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1、(10)申请公布号 CN 103937796 A (43)申请公布日 2014.07.23 CN 103937796 A (21)申请号 201410150768.7 (22)申请日 2014.04.16 C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风华路 818 号 (72)发明人 郭俊明 夏天 肖丙秀 (74)专利代理机构 宁波奥圣专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 33226 代理人 程晓明 (54) 发明名称 一对胃癌发生相关的竞争性内源 RNA (57) 摘要 本发明公开了一对胃癌发生相。
2、关的竞争性 内源 RNA， 该 竞 争 性 内 源 RNA 为 FER1L4-PTEN ； FER1L4与PTEN之间在胃癌组织中存在正相关性， 即 FER1L4 表达高时， PTEN 表达也高， FER1L4 表达 低时， PTEN 表达也低， 而 FER1L4 在胃癌组织和癌 旁组织中表达相差 9.17 倍， 说明 FER1L4-PTEN 在 胃癌组织表达异常， 与胃癌发生存在相关性， 对于 进一步研究 lncRNA 与 mRNA 参与的基因表达调控 网络在生命活动和疾病发生中的作用具有重要的 意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 (19)中华。
3、人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表2页 (10)申请公布号 CN 103937796 A CN 103937796 A 1/1 页 2 1. 一 对 胃 癌 发 生 相 关 的 竞 争 性 内 源 RNA， 其 特 征 在 于 该 竞 争 性 内 源 RNA 为 FER1L4-PTEN。 2. 如权利要求 1 所述的一对胃癌发生相关的竞争性内源 RNA， 其特征在于该竞争性内 源 RNA 的介导 miRNA 为 miR-106a-5p。 权 利 要 求 书 CN 103937796 A 2 1/3 页 3 一对胃癌发生相关的竞争性内源 RNA 技。
4、术领域 0001 本发明涉及竞争性内源 RNA， 具体涉及一对胃癌发生相关的竞争性内源 RNA。 背景技术 0002 在生物体内， mRNA、 假基因转录物、 长链非编码 RNA（long noncoding RNA, lncRNA） 等转录物可以竞争性结合相同的微小 RNA （microRNA, miRNA） 而相互影响各自的表 达水平。 这些转录物互相称为竞争性内源RNA （competing endogenous RNA, ceRNA） 。 研究 表明， ceRNA 参与正常生命活动过程和疾病的发生， 特别是在肿瘤的发生发展过程中起着重 要作用。VAPA、CNOT6L、ZEB2、vers。
5、ican和CD44等 mRNA 以 ceRNA 方式影响结直肠癌、 肝癌、 乳腺癌和黑色素瘤等肿瘤的发生 ；PTENP1、KRASP1和OCT4-pg4等假基因转录物以 ceRNA 方 式影响前列腺癌和肝癌等肿瘤的发生 ；HULC等 lncRNA 以 ceRNA 方式影响肝癌的发生等等。 lncRNA 是一类理想的 ceRNA， 因为它们不受翻译活性的干扰， 可以高效地结合 miRNA。除了 HULC以外，linc-MD1、lincRNA-RoR和H19等 lncRNA 均可以在 ceRNA 角色中发挥作用 ； 如 2013 年发表在 Journal of Translational Medi。
6、cine 杂志上的论文 “Long non-coding RNA expression profile in human gastric cancer and its clinical significances” 指出， lncRNA-FER1L4在胃癌组织中的表达水平比癌旁组织中的水平低 9.17 倍。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是提供一对胃癌发生相关的竞争性内源 RNA， 既 FER1L4与PTEN之间在胃癌组织中存在正相关性， 可以进一步研究lncRNA与mRNA参与的基 因表达调控网络、 在生命活动和疾病发生中的作用具有重要的意义。 0004 本发明解决上述技术问题。
