用于生产因子VIII的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103946235 A (43)申请公布日 2014.07.23 CN 103946235 A (21)申请号 201280057127.6 (22)申请日 2012.11.02 11189861.5 2011.11.21 EP 61/563,188 2011.11.23 US C07K 14/755(2006.01) (71)申请人 诺沃诺迪斯克有限公司 地址 丹麦鲍斯韦 (72)发明人 L.B. 约翰逊 M.P. 科林德 P.L. 诺拜 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 李波 权陆军 (54) 发明名称 用于生产因子 VII。

2、I 的方法 (57) 摘要 本发明涉及在哺乳动物培养物中生产因子 VIII 多肽的方法。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.05.21 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2012/071701 2012.11.02 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/075926 EN 2013.05.30 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 16 页 序列表 17 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书16页 序列表17页 (10)申请公布号 CN 103946235 A CN 1039。

3、46235 A 1/1 页 2 1. 用于生产因子 VIII 多肽的方法， 所述方法包括 ： a) 在使所述多肽表达的条件下培养能够表达因子 VIII 多肽的哺乳动物细胞 ； 和 b) 在步骤 (a) 期间或步骤 (a) 之后， 使所述细胞接触结合磷脂酰丝氨酸的试剂。 2. 权利要求 1 的方法， 其中所述方法进一步包括在所述细胞的生存力是至少 80% 的时 间点， 收获因子 VIII 多肽的步骤。 3. 权利要求 1-2 中任一项的方法， 其中所述方法进一步包括在 2-3 天后收获因子 VIII 多肽的步骤。 4. 权利要求 1 的方法， 其中将所述哺乳动物细胞培养在细胞培养基中， 并且其中。

4、所述 因子 VIII 多肽是人因子 VIII 多肽。 5.前述权利要求中任一项的方法， 其中通过i) 将所述试剂与因子VIII共表达， 或ii) 向培养所述细胞的培养基添加所述试剂， 使所述试剂接触所述哺乳动物细胞。 6. 前述权利要求中任一项的方法， 其中所述试剂是特异性结合磷脂酰丝氨酸的蛋白， 优选乳凝集素、 膜联蛋白 V、 抗磷脂抗体或因子 VIII 轻链。 7. 权利要求 6 的方法， 其中所述乳凝集素、 膜联蛋白 V 或因子 VIII 轻链以 0.01 至 100M 的浓度添加或共表达。 8. 前述权利要求中任一项的方法， 其中使一种、 两种、 三种或更多种能够结合细胞膜上 的磷脂酰。

5、丝氨酸的试剂接触所述哺乳动物细胞。 9. 前述权利要求中任一项的方法， 其中乳凝集素、 膜联蛋白 V、 抗脂质抗体或因子 VIII 轻链与正磷酸 -L- 丝氨酸 (OPLS) 或抗凋亡蛋白一起接触所述哺乳动物细胞。 10. 前述权利要求中任一项的方法， 其中所述哺乳动物细胞培养在不含动物来源组分 的细胞培养基中， 其中所述方法进一步包括分离所述因子 VIII 多肽和将所述因子 VIII 多 肽配制到药物组合物中。 11. 前述权利要求中任一项的方法， 其中从培养所述哺乳动物细胞的细胞培养基分离 所述因子 VIII 多肽， 而基本不降低细胞的生存力， 其中优选至少 85% 的细胞保持存活。 12。

6、. 前述权利要求中任一项的方法， 其中在分离所述因子 VIII 多肽后， 将相同的细胞 用于根据前述权利要求中任一项的方法中。 13. 细胞培养基， 其不含血清并且包含 ： i) 选自乳凝集素、 膜联蛋白 V、 抗磷脂抗体和 因子 VIII 轻链的试剂， 和 ii) 正磷酸 -L- 丝氨酸 (OPLS) 或抗凋亡蛋白。 14. 能够结合磷脂酰丝氨酸的试剂用于提高可以从哺乳动物细胞培养物分离的因子 VIII 的产量的用途。 权 利 要 求 书 CN 103946235 A 2 1/16 页 3 用于生产因子 VIII 的方法 发明领域 0001 本发明涉及用于生产因子 VIII 多肽的方法。 0。

7、002 发明背景 因子 VIII 是重要的凝血因子。导致因子 VIII 蛋白减少或缺陷的因子 VIII 基因中的 突变引起遗传疾病血友病A， 其特征在于复发性的出血发作。 血友病A的治疗需要血浆来源 或重组的因子 VIII 的静脉输注。 0003 尽管血浆来源的因子 VIII 可用于治疗血友病， 但这种方法有多种问题， 包括病毒 向患者的传播。因此， 优选施用已重组表达的因子 VIII。 0004 难以从细胞培养物获得大量的因子 VIII。已知因子 VIII 以非常低的水平在哺乳 动物细胞中表达。 也已知因子VIII是在无血清或无蛋白培养基中不稳定的蛋白。 各种物质 的添加已用于改进重组生产的。

