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1、(10)申请公布号 CN 103992390 A (43)申请公布日 2014.08.20 CN 103992390 A (21)申请号 201310412014.X (22)申请日 2013.09.10 C07K 7/16(2006.01) C07K 1/06(2006.01) C07K 1/04(2006.01) (71)申请人 杭州诺泰制药技术有限公司 地址 310018 浙江省杭州市下沙经济开发区 6 号大街 452 号 (72)发明人 程丽 杨东晖 路杨 周亮 (54) 发明名称 一种合成卡贝缩宫素的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种合成卡贝缩宫素的技术， 解 决了现有技术存在的成。
2、本高， 纯度低， 杂质多的 问题。本发明的具体步骤为 ： 首先， 在 wang 树 脂上依次偶联 7 个氨基酸， 偶联氨基酸顺序为 ： Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Tyr(Me)-OH ； 然后， 去保护基 Fmoc 后， 连接 4- 氯丁酸， 裂解得到酰化的卡贝缩 宫素 7 肽线性肽， 在碱性条件下液环得到卡贝缩 宫素 7 肽环肽粗肽， 粗肽经纯化冻干后得到卡贝 缩宫素 7 肽环肽精肽 ； 最后， 纯化冻干后的卡贝缩 宫素 7 。
3、肽环肽片段和 H-Gly-NH2.HCl 偶联， 得到卡 贝缩宫素。本发明提供了一种成本低、 收率较高， 适合规模化生产的卡贝缩宫素的合成工艺。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书11页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103992390 A CN 103992390 A 1/1 页 2 1. 一种合成卡贝缩宫素的方法， 所述方法步骤如下 ： 步骤 1， 固相合成酰化的卡贝缩宫素 7 肽线性肽树脂 ； 步骤 2， 去保护基 Fmoc 后， 连接 4- 氯丁酸， 然后裂。
4、解得到酰化的卡贝缩宫素 7 肽线性 肽 ； 步骤 3， 液环得到卡贝缩宫素 7 肽环肽粗肽， 然后纯化冻干后得到卡贝缩宫素 7 肽环肽 精肽 ； 步骤 4， 纯化冻干后的卡贝缩宫素 7 肽环肽片段和 H-Gly-NH2.HCl 偶联， 得到卡贝缩宫 素。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是 ： 其中， 步骤 1 所述的固相合成方法， 以低成本的 wang 树脂为起始原料， 依次偶 联 7 个 氨 基 酸， 偶 联 氨 基 酸 顺 序 为 ： Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH、 Fmoc-Gln(。
5、Trt)-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Tyr(Me)-OH ； 其中， 步骤2所述去保护基Fmoc后， 连接4-氯丁酸所用缩合试剂为 ： DIC， HOBt， 操作过 程为 ： 将 4- 氯丁酸和 HOBt 用溶剂 DMF 溶解， 冰浴冷却温度为 0-10， 加入 DIC， 激活 5 分 钟后加入到反应柱中与脱完保护的树脂进行反应， 25-35下反应 2 小时， 裂解条件为 ： 裂 解液为 VTFA:VTis=95:5， 裂解温度 20-30， 裂解时间 2 小时 ； 其中， 步骤 3 所述的液环溶剂为 VH2O: VACN=50:50， 反应浓度为 1mg/mL， 反应温度 。
6、： 20-25， 反应液使用 TEA 调 pH 值至 7-10 ； 其中， 步骤4所述的卡贝缩宫素7肽环肽片段和H-Gly-NH2.HCl 偶联条件为 ： 缩合试剂 为 ： HOBt、 DCC， 反应溶剂为 ： DMF， 反应温度 ： 在 0oC 反应 2 小时， 然后在 25oC 反应 6 小时。 3.根据权利要求1 所述的方法， 其特征是 ： 固相合成时， 起始树脂选用Wang树脂， 降低 了成本。 4.根据权利要求1 所述的方法， 其特征在于 ： 先得到卡贝缩宫素7肽环肽片段， 然后再 将其与 H-Gly-NH2.HCl 偶联， 有效避免了多甘和缺甘等杂质， 得到高收率和高纯度的卡贝 缩。
