用于KIR基因快速分型的引物、试剂盒及方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104032025 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104032025 A (21)申请号 201410293463.1 (22)申请日 2014.06.25 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 上海荻硕贝肯生物科技有限公司 地址 201201 上海市浦东新区王桥路 999 号 中邦商务园 1010 幢 (72)发明人 潘捷 郑仲征 田石磊 (74)专利代理机构 北京万慧达知识产权代理有 限公司 11111 代理人 杨颖 张金芝 (54) 发明名称 用于 KIR 基因快速分型的引物、 试剂盒。

2、及方 法 (57) 摘要 本发明属于基因工程技术领域， 公开了一种 用于 KIR 基因快速分型的引物、 含有该引物的试 剂盒以及采用该引物和试剂盒进行 KIR 基因快速 分型的方法。本发明使用了 KIR 基因的特异性引 物， 增强了特异性的结合， 完全可用于检测目前已 知的 16 个 KIR 等位基因。此外， 本发明将特异性 引物， dNTPs， PCR 缓冲液和染料预先混合， 大大节 省了操作时间和工作量， 具有快速、 简便、 准确、 直 观的特点， 在 3 小时内即可完成整个基因的分型 实验， 解决了 KIR 基因分型的问题。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 12 页 。

3、附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书12页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104032025 A CN 104032025 A 1/1 页 2 1.一种用于KIR基因快速分型的引物， 其包含SEQ ID NO.1-46所示的检测引物KP-01、 KP-02、 KP-03、 KP-46， 其中检测引物 KP-01 和 KP-02 组成一组， 依次按照顺序两两组 合， 组成 23 组引物组。 2. 根据权利要求 1 所述的引物， 其进一步包含 SEQ ID NO.47 和 SEQ IDNO.48 所示的内 对照引物 NCXF 和 N。

4、CXR。 3.一种用于KIR基因快速分型的试剂盒， 其包含PCR反应混合液和Taq酶， 所述PCR反 应混合液分别包含权利要求 1 所述的 23 组引物组， 所述 Taq 酶的浓度优选为 5U/L。 4. 根据权利要求 3 所述的试剂盒， 其中用于 KIR 基因快速分型的引物 KP-01、 KP-02、 KP-03、 KP-46 的浓度均为 0.5M。 5. 根据权利要求 3 或 4 所述的试剂盒， 其中 PCR 反应混合液中进一步包含权利要求 2 所述的内对照引物。 6. 根据权利要求 5 所述的试剂盒， 其中内对照引物 NCXF 和 NCXR 的浓度均为 0.2M。 7. 根据权利要求 3。

5、 至 6 任一项所述的试剂盒， 其中 PCR 反应混合液中进一步包含 dNTPs， 染料和 PCR 缓冲液， 染料优选为甲酚红。 8.根据权利要求7所述的试剂盒， 其中dNTPs浓度为0.2mM， 染料浓度为0.01， PCR缓 冲液组成为 ： Tris-HCL 浓度 10mM， 氯化钾浓度 50mM， 氯化镁浓度 1.5mM， 明胶浓度 0.001。 9. 一种对 KIR 基因进行快速分型的方法， 其包含以下步骤 ： (1) 提取待分型样品的 DNA 溶液， (2) 采用权利要求 1 或 2 所述的引物， 或采用权利要求 3 至 8 中任一项所述的试剂盒， 以步骤 (1) 中提取的 DNA 。

6、溶液作为模板， 进行 PCR 扩增 ； (3)PCR 扩增产物经电泳后， 进行结果判读， 当电泳结果均出现与目标片段大小一致的 条带时， 表明该基因为 KIR 基因阳性， 否则表明该基因为 KIR 基因阴性。 10. 权利要求 1 或 2 所述的引物， 或者权利要求 3 至 8 中任一项所述的试剂盒在 KIR 基 因快速分型中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104032025 A 2 1/12 页 3 用于 KIR 基因快速分型的引物、 试剂盒及方法 技术领域 0001 本发明涉及基因工程技术领域， 具体涉及用于 KIR 基因快速分型的引物、 试剂盒 及方法。 背景技术 0002 杀伤细胞。