8、因子VIII的产量。 例如， 使用高强度的缓冲液提高因子VIII 的产量。然而， 这种苛刻的处理不允许细胞的后续重新使用。 0005 尽管对因子VIII调控有所了解， 但在商业制造使用的异源系统中， 因子VIII的产 量依旧显著低于其他重组蛋白。 WO 2008/135501公开了使用结合因子VIII的C2结构域的 配体 ( 例如， 正磷酸 -L- 丝氨酸 (OPLS) 获得改进的因子 VIII 产量。然而， 需要进一步提 高可以从细胞培养物分离的因子 VIII 的产量的方法和组合物。 发明内容 0006 本发明人意外地发现通过使培养细胞接触结合磷脂酰丝氨酸的试剂， 释放到培养 基且随后收获的。

9、因子 VIII 的量大幅增加。具体地， 与向细胞基添加结合因子 VIII 的 C2 结 构域的试剂 OPLS 时所见的产量相比， 因子 VIII 的产量显著增加。 0007 因此， 本发明提供了用于生产因子 VIII 多肽的方法， 所述方法包括 ： a) 在使所述多肽表达的条件下培养能够表达因子 VIII 多肽的哺乳动物细胞 ； 和 b) 在步骤 (a) 期间或步骤 (a) 之后， 使所述细胞接触结合磷脂酰丝氨酸的试剂。 0008 本发明进一步提供了 ： - 细胞培养基， 其不含血清并且包含 ： i) 选自乳凝集素、 膜联蛋白 V、 抗磷脂抗体和因 子 VIII 轻链的试剂， 和 ii) 正磷。

10、酸 -L- 丝氨酸 (OPLS) 或抗凋亡蛋白。 - 能够结合磷脂酰丝氨酸的化合物用于提高可以从哺乳动物细胞培养物分离的因子 VIII 的产量的用途。 0009 序列 SEQ ID NO: 1 ( 人 B- 结构域缺失的因子 VIII) ： 说 明 书 CN 103946235 A 3 2/16 页 4 SEQ ID NO: 2 ( 人膜联蛋白 V) ： SEQ ID NO: 3 ( 人乳凝集素 ) ： SEQ ID NO: 4 ( 人因子 VIII 轻链 ) ： 说 明 书 CN 103946235 A 4 3/16 页 5 SEQ ID NO: 5 ( 人乳凝集素的 C2 结构域的残基 2。

11、07-364) ： SEQ ID NO: 6 ( 人因子 VIII 轻链的 C2 结构域 ) ： SEQ ID NO:7 ： CD33-FLAG- 乳凝集素 。 0010 发明详述 本发明源自于预想不到的发现， 即， 使表达因子 VIII 多肽的哺乳动物细胞接触结合磷 脂酰丝氨酸的试剂， 大幅提高了可从细胞培养基收获的因子 VIII 的产量。本发明因此涉及 用于生产因子 VIII 多肽的方法， 包括 ： a) 在使所述多肽表达的条件下培养能够表达因子 VIII多肽的哺乳动物细胞 ； 和b) 在步骤(a)期间或步骤(a)之后， 使所述细胞接触结合磷 脂酰丝氨酸的试剂。 0011 因子 VIII 。

12、多肽 成熟的人因子 VIII 分子由 2332 个氨基酸组成， 其可以分成按 A1-A2-B-A3-C1-C2 顺序 说 明 书 CN 103946235 A 5 4/16 页 6 排列的 3 个同源 A 结构域， 2 个同源 C 结构域， 和 B 结构域。由经过源自 B- 结构域的小接 头连接的因子 VIII 的重链 (HC) 和轻链 (LC) 组成的因子 VIII 分子 (B 结构域缺失的因子 VIII 或 BDD-FVIII) 保留了全长 ( 天然 ) 因子 VIII 的生物活性。 0012 如本文使用的 “因子 VIII 多肽” 包括但不限于因子 VIII， 以及因子 VIII- 相关。

13、的 多肽， 优选人因子 VIII。 0013 “因子 VIII 多肽” 包括具有如 Toole 等人，Nature 1984, 312: 342-347 中描述的 氨基酸序列的多肽 ( 野生型人因子 VIII)， 以及源自其他物种的野生型因子 VIII， 例如， 如 牛、 猪、 犬、 鼠和鲑鱼因子 VIII。优选地， 所述因子 VIII 多肽是人因子 VIII 多肽。最优选 地， 所述人因子 VIII 多肽是 B- 结构域缺失 / 截短的人因子 VIII。 0014 因子 VIII- 相关的多肽， 包括变体， 涵盖当在用于因子 VIII 的生物活性的测定中 测试时， 显示至少约 10%、 至少。