7、宫素。 权 利 要 求 书 CN 103992390 A 2 1/11 页 3 一种合成卡贝缩宫素的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种多肽类药物的合成方法， 是一种合成的具有激动剂性质的长效催 产素卡贝缩宫素的合成方法。 背景技术 0002 卡贝缩宫素， 英名为 ： Carbetocin， 为一种环状多肽 , 是一种合成的具有激动剂性 质的长效催产素九肽类似物。硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药， 以预 防子宫张力不足和产后出血。卡贝缩宫素的临床和药理特性与天然产生的催产素类似。像 催产素一样， 卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合， 引起子宫的节律性收缩， 在原有 的收缩。
8、基础上， 增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下， 子宫的催产素受体含量很 低， 在妊娠期间增加， 分娩时达高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用， 但是对妊 娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。 0003 捷克专利 CS255616 率先使用固相多肽合成方法合成卡贝缩宫素， 具体步骤为 ： （1） 合成 Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-O- 树脂，（2） 裂解得到 Z-Ile-Gln-Asn- Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2，（3） 氢化去保护得到 Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2，（4） 。
9、Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2与 4- 溴丁酸反应， 得到 Ile-Gln-Asn-Cys(C3H6COOH)- Pro-Leu-Gly-NH2，（5） Ile-Gln-Asn-Cys(C3H6COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2与 X-Tyr(Me)-OH 反 应， 脱保护， 环化得到卡贝缩宫素。该方法使用氢化去保护法， 工业化生产设备操作安全隐 患较大， 同时该工艺需要多步液相合成， 都需要对产物分离纯化或沉淀以便除去未反应的 原料和副产物， 这个过程相当费时、 繁琐， 操作带来的损失非常大。 总之， 该方法不利于工业 生产、 应用价值不高。 0004。
10、 西班牙专利 ES2115543 公开了一种卡贝缩宫素的制备方法， 具体步骤为 ：（1） 合成 主肽链结构， N 末端氨基与 4- 氯丁酸连接，（2） 半胱氨酸巯基脱保护基团， 同时断开多肽链 与树脂的连接，（3） 碱性条件下通过巯基的亲核进攻反应形成成硫醚键进行分子内的环化。 该工艺为液相环化合成工艺， 操作复杂， 步骤相当费时， 不利于工业生产、 应用价值不高。 0005 中国专利 CN102477082 一种液相合成法合成卡贝缩宫素的方法， 具体步骤为先分 别合成中间体 I ： 4-Bromobutyryl-Tyr(me)-Ile-OH、 中间体 II ： H-Gln(Trt)-Asn(。
11、Trt)-Cy s(Trt)-ome 和中间体III ： H-Pro-Leu-Gly-NH2， 接着中间体I、 II 和III 在液相中缩合成 未成环产品IV， 最后IV在碱性条件下环化得到卡贝缩宫素。 该方法为液相合成三个片段后 再合成目的肽法， 每次接肽以后都需要对产物分离纯化或沉淀以便除去未反应的原料和副 产物， 这个过程相当费时、 繁琐， 操作带来的损失非常大， 因此不利于工业生产、 应用价值不 高。 0006 中国专利 CN102260326 、 CN102796178、 CN101555272 都是通过固相合成法依次连 接具有Fmoc 保护基团的氨基酸， 脱保护基， 环化， 得到卡。