7、所采用的技术方案为 ： 一对胃癌发生相关的竞争性内源 RNA， 该竞争性内源 RNA 为FER1L4-PTEN。 0005 该竞争性内源 RNA 的介导 miRNA 为 miR-106a-5p。 0006 该竞争性内源 RNA 为FER1L4-PTEN的筛选 ： 利用 lncRNA 芯片检测胃癌组织和癌 旁组织中 lncRNA 表达水平， 筛选出在胃癌组织中低表达 9.17 倍的 lncRNA-FER1L4； 使用 miRcode 算法预测与FER1L4相互作用的 miRNA， 结果显示FER1L4上存在 miR-106a-5p 的结 合位点 ； 进一步可以采用双萤光素酶报告基因实验证明 mi。
8、R-106a-5p 与FER1L4相互作用 ； 从TarBase数据库获取并实验验证miR-106a-5p靶标mRNA， 其中PTEN为miR-106a-5p的靶 标之一， 因此FER1L4和PTEN通过 miR-106a-5p 介导组成一对 ceRNA。采用 RT-qPCR 检测互 为 ceRNA 的FER1L4和PTEN在胃癌组织中的表达水平， 分析其表达水平的相关性， 得出竞争 性内源 RNA ：FER1L4与PTEN之间在胃癌组织中存在正相关性。 0007 与现有技术相比， 本发明的优点在于一对胃癌发生相关的竞争性内源 RNA， 该竞争 性内源 RNA 为FER1L4-PTEN；FER。
9、1L4与PTEN之间在胃癌组织中存在正相关性， 即FER1L4表 达高时，PTEN表达也高，FER1L4表达低时，PTEN表达也低， 而FER1L4在胃癌组织和癌旁组 织中表达相差9.17倍， 说明FER1L4-PTEN在胃癌组织表达异常， 与胃癌发生存在相关性， 对 说 明 书 CN 103937796 A 3 2/3 页 4 于进一步研究lncRNA与mRNA参与的基因表达调控网络在生命活动和疾病发生中的作用具 有重要的意义。 具体实施方式 0008 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。 0009 使用 lncRNA 芯片 Human LncRNA Array（Arraystar, R。
10、ockville, MD, USA） 检测 3对胃癌和癌旁组织中lncRNA表达水平。 该芯片覆盖18534种lncRNA。 杂交、 清洗后， 使用 Axon GenePix 4000B Microarray Scanner（Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA） 进行扫描， NimbleScan v2.5（Roche NimbleGen, Madison, WI, USA） 分析原始数据， 筛选 出在胃癌组织中低表达 9.17 倍的 lncRNA-FER1L4。使用 miRcode 算法预测与FER1L4相互 作用的 miRNA， 表明FER1L4上存在。
11、 miR-106a-5p 的结合位点。合成FER1L4中 miR-106a-5p 结合位点上下游约 200 bp 序列， 其中野生型中结合位点为 5 -GCACUU-3 ， 突变型中结合位 点为 5 -UACAGG-3 ： 野生型序列为 ： TGAGCCTCCCCAGGCCCAGCAGGGGTCCACGTTGTCCCGGCTCACCCGAAAGAAGAAAAAGAAAGCCAGAAG GGATCAGACCCCAAAGGCGGTTCCGCAGCACTTGGACGCCAGCCCCGGTGCCGAGGGGCCTGAGATCCCCCGTGCCA TGGAGGTGGAGGTGGAGGAGCTGCTGCC。
12、GCTGCCAGAGAATGTCCTGGCGCCCTGT 突变型序列为 ： TGAGCCTCCCCAGGCCCAGCAGGGGTCCACGTTGTCCCGGCTCACCCGAAAGAAGAAAAAGAAAGCCAGAAG GGATCAGACCCCAAAGGCGGTTCCGCATACAGGGGACGCCAGCCCCGGTGCCGAGGGGCCTGAGATCCCCCGTGCCA TGGAGGTGGAGGTGGAGGAGCTGCTGCCGCTGCCAGAGAATGTCCTGGCGCCCTGT 质粒转染前一天， 将人胚肾细胞HEK 293T接种到24孔板中培养。 使用Lipofectamine 200。
13、0 Reagent （Invitrogen, Carlsbad, CA, USA） 将 miR-106a-5p 真核表达质粒 GV268 （吉 凯， 上海， 中国） 、 包含FER1L4结合位点序列 （野生型或突变型） 的萤火虫萤光素酶质粒GV272 （吉凯， 上海， 中国） 和作为对照的海肾萤光素酶质粒 pRL-TK Vector（Promega, Madison, WI, USA） 共转染HEK 293T细胞。 转染24小时后， 使用Dual-Glo Luciferase Assay System （Promega, Madison, WI, USA） 试剂盒处理细胞， 检测荧光值。 结果。
