《转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测的引物和探针及方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测的引物和探针及方法.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 104032027 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104032027 A (21)申请号 201410304821.4 (22)申请日 2014.06.30 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 四川省农业科学院分析测试中心 地址 610000 四川省成都市锦江区净居寺路 20 号 (72)发明人 常丽娟 宋君 雷绍荣 郭灵安 刘勇 王东 尹全 刘文娟 张富丽 (74)专利代理机构 成都顶峰专利事务所 ( 普通 合伙 ) 51224 代理人 杨俊华 (54) 发明名称 转基因玉米 MIR60。
2、4 转化事件特异性定量 PCR 精准检测的引物和探针及方法 (57) 摘要 本发明属于生物技术领域， 涉及基因的定量 分析方法， 具体是指转基因玉米 MIR604 转化事 件特异性定量 PCR 精准检测方法。本发明采用 设计的特异性上游引物序列 MIR604eveF、 下游引 物序列 MIR604eveR、 荧光探针序列 MIR604eveP、 MIR604 的 DNA 稀 释 液 以 及 TaqmanMastermix （2） 和水配制成 PCR 反应体系， 进行定量 PCR 检 测。本发明主要建立了一种高扩增效率、 高准确 度的 Taqman 定量 PCR 检测技术， 适用于国内农业 转基。
3、因生物及产品监督检验、 进出境口岸转基因 生物及产品检验、 企业内部进口原材料含转基因 MIR604 品系生物成分检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104032027 A CN 104032027 A 1/1 页 2 1. 转基因玉米 MIR604 转化事件特异性定量 PCR 精准检测的引物和探针， 其特征在于 , 上游引物序列， MIR604eveF ： 5-GCCGTATCCGCAATGTGT。
4、TAT-3 ； 下游引物序列， MIR604eveR ： 5-CGACGCTTGCGCGAG-3 ； 荧光探针序列， MIR604eveP ： 5-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3。 2.转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测方法， 其特征在于,包括以下 步骤 ： （1） 合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针， 上游引物序列， MIR604eveF ： 5-GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3 下游引物序列， MIR604eveR ： 5-CGACGCTTGCGCGAG-3 荧光探针序列， MIR604eveP ： 5-FAM-AGAG。
5、TTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3 ； （2） 制备 MIR604 的 DNA 稀释液 ； （3） 配制 PCR 反应体系 ； （4） 定量 PCR 检测。 3.根据权利要求2所述的转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测方法， 其特征在于， 步骤 （1） 所述合成的引物及荧光探针的浓度均为 10mol/l， 步骤 （2） 所述制备 的 DNA 稀释液的浓度为 50ng/l。 4.根据权利要求3所述的转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测方法， 其特征在于， 步骤 （3） 所述的配制 PCR 反应体系， 即将 DNA 稀释液加入到反应体系中配制成 20。
6、l 的反应体系， 所述 20l 的反应体系包括以下组分 ： Taqman Master mix（2） 10l 上游引物 1l 下游引物 1l 荧光探针 0.5l DNA 稀释液 4.0l 水 3.5l。 5. 根据权利要求 2 或 4 所述的转基因玉米 MIR604 转化事件特异性定量 PCR 精准检测 方法， 其特征在于， 所述 PCR 反应条件为 ： 95预变性 10min， 1 个循环 ； 95变性 15s， 60 退火 60s， 45 个循环。 权 利 要 求 书 CN 104032027 A 2 1/5 页 3 转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测的引 物和探针及方。
