复合纳米纤维小直径血管组织工程支架材料的制备方法 【技术领域】
本发明涉及组织工程领域，具体说涉及复合纳米纤维小直径血管组织工程支架材料的制备方法。
背景技术
人工合成血管和自体血管是目前临床上小直径血管移植物的主要来源。在实践中人工合成血管存在植入后容易造成血栓形成、内膜增生、远期通畅率不高等问题；自体血管受到来源、大小等限制，无法满足小直径血管移植物的需求。血管组织工程为解决小直径血管移植物来源提供了有效的途径，其基本原理是将正常血管细胞与生物可降解支架材料复合培养，以形成具有特定形态和功能的血管组织，达到修复病变、创伤和重建功能的目的。利用血管组织工程方法已开展临床应用的研究，2002年，日本研究人员首次报道通过组织工程方法构建的血管移植物应用临床，他们利用聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)制备多孔网状支架，种植自体骨髓细胞并移植体内。临床跟踪结果显示，植入体内32个月后血管移植物仍然保持通畅。
支架材料在组织工程血管中起关键作用，不仅具有直接支撑细胞的特性，而且影响细胞的生长、迁移、分化以及决定新生组织的结构。令人满意的血管组织工程支架材料应尽可能地模拟天然血管细胞外基质的三维网架结构及生理功能，有良好的生物相容性，包括抗凝血、抗炎症以及非免疫原性、允许细胞的黏附和生长等生物学性能；模拟天然血管的弹性和顺应性；良好的生物降解性能，材料支架的降解速率须与植入的细胞组织形成相匹配；易于加工成形，并具缝合性和灭菌性等特点。
在组织工程血管支架材料的研究中，天然蛋白如胶原蛋白是最早用于构建组织工程血管支架的材料，但因天然蛋白机械强度不够、获取有一定困难，而且还存在一些问题，如抗原性、在处理过程中容易变性等，尽管有大量的研究来改进，但仍受力学性能不足所限。之后更多的研究工作是寻找人工合成、具有一定力学性能、可降解的高分子材料，聚羟基乙酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚羟丁酸(P4HB)、聚乳酸(PLA)及其共聚物等是本世纪初广泛应用于构建血管支架的材料。然而，由于存在PGA降解过快、PCL缺乏细胞亲和性、PLA力学强度不匹配等问题，亦不理想。基于天然血管结构和功能的复杂性，很难使某一材料同时满足血管支架材料的要求，需要将天然材料和人工合成材料按照一定的比例混合，以发挥天然材料和人工合成材料的优点，制备兼具良好生物相容性和优良力学性能的复合支架材料。
蜘蛛丝是一种特殊的蛋白质纤维，是天然的高分子纤维和生物材料，根据蜘蛛丝的结构和功能特性，福建师范大学李敏等于2004年(李敏，黄建坤，涂桂云等，RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因的构建、表达与纯化，生物医学工程学杂志，2004，21(6)：1006)应用基因工程为核心的现代生物技术，利用原核生物表达体系，构建了多种特殊序列的蛛丝蛋白基因，并在蛛丝蛋白的功能重复基因序列中引入RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽密码子，构建并表达了RGD-重组蛛丝蛋白(命名为pNSR16和pNSR32，分子量分别约为65KD和102KD)。生物活性分子RGD三肽是黏附蛋白中能够为细胞表面特异受体蛋白识别的最小短肽序列，是目前应用最广、最有效的促黏附肽。
