTCC TGCTC-3 进行 PCR 扩增， 得到目的产品片段 2 ； 0076 其中， 每25L PCR反应体系包括 ： 2.5L含硫酸镁的10X Pfu缓冲液,0.3L的 Pfu聚合酶(2.5U/L),0.5L的dNTP混合液(每种10mM)， 两条特异性引物分别为5M， 5M， 模板 40ng， 其余为水。PCR 反应条件为 ： 95预变性 5 分钟 ； 95变性 20S， 58退火 20S， 72延伸 30S， 共 35 个循环 ； 最后 72 5 分钟。 0077。
28、 2.3 将步骤 2.1.1 和步骤 2.1.2 中得到的两组产物产品片段 1 和 2 等量混合再分 装至 25L/ 管， 再进行一轮 PCR ； 0078 2.4 以步骤 2.1.3 得到的产物作为模版， 以引物 1、 引物 5 进行 PCR 扩增， 反应条件 同上， 得到含有BaeI位点的全长博来霉素基因序列的可用于插入PMD-19质粒的核酸片段。 0079 2.5 电泳分离纯化目的片段， 用 DrdI 酶切 PMD-19 和步骤 1 得到的 PCR 产物， 使用 天根 DNA 纯化回收试剂盒分别回收目的片段 ： 0080 2.620l酶切反应体系为2L的10 X快速消化缓冲液， 限制性内。
29、切酶DrdI1L， PCR 产物或 PMD-191g， 其余为水。反应条件为 37 30 分钟， 65 5 分钟 ； 使用天根 DNA 纯 化回收试剂盒回收 PCR 产物酶切片段和 PMD-19 质粒酶切大片段产物， 0081 2.7 将两个酶切产物混合构建连接体系， 进行连接反应。其连接体系为 ： 1uL 的 10T4 DNA 连接酶缓冲液， 0.5L 的 T4 DNA 连接酶， 1L 的 PMD-19， 0.1pmol 0.3pmol 的目标产物， 加水至总体积 10L， 22反应 60 分钟， 得到博来霉素 / 氨苄青霉素双抗质粒 PZAB。 0082 2.8 转化及筛选 0083 将上。
30、述得到的双抗质粒PZAB转化DH5大肠杆菌， 在含有氨苄抗生素和含有博来 说 明 书 CN 104450919 A 7 6/10 页 8 霉素抗生素的琼脂培养基上平行培养， 观察是否形成单菌落， 挑选抗氨苄青霉素且不抗博 来霉素的菌落送测序， 并筛选合适克隆。 0084 三、 在双抗质粒 PZAB 中插入待检测核酸酶靶序列 , 即在质粒 PZAB 博来霉素抗性 基因的起始密码子 ATG 与其后的密码子 GCC 之间插入一定长度的异源靶序列核苷酸片段。 具体步骤如下 : 0085 3.1提取PZAB质粒， 使用BaeI酶切， 使用天根DNA纯化回收试剂盒回收大片段， 作 为载体。50ul 消化体。
31、系为 10X cutsmart 5ul， SAM 1ul， BaeI 2ul， PZAB 2ug， 其余均为双 蒸水。消化条件为 25孵育 2 小时， 85孵育 5 分钟。消化完成后使用天根 DNA 纯化回收 试剂盒回收载体片段。 0086 0087 0088 3.2 设计可变序列。设计如下 ： 0089 NNT+:5 -NNTNNTNNTNNTNNTNNTNNTNNTGCCAA-3 0090 NNT-:5 -ANNANNANNANNANNANNANNANNCATAG-3 0091 NNC+:5 -NNCNNCNNCNNCNNCNNCNNCNNCGCCAA-3 0092 NNC-:5 -GNN。
32、GNNGNNGNNGNNGNNGNNGNNCATAG-3 0093 3.3 将寡核苷酸退火形成双链 DNA。NNT+， NNT-， NNC+， NNC- 分别两两构建退火体 系， 10ul 的体系包括 1ul 10X 退火缓冲液， 100pmol 寡核苷酸 + 和 100pmol 寡核苷酸 -， 其 余均为 ddH2O。退火条件为加热至 95并保持 5min 后， 按 0.5 /min 的速度缓慢降温至 37， 取出， 存于 4冰箱。 0094 0095 3.4 核酸酶靶序列和载体构建连接体系， 进行连接反应。连接 PZAB 载体。退火产 物稀释 10 倍后与 PZAB 载体构建连接体系。10。
33、ul 的体系中含有 1ul 10T4DNA 连接酶缓冲 说 明 书 CN 104450919 A 8 7/10 页 9 液r， 0.5L的T4 DNA连接酶， 1ul退火产物， 0.010.03pmol PZAB载体， 其余均为ddH2O。 连接条件为 16过夜连接。 0096 其中， 10T4 缓冲液 1ul， PZAB1ul， 退火产物 1ul， T41ul， 水加至 10ul， 总体积 10ul。 0097 3.5 连接产物转化 DH5 大肠杆菌， 挑选单克隆， 鉴定正确后即可与相应的核酸酶 重组质粒进行相关实验。 0098 3.6连接产物转化DH5感受态大肠杆菌。 摇菌40分钟后取少量。
34、菌液涂于氨苄培 养基上， 并将剩余全部菌液铺于博来霉素培养基上过夜培养。于第二天观察并挑选合适克 隆送测序。 0099 四、 结果 0100 表 1.NNT 组寡核苷酸序列 0101 说 明 书 CN 104450919 A 9 8/10 页 10 0102 表 2.NNT 编码的氨基酸 0103 0104 说 明 书 CN 104450919 A 10 9/10 页 11 0105 表 3.NNT Fisher exact 检测 0106 0107 卡方检验， P 大于 0.05, 统计学上无显著性差异， 表明本实验中在插入序列部位对 碱基使用时没有选择性， 或没有歧视现象。 其意义提示实际。
35、情形有可能插入任意靶点序列。 0108 表 4.NNC Fisher exact 检测 0109 0110 说 明 书 CN 104450919 A 11 10/10 页 12 0111 卡方检验， P 大于 0.05, 统计学上无显著性差异， 表明本实验中在插入序列部位对 碱基使用时没有选择性， 或没有歧视现象。 其意义提示实际情形有可能插入任意靶点序列。 0112 结论 ： 一是该方法可以用于待测靶基因突变耐受力的检测 ； 二是 NNT 的检测能力 大于 NNC。上述两个结论在应用例子中得到了说明。 0113 上述实例只为说明本发明的技术构思及特点， 其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了。
36、解本发明的内容并据以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 104450919 A 12 1/2 页 13 0001 序 列 表 CN 104450919 A 13 2/2 页 14 0002 序 列 表 CN 104450919 A 14 1/3 页 15 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104450919 A 15 2/3 页 16 图 4 说 明 书 附 图 CN 104450919 A 16 3/3 页 17 图 5 说 明 书 附 图 CN 104450919 A 17 。