14、显示， 突变型一组的相对 荧光值高出野生型一组约56%。 这表明结合位点突变后， miR-106a-5p对FER1L4的抑制作用 减弱， 即野生型FER1L4和miR-106a-5p存在直接相互作用。 TarBase数据库获取经实验验证 的 miR-106a-5p 靶标，PTEN为 miR-106a-5p 的靶标之一，FER1L4和PTEN通过 miR-106a-5p 介导组成一对 ceRNA。用 RT-qPCR 检测胃癌组织中FER1L4和PTEN的表达水平 ： 使用 GoTaq 2-Step RT-qPCR System （Promega, Madison, WI, USA） 试剂盒进行 。
15、RT-qPCR，FER1L4退火 温度为54，PTEN退火温度为53，GAPDH作为外参照， 从13例胃癌组织中分析互为ceRNA 的FER1L4和PTEN在胃癌组织中表达水平的相关性， 得到表 1 结果。所用引物序列分别如 下 ： FER1L4正向引物 ： 5 -CCGTGTTGAGGTGCTGTTC-3 FER1L4反向引物 ： 5 -GGCAAGTCCACTGTCAGATG-3 PTEN正向引物 ： 5 -GTTTACCGGCAGCATCAAAT-3 PTEN反向引物 ： 5 -CCCCCACTTTAGTGCACAGT-3 说 明 书 CN 103937796 A 4 3/3 页 5 G。
16、APDH正向引物 ： 5 -AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3 GAPDH反向引物 ： 5 -AATGAAGGGGTCATTGATGG-3 表 1 胃癌组织中FER1L4和PTEN的相对表达水平 胃癌组织编号FER1L4相对表达水平PTEN相对表达水平 10.231.27 20.190.74 30.281.10 40.210.90 50.261.11 60.180.93 70.291.08 80.250.93 90.260.94 100.372.2 110.220.95 120.200.62 130.290.87 从表 1 中结果表明 ：FER1L4和PTEN在胃癌组织中的表达水平呈。
17、正相关， 相关系数r为 0.77。这样进一步研究 lncRNA 与 mRNA 参与的基因表达调控网络、 在生命活动和疾病发生 中的作用具有重要的意义。 说 明 书 CN 103937796 A 5 1/2 页 6 宁波大学 一对胃癌发生相关的竞争性内源 RNA 8 PatentIn version 3.5 1 205 RNA 1 TGAGCCTCCC CAGGCCCAGC AGGGGTCCAC GTTGTCCCGG CTCACCCGAA50 AGAAGAAAAA GAAAGCCAGA AGGGATCAGA CCCCAAAGGC GGTTCCGCAG100 CACTTGGACG CCAGCCCC。
18、GG TGCCGAGGGG CCTGAGATCC CCCGTGCCAT150 GGAGGTGGAG GTGGAGGAGC TGCTGCCGCT GCCAGAGAAT GTCCTGGCGC200 CCTGT 205 2 205 RNA 2 TGAGCCTCCC CAGGCCCAGC AGGGGTCCAC GTTGTCCCGG CTCACCCGAA50 AGAAGAAAAA GAAAGCCAGA AGGGATCAGA CCCCAAAGGC GGTTCCGCAT100 ACAGGGGACG CCAGCCCCGG TGCCGAGGGG CCTGAGATCC CCCGTGCCAT150 GGAGGTGG。
19、AG GTGGAGGAGC TGCTGCCGCT GCCAGAGAAT GTCCTGGCGC200 CCTGT 205 3 19 DNA 人工序列 3 CCGTGTTGAG GTGCTGTTC 19 4 20 DNA 人工序列 序 列 表 CN 103937796 A 6 2/2 页 7 4 GGCAAGTCCA CTGTCAGATG 20 5 20 DNA 人工序列 5 GTTTACCGGC AGCATCAAAT 20 6 20 DNA 人工序列 6 CCCCCACTTT AGTGCACAGT 20 7 20 DNA 人工序列 7 AAGGTGAAGG TCGGAGTCAA 20 8 20 DNA 人工序列 8 AATGAAGGGG TCATTGATGG 20 序 列 表 CN 103937796 A 7 。