聚己内酯(PCL)是近年来国外开发的一种合成高分子聚酯材料，是美国食品和药物管理局(FDA)认可的一类生物医用材料，具有良好的物理机械性、化学稳定性、无毒性及易加工成形等特点。壳聚糖(CS)是甲壳素的脱乙酰产物，是自然界中第二大丰富的生物材料，具有良好的生物相容性、可生物降解和抗血凝性，并可促进伤口愈合和抗菌等功能，是一种理想的生物医用材料。研制思路是将上述三种材料按一定比例共混，从而吸取材料各自的优点，制备具有一定黏附功能、适当的机械性能以及抗凝血性能的血管组织工程支架。
目前，血管支架制备技术方法主要有浇铸-浸渍法、细胞自组装法以及凝胶纺丝。然而，浇铸-浸渍法的缺点是在支架残留有毒溶剂且不能很好地控制孔径的大小和分布；细胞自组装技术对制备的条件要求很高，必须在无菌条件下操作，并且通过该技术所构建的血管所需的长期培养也受到相当大的限制，至于构建物在植入后是否表现合适的弹性和顺应性难以确定；凝胶纺丝法虽然可以制备微型的血管支架，但是支架的微观结构无法很好模拟细胞外基质地结构和功能。
静电纺丝是一项独特的技术，利用聚合物溶液或熔体在强电场作用下形成喷射流，射流凝固形成纳米纤维，以无纺布状排列在收集板上。应用该技术不仅可模仿细胞外基质纳米纤维网架结构，制备大小在500nm以内的纤维，而且所制备的纳米纤维具有高孔隙率和比表面积，有利于细胞的黏附、生长及增殖。迄今，有数十种高分子合成材料以及甲壳素、纤维素、蚕丝等天然聚合物成功电纺，其中有不少作为支架材料广泛应用于骨、软骨、皮肤、膀胱、神经等组织工程研究领域。与其他纳米纤维制备方法如相分离、自组装相比，静电纺丝能够制备成小直径(＜6mm)的管状结构，并具有适当的机械性能，这些特点赋予静电纺丝技术在组织工程血管支架构建领域突出的优势。
【发明内容】
本发明将RGD-重组蛛丝蛋白(pNSR32或pNSR16)与聚己内酯(PCL)和壳聚糖(CS)按照一定比例共混配成一定浓度的电纺液，应用静电纺丝技术制备内径为3-6mm的复合纳米纤维管状物，作为小直径血管组织工程支架。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：以甲酸为共同溶剂，根据血管支架的要求，将RGD-重组蛛丝蛋白(pNSR32或pNSR16)与聚己内酯(PCL)和壳聚糖(CS)按照适当的比例共混，制备电纺溶液，备用。调节不锈钢转轴的直径以控制管状支架的内径，考察不同电纺参数(如纺丝液浓度、电压、挤出速度、固化距离、温度、转速等)对支架宏观形貌和微观结构的影响，以确定最佳的纺丝条件。在不锈钢转轴上涂上一薄层润滑剂以便于取出血管支架，润滑剂必须无毒且通过一定的处理可以将其去除。
具体制备方法为：
①配制电纺溶液：以甲酸为共同溶剂，将RGD-重组蛛丝蛋白(pNSR32或pNSR16)、聚己内酯以及壳聚糖按照质量比为1∶8∶1配制成浓度为20％～30％(w/v)的静电纺丝液。
②小直径血管支架的制备：通过带圆柱状转轴收集器(涂有聚乙二醇)的静电纺丝设备，在高压静电的作用下，制备复合纳米纤维管状支架。圆柱状转轴横截面的直径为3mm～6mm，转动速度为1500rpm～2000rpm，固化距离为15cm～30cm，电压为50kV～150kV，挤出速度为3ml/h～7ml/h，温度45℃～50℃。
③去除聚乙二醇残留：将支架依次经过以下处理：PBS漂洗，70％酒精20min，无菌水3min，无菌PBS 5min。即可除去支架上残留的聚乙二醇。