7、法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及基因的定量的分析方法。 背景技术 0002 国际上很多国家对转基因产品实施限量标识和进口， 而我国尚无具体的转基因产 品标识阈值。为了打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒， 同时弥补和完 善我国转基因生物及产品定量检测技术体系， 更好地保护消费者对转基因产品的知情权和 选择权， 建立一种新型转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测方法已成为必 要。 0003 目前关于转基因玉米MIR604的检测技术， 主要集中在普通定性PCR分析方法和标 准， 尚无关于扩增检测转基因玉米MIR604及产品的转化事件特异性某特定位点。
8、 （基因序列） 的定量 PCR 精准检测技术。 发明内容 0004 本发明的目的主要是提供一种扩增效率高、 准确度高的检测转基因玉米 MIR604 及产品的转化事件特异性某特定位点的定量 PCR 精准检测技术。 0005 本发明通过下述技术方案实现 ： 转基因玉米 MIR604 转化事件特异性定量 PCR 精准检测的引物和探针， 其中， 上游引物序列， MIR604eveF ： 5-GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3 ； 下游引物序列， MIR604eveR ： 5-CGACGCTTGCGCGAG-3 ； 荧光探针序列， MIR604eveP ： 5-FAM-AGAGTTGGTGG。
9、TACGGGTA-TAMRA-3。 0006 转基因玉米 MIR604 转化事件特异性定量 PCR 精准检测方法， 包括以下步骤 ： （1） 合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针， 上游引物序列， MIR604eveF ： 5-GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3 下游引物序列， MIR604eveR ： 5-CGACGCTTGCGCGAG-3 荧光探针序列， MIR604eveP ： 5-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3 ； （2） 制备 MIR604 的 DNA 稀释液 ； （3） 配制 PCR 反应体系 ； （4） 定量 PCR 检测。 0007。
10、 进一步地， 步骤 （1） 所述合成的引物及荧光探针的浓度均为 10mol/l， 步骤 （2） 所 述制备的 DNA 稀释液的浓度为 50ng/l。 0008 再进一步地， 步骤 （3） 所述的配制 PCR 反应体系， 即将 DNA 稀释液加入到反应体系 中配制成 20l 的反应体系， 所述 20l 的反应体系包括以下组分 ： Taqman Master mix（2） 10l 上游引物 1l 说 明 书 CN 104032027 A 3 2/5 页 4 下游引物 1l 荧光探针 0.5l DNA 稀释液 4.0l 水 3.5l。 0009 另外， 所述PCR反应条件为 ： 95预变性10min。
11、， 1个循环 ； 95变性15s， 60退火 60s， 45 个循环。 0010 本发明具有以下优点及有益效果 ： （1） 本发明打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒 ； （2） 本发明弥补和完善我国转基因生物及产品定量检测技术体系 ； （3） 本发明提供的检测技术可更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权 ； （4） 本发明扩增效率高、 准确度高。 附图说明 0011 图 1 为本发明对非目标转化体的转基因作物和非转基因作物的检测结果图。 具体实施方式 0012 下面结合实施例对本发明做进一步的说明， 但本发明的实施方式并不限于此。 实施例 0013 转基因玉米 MIR604。
12、 转化事件特异性定量 PCR 精准检测方法， 主要包括以下步骤 ： （1） 合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针， 上游引物序列， MIR604eveF ： 5-GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3 下游引物序列， MIR604eveR ： 5-CGACGCTTGCGCGAG-3 荧光探针序列， MIR604eveP ： 5-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3。 0014 本实施例引物及荧光探针的合成浓度均为 10mol/l。 0015 以上引物和荧光探针的核苷酸序列是针对转基因玉米 MIR604 及产品的转化事件 特异性某特定位点， 即目的基因与受体玉。