14、约 20%、 至少约 30%、 至少约 40%、 至少约 50%、 至少约 60%、 至少 约 70%、 至少约 80%、 至少约 90%、 至少约 100%、 至少约 110%、 至少约 120%， 和至少约 130% 的 在相同细胞类型中产生的野生型因子 VIII 的比活性的那些。 0015 用于因子 VIII 的生物活性的测试是本领域中熟知的。例如， 一种技术涉及测试因 子 VIII 的样品在钙和磷脂的存在下， 通过因子 IXa 刺激因子 X 的活化的能力。 0016 B- 结构域缺失的人因子 VIII 的多肽序列在 SEQ ID NO:1 中给出。 0017 载体 编码因子 VIII 。

15、的核酸分子可以以表达盒的形式提供， 其包含可操作地连接到插入序 列的控制序列， 由此允许本发明的多肽在目标细胞中的体内表达。这些表达盒进而典型地 提供在载体 ( 例如质粒， 或重组病毒载体 ) 中。因此， 用于本发明的多肽可通过将这样的载 体递送到细胞中并允许发生从所述载体的转录而获得。 0018 哺乳动物宿主细胞 本发明的方法涉及在哺乳动物细胞中生产因子 VIII。可使用适合用于在培养物中生 产因子 VIII 的任何哺乳动物宿主细胞。例如， 所述宿主细胞可源自人、 鼠或啮齿动物细胞。 所述宿主细胞还可用于表达因子 VIII 之外的目标多肽。例如， 可通过将能够结合磷脂酰丝 氨酸的多肽与因子 。

16、VIII 共表达， 使所述多肽接触表达因子 VIII 的哺乳动物细胞。 0019 当使用在其中异源表达多于一种目标多肽， 例如因子 VIII 多肽和能够结合磷脂 酰丝氨酸的多肽二者的细胞系时， 这些蛋白可以从单个载体或从两个分离的载体表达。载 体中可存在多于一个拷贝的蛋白编码序列。 0020 目前优选的细胞是 HEK293、 COS、 中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞、 幼仓鼠肾 (BHK) 和骨 髓瘤细胞， 特别是中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞。 0021 细胞培养 ( 物 ) 在一些实施方式中， 在实施本发明中使用的细胞能够在悬浮培养中生长。如本文使用 的， 悬浮 - 感受态细胞是能够悬浮生。

17、长而不产生大的、 坚固聚集体的那些细胞， 即， 单分散 或生长在每个聚集体中只有少数细胞的松散聚集体中的细胞。 0022 用于实施本发明的细胞可以是粘附细胞 ( 也称作锚定 - 依赖性或连接 - 依赖性细 胞)。 如本文使用的， 粘附细胞是需要将其本身粘附或锚定至适合表面以用于繁殖和生长的 那些细胞。 0023 细胞生存力 说 明 书 CN 103946235 A 6 5/16 页 7 细胞生存力是基于总细胞样品， 确定存活或死亡的细胞。细胞死亡可分成两个不同的 事件， 坏死和凋亡。坏死是由于疾病或损伤导致的细胞死亡。细胞膨胀， 其质膜变为破损 的， 并且细胞内容物释放到细胞外间隙， 在此， 。

18、它们常常激发炎性反应。坏死过程是不受调 控的。另一方面， 凋亡是允许细胞在受到凋亡激发刺激时自我破坏的机制。它在细胞不再 被需要时， 或细胞成为生物健康的威胁时， 或出于其他原因而被启动。 0024 用于细胞生存力的测试通常涉及观察样品细胞群， 并将细胞染色， 或施加化学品 以显示哪些细胞是存活的， 以及哪些是死亡的。 有多种用于测量细胞生存力的测试和方法。 0025 在大多数正常和存活的真核细胞中， 带负电的磷脂 ： 磷脂酰丝氨酸 (PS) 定位在质 膜脂双层的胞质侧。磷脂酰丝氨酸在真核细胞凋亡期间从内层 (inner leaflet) 重新分布 到外层。膜联蛋白 V 是与磷脂酰丝氨酸 (P。

19、S) 反应的 Ca+ 依赖性磷脂结合蛋白。可通过将 细胞与荧光标记的膜联蛋白 V 培育， 在流式细胞术中检测凋亡。在坏死的早期， 细胞膜变为 破损的， 并且整联蛋白 V 也能够接近这些细胞内层中的 PS。 0026 用于检测膜通透性的方法是常见的染料排斥法。荧光 DNA- 结合探针， 如碘化丙啶 (PI) 和 7- 氨基放线菌素 D (7-AAD)， 进入死亡细胞并将 DNA 染色。不需要流式细胞术知识 的染料排斥法是使用台盼蓝和血细胞计数器的用于显微镜方法的染料排斥方法。 0027 确定生存力的其他方式是基于细胞的 ATP 含量， 这是代谢活细胞的指示。 CellTiter-GLO 试剂盒将。