12、贝缩宫素。 该方法在合成过程中非 常容易产生多甘和缺甘现象， 且该方法多采用氨基树脂， 价格昂贵， 不适用于工业化规模生 产。 说 明 书 CN 103992390 A 3 2/11 页 4 0007 中国专利 CN102146122 通过固相合成法依次连接具有 Fmoc 保护基团的氨基酸， 脱去半胱氨基酸的侧链保护基， 接入溴丁酸， 去末端氨基的 Fmoc 保护， 环化， 得到卡贝缩宫 素。该方法合成中两次去保护， 费时、 繁琐， 且固相环化收率不高。 0008 现有卡贝缩宫素的固相合成过程中， 由于合成步骤较多， 纯度和收率不高， 原料价 格昂贵， 不适于工业化规模生产。 0009 本发明。
13、人用现有的合成方法， 制备卡贝缩宫素， 发现合成步骤较多， 原料价格昂 贵， 纯度和收率不高， 不适于工业化规模生产。为此， 本发明人对卡贝缩宫素的合成方法进 行了研究， 从而得到了本发明的技术方案。 发明内容 0010 本发明的目的是提供一种卡贝缩宫素的固相合成方法。 本发明需要解决的技术问 题是 ：（1） 选择一种合适的树脂等原料， 解决氨基树脂价格昂贵、 不适用于工业化生产的问 题，（2） 选择一种合适的工艺路线， 解决卡贝缩宫素合成过程中容易出现多甘或缺甘等杂质 的现象， 以得到纯度和收率更高的产品 （3） 选择一种成本低廉且便于工业化规模生产的卡 贝缩宫素的固相合成方法。 0011 。
14、本发明的合成路线如图 1 所示 ： 如图 1 所示， 首先在 wang 树脂上依次偶联上图 1 中所示的 7 个氨基酸， 偶联氨基酸顺序为 ： Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Tyr(Me)-OH， 去完保护基 Fmoc 后， 再在树脂上连接上4-氯丁酸， 然后裂解得到图中的7肽线性肽， 最后在碱性条件下液环 得到7肽环肽片段， 最后用纯化后的7肽环肽片段和H-Gly-NH2 偶联， 得到收率和纯度都较 高的卡贝缩宫素。 0012 。
15、本发明中一些常用的缩写具有以下含义 ； Fmoc ： 芴甲氧羰基 Fmoc-AA ： 芴甲氧羰基保护的氨基酸 tBu ： 叔丁基 HOBt ： 1- 羟基苯骈三唑 DIC ： N， N - 二异丙基碳化二亚胺 Tyr(Me) ： 酪氨酸侧链用甲基保护 Ile ： 异亮氨酸 Gln ： 谷氨酰胺 Asn ： 天门冬酰胺 Cys ： 半胱氨酸 Pro ： 脯氨酸 Leu ： 亮氨酸 Gly ： 甘氨酸 Trt ： 三苯甲基 Me ： 甲基 DMF ： N， N - 二甲基甲酰胺 Piperidine ： 六氢吡啶 说 明 书 CN 103992390 A 4 3/11 页 5 TFA ： 三氟醋酸。
16、 TIS ： 三异丙基硅烷 MeOH ： 甲醇 DCM ： 二氯甲烷 DMAP ： 4- 二甲氨基吡啶 Kniser test 检测试剂为 ： 茚三酮 DCC ： N， N - 二环己基碳二亚胺 为此本发明提供一种卡贝缩宫素的合成方法， 其步骤如下 ： 步骤 1， 固相合成酰化的卡贝缩宫素 7 肽线性肽树脂 ； 步骤 2， 去保护基 Fmoc 后， 连接 4- 氯丁酸， 然后裂解得到酰化的卡贝缩宫素 7 肽线性 肽 ； 步骤 3， 液环得到卡贝缩宫素 7 肽环肽粗肽， 然后纯化冻干后得到卡贝缩宫素 7 肽环肽 精肽 ； 步骤 4， 纯化冻干后的卡贝缩宫素 7 肽环肽片段和 H-Gly-NH2.。
17、HCl 偶联， 得到卡贝缩宫 素。 0013 其中， 步骤 1 所述的固相合成方法， 以低成本的 wang 树脂为起始原料， 依次 偶联 7 个氨基酸， 偶联氨基酸顺序为 ： Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Tyr(Me)-OH。 0014 其中， 步骤2所述去保护基Fmoc后， 连接4-氯丁酸所用缩合试剂为 ： DIC， HOBt， 操 作过程为 ： 将 4- 氯丁酸和 HOBt 用溶剂 DMF 溶解， 冰浴冷却温度为 0-10，。
18、 加入 DIC， 激活 5 分钟后加入到反应柱中与脱完保护的树脂进行反应， 25-35下反应 2 小时。裂解条件为 ： 裂解液为 VTFA:VTis=95:5， 裂解温度 20-30， 裂解时间 2 小时。 0015 其中， 步骤 3 所述的液环溶剂为 VH2O: VACN=50:50， 反应浓度为 1mg/mL， 反应温度 ： 20-25， 反应液使用 TEA 调 pH 值至 7-10。 0016 其中， 步骤 4 所述的卡贝缩宫素 7 肽环肽片段和 H-Gly-NH2.HCl 偶联条件为 ： 缩 合试剂为 ： HOBt、 DCC， 反应溶剂为 ： DMF， 反应温度 ： 在 0oC 反应 。
