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1、(10)申请公布号 CN 104046607 A (43)申请公布日 2014.09.17 CN 104046607 A (21)申请号 201410314872.5 (22)申请日 2014.07.04 C12N 9/96(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号江南大学食品科学与技术国家 重点实验室 (72)发明人 江波 张涛 张巧 沐万孟 缪铭 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32104 代理人 时旭丹 刘品超 (54) 发明名称 一种提高D-塔格糖-3-差向异构酶储藏稳定 性的方法 (57。
2、) 摘要 一种提高D-塔格糖-3-差向异构酶储藏稳定 性的方法， 属于食品工业技术领域。本发明以一 种类球红细菌 SK011 为出发菌株， 发酵产的 D- 塔 格糖 -3- 差向异构酶， 离心、 高压破碎， 再超滤浓 缩后添加一定的稳定剂。 该稳定剂包括以下组分 ： 防腐剂0.10.5g/100mL、 糖类26g/100mL、 醇 类26g/mL、 盐类0.52.0mmol/L， 其中防腐剂 为对羟基苯甲酸甲酯 （Met） ， 糖类为果糖， 醇类为 肌醇， 盐类为MgSO4。 本发明的D-塔格糖-3-差向 异构酶稳定剂组分简单， 能很好地抑制微生物的 生长和繁殖， 且几乎无毒性， 能应用于食品。
3、工业， 且对D-塔格糖-3-差向异构酶的粗酶液保护效果 较好， 25下储存 15d， 可使酶液的酶活保留率由 不加稳定剂的 2.2% 提高到 97.74%。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104046607 A CN 104046607 A 1/1 页 2 1. 一种提高 D- 塔格糖 -3- 差向异构酶储藏稳定性的方法， 其特征在于 ： 以一种类球红细菌 SK011 为出发菌株， 经发酵产 D- 塔格糖 -3- 差向异构酶， 。
4、离心、 高压 破碎后再超滤浓缩 10 倍得到的粗酶液， 其酶活为 100-1000U/mL ； 以所述 D- 塔格糖 -3- 差向异构酶的粗酶液为基础， 经添加稳定剂 ： 取防腐剂、 糖类、 醇 类和 / 或盐类， 加入粗酶液中充分混匀后， 使粗酶液中含有防腐剂 0.1 0.5g/100mL， 以及 糖类 2 6g/100mL、 醇类 2 6g/mL 和 / 或盐类 0.5 2.0mmol/L 中的一种或几种， 即能提 高 D- 塔格糖 -3- 差向异构酶储藏稳定性。 2.根据权利要求1所述提高D-塔格糖-3-差向异构酶储藏稳定性的方法， 其特征在于 所述防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯， 糖类为果糖。
5、， 醇类为肌醇， 盐类为 MgSO4。 权 利 要 求 书 CN 104046607 A 2 1/2 页 3 一种提高 D- 塔格糖 -3- 差向异构酶储藏稳定性的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种提高D-塔格糖-3-差向异构酶储藏稳定性的方法， 属于食品工业 技术领域。 背景技术 0002 D-阿洛酮糖是D-果糖C-3位的差向异构体， 它是一种具有重要功能的稀有糖。 如 它的甜度与果糖相当， 但它在消化道几乎不被吸收， 因此具有极低的热量值， 可以防止肥胖 与不引起高血糖等。另外它还具有独特的生理功能， 如神经保护作用， 减少脂肪沉积、 自由 基清除功能等。 D-塔格糖-3-差向异构酶。
6、是生物法生产D-阿洛酮糖最为有效的酶， 具有巨 大的应用价值。 0003 然而， 液体酶在工业生产及应用过程中， 易受环境中各种因素的影响而逐渐失活， 这是酶技术应用的一大屏障。酶的不稳定性使其必须保存在低温和适宜的 pH 下， 保存环境 受到极大的限制， 不方便 D- 塔格糖 -3- 差向异构酶的生产后的处理、 储存及运输。 0004 提高酶稳定性的方法很多， 常见的有 ： 固定化法、 化学修饰法、 蛋白质工程法、 添加 保护剂等方法。 其中， 使用保护剂是研究酶储藏稳定性最普通、 最简单的方法， 且有成本低、 操作简单等优点。 常用的保护剂有某些防腐剂、 糖类、 多元醇、 蛋白及盐类等， 。
7、在具体选择保 护剂时， 应根据保护剂与酶的相互作用不同而加以选择。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种能提高D-塔格糖-3-差向异构酶稳定性的方法， 使得添 加稳定剂后的酶液在运输或储存一段较长时间后仍能保持较好的酶活力。 0006 本发明的技术方案， 一种提高 D- 塔格糖 -3- 差向异构酶储藏稳定性的方法， 以一 种类球红细菌 SK011 为出发菌株， 种子培养基 ： 2 20g/L 胰蛋白胨， 2 20g/L NaCl， 2 10g/L酵母粉 ； 发酵培养基 ： 520g/L葡萄糖， 1030g/L酵母浸膏， 1020g/L胰蛋白胨， 1 10g/L NaCl， 0.1 1g/。