20、 ATP 转化为荧光， 其与细胞的生存力成正比。这个方法是相对的， 并且不可用于研究单个细胞。 0028 大规模动物细胞培养广泛用于制药工业和生物技术公司的治疗性蛋白的生产中。 经历培养基消耗的细胞将通过凋亡 ( 饥饿诱导的凋亡 ) 死亡， 并且只有在高胁迫水平 ( 例 如， pH 突然下降， 或高浓度毒素 )， 细胞才通过坏死死亡。 0029 FVIII 和 FVIIIa 确实由于其本质而结合到通过暴露于磷脂酰丝氨酸而活化的血 小板， 并且 FVIIIa/FIXa 复合体是在这种细胞表面上活化体内的 FX。凋亡细胞或来自坏死 细胞的膜片段上的磷脂酰丝氨酸也通过 FVIII 结合。在动物细胞培。

21、养物中生产 FVIII 将导 致 FVIII 结合至死细胞， 并且 FVIII 蛋白因此被 “截留” 在该处。 0030 细胞培养基 术语 “细胞培养基” ( 或简称 “培养基” ) 是指用于哺乳动物细胞生长的营养溶液， 其通 常提供来自以下类别中的一个或多个的至少一种组分 ： (1) 促成培养基的渗透度的， 例如 钠、 钾、 镁和钙的盐 ； (2) 能量来源， 通常为碳水化合物的形式， 例如葡萄糖 ； (3) 所有必需 氨基酸， 和通常20种氨基酸的基本组 ； (4) 维生素和/或以低浓度需要的其他有机化合物 ； 和 (5) 微量元素， 其中微量元素定义为通常以非常低的浓度， 通常在微摩尔范。

22、围需要的无 机化合物。营养溶液可任选地补充来自任何以下类别的一种或多种组分 ： (a) 激素和其他 生长因子， 例如， 如胰岛素、 转铁蛋白和表皮生长因子 ； 和 (b) 蛋白和组织的水解物。优选 地， 所述细胞培养基不包含任何动物来源的组分。 0031 在一个实施方式中， 所述培养基缺少动物来源的组分并且缺少蛋白 (“不含蛋 白” )。缺少动物来源的组分和 / 或蛋白的培养基可得自于商业供应商， 例如， 如 Sigma、 JRH Biosciences、 Gibco、 Hyclone 和 Gemini。 0032 在一个实施方式中， 所述细胞培养基不含血清。 优选地， 所述细胞培养基包含小于。

23、 0.25 体积 % 的血清。在进一步的实施方式中， 所述培养基完全不含蛋白 (“不含蛋白” ) 并 说 明 书 CN 103946235 A 7 6/16 页 8 且缺少动物来源的组分。 0033 优选地， 在本发明的方法中， 将能够表达人因子 VIII 多肽的哺乳动物细胞培养在 不含动物来源组分的细胞培养基中， 并且通过将结合磷酯酰丝氨酸的试剂， 例如乳凝集素， 添加到培养基中， 使所述细胞接触所述试剂。优选地， 在本发明的方法中， 将能够表达人因 子 VIII 多肽的哺乳动物细胞培养在不含动物来源组分的细胞培养基中， 并且通过将结合 磷酯酰丝氨酸的试剂， 例如膜联蛋白 V， 添加到培养基。

24、中， 使所述细胞接触所述试剂。关于 本发明， 所述试剂可以在 0.01 至 100M 之间的浓度添加到培养基， 例如， 如 0.01-50 M、 0.01-25 M、 0.01-10 M， 或 0.01-1 M、 0.01-0.1 M、 0.1-100 M、 0.1-50 M、 0.1-25 M、 0.1-10 M、 0.1-1 M、 1-100 M、 1-50 M、 1-25 M、 1-10 M、 10-100 M、 10-50 M， 或10-25 M。 0034 在本发明的方法中， 可通过向培养基中添加结合磷脂酰丝氨酸的一种或多种试 剂， 使其接触培养细胞。所述细胞培养基还可包含减少因子 。

25、VIII 与细胞膜结合和 / 或改进 因子VIII的稳定性或滴度的额外试剂。 例如， 可将试剂， 例如正磷酸-L-丝氨酸(OPLS)、 抗 凋亡蛋白或肝素， 添加到培养基中。 0035 在本发明的一个实施方式中， 提供了细胞培养基， 其不含血清并且包含 ： i) 选自 乳凝集素、 膜联蛋白 V、 抗磷脂抗体和因子 VIII 轻链的化合物， 和 ii) 正磷酸 -L- 丝氨酸 (OPLS)或抗凋亡蛋白， 用于在本发明的方法中使用。 最优选地， 所述培养基不含动物来源的 组分并且包含乳凝集素和 OPLS。本发明的不含动物来源组分的培养基可包含因子 VIII 轻 链和 OPLS。通常， OPLS 在。