19、2 小时， 然后在 25oC 反应 6 小 时。 0017 本发明的方法是经过筛选获得的， 筛选过程如下 ： 1、 卡贝缩宫素 7 肽环肽片段 ： H-Gly-NH2.HCl ： HOBt ： DCC 的摩尔比的选择 ： 卡 贝 缩 宫 素 7 肽 环 肽 片 段 ： H-Gly-NH2.HCl ： HOBt ： DCC 的 摩 尔 比 为 ： 1:1:1:1 和 1:1.2:1.2:1.1 ； 2、 反应温度的选择 ： 25oC 和 35oC 和 45oC 3、 反应时间的选择 ： 反应时间为 :4 小时、 6 小时和 8 小时。 0018 为此提出了 6 种实验条件 ： 实验条件 1 ： 。
20、0.61g (0.62mmol) 卡贝缩宫素 7 肽环肽片段、 82.2mg (0.74 mmol) H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg(0.74mmol)HOBt、 108l (0.74mmol) 三乙胺加入 5ml DMF 中搅 拌溶解， 冷却到 0oC， 将 140.7mg(0.68mmol)DCC 加入上述溶液中， 在 0oC 反应 2 小时， 然后在 说 明 书 CN 103992390 A 5 4/11 页 6 25oC 反应 6 小时， 过滤， 油泵真空旋蒸除去 DMF， 经反相 HPLC 纯化、 冻干后得到卡贝缩宫素 精肽 ； 实验条件 2 ： 0.61g (0.6。
21、2mmol) 卡贝缩宫素 7 肽环肽片段、 68.5mg (0.62 mmol) H-Gly-NH2.HCl 和 83.8mg(0.62mmol)HOBt、 89.6l (0.62mmol) 三乙胺加入 5ml DMF 中搅 拌溶解， 冷却到 0oC， 将 127.9mg(0.62mmol)DCC 加入上述溶液中， 在 0oC 反应 2 小时， 然后在 25oC 反应 6 小时， 过滤， 油泵真空旋蒸除去 DMF， 经反相 HPLC 纯化、 冻干后得到卡贝缩宫素 精肽 ； 实验条件 3 ： 0.61g (0.62mmol) 卡贝缩宫素 7 肽环肽片段、 82.2mg (0.74 mmol) H。
22、-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg(0.74mmol)HOBt、 108l (0.74mmol) 三乙胺加入 5ml DMF 中搅 拌溶解， 冷却到 0oC， 将 140.7mg(0.68mmol)DCC 加入上述溶液中， 在 0oC 反应 2 小时， 然后在 35oC 反应 6 小时， 过滤， 油泵真空旋蒸除去 DMF， 经反相 HPLC 纯化、 冻干后得到卡贝缩宫素 精肽 ； 实验条件 4 ： 0.61g (0.62mmol) 卡贝缩宫素 7 肽环肽片段、 82.2mg (0.74 mmol) H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg(0.74mmol)HOBt、 108l。
23、 (0.74mmol) 三乙胺加入 5ml DMF 中搅 拌溶解， 冷却到 0oC， 将 140.7mg(0.68mmol)DCC 加入上述溶液中， 在 0oC 反应 2 小时， 然后在 45oC 反应 6 小时， 过滤， 油泵真空旋蒸除去 DMF， 经反相 HPLC 纯化、 冻干后得到卡贝缩宫素 精肽 ； 实验条件 5 ： 0.61g (0.62mmol) 卡贝缩宫素 7 肽环肽片段、 82.2mg (0.74 mmol) H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg(0.74mmol)HOBt、 108l (0.74mmol) 三乙胺加入 5ml DMF 中搅 拌溶解， 冷却到 0oC，。
24、 将 140.7mg(0.68mmoll)DCC 加入上述溶液中， 在 0oC 反应 2 小时， 然后 在 25oC 反应 4 小时， 过滤， 油泵真空旋蒸除去 DMF， 经反相 HPLC 纯化、 冻干后得到卡贝缩宫 素精肽 ； 实验条件 6 ： 0.61g (0.62mmol) 卡贝缩宫素 7 肽环肽片段、 82.2mg (0.74 mmol) H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg(0.74mmol)HOBt、 108l (0.74mmol) 三乙胺加入 5ml DMF 中搅 拌溶解， 冷却到 0oC， 将 140.7mg(0.68mmol)DCC 加入上述溶液中， 在 0oC 反。