7、免疫球蛋白样受体 (KIR) 基因编码一族激活性和抑制性 KIR 受体， 表达 在 NK 细胞和部分 T 细胞表面， 通过特异性识别靶细胞表面的 MHC-I 类分子， 转导激活或抑 制信号， 从而调节 NK 细胞和 T 细胞的活性， 在抗感染、 肿瘤监测、 移植免疫和自身免疫性疾 病等方面发挥重要作用。KIR 基因属于常染色体共显性遗传， 位于人类染色体 19q13.42， 长约 100 200kb， 具有高度多态性。目前已明确的 KIR 基因共 l6 个， 包括 14 个功能基因 (KIR2DL1-5、 KIR3DL1-3、 KIR2DS1-5、 KIR3DS1) 和 2 个假基因 (KIR。

8、2DP1、 KIR3DP1)， 形成以 KIR3DL2 和 KIR3DL3 基因分列染色体端粒端和着丝粒端， KIR2DL 和 KIR3DP1 基因居中的框 架格局， 各 KIR 基因的规律组合又可形成 KIR 基因 A 和 B 两种单倍型。KIR 基因的表达产 物KIR受体对NK细胞和部分T细胞活性调节起着重要作用， 故检测KIR基因对感染、 肿 瘤和自身免疫病发病机制的探讨、 发病预测、 治疗及造血干细胞移植都具有临床指导意义。 0003 1997 年 Uhrberg 等首次建立了采用 PCR-SSP 方法检测 KIR 基因。随后又出现了 序列特异性寡核苷酸探针聚合酶链反应 (PCR-SS。

9、OP)、 RT-PCR 等检测方法。但这些方法都存 在一定的局限性， 主要表现在PCR-SSOP与RT-PCR方法需要特定的仪器， 且试剂、 耗材较贵。 虽然， 总的来说 PCR-SSP 是一种相对简单方便、 特异性高的方法， 且目前已有基于 PCR-SSP 方法进行单特异引物检测 KIR 的试剂盒， 但因其采用的均是既往的引物， 因而不能检测出 近年来新发现的 KIR 基因的等位基因和座位， 且其扩增产物多为长片段， 对样本基因组 DNA 的要求也高， 存在漏检和误检的可能， 远远不能满足对 KIR 基因获得中高分辨率的分型结 果的要求。 发明内容 0004 本发明针对现有技术中存在的上述缺。

10、陷， 基于最新的 KIR 基因数据库， 重新设计 了 KIR 基因的 PCR-SSP 分型方法并建立了一套结果判读格局图。本发明的分型方法准确 可行， 与长片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法相比， 其对 KIR2DL1、 KIR2DL2、 KIR2DL3 和 KIR2DS1 等基因均可获得中高分辨的分型结果。 0005 为此， 本发明一方面提供了一种用于 KIR 基因快速分型的引物， 其包含 SEQ ID NO.1-46 所示的检测引物 KP-01、 KP-02、 KP-03、 KP-46， 其中检测引物 KP-01 和 KP-02 组成一组， 依次按照顺序两两组合， 组成 23。

11、 组引物组。 0006 在本发明优选的实施方案中， 该引物还进一步包含 SEQ ID NO.47 和 SEQ ID NO.48 所示的内对照引物 NCXF 和 NCXR。 0007 本发明另一方面提供了一种用于 KIR 基因快速分型的试剂盒， 其包含 PCR 反应混 合液和 Taq 酶， 所述 PCR 反应混合液分别包含如上所述的 23 组引物组， 所述 Taq 酶的浓度 说 明 书 CN 104032025 A 3 2/12 页 4 优选为 5U/L。 0008 在本发明更加优选的实施方案中， 该试剂盒中用于 KIR 基因快速分型的引物 KP-01、 KP-02、 KP-03、 KP-46 。