26、培养基中的浓度在 1 M 和 100mM 之间， 在 10 M 和 50mM 之间， 在 100 M 和 50mM 之间， 在 1 mM 和 50mM 之间， 或在 1 mM 和 30mM 之间。 0036 大规模培养条件 本发明特别涉及大规模生产。术语 “大规模生产” 是指包括至少 100L 的培养容器的生 产。 然而， 在优选的实施方式中， 所述规模通常是至少250L， 例如至少500L， 例如至少1000L 或甚至 5000L 或更多。术语 “大规模” 可以与术语 “工业规模” 和 “生产规模” 交换使用。 0037 细胞培养物与结合磷脂酰丝氨酸的试剂的接触 在本发明的一个实施方式中， 。

27、使结合磷脂酰丝氨酸的一种或多种试剂接触生产因子 VIII 的培养细胞。进一步地， 除了结合磷脂酰丝氨酸的试剂之外， 还可以使减少因子 VIII 与细胞膜结合和/或改进因子VIII的稳定性或滴度的一种或多种额外试剂接触培养细胞。 0038 能够结合磷脂酰丝氨酸的任何试剂均可用于本发明的方法中。 结合磷脂酰丝氨酸 的试剂可以是， 或可以包含多肽、 抗体、 抗体片段、 多核苷酸、 小分子或其他试剂。 0039 通常， 结合磷脂酰丝氨酸的试剂能够减少因子 VIII 与细胞膜上的磷脂酰丝氨酸 的结合。所述试剂可以与因子 VIII 竞争结合磷脂酰丝氨酸。优选的试剂是与不存在所述 试剂的情况下所见的结合相比。

28、， 至少 10%， 至少 20%， 至少 30%， 至少 40%， 至少 50%， 至少 60%， 至少 70%， 至少 80%， 至少 90% 减少因子 VIII 与细胞膜结合的那些试剂。 0040 结合磷脂酰丝氨酸的试剂优选提高从细胞培养物分离的因子 VIII 的产量。典型 地， 因子 VIII 的产量是从细胞培养基分离的。因此， 优选的试剂是与不存在所述试剂的情 况下因子 VIII 的产量或释放相比， 至少 10%， 至少 20%， 至少 30%， 至少 40%， 至少 50%， 至少 60%， 至少 70%， 至少 80%， 至少 90% 提高因子 VIII 的产量， 或释放到培养基中。

29、的因子 VIII 的 量的那些试剂。 说 明 书 CN 103946235 A 8 7/16 页 9 0041 可使用竞争性结合测定鉴定竞争性地结合在细胞膜上的磷脂酰丝氨酸的试剂。 这 种技术涉及使用未标记和标记的分析物， 其竞争细胞膜上的磷脂酰丝氨酸。竞争性结合测 定的普通技术是本领域中熟知的。这种测定给出随着目标分析物的浓度增加而降低的信 号。可使用竞争性测定方法， 通过其与因子 VIII 竞争结合至细胞膜的能力， 检测结合磷脂 酰丝氨酸的试剂。例如， 可通过其在竞争性测定中， 至少 50% 降低因子 VIII 与细胞膜结合 的能力， 鉴定结合磷脂酰丝氨酸并且适合用于本发明方法中的试剂。 。

30、0042 用于本发明方法的膜联蛋白 V ( 膜联蛋白 A5 或血管抗凝 蛋白 ) 可以是天然发 生的膜联蛋白 V 多肽或仍能够结合磷脂酰丝氨酸的其片段或变体。所述变体多肽可以是物 种同源物， 例如哺乳动物同源物 ( 通常为人、 灵长类或小鼠、 大鼠或其他啮齿动物同源物 )。 优选地， 膜联蛋白 V 是人膜联蛋白 V。适合的人膜联蛋白 V 多肽可包含 SEQ ID NO:2 的氨基 酸序列， 由 SEQ ID NO:2 的氨基酸序列组成， 或基本由 SEQ ID NO:2 的氨基酸序列组成。适 合的膜联蛋白 V 序列可以是能够结合磷脂酰丝氨酸的此序列的片段或变体。例如， 膜联蛋 白 V 的变体可。

31、以是其取代、 缺失或添加变体或片段。 0043 优选地， 天然发生的膜联蛋白V的片段或变体能够与因子VIII竞争细胞膜上的结 合位点。通常， 所述片段或变体保留至少一个细胞膜结合结构域。所述片段或变体还可保 留形成阻断因子VIII与细胞膜结合的蛋白-蛋白复合体所需的至少一个蛋白结合结构域。 0044 用于本发明方法的乳凝集素可以是天然发生的乳凝集素多肽或仍能够结合磷脂 酰丝氨酸的其片段或变体。所述变体多肽可以是物种同源物， 例如哺乳动物同源物 ( 通常 为人、 灵长类或小鼠、 大鼠或其他啮齿动物同源物 )。优选地， 所述乳凝集素是人乳凝集素。 适合的人乳凝集素多肽可包含 SEQ ID NO:3。