本发明所选用的静电纺丝液是指以浓度为70％～98％甲酸为溶剂的RGD-重组蛛丝蛋白/聚己内酯/壳聚糖混合溶液。RGD-重组蜘蛛丝蛋是通过由福建师范大学李敏等建立的可规模化生产的发酵罐高密度发酵工艺条件等技术而获得，公众也能根据其公开的技术(参见：李敏，章文贤，黄智华，黄建坤；蜘蛛拖丝蛋白基因的构建及在大肠杆菌中的表达[J]；生物工程学报；2002年03期)以简便易行、低成本和有效的分离纯化方法规模化制备重组蛛丝蛋白。
本发明所选用的静电纺丝专用设备——静电纺丝仪，由福建师范大学研制定型的产品。该仪器具有：电源电压可调范围为0～300kV，可更换的圆柱形转轴收集器的横截面直径为4～10mm，旋转速度可调范围为1000rpm～4500rpm，收集距离可调范围为10～30cm、挤出速度可调范围为2ml/h～10ml/h，电纺最高温度可达60℃。
采用本发明的技术，具有：
1、RGD-重组蛛丝蛋白(pNSR32或pNSR16)具有良好的生物相容性，其特殊的RGD序列能够促进细胞外基质与细胞之间的相互作用，促进种子细胞在支架上的黏附和生长。
2、聚己内酯具有良好的物理机械性，化学稳定性、无毒性及易加工成形等特点，但其降解速度较慢，与降解速度较快的壳聚糖共混，不仅可以提高支架材料的降解速度，为细胞的生长提供足够的空间，壳聚糖还可以提高支架材料的抗凝血性。这样血管支架具有良好力学性能的同时，还拥有良好的生物相容性和抗凝血性能，并且支架所携带的RGD促黏附肽有利于种子细胞的黏附和生长，从而达到三赢的效果。
3、应用静电纺丝技术，可以很方便地控制血管支架的内径大小。此外，静电纺丝所制备支架的微观结构模拟了天然细胞外基质的结构，为种子细胞的生长提供一个仿生的环境。
【附图说明】
下面结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。
图1是血管支架外观形貌图。
图2是血管支架横截面。
图3是血管支架的腔内表面。
图4是血管支架的腔外表面。
【具体实施方式】
下面根据实施例对本发明做进一步说明：
实施例1
1、电纺液配制：分别称取配0.1g pNSR16、0.8gPCL以及0.1gCS溶解于5ml88％甲酸，得到20％(w/v)的pNSR32/PCL/CS混合电纺溶液。
2、转轴处理：在不锈钢转轴上涂上一薄层聚乙二醇(PEG)。
3、小直径血管支架的制备：吸取1.5ml的纺丝液到规格为2ml的注射器中，将注射器安置在注射泵上，采用横截面直径为4mm圆柱状转轴收集器，以1000r/min的速度旋转，固化距离为18cm、电压为80kV、挤出速度为5ml/h、温度45℃的条件下，制得内径为4mm的pNSR32/PCL/CS复合纳米纤维小直径血管支架。
4、支架制备后处理：将支架经以下处理：PBS漂洗、70％酒精浸泡20min、无菌水3min以及无菌PBS5min后，即可除去支架表面上残留的聚乙二醇。
实施例2
1、电纺液配制：分别称取配0.15g pNSR32、1.2gPCL以及0.15gCS溶解于5ml98％甲酸，得到30％(w/v)的pNSR32/PCL/CS混合电纺溶液。
2、转轴处理：在不锈钢转轴上涂上一薄层聚乙二醇(PEG)。
3、小直径血管支架的制备：吸取2.0ml的纺丝液到规格为2.5ml的注射器中，将注射器安置在注射泵上，采用横截面直径为6mm圆柱状转轴收集器，以1500r/min的速度旋转，固化距离为20cm、电压为100kV、挤出速度为7ml/h、温度50℃的条件下，制得内径为6mm的pNSR32/PCL/CS复合纳米纤维小直径血管支架。
4.支架制备后处理：将支架经以下处理：PBS漂洗、70％酒精浸泡20min、无菌水3min以及无菌PBS5min后，即可除去支架表面上残留的聚乙二醇。