12、的浓度均为 0.5M。 0009 在本发明另一优选的实施方案中， 该试剂盒的 PCR 反应混合液中进一步包含如上 所述的内对照引物。 0010 在本发明更加优选的实施方案中， 该试剂盒中内对照引物 NCXF 和 NCXR 的浓度均 为 0.2M。 0011 在本发明再一优选的实施方案中， 该试剂盒的 PCR 反应混合液中进一步包含 dNTPs， 染料和 PCR 缓冲液， 染料进一步优选为甲酚红。 0012 在本发明更加优选的实施方案中， 该试剂盒中 dNTPs 浓度为 0.2mM， 染料浓度为 0.01， PCR 缓冲液组成为 ： Tris-HCL 浓度 10mM， 氯化钾浓度 50mM， 氯。

13、化镁浓度 1.5mM， 明胶 浓度 0.001。 0013 本发明另一方面提供了一种对 KIR 基因进行快速分型的方法， 其包含以下步骤 ： 0014 1、 提取待检测样品的 DNA 溶液 ； 0015 2、 采用如上所述的引物或采用如上所述的试剂盒， 以步骤 1 中提取的 DNA 溶液作 为模板， 进行 PCR 扩增 ； 0016 3、 PCR 扩增产物经电泳后， 进行结果判读， 当电泳结果均出现与目标片段大小一致 的条带时， 表明该基因为 KIR 基因阳性， 否则表明该基因为 KIR 基因阴性。 0017 本发明再一方面提供了如上所述的引物或如上所述的试剂盒在 KIR 基因快速分 型中的应。

14、用。 0018 由上述描述可知， 本发明基于PCR-SSP技术开发的KIR基因分型试剂盒， 由于使用 了特异性引物， 因此相比现有其他检测方法而言， 具有快速、 简便、 准确、 直观的特点， 实验 成本低， 且仅需微量检材即可完成实验检测所需。 同时， 本发明的检测试剂盒可以很直观的 根据扩增后电泳的条带的判读， 即可判断 KIR 的等位基因型别， 从而完成 KIR 基因的分型。 0019 此外， 本发明将引物， dNTPs， PCR 缓冲液和染料预先混合， 可大大节省实验者的操 作时间和工作量。 将等位基因的多对引物混合同时扩增， 满足高通量的实验需求， 直接得出 分型和筛查结果， 具有灵敏。

15、、 稳定、 准确、 高效的特点。在拥有合格 DNA 样品的情况下， 本发 明在 3 小时内即可完成整个基因的分型实验， 解决了 KIR 基因分型的问题。 附图说明 0020 图 1 ： KIR 基因阳性样品凝胶电泳图， 其中图 1 上的号码对应于图 2 判读格局图中 相应的孔号。 0021 图 2 ： KIR-SSP 结果判读格局图。 具体实施方式 0022 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明， 旨在用于说明本发明而非限定本 发明。应当指出， 对于本领域技术人员而言， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以对本发 明进行若干改进和修饰， 这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。 00。

16、23 实施例 1 ： 制备快速检测 KIR 基因的试剂盒 说 明 书 CN 104032025 A 4 3/12 页 5 0024 1、 引物的合成 0025 引物由上海英骏生物技术有限公司合成， 引物序列分别如 SEQ ID NO.1-46 所示。 0026 同时， 为了保证反应体系的正常进行， 还设计了一对上下游引物 NCXF(SEQ ID NO.47) 和 NCXR(SEQ ID NO.48)， 作为内对照引物， 其扩增片段大小为 790bp。 0027 具体序列情况如表 1 所示 0028 表 1. 快速检测 KIR 基因的引物 0029 说 明 书 CN 104032025 A 5 。

17、4/12 页 6 0030 0031 2、 PCR 反应混合液的制备 0032 将 SEQ ID NO.1-48 所示的引物， dNTPs， 染料甲酚红， PCR 缓冲液混合。检测引物 KP-01和KP-02为一组， 依次按照顺序两两组合， 组成23组引物组。 检测引物SEQ ID NO.1-46 的浓度均为 0.5M， 内对照引物 SEQID NO.47-48 的浓度分别为 0.2M， 染料甲酚红浓度为 0.01， dNTPs 浓度为 0.2mM。PCR 缓冲液为 ： Tris-HCL 浓度为 10mM， 氯化钾浓度为 50mM， 氯 化镁浓度为 1.5mM， 明胶浓度为 0.001。将上述。