32、 的氨基酸序列， 由 SEQ ID NO:3 的氨基酸序列 组成， 或基本由 SEQ ID NO:3 的氨基酸序列组成。适合的乳凝集素序列可以是能够结合磷 脂酰丝氨酸的此序列的片段或变体。 例如， 乳凝集素的变体可以是其取代、 缺失或添加变体 或片段。 0045 用于本发明方法的因子 VIII 轻链可以包含因子 VIII 的结构域 A3-C1-C2。因子 VIII轻链可通过重组表达编码因子VIII结构域A3-C1-C2的核酸产生。 可选地， 或额外地， 因子 VIII 轻链可通过在因子 VIII 多肽的 B-A3 连接点的蛋白水解加工产生。 0046 因子 VIII 轻链的片段或变体也可以用于。

33、本发明的方法中， 前提是所述片段或变 体仍能够结合磷脂酰丝氨酸。通常， 所述片段或变体能够与因子 VIII 竞争细胞膜上的结合 位点。通常， 所述片段或变体保留至少一个细胞膜结合结构域。例如， 所述片段或变体可包 含结构域 C2。最优选地， 所述片段或变体包含结构域 C1 和 C2。具体地， 所述片段或变体包 含由 SEQ ID NO: 6 ( 人因子 VIII 的氨基酸 2173-2332) 所示的 C2 结构域序列， 或包含多 至 20， 多至 10， 多至 5， 或多至 2 个氨基酸取代和 / 或缺失的该 C2 结构域的变体。所述片 段或变体可包含人因子 VIII C2 结构域的氨基酸序。

34、列 2303-2332， 或包含 1、 2、 3、 4、 5、 6 或 7 个氨基酸取代和 / 或缺失的该序列的变体。 0047 适合用于本发明方法的抗磷脂抗体包括结合一种或多种磷脂， 包括磷脂酰丝氨酸 的任何抗体。抗磷脂抗体可结合磷脂酰丝氨酸和一种或多种其他磷脂， 包括但不限于两性 磷脂、 脂双层磷脂、 磷酸甘油、 磷脂酸、 磷脂酰胆碱、 磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰肌醇、 二磷脂酰甘 油或鞘磷脂。通常， 抗磷脂抗体能够竞争、 减少或抑制因子 VIII 与细胞膜的结合。 0048 所述抗体可以是人、 小鼠、 大鼠、 山羊、 兔、 豚鼠、 鸡、 绵羊或马抗体。 优选地， 所述抗 说 明 书 CN 1。

35、03946235 A 9 8/16 页 10 磷脂抗体是人、 人源化、 嵌合、 大鼠或小鼠抗体。 0049 适合的抗磷脂抗体序列可以是能够结合磷脂酰丝氨酸的此序列的片段或变体。 例 如， 天然发生的抗磷脂抗体的变体可以是其取代、 缺失或添加变体或片段。 0050 如上文讨论的多肽及其变体和片段可以通过从核酸分子表达而提供。因此， 本发 明还涉及包含核酸序列的多核苷酸， 所述核酸序列编码膜联蛋白 V、 乳凝集素、 因子 VIII 轻 链， 或抗磷脂抗体， 或其任何衍生物、 片段或变体。 0051 所述试剂可以提供在培养基中， 在足以降低或抑制因子 VIII 与细胞膜结合的浓 度。通常， 所述试剂。

36、能够提高因子 VIII 在培养细胞周围的培养基中的浓度。优选地， 通过 向细胞培养基添加浓度在 0.001 和 1000 M 之间， 在 0.01 和 500 M 之间， 在 0.01 和 100 M 之间， 在 0.01 和 10 M 之间， 或在 0.1 和 100 M 之间的结合磷脂酰丝氨酸的试剂， 使所 述试剂接触培养细胞。 0052 在培养表达因子 VIII 的细胞的时期中， 或在培养表达因子 VIII 的细胞的时期后 但在从培养基分离因子 VIII 之前， 向细胞培养基添加结合磷脂酰丝氨酸的试剂。通常， 在 从培养基分离因子 VIII 之前， 将表达因子 VIII 的细胞培养至少 。

37、6 小时， 至少 12 小时， 至少 24 小时， 至少 48 小时， 至少 4 天或至少 10 天。结合磷脂酰丝氨酸的试剂可以在细胞初始 接触培养基时的同时， 或基本同时， 或在不同于细胞初始接触培养基的时间， 与培养细胞接 触。 所述试剂可以重复地向培养基添加， 例如在有规律的间隔后添加， 或者每次使新鲜培养 基接触培养细胞。可以添加所述试剂， 之后立即从培养基分离因子 VIII。 0053 表达因子 VIII 的培养细胞可接触一种或多种， 两种或更多种， 三种或更多种， 四 种或更多种结合磷脂酰丝氨酸的试剂。例如， 在本发明的方法中可使用选自膜联蛋白 V、 乳 凝集素、 因子 VIII 。