25、应 2 小时， 然后在 25oC 反应 8 小时， 过滤， 油泵真空旋蒸除去 DMF， 经反相 HPLC 纯化、 冻干后得到卡贝缩宫素 精肽。 0019 实验结果如下 ： 实验条件收率纯度 实验条件 1 73.1% 99.95% 实验条件 2 71.3% 99.61% 实验条件 3 69.8% 99.06% 实验条件 4 70.6% 99.62% 实验条件 5 72.2% 99.32% 实验条件 6 68.3% 99.26% 以上结果表明， 实验条件 1 的纯化效果最优。 0020 本发明的方法和现有技术相比具有明显的优势， 有关对比实验如下 ： 专利收率纯度 本发明技术73.1%99.95%。
26、 CN10226032667.8%99.4% CN10279617851%99.3% CN10155527245%99% CN10214612275%NA 说 明 书 CN 103992390 A 6 5/11 页 7 本发明的有益效果是 ： 选用 wang 树脂作为起始树脂， 解决了氨基树脂价格昂贵、 不适 用于工业化生产的问题 ； 解决了卡贝缩宫素合成过程中容易出现多甘或缺甘等杂质的现 象， 提高了最终产品的纯度和收率 ； 本发明的工艺为成本低廉且便于工业化规模生产的卡 贝缩宫素的固相合成方法。 附图说明 0021 图 1 本发明的合成路线 ； 图 2 实 施 例 1 卡 贝 缩 宫 素 。
27、精 肽 HPLC 图 谱 （色 谱 柱 ： YMC-Pak ODS-AQ, (3m) (150mm4.6mm) 色谱柱或相当柱 ； 流动相 ： 流动相 A ： 磷酸盐缓冲液 （取磷酸二氢钾 6.355g， 磷酸氢二钠二水合物 3.563g， 加水溶解并定容至 1000ml。 ） - 乙腈 （76:24） ； 流动相 B ： 乙腈 ； 洗脱流速 ： 1ml/min ； 检测波长 ： 220nm ； 柱温 ： 40 ； 洗脱梯度 ： 洗脱梯度的初始状 态为 20%B， 在 35 分钟内将流动相 B 增至 35%， 然后再在 1 分钟内将流动相 B 减至 20%， 保持 6 分钟） ； 图 3 实 。
28、施 例 2 卡 贝 缩 宫 素 精 肽 HPLC 图 谱 （色 谱 柱 ： YMC-Pak ODS-AQ, (3m) (150mm4.6mm) 色谱柱或相当柱 ； 流动相 ： 流动相 A ： 磷酸盐缓冲液 （取磷酸二氢钾 6.355g， 磷酸氢二钠二水合物 3.563g， 加水溶解并定容至 1000ml。 ） - 乙腈 （76:24） ； 流动相 B ： 乙腈 ； 洗脱流速 ： 1ml/min ； 检测波长 ： 220nm ； 柱温 ： 40 ； 洗脱梯度 ： 洗脱梯度的初始状 态为 20%B， 在 35 分钟内将流动相 B 增至 35%， 然后再在 1 分钟内将流动相 B 减至 20%， 保。
29、持 6 分钟） 。 具体实施方式 0022 以下通过实施例进一步说明本发明。 0023 实施例 1 ： （1） 氨基酸树脂合成 ： 称取 1.25g(1.0mmol )Wang Resin（替代度为 0.80mmol/g） 加 入到反应柱中， 加入 15ml DCM， 在 15-35下搅拌溶胀 30min， 抽滤除去液体。称取 1.06g (3.0mmol) Fmoc-Leu-OH、 0.41g (3.0mmol) HOBt装入溶解罐。 量取6ml的DMF溶剂加入罐 中， 搅拌溶解， 完全溶解后冰浴降温至 0-15左右， 加入 464l (3.0mmol) 的 DIC， 搅拌均 匀后控温 10。
30、-25保持 5min， 加入 0.04g (0.3mmol) DMAP, 然后加入到反应柱内， 25-35 反应 5h， 取样检测替代度为 0.63 mmol/g， 抽除反应液。量取 10ml DMF 加入反应柱， 搅拌洗 涤3分钟， 重复洗涤3次。 量取525l (5.5mmol)乙酸酐， 445l (5.5mmol)吡啶， 10mlDMF 溶液， 混合均匀后加入反应柱内搅拌反应 60min， 抽除反应液。量取 10ml DMF 加入反应柱， 搅拌洗涤 3 分钟， 重复洗涤 3 次。量取 10ml MeOH 加入反应柱， 搅拌洗涤 3 分钟， 重复洗涤 3 次。量取 15ml DCM 加入反。