13、米基因组旁侧位点设计 ； 通过该设计就可以精准 检测转基因玉米中 MIR604 的转化事件。 0016 （2） 制备MIR604的DNA稀释液 ； 即采用常规的DNA提取手段， 从转基因玉米MIR604 中提取出浓度为 50ng/l 的 DNA 稀释液。 0017 （3） 配制 PCR 反应体系 ； 即将 DNA 稀释液加入到反应体系中配制成 20l 的反应体 系， 所述 20l 的反应体系包括以下组分 ： Taqman Master mix（2） 10l 上游引物 1l 下游引物 1l 荧光探针 0.5l DNA 稀释液 4.0l 水 3.5l。 0018 （4） 定量 PCR 检测。 说 。
14、明 书 CN 104032027 A 4 3/5 页 5 0019 根据上述 PCR 反应体系， 在以下 PCR 反应条件下对产物进行扩增并检测， 所述 PCR 反应条件为 ： 95预变性 10min， 1 个循环 ； 95变性 15s， 60退火 60s， 45 个循环。本实施 例中采用的是 ABI 公司生产的 7500 型荧光定量 PCR 仪器。 0020 采用本发明对非转基因玉米、 水稻、 大豆、 棉花、 油菜、 甜菜以及 15 个玉米转化体， 5 个水稻转化体， 5 个大豆转化体， 3 个棉花转化体， 3 个油菜转化体和 1 个甜菜转化体进行 了特异性检测， 检测结果如图1所示， 从图。
15、1可看出本发明设计的引物和探针对以上非转基 因作物和转基因转化体均没有非特异扩增。另外图 1 中 Rn 代表荧光原始信号减去背景 信号的值。 0021 同时， 采用本发明对1%的转基因玉米MIR604转化事件特异性片段进行定量检测， 连续重复做 10 个平行样品的检测数据见表 1。 0022 表 1 检测样品 （1%， CRM） 转基因玉米 MIR604 特异片段定量检测结果 说 明 书 CN 104032027 A 5 4/5 页 6 实验次数 构建特异序列 Ct 值构建特异序列绝对含量 （ng）zSS bCt 值 zSS b 绝对含量 （ng）构建特异序列相对含量 （%） 132.0673。
16、.26023.577271.3631.20 232.0183.37423.415302.3651.12 331.9933.43423.400305.3391.12 431.9883.44623.268333.5641.03 531.9873.44723.267333.6841.03 631.9653.50023.254336.7981.04 731.9633.50623.234341.1201.03 831.9433.55423.234341.3181.04 931.9263.59623.232341.6941.05 1031.9193.61623.223343.7401.05 平均值31.9。
17、773.47323.310325.0981.07 另外， 采用不同核酸浓度的10%转基因玉米MIR604片段对本发明方法的灵敏度进行检 说 明 书 CN 104032027 A 6 5/5 页 7 测， 检测结果见表 2。 0023 表 2 转基因玉米 MIR604 结构特异片段灵敏度检测结果 采用本方法能够精准检测转基因玉米中 MIR604 品系特异片段及其含量， 获得标准曲 线斜率， 在 -3.6 -3.1 之间， 相关系数大于 0.99， 扩增效率为 100.6%， 在 90% 110% 的范 围内。待检样品的定量检测结果 （1.07%） 非常接近真实值 （1%） ， 检测结果的偏差率小。
18、于国 际认可的 25%， 检测结果的不确定度小于 10%。本发明灵敏度测定结果表面， 本发明最低能 检测到核酸浓度为 0.012ng， 约为 5 个拷贝。 0024 由以上检测结果可得知， 本方法的各指标均满足国际认可的精准基因定量检验方 法的范围， 本发明的扩增效率高、 准确度高。 说 明 书 CN 104032027 A 7 1/2 页 8 SEQUENCE LISTING 四川省农业科学院分析测试中心 转基因玉米 MIR604 转化事件特异性定量 PCR 精准检测的引物和探针及方法 3 PatentIn version 3.3 1 21 DNA Artifi cial 上游引物 （MIR604eveF） 1 gccgtatccg caatgtgtta t 21 2 15 DNA Artifi cial 下游引物 （MIR604eveR） 2 cgacgcttgc gcgag 15 3 19 序 列 表 CN 104032027 A 8 2/2 页 9 DNA Artifi cial 荧光探针 （MIR604eveP） 3 agagttggtg gtacgggta 19 序 列 表 CN 104032027 A 9 1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 104032027 A 10 。