测定土茯苓乙醇水溶液提取物中的总苷有效成分的方法 【技术领域】
本发明涉及药物分析方法领域，具体地说是测定土茯苓乙醇水溶液提取物中的总苷有效成分的方法。
技术背景
土茯苓为百合科植物光叶菝葜(Smilax glabra Roxb.)的干燥根茎；具有除湿，解毒，通利关节。用于湿热淋浊、带下、痈肿、瘰疬、疥癣、梅毒及汞中毒所致的肢体拘挛，筋骨疼痛。由于在采收、流通、临床应用等环节不太注重品种的鉴别，因此在土茯苓生产经营中品种比较混乱。例如：Smilax属菝葜S.china L.为混淆品。黑果菝葜S.glauco-china Warb.在四川南川作红土苓，江苏镇江称“鲜土苓”，为地方习用品。白土苓为同科肖菝葜属(Heterosmilax属)植物华肖菝葜H.chinensis Wang、短柱肖菝葜H.yunnanensis Gagnep.及肖菝葜H.japonica Kunth.的根茎。前两种为白土苓的主流种，在四川、湖北、河北、山东、新疆、宁夏、浙江等地分布及使用。
CN1772170A公开了”土茯苓总苷提取物及其制备方法和用途”，具体是用土茯苓药材经乙醇水溶液提取，用乙酸乙酯纯化的方法得到土茯苓总苷。土茯苓总苷为土茯苓药材经过提取、纯化的具有活性成分的一类物质的总称，用于治疗各种炎症和免疫性疾病。对于土茯苓总苷的质量控制，目前还未见文献报道。中药提取物为多组分的复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法。中药指纹图谱技术已成为公认的控制中药质量的有效手段之一。因此建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药材提取物中所含化学成分，进而对其质量进行整体描述和评价。
【发明内容】
本发明的目的是建立土茯苓乙醇水溶液提取物中的总苷的标准指纹图谱，并用此方法来测定土茯苓乙醇水溶液提取物中的总苷中的有效化学成分，作为土茯苓总苷的质量控制及真伪鉴别的指标之一。
本发明的技术方案是采用高效液相色谱法建立以落新妇苷色谱峰为内参比峰为特征峰的标准指纹图谱，具体是采取如下方法：
(a)供试品溶液的制备：精密称取土茯苓乙醇水溶液提取物(简称土茯苓总苷，以下同)的干粉1g，置于25mL容量瓶中，加入甲醇溶解，再稀释至刻度，摇匀，得土茯苓总苷供试品溶液；
(b)对照品溶液的制备：取落新妇苷对照品，用甲醇溶解配成每1mL含0.1mg落新妇苷的溶液；
(c)色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相：由A相为甲醇，B相为0.3％(V/V)的乙酸水溶液组成的梯度洗脱液；流速为0.8mL/min；检测波长325±2nm；柱温为30±5℃；理论塔板数以落新妇苷峰计算，不低于3000；
(d)测定：分别吸取落新妇苷对照品溶液及供试品溶液5μL，注入高效液相色谱仪，依法测定，记录色谱图。
按照本发明所提供的方法测定土茯苓总苷，以落新妇苷的色谱峰为内参比峰，其保留时间为1，计算相对保留时间，得土茯苓总苷的标准指纹图谱至少有10个特征共有峰。
1号峰平均相对保留时间(简称RT，以下同)0.580，相对标准偏差(简称RSD，以下同)为0.13％
2号峰RT为0.651，RSD为0.12％
3号峰RT为0.666，RSD为0.13％
4号峰RT为0.730，RSD为0.13％
5号峰RT为0.833，RSD为0.08％
6号峰RT为0.964，RSD为0.06％
7号峰RT为1，此峰为内参比峰
8号峰RT为1.085，RSD为0.30％
9号峰RT为1.116，RSD为0.05％
10号峰RT为1.164，RSD为0.06％。
本发明的优点如下：
1)以土茯苓总苷建立起来的HPLC指纹图谱，代表着土茯苓总苷中有主要药理活性的有效成分，能表征土茯苓总苷的质量。
2)以土茯苓总苷整个指纹图谱作为一个整体来评判，避免了因只测定一、二个化学成分而判定土茯苓总苷整体质量的片面性。
3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。下面结合实施例和附图进一步阐述本发明的技术方案
【附图说明】
图1落新妇苷的HPLC图谱
图2土茯苓总苷标准指纹图谱
图3十批次土茯苓总苷指纹图谱的组合图
下面结合具体实施例和附图进一步阐述本发明的技术方案。
具体实施方案
实施例1土茯苓总苷的制备
按CN1772170A所公开的文献中实施例2的方法。共制备了十批土茯苓总苷。批号分别是：S1批、S2批、S3批、S4批、S5批、S6批、S7批、S8批、S9批、S10批。
实施例2高效液相色谱法测定土茯苓总苷中有效化学成分，建立以落新妇苷色谱峰为内参比峰的标准指纹图谱
1仪器与试药
1.1仪器