31、应柱， 搅拌洗涤 3 分钟， 重复洗涤 3 次。 0024 （2） 去保护 ： 加入 V Piperidine:VDMF=20:80 混合溶液， 搅拌反应 5min 后抽去， 再次加 入上述混合溶液， 搅拌反应 10min 后抽去， 如此进行 2 次脱保护， 然后用 DMF 洗涤 6 次， 每次 15mL。 0025 （3） 偶联 Fmoc-Pro-OH ： 将 1.01g (3.0mmol) Fmoc- Pro-OH 和 0.41g (3.0mmol) HOBt 用溶剂 DMF 溶解， 冰浴冷却温度为 010， 加入 465l DIC， 激活 5 分钟后加入到反 应柱中与脱完保护的树脂进行反。
32、应， 25-35下反应 2 小时， 取少量树脂使用 Kniser test 说 明 书 CN 103992390 A 7 6/11 页 8 检测为阴性， 抽除液体， DMF 洗涤 3 次， 每次 15mL。 0026 （4）重复偶联 ： 重复去除 Fmoc 保护基及接肽反应步骤的操作， 按照卡贝缩宫 素氨基酸序列， 依次偶联 ： Fmoc-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Tyr(Me)-OH、 4- 氯丁酸。 0027 （5） 裂解 ： 将上述肽树脂用15 ml DCM溶液洗涤， 抽去， 再重。
33、复一次DCM洗涤 ； 用15 ml 甲醇溶液洗涤， 抽去， 再重复一次甲醇洗涤 ; 用 15 ml DCM 溶液洗涤， 抽去， 再重复一次 DCM 洗涤 ； 用 15 ml 甲醇溶液洗涤， 抽去， 再重复一次甲醇洗涤。转出树脂， 真空干燥。干燥 所得的卡贝缩宫素环肽树脂， 用 VTFA:VTis=95:5 裂解液裂解 2 小时， 过滤树脂得到滤液， 浓缩 裂解液至原体积的20-30%， 使用6倍浓缩后裂解液体积的的乙醚 （小于0） 在小于0条件 下沉降 0.5 小时， 离心， 弃上清液， 固体用 3 倍体积的乙醚洗涤 6 次， 所得固体室温 15-35 干燥 1 小时， 油泵减压干燥 4 小时。
34、， 碾磨成粉， 然后环化。2 小时后过滤除去树脂， 滤液加入 到乙醚中， 沉降后离心， 离心洗涤 5 次后， 真空干燥制得 7 肽线性肽片段 ： 0.98g。 0028 （6） 环化 ： 将 0.98g 的 7 肽线性肽片段加入到 500ml 纯净水和 500ml 的乙腈混合 水溶液中， 加入 2ml TEA， 在 20-25反应 ： 24h。 0029 （7） 卡贝缩宫素 7 肽环肽片段纯化 ： 使用醋酸调 pH 值至 3.5-4.5， 粗肽环化液在 305 oC、 减压条件下旋蒸浓缩， 浓缩至 650ml 以下， 再加入纯化水稀释至 1000ml。使用 0.45m 的有机系滤膜减压过滤， 。
35、待纯化。 0030 制备条件设置如下 ： 色谱柱 ： 色谱填料为 Daisogel 的 C18 填料， 粒径为 10 m， 色谱柱尺寸 525 cm 检测波长 ： 230 nm 上样流速 ： 50 ml/min 洗脱流速 ： 80 ml/min 流动相 A ： 0.1%TFA 水溶液 流动相 B ： ACN 流动相配制 ： 按 VTFA:V纯化水=0.1:100 配制 0.1%TFA 水溶液 20L， 即得流动相 A ： 0.1%TFA 水溶液。 0031 冲柱 ： 按体积分数设置梯度， 使用 50% 的 ACN +50% 水， 冲洗 10min ； 然后使用 5% 的 ACN +95% 水，。
36、 冲洗 15min。 0032 平衡 ： 按体积分数设置梯度， 使用 95% 流动相 A+5% 流动相 B 平衡 15min。 0033 上样 ： 使用流动相 A 管道上样。 0034 洗脱 ： 按体积分数设置梯度， 使用 0.1%TFA 的水溶液 (A 相 ) 和 ACN (B 相 ) 梯度洗脱， 洗脱梯 度为 : 步骤时间流动相 B(%) 105 225 32020 44340 说 明 书 CN 103992390 A 8 7/11 页 9 馏分收集 ： 待检测器信号出峰时 （起始出峰时间在20-25 min之间） ， 分部收集主峰各馏分， 将符合 要求的目的肽的组分合并收集。 0035 。
37、冻干 ： 将纯化峰顶在 305 oC、 减压条件下旋蒸浓缩， 浓缩后体积在旋蒸前总体积 75% 以下。 将冻干盘放入冰箱冷冻室 (-20 oC) 中， 预冻 6 h。开启冻干机， 打开制冷， 预冷 30 min 以 上， 设置冻干曲线如下 ： 第一段 ： 在 -27 oC 运行 16 h ； 第二段 ： 在 -5 oC 运行 4 h ； 第三段 ： 在 5 oC 运行 2 h ； 第 四段 ： 在 30 oC 运行 16 h。 0036 冻干后得到 7 肽环肽精肽片段 ： 0.86g， 纯度 ： 95.55%。 0037 （8） 偶联生成卡贝缩宫素 ： 0.86g (0.87mmol) 卡贝缩。