18、 33 组 PCR 反应混合液和 Taq 酶分装后包 装， 组成试剂盒。 0033 实施例 2 ： 样本中 KIR 基因的定型检测 0034 选取了覆盖 16 个 KIR 基因型别的阳性 DNA 样品。分别加入 PCR 管中， 同时在每管 中加入 Taq 酶。加样完成后将反应混合液混匀， 短暂离心， 进行 PCR 反应。 0035 PCR 反应的条件为 ： 94 5min ； 再依次按照以下程序运行 30 个循环， 94 1min， 65 2min， 72 1min ； 最后 72 10min， 降温至 15， 可进行凝胶电泳检测。 0036 使用 0.5TBE 缓冲液， 配置 2琼脂糖凝胶。。

19、取 3ul PCR 产物直接点样到凝胶孔 上， 电泳 30 分钟， 然后在紫外光下拍照记录， 具体凝胶电泳结果参见附图 1。 0037 结果判读 ： 所有结果均出现与目标片段大小一致的条带， 说明本发明的试剂盒具 有很好的特异性。 0038 序列表 0039 上海荻硕贝肯生物科技有限公司 0040 用于 KIR 基因快速分型的引物、 试剂盒及方法 0041 PT20141228 0042 48 0043 PatentIn version3.3 0044 1 0045 22 说 明 书 CN 104032025 A 6 5/12 页 7 0046 DNA 0047 人工序列 0048 1 004。

20、9 gttggtcaga tgtcatgttt gc 22 0050 2 0051 21 0052 DNA 0053 人工序列 0054 2 0055 ggtccctgcc aggtcttgcg c 21 0056 3 0057 20 0058 DNA 0059 人工序列 0060 3 0061 tggaccaaga gtctgcaggc 20 0062 4 0063 20 0064 DNA 0065 人工序列 0066 4 0067 ggagacaact ttggatctgg 20 0068 5 0069 18 0070 DNA 0071 人工序列 0072 5 0073 ctggcccac。

21、c caggtcgc 18 0074 6 0075 22 0076 DNA 0077 人工序列 0078 6 0079 ggaccgatgg agaagttggc tg 22 0080 7 0081 20 0082 DNA 0083 人工序列 0084 7 说 明 书 CN 104032025 A 7 6/12 页 8 0085 gagggggagg cccatgaatc 20 0086 8 0087 21 0088 DNA 0089 人工序列 0090 8 0091 tcgagtttga ccactcgtat g 21 0092 9 0093 18 0094 DNA 0095 人工序列 00。

22、96 9 0097 cttcatcgct ggtgctgc 18 0098 10 0099 21 0100 DNA 0101 人工序列 0102 10 0103 aggctcttgg tccattacaa c 21 0104 11 0105 20 0106 DNA 0107 人工序列 0108 11 0109 tccttcatcg ctggtgctgg 20 0110 12 0111 23 0112 DNA 0113 人工序列 0114 12 0115 ggcaggagac aactttggat cag 23 0116 13 0117 19 0118 DNA 0119 人工序列 0120 13。

23、 0121 caggacaagc ccttctgca 19 0122 14 0123 17 说 明 书 CN 104032025 A 8 7/12 页 9 0124 DNA 0125 人工序列 0126 14 0127 ctgggtgccg accactc 17 0128 15 0129 19 0130 DNA 0131 人工序列 0132 15 0133 accttcgctt acagccctg 19 0134 16 0135 21 0136 DNA 0137 人工序列 0138 16 0139 cctcacctgt gacagaaact g 21 0140 17 0141 18 0142 。

24、DNA 0143 人工序列 0144 17 0145 tgcctcgagg aggacagt 18 0146 18 0147 18 0148 DNA 0149 人工序列 0150 18 0151 accactcaat gggggagc 18 0152 19 0153 19 0154 DNA 0155 人工序列 0156 19 0157 gtaggctccc tgcagggaa 19 0158 20 0159 23 0160 DNA 0161 人工序列 0162 20 说 明 书 CN 104032025 A 9 8/12 页 10 0163 aacaagcagt gggtcacttg act 。