1.2高效液相色谱仪：Agilent1100高效液相色谱仪，二极管阵列检测器。
1.3试药
对照品落新妇苷，自制，无色针状结晶，mp182-186℃，薄层图谱上为一个单一斑点，HPLC检测为单峰，面积归一化法测定含量大于99％。甲醇为色谱纯，，其他所用试剂均为分析纯。
2方法与结果
色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为Lichrospher C-18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：A相为甲醇，B相为0.3％(V/V)的乙酸溶液组成液梯度洗脱，洗脱条件见表1；流速：0.8mL·min-1；检测波长：325±2nm；检测时间：105min；柱温：30±5℃；进样量：5μL。理论塔板数以落新妇苷峰计算，应不低于3000。
表1指纹图谱梯度洗脱条件
注：表中A相为甲醇，B相为0.3％的乙酸溶液。
对照品溶液的制备取落新妇苷对照品适量，用流动相稀释，制成制成0.10mg/mL对照品溶液。
内参比峰 选用落新妇苷色谱峰为内参比峰。
供试品溶液制备分别精密称取取土茯苓总苷S1批、S2批、S3批、S4批、S5批、S6批、S7批、S8批、S9批、S10批1g，置25mL的容量瓶中，加入甲醇溶解，再稀释至刻度，摇匀，滤过，得土茯苓总苷供试品溶液；
测定：分别吸取落新妇苷对照品溶液及供试品溶液5μL，注入高效液相色谱仪，依法测定，记录色谱图，落新妇苷对照品溶液的色谱图见附图1；建立的标准指纹图谱见附图2。
实施例3 测定10批土茯苓总苷的指纹图谱，确定土茯苓总苷的特征共有峰
试验方法同实施例2。结果如图3所示。
以落新妇苷的色谱峰为内参比峰，其保留时间为1计算相对保留时间。
通过对10批土茯苓总苷指纹图谱测定，比较其色谱图，根据国家药品监督管理局颁布的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》相关原则，确定共有峰为10个。10批总苷共有峰相对保留时间统计结果见表2。从表2的结果看，10个共有峰的相对保留时间RSD均小于3％，比较稳定。通过对10批土茯苓总苷指纹图谱测定，比较其色谱图，确定共有峰为10个：
1号峰RT为0.580，RSD为0.13％
2号峰RT为0.651，RSD为0.12％
3号峰RT为0.666，RSD为0.13％
4号峰RT为0.730，RSD为0.13％
5号峰RT为0.833，RSD为0.08％
6号峰RT为0.964，RSD为0.06％
7号峰RT为1，此峰为内参比峰
8号峰RT为1.085，RSD为0.30％
9号峰RT为1.116，RSD为0.05％
10号峰RT为1.164，RSD为0.06％。
相似度评价 采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版计算相似度。结果见表3，十个不同批次的土茯苓总苷相似度均大于0.9。经匹配后地指纹图谱见附图3。
表3：土茯苓总苷指纹图谱相似度计算结果
实施例4本发明的方法的精密度试验
以土茯苓总苷S1批为供试品，取同一份供试品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，记录各特征峰的保留时间和峰面积，以落新妇苷为参照，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD不大于0.5％，相对峰面积的RSD不大于1.0％。结果见表4、表5。
表4精密度试验共有峰相对保留时间统计
表5精密度试验共有峰相对峰面积统计
指纹图谱重现性试验
精密称取干燥的土茯苓总苷S1批粉末6份，每份1.0g，按“2.1”项下制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行HPLC分析，记录各特征峰的保留时间和峰面积，以落新妇苷为参照，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD不大于1.0％，相对峰面积的RSD不大于2.0％。结果见表6、表7。
表6重现性试验共有峰相对保留时间统计
表7重现性试验共有峰相对峰面积统计
指纹图谱稳定性试验
取土茯苓总苷S1批供试品溶液分别在0，2，4，8，12，24h进样分析，记录各特征峰的保留时间和峰面积，以落新妇苷为参照，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD不大于1.5％，相对峰面积的RSD不大于2.5％，说明供试品溶液在24h内稳定。结果见表8、表9。
表8稳定性试验共有峰相对保留时间统计
表9稳定性试验共有峰相对峰面积统计
以上试验显示，该方法稳定可靠，符合方法学验证的要求。