检测及鉴别分枝杆菌的 mPCR-DHPLC 引物和方法 技术领域 本发明属于生物技术领域， 具体地， 涉及一种同步检测分枝杆菌感染及鉴别结核 分枝杆菌复合群、 副结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌的五重 mPCR-DHPLC 方法。
背景技术 分枝杆菌属 （Mycobacterium） ， 除结核分枝杆菌复合群 （包括结核分枝杆菌、 牛分 枝杆菌、 非洲分枝杆菌、 田鼠分枝杆菌） 和麻风分枝杆菌外， 统称为非结核分枝杆菌。据目前 所知， 自然界中有致病性和非致病分枝杆菌共 200 多种。
结核病是威胁人类及动物健康的重大传染病。世界卫生组织 （WHO） 专门发布了 全球结核控制战略， 并把每年的 3 月 24 号定为世界防治结核病日。结核分枝杆菌复合群 （Mycobacterium tuberculosis complex， MTC） 是人及哺乳动物的结核病原菌， 包括结核分 枝杆菌 （又称人型结核分枝杆菌， Mycobacterium tuberculosis， M.tuberculosis） ， 牛分枝 杆菌 （牛型结核分枝杆菌， Mycobacterium bovis， M.bovis） ， 卡介苗 BCG（Mycobacterium bovis BCG， BCG） ， 非洲分枝杆菌 （Mycobacterium africanum， M.africanum） 和田鼠分枝杆 菌 （Mycobacterium microti， M.microti） 。其中， 结核分枝杆菌、 牛分枝杆菌为主要的人畜 结核致病菌。
与结核分枝杆菌复合群对应的是各种非结核分枝杆菌， 目前已发现上百种， 广泛 存在于土壤、 环境、 动物中。临床上， 各种非结核分枝杆菌感染患者的临床症状及病理变化 与 MTC 引起的结核病极为相似， 但多数非结核分枝杆菌对抗结核药物有天然耐药性 ； 因此， 鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染在临床诊疗中就有着非常重要的作用。 由 于非结核分枝杆菌感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性， 因此准确鉴别 结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染对动物结核病确诊也非常重要。
鸟分枝杆菌 （Mycobacterium avium） 是人型结核分枝杆菌的近支抗酸菌， 在结核 分枝杆菌以外的抗酸菌中是从人分离频度最高的菌种。 鸟分枝杆菌是鸟类和猪等家畜的病 原， 也可感染人。 它是一种机会性细菌， 在 AIDS 病人细菌感染合并症中占第一位 ； 在抗酸菌 中对化疗药物耐药性最强， 并广泛存在于天然土壤和水中。
副结核分枝杆菌 （Mycobacterium paratuberculosis） 是引起牛、 羊、 羊驼等动物 副结核病的病原。副结核病自 1895 年首次被报道后， 现已广泛流行于世界各国。2002 年韩 国某地区调查研究显示 162 个奶牛场中存在副结核病流行 ； 在我国该病分布广泛， 感染率 在近年有上升趋势， 部分地区甚至达 44.8%， 严重危害着畜牧业发展。目前副结核病尚无特 效治疗方法或药物。对于副结核病的控制常采用检测、 隔离、 淘汰病畜等方法。
2000 年第四次全国结核病流行病学抽样调查报告显示， 我国现有活动性肺结核患 者 451 万， 菌阳性肺结核患者 196 万。 分枝杆菌培养阳性者中， 结核分枝杆菌占 86.4%， 牛结 核分枝杆菌占 2.5%， 非结核分枝杆菌占 11.1%。而 1990 年第三次全国结核病流调时非结核 分枝杆菌仅占 4.9%， 由此可见， 非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。 非结核分枝杆菌患者 对大多数一线抗结核药物耐药， 采用目前标准的化疗方案治疗无效。传统的分枝杆菌菌种
鉴定和药敏实验方法建立在培养基础上， 烦琐、 费时， 需 1 ～ 2 月时间， 不能满足临床开展早 期有效化疗的需要， 使非结核分枝杆菌患者经长期规则化疗而疗效不佳， 疗程延长， 成为难 治、 复治患者， 细菌可能在局部播散。 因此， 分枝杆菌的快速鉴定对结核病的早期诊断、 鉴别 诊断、 有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。
目前国内外用于诊断分枝杆菌的检验方法， 大体上可分为 3 类 ： 第一类是细菌学 检验方法， 如染色镜检、 细菌培养和动物接种等 ； 第二类是采用免疫学方法检测结核菌的特 异性抗体， 如皮内变态反应、 酶联免疫吸附实验 （ELISA） 和补体结合实验 （CF） 方法等 ； 第三 类是采用分子生物学检验方法， 如 PCR-RFLP、 PCR- 核酸探针、 多重 PCR 等。
由于分枝杆菌生长缓慢， 细菌分离培养周期长 （常需数周时间） ， 传统的细菌学检 查方法难于适应进出境检验检疫快速通关需求， 也不利于疾病临床诊疗。皮内变态反应是 世界动物卫生组织 （OIE） 推荐的牛结核病诊断方法， 也是目前在进出境动物检疫、 牛结核病 疾病防控、 根除等方面常采用的方法， 但由于试剂质量以及非典型分枝杆菌的干扰等原因， 常造成非特异性反应。ELISA 和 CF 方法等免疫学方法在特异性方面尚存在争议， 国内目前 尚缺乏可靠的免疫学诊断试剂。随着分子生物学技术的发展， 国内外众多实验室开展了结 核、 副结核 PCR 方法研究， 但检测方法和试剂盒缺乏规范化、 标准化是影响 PCR 结果准确性 的关键。世界卫生组织于 2006 年 10 月发表报告指出， 世界迫切需要投资研究更有效和费 用更低的结核病诊断方法， 尽早发现病情尽早治疗， 以减少这种疾病对人类、 特别是对发展 中国家人口的危害。 发明内容 本发明的主要目的在于， 提供一组检测分枝杆菌的核苷酸序列 （分枝杆菌通用型 检测引物） ， 一组鉴别多种致病分枝杆菌群 （种） 的核苷酸序列。
本发明的又一目的在于， 提供一种同步检测分枝杆菌及鉴别多种重要致病分枝杆 菌群 （种） 的方法。
为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案 ：
一组检测及鉴别分枝杆菌的 mPCR-DHPLC 方法中使用的引物， 其特征在于， 其组成 为： 检测分枝杆菌的引