38、宫素 7 肽环肽片段、 115.3mg (1.04mmol)H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg(1.04mmol)HOBt、 151l (1.04mmol) 三乙胺加入 9ml DMF 中搅拌溶解， 冷却到 0oC， 将 197mg(0.95mmol)DCC 加入上述溶液中， 在 0oC 反应 2 小 时， 然后在 25oC 反应 6 小时， 过滤， 油泵真空旋蒸除去 DMF， 剩余固体用 100mL 纯化水溶解， 并用醋酸调 pH 值至 3.5-4.5。 0038 （9） 卡贝缩宫素纯化 ： 将上步粗肽溶液， 使用 0.45m 的有机系滤膜减压过滤， 待 纯化。 0039 制备条。
39、件设置如下 ： 色谱柱 ： 色谱填料为 Daisogel 的 C18 填料， 粒径为 10 m， 色谱柱尺寸 525 cm 检测波长 ： 230 nm 上样流速 ： 50 ml/min 洗脱流速 ： 80 ml/min 流动相 A ： 0.3%HAc 水溶液 流动相 B ： ACN 流动相配制 ： 按 VHAc:V纯化水=0.3:100 配制 0.3%HAc 水溶液 20L， 即得流动相 A ： 0.3%HAc 水溶液。 0040 冲柱 ： 按体积分数设置梯度， 使用 50% 的 ACN +50% 水， 冲洗 10min ； 然后使用 5% 的 ACN +95% 水， 冲洗 15min。 00。
40、41 平衡 ： 按体积分数设置梯度， 使用 95% 流动相 A+5% 流动相 B 平衡 15min。 0042 上样 ： 使用流动相 A 管道上样。 0043 洗脱 ： 按体积分数设置梯度， 使用 0.3% HAc 的水溶液 (A 相 ) 和 ACN (B 相 ) 梯度洗脱， 洗脱 梯度为 : 步骤时间流动相 B(%) 105 225 3725 44340 说 明 书 CN 103992390 A 9 8/11 页 10 馏分收集 ： 待检测器信号出峰时 （起始出峰时间在20-25 min之间） ， 分部收集主峰各馏分， 将符合 要求的目的肽组分合并收集。 0044 冻干 ： 将纯化峰顶在 3。
41、05 oC、 减压条件下旋蒸浓缩， 浓缩后体积在旋蒸前总体积 75% 以下。 将冻干盘放入冰箱冷冻室 (-20 oC) 中， 预冻 6 h。开启冻干机， 打开制冷， 预冷 30 min 以 上， 设置冻干曲线如下 ： 第一段 ： 在 -27 oC 运行 16 h ； 第二段 ： 在 -5 oC 运行 4 h ； 第三段 ： 在 5 oC 运行 2 h ； 第 四段 ： 在 30 oC 运行 16 h。 0045 冻干后得到卡贝缩宫素精肽 ： 0.76g， 纯度 ： 99.95%， 水分 ： 2% 醋酸 ： 3%， 收率 ： 73.1%。精肽图谱见图 2。 0046 实施例 2 ： 100mmo。
42、l （1） 氨基酸树脂合成 ： 称取 125g(100.0mmol )Wang Resin（替代度为 0.80mmol/g） 加 入到反应柱中， 加入 1.4L DCM， 在 15-35下搅拌溶胀 30min， 抽滤除去液体。称取 106g (300mmol) Fmoc-Leu-OH、 41g (300mmol) HOBt装入溶解罐。 量取500ml的DMF溶剂加入罐 中， 搅拌溶解， 完全溶解后冰浴降温至 0-15左右， 加入 46.4mL (300mmol) 的 DIC， 搅拌均 匀后控温 10-25保持 5min， 加入 4.0g (30mmol) DMAP, 然后加入到反应柱内， 25。
43、-35反 应 5h， 取样检测替代度为 0.63 mmol/g， 抽除反应液。量取 900ml DMF 加入反应柱， 搅拌洗 涤 3 分钟， 重复洗涤 3 次。量取 52.5mL (550mmol) 乙酸酐， 44.5mL (550mmol) 吡啶， 900mL DMF 溶液， 混合均匀后加入反应柱内搅拌反应 60min， 抽除反应液。量取 900ml DMF 加入反 应柱， 搅拌洗涤 3 分钟， 重复洗涤 3 次。量取 900ml MeOH 加入反应柱， 搅拌洗涤 3 分钟， 重 复洗涤 3 次。量取 1.4L DCM 加入反应柱， 搅拌洗涤 3 分钟， 重复洗涤 3 次。 0047 （2）。