38、轻链和抗磷脂抗体的两种试剂。 0054 培养基中的因子 VIII 多肽的量可以通过本领域中熟知的技术测量。因子 VIII 多肽可以是标记的， 例如使用放射性同位素、 放射性核苷酸， 荧光部分， 例如 GFP， 酶、 亲和标 签， 例如生物素、 组氨酸或 GST， 表位标签， 抗体或多核苷酸。如果因子 VIII 是标记的， 则可 以通过分离并检测培养基中标记的因子 VIII 来计算产量， 例如通过本领域中已知的光谱、 光化学、 放射化学、 生物化学、 免疫化学、 化学或电化学的方式。 0055 如果没有标记， 可以如下文所述， 使用本领域中熟知的技术从培养基分离因子 VIII。因子 VIII 多。

39、肽的纯化可包括在抗因子 VIII 抗体柱上的亲和层析和通过蛋白水解切 割的活化。 0056 一方面， 本发明由此涉及用于生产因子 VIII 多肽的方法， 所述方法包括 ： a) 在使所述多肽表达的条件下培养能够表达因子 VIII 多肽的哺乳动物细胞 ； 和 b) 在步骤 (a) 期间或步骤 (a) 之后， 使所述细胞接触结合磷脂酰丝氨酸的试剂。 0057 在一个实施方式中， 所述方法进一步包括在所述细胞的生存力是至少 80%， 优选至 少 85%， 最优选至少 90%， 且最优选至少 95% 的时间点， 收获因子 VIII 多肽的步骤。 0058 在另一个实施方式中， 所述方法进一步包括在2-。

40、3天后， 或在2-4天后， 例如， 如在 2 天后， 或在 3 天后或在 4 天后， 收获因子 VIII 多肽的步骤。 0059 在另一个实施方式中， 将所述哺乳动物细胞培养在细胞培养基中， 其中所述因子 VIII 多肽是人因子 VIII 多肽。 0060 在另一个实施方式中， 通过 i) 将所述试剂与因子 VIII 共表达， 或 ii) 向培养细 说 明 书 CN 103946235 A 10 9/16 页 11 胞的培养基添加所述试剂， 使所述试剂接触所述哺乳动物细胞。所述细胞可以是瞬时转化 或稳定转化的细胞。 0061 在另一个实施方式中， 所述试剂是特异性结合磷脂酰丝氨酸的蛋白， 优选。

41、乳凝集 素、 膜联蛋白 V、 抗脂质抗体或因子 VIII 轻链。 0062 在另一个实施方式中， 乳凝集素、 膜联蛋白 V 或因子 VIII 轻链以 0.01 至 100M 的浓度添加或共表达。 0063 在另一个实施方式中， 使一种、 两种、 三种或更多种能够结合细胞膜上的磷脂酰丝 氨酸的试剂接触所述哺乳动物细胞。 0064 在另一个实施方式中， 乳凝集素、 膜联蛋白 V、 抗脂质抗体或因子 VIII 轻链与正磷 酸 -L- 丝氨酸 (OPLS) 或抗凋亡蛋白一起接触所述哺乳动物细胞。 0065 在另一个实施方式中， 所述哺乳动物细胞培养在不含动物来源组分的细胞培养基 中。可选地， 本发明的。

42、方法进一步包括分离因子 VIII 多肽和任选地将因子 VIII 多肽配制 到药物组合物中。 0066 在另一个实施方式中， 从培养所述哺乳动物细胞的细胞培养基分离因子 VIII 多 肽， 而基本不降低细胞的生存力， 其中优选至少 75%， 或 80%， 或 85% 或 90% 的细胞保持存活。 0067 在另一个实施方式中， 在分离因子 VIII 多肽后， 将相同的细胞用于根据前述权利 要求中任一项的方法中。 0068 本发明的另一方面涉及细胞培养基， 其不含血清并且包含 ： i) 选自乳凝集素、 膜 联蛋白 V、 抗磷脂抗体和因子 VIII 轻链的试剂， 和 ii) 正磷酸 -L- 丝氨酸 。

43、(OPLS) 或抗凋亡 蛋白。 0069 本发明的另一方面涉及能够结合磷脂酰丝氨酸的试剂用于提高可以从哺乳动物 细胞培养物分离的因子 VIII 的产量的用途。 实施例 0070 结合测定 方法 通过使用 125I-BDD-FVIII和未标记的BDD-FVIII的同源竞争测定研究纯化的B-结构域 缺失的因子 VIII (BDD-FVIII) ( 由 J. Karlsson 和 L. Thim， Novo Nordisk A/S 惠赠 ) 对 HEK293 细胞的细胞膜的亲和力。将细胞在 PBS + 1% BSA 中清洗一次。将 5x105个细胞分 配到微滴定孔， 并将平板冷却至 4。在细胞表面的。