8、L MgSO4， 1 5g/L NaH2PO42H2O ； 发酵条件 ： 种子液接种量为 1%5%， 2540、 100500rpm、 初始pH7.0， 发酵初期添加0.1%0.5%塔格糖。 发酵罐 培养 36h 后， 将发酵液离心 （6000rpm、 10min） ， 高压破碎离心后的菌体， 再离心 （10000rpm、 15min） ， 将上清液超滤浓缩 （膜分子量 10000） 10 倍， 即为 D 塔格糖 -3- 差向异构酶粗酶液。 粗酶液酶活为 100-1000U/mL。 0007 以所述 D- 塔格糖 -3- 差向异构酶的粗酶液为基础， 经添加稳定剂 ： 取防腐剂、 糖 类、 醇类。
9、和/或盐类， 加入粗酶液中充分混匀后， 使粗酶液中含有防腐剂0.10.5g/100mL， 以及糖类 2 6g/100mL、 醇类 2 6g/mL 和 / 或盐类 0.5 2.0mmol/L 中的一种或几种， 即 能提高 D- 塔格糖 -3- 差向异构酶储藏稳定性。 0008 其中防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯， 糖类为果糖， 醇类为肌醇， 盐类为 MgSO4。 0009 所述类球红细菌 SK011， 张龙涛等 .生物转化生成 D- 阿洛酮糖的类球红细菌的 筛选 J. 食品与发酵工业， 2008， 34（9） ： 40-43 已公开。 说 明 书 CN 104046607 A 3 2/2 页 4 00。
10、10 本发明的有益效果 ： 本发明涉及的D-塔格糖-3-差向异构酶稳定剂， 组分简单， 能 很好地抑制微生物的生长和繁殖， 且几乎无毒性， 能应用于食品工业， 且对D-塔格糖-3-差 向异构酶的粗酶液保护效果较好， 25下储存 15d， 可使酶液的酶活保留率由不加稳定剂时 的 2.2% 提高到 97.74%。 附图说明 0011 图 1 为防腐剂对羟基苯甲酸甲酯对 D- 塔格糖 -3- 差向异构酶的保护作用。 0012 图 2 为对羟基苯甲酸甲酯和果糖组成的稳定剂对 D- 塔格糖 -3- 差向异构酶的保 护作用。 0013 图 3 为对羟基苯甲酸甲酯和肌醇组成的稳定剂对 D- 塔格糖 -3- 。
11、差向异构酶的保 护作用。 0014 图 4 为对羟基苯甲酸甲酯和 MgSO4 组成的稳定剂对 D- 塔格糖 -3- 差向异构酶的 保护作用。 0015 图 5 为对羟基苯甲酸甲酯、 果糖、 肌醇和 MgSO4 组成的复合稳定剂对 D- 塔格 糖 -3- 差向异构酶的保护作用。 具体实施方式 0016 实施例 1 发酵产的 D- 塔格糖 -3- 差向异构酶， 离心、 高压破碎后超滤浓缩 10 倍得到的粗酶液， 其酶活为1001000U/mL， 将其置于25下保存5、 10、 15天， 其酶活保留率分别为23.52%、 6.91%、 2.23%。 0017 实施例 2 向超滤后的酶液添加 0.3 。
12、g/100mL 对羟基苯甲酸甲酯 （Met） ， 25下保存 5、 10、 15 天， 酶活保留率分别为 79.31%、 71.20%、 66.04%。 0018 实施例 3 向超滤后的酶液添加 0.3 g/100mL 对羟基苯甲酸甲酯和果糖 2g/100mL， 25下保存 5、 10、 15 天， 酶活保留率分别为 88.38%、 78.57%、 73.52%。 0019 实施例 4 向超滤后的酶液添加 0.3g/100mL 对羟基苯甲酸甲酯和肌醇 2g/100mL， 25下保存 5、 10、 15 天， 酶活保留率分别为 89.04%、 80.31%、 69.83%。 0020 实施例 5。
13、 向超滤后的酶液添加 0.3g/100mL 对羟基苯甲酸甲酯和 MgSO4 0.5mmol/L， 25下保存 5、 10、 15 天， 酶活保留率分别为 98.90%、 88.09%、 79.21%。 0021 实施例 6 向超滤后的酶液添加复合稳定剂 （0.1 0.5g/100mL 对羟基苯甲酸甲酯、 2 6g/100mL 果糖、 2 6g/mL 肌醇、 0.5 2.0mmol/LMgSO4） ， 25下保存 5、 10、 15 天， 酶活保 留率分别为 107.22%、 99.26%、 97.94%。 说 明 书 CN 104046607 A 4 1/3 页 5 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104046607 A 5 2/3 页 6 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104046607 A 6 3/3 页 7 图 5 说 明 书 附 图 CN 104046607 A 7 。