44、 去保护 ： 加入 V Piperidine:VDMF=20:80 混合溶液 900mL， 搅拌反应 5min 后抽去， 再 次加入上述混合溶液， 搅拌反应 10min 后抽去， 如此进行 2 次脱保护， 然后用 DMF 洗涤 6 次， 每次 1.4L。 0048 （3） 偶联Fmoc-Pro-OH ： 将101g (300mmol) Fmoc- Pro-OH和41g (300mmol) HOBt 用溶剂 DMF 溶解， 冰浴冷却温度为 0-10， 加入 46.5mL DIC， 激活 5 分钟后加入到反应柱 中与脱完保护的树脂进行反应， 25-35下反应 2 小时， 取少量树脂使用 Knise。
45、r test 检测 为阴性， 抽除液体， DMF 洗涤 3 次， 每次 1.4L。 0049 （4）重复偶联 ： 重复去除 Fmoc 保护基及接肽反应步骤的操作， 按照卡贝缩宫 素氨基酸序列， 依次偶联 ： Fmoc-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Tyr(Me)-OH、 4- 氯丁酸。 0050 （5） 裂解 ： 将上述肽树脂用 1.5L DCM 溶液洗涤， 抽去， 再重复一次 DCM 洗涤 ； 用 1.5L甲醇溶液洗涤， 抽去， 再重复一次甲醇洗涤; 用1.5L DCM溶液洗涤， 抽去， 。
46、再重复一次 DCM洗涤 ； 用1.5L甲醇溶液洗涤， 抽去， 再重复一次甲醇洗涤。 转出树脂， 真空干燥。 干燥所 得的卡贝缩宫素环肽树脂， 用 VTFA:VTis=95:5 裂解液裂解 2 小时， 过滤树脂得到滤液， 浓缩裂 解液至原体积的 20-30%， 使用 6 倍浓缩后裂解液体积的的乙醚 （小于 0） 在小于 0条件 下沉降 0.5 小时， 离心， 弃上清液， 固体用 3 倍体积的乙醚洗涤 6 次， 所得固体室温 15-35 干燥 1 小时， 油泵减压干燥 4 小时， 碾磨成粉， 然后环化。2 小时后过滤除去树脂， 滤液加入 说 明 书 CN 103992390 A 10 9/11 页。
47、 11 到乙醚中， 沉降后离心， 离心洗涤 5 次后， 真空干燥制得 7 肽线性肽片段 ： 102g。 0051 （6） 环化 ： 将 102g 的 7 肽线性肽片段加入到 50L 纯净水和 50L 的乙腈混合水溶液 中， 加入 200mlTEA， 在 20-25反应 ： 24h。 0052 （7） 卡贝缩宫素 7 肽环肽片段纯化 ： 使用醋酸调 pH 值至 3.5-4.5， 粗肽环化液在 305 oC、 减压条件下旋蒸浓缩， 浓缩至65L以下， 再加入纯化水稀释至100L。 使用0.45m 的有机系滤膜减压过滤， 待纯化。 0053 制备条件设置如下 ： 色谱柱 ： 色谱填料为 Daisog。
48、el 的 C18 填料， 粒径为 10 m， 色谱柱尺寸 1525 cm 检测波长 ： 230 nm 上样流速 ： 300 ml/min 洗脱流速 ： 400 ml/min 流动相 A ： 0.1%TFA 水溶液 流动相 B ： ACN 流动相配制 ： 按VTFA:V纯化水=0.1:100配制0.1%TFA水溶液， 即得流动相A ： 0.1%TFA水溶 液。 0054 冲柱 ： 按体积分数设置梯度， 使用 50% 的 ACN +50% 水， 冲洗 10min ； 然后使用 5% 的 ACN +95% 水， 冲洗 15min。 0055 平衡 ： 按体积分数设置梯度， 使用 95% 流动相 A+。
49、5% 流动相 B 平衡 15min。 0056 上样 ： 使用流动相 A 管道上样。 0057 洗脱 ： 按体积分数设置梯度， 使用 0.1%TFA 的水溶液 (A 相 ) 和 ACN (B 相 ) 梯度洗脱， 洗脱梯 度为 : 步骤 时间 流动相 B(%) 105 225 32020 44340 馏分收集 ： 待检测器信号出峰时 （起始出峰时间在20-25 min之间） ， 分部收集主峰各馏分， 将符合 要求的目的肽的组分合并收集。 0058 冻干 ： 将纯化峰顶在 305 oC、 减压条件下旋蒸浓缩， 浓缩后体积在旋蒸前总体积 75% 以下。 将冻干盘放入冰箱冷冻室 (-20 oC) 中， 预冻 6 h。开启冻干机， 打开制冷， 预冷 30 min 以 上， 设置冻干曲线如下 ： 第一段 ： 在 -27 oC 运行 16 h ； 第二段 ： 在 -5 oC 运行 4 h ； 第三段 ： 在 5 oC 运行 2 h ； 第 四。