25、23 0164 21 0165 23 0166 DNA 0167 人工序列 0168 21 0169 ttctgcacag agaggggaag tag 23 0170 22 0171 21 0172 DNA 0173 人工序列 0174 22 0175 gggtcactgg gagctgacac a 21 0176 23 0177 24 0178 DNA 0179 人工序列 0180 23 0181 ctatgacatg taccatctat cctc 24 0182 24 0183 20 0184 DNA 0185 人工序列 0186 24 0187 aagcagtggg tcacttga。

26、cg 20 0188 25 0189 19 0190 DNA 0191 人工序列 0192 25 0193 gttcaggcag gagagaatc 19 0194 26 0195 21 0196 DNA 0197 人工序列 0198 26 0199 gtttgaccac tcgtagggtg c 21 0200 27 0201 19 说 明 书 CN 104032025 A 10 9/12 页 11 0202 DNA 0203 人工序列 0204 27 0205 atcctgcaat gttggtcgg 19 0206 28 0207 18 0208 DNA 0209 人工序列 0210 2。

27、8 0211 ctgcaggaca aggtcgca 18 0212 29 0213 19 0214 DNA 0215 人工序列 0216 29 0217 ggtgaaatca ggagagtag 19 0218 30 0219 21 0220 DNA 0221 人工序列 0222 30 0223 gtaggtccct gcaagggcag a 21 0224 31 0225 21 0226 DNA 0227 人工序列 0228 31 0229 caaacccttc ctgtctgccc g 21 0230 32 0231 19 0232 DNA 0233 人工序列 0234 32 0235 。

28、gtgccgacca cccagtaga 19 0236 33 0237 20 0238 DNA 0239 人工序列 0240 33 说 明 书 CN 104032025 A 11 10/12 页 12 0241 cccatgaacg taggctcacg 20 0242 34 0243 18 0244 DNA 0245 人工序列 0246 34 0247 cacacgcagg gcaggccg 18 0248 35 0249 18 0250 DNA 0251 人工序列 0252 35 0253 gtcaggacaa gccccctc 18 0254 36 0255 21 0256 DNA 0。

29、257 人工序列 0258 36 0259 gagtgtgggt gtgaactggc a 21 0260 37 0261 21 0262 DNA 0263 人工序列 0264 37 0265 ttctgcacag agaggggatc t 21 0266 38 0267 21 0268 DNA 0269 人工序列 0270 38 0271 gagccgacaa ctcatagggc g 21 0272 39 0273 22 0274 DNA 0275 人工序列 0276 39 0277 gtcagatgtc aggtttgagc tg 22 0278 40 0279 22 说 明 书 CN 。

30、104032025 A 12 11/12 页 13 0280 DNA 0281 人工序列 0282 40 0283 catggaatag ttgacctggg ac 22 0284 41 0285 17 0286 DNA 0287 人工序列 0288 41 0289 ggtccagagg gccggtg 17 0290 42 0291 20 0292 DNA 0293 人工序列 0294 42 0295 gaagagtcac gtgtcctccg 20 0296 43 0297 18 0298 DNA 0299 人工序列 0300 43 0301 gtctgcctgg cccagcct 18 。

31、0302 44 0303 22 0304 DNA 0305 人工序列 0306 44 0307 gtgtgaaccc cgacatctgt tc 22 0308 45 0309 20 0310 DNA 0311 人工序列 0312 45 0313 tctgaaggag aacatgtggc 20 0314 46 0315 18 0316 DNA 0317 人工序列 0318 46 说 明 书 CN 104032025 A 13 12/12 页 14 0319 tgaccaccca gtgaggag 18 0320 47 0321 20 0322 DNA 0323 人工序列 0324 47 0325 agcgagcatc ccccaaagtt 20 0326 48 0327 20 0328 DNA 0329 人工序列 0330 48 0331 gggcacgaag gctcatcatt 20 说 明 书 CN 104032025 A 14 1/1 页 15 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104032025 A 15 。