44、封闭期间， 检测 BDD-FVIII 的结合。在 4， 与膜联蛋白V (0.5 M， Sigma)、 正磷酸-L-丝氨酸(20 mM， Sigma)、 肝素(100 g mL-1， Leo Pharmaceuticals)和受体相关蛋白(RAP) 0.5 M (H.H. Petersen, Novo Nordisk A/ S 惠赠 ) 中的任一者同时添加恒定浓度的 125I-FVIII (0.5 nM) 以防止内吞。 0071 将平板在温和振荡下在 4培育 2 小时。在离心后， 除去未结合 ( 非膜连接的 ) 125I-FVIII， 并将细胞在冰冷的测定缓冲液(10 mM HEPES、 150。

45、 mM NaCl、 4 mM KCl、 11 mM葡 萄糖、 5 mM CaCl2、 1 mg ml-1 BSA， pH 7.4) 中清洗 2 次。在 - 计数器上计数表面结合的 125I-FVIII。将试验一式三份地进行两次。在 12000x 过量的未标记的 BDD 因子 VIII 的存 在下， 评估非特异性结合。 0072 在测定细胞膜相互作用的有效抑制剂的尝试中， 测试了已知任一其特异性作用的 说 明 书 CN 103946235 A 11 10/16 页 12 四种蛋白 ： 1) 封闭磷脂酰丝氨酸 ( 膜联蛋白 V)， 2) 与因子 FVIII 的 C2 结构域相互作用 (OPLS)，。

46、 3) 与促进内化随后降解的受体， 例如 LRP ( 脂蛋白受体相关蛋白 ) 和 HSPGs ( 硫 酸肝素蛋白聚糖 ) 相互作用 (RAP， 肝素 )。 0073 结果 结果显示在下表 2 中。 总结合的 %标准差 0.5nM125I-FVIII95,92,5 非特异性结合11,90,7 膜联蛋白 V500nM28,53,1 OPLS20mM68,45,2 肝素 100ug/mL86,87,7 RAP500nM106,66,9 表 2。 0074 膜联蛋白V使膜连接的FVIII减少70%， 并且正磷酸-L-丝氨酸(OPLS)使膜连接 的 FVIII 减少 30%。肝素显示小但不显著的作用。R。

47、AP 显示没有作用。 0075 因为膜联蛋白 V 能够最有效地减少膜结合， 本发明人继续研究了也可抑制 FVIII 在细胞表面上的 PS 结合的其他化合物。这描述在下一个试验中。 0076 FVIII 膜位移细胞培养 方法 将稳定表达BDD-FVIII的CHO DUKX B11细胞以高密度(8x106个细胞/mL)设置在50mL 滤管 (TPP， 瑞士 ) 中的无血清培养基中。向培养基添加下述添加剂 ( 乳凝集素、 因子 VIII 轻链和 / 或 OPLS)， 并将细胞培育 24 小时， 随后测定培养液和膜结合部分。 0077 结果 结果显示在下表 3A 和 3B 中。 0078 通过添加 O。

48、PLS， 培养基中的 FVIII 活性从 4000 mU/mL 提高到 6000 mU/mL， 且膜上 的活性没有成比例下降。这可以说明所添加的 OPLS 的稳定化作用。乳凝集素的添加进一 说 明 书 CN 103946235 A 12 11/16 页 13 步增加了培养基中的 FVIII 的量， 并且还观察到膜结合 FVIII 的减少。当添加两种化合物 (乳凝集素和OPLS)时， 与仅添加乳凝集素相比， 仅看到小的增加。 与对照培养相比， 流体相 中的 FVIII 的量增加了 2.2 倍。 0079 在向培养基添加 FVIII LC 时， 观察到类似的趋势。然而， 流体相中 FVIII 产量。

49、的 增加与乳凝集素的添加相比显著更高。这可能是由于所添加的 FVIII LC 浓度高得多， 这导 致更完全地从细胞膜竞争 FVIII。在这种情况下， FVIII LC 和 OPLS 的添加甚至进一步地有 助于流体相 FVIII 部分， 并且整体改进高于 3 倍。 0080 共表达试验 细胞培养 将 HEK293 细胞保持在补充 50 U/mL 青霉素和 50 ug/mL 链霉素的商购 FreeStyle 培养 基中。细胞在振动器中作为悬浮细胞生长， 并在 37， 5% CO2和 95% 相对湿度条件下培育。 0081 细胞以 3105个细胞 /ml 的密度接种， 并每 3-4 天继代。对于转染试验， 将细胞 培养物放大培养， 直到达到目标密度。通过 Cedex (Innovartis) 分析评估活细胞和总细胞 浓度。所述仪器使用用于自动细胞计数的图像分析软件， 并且基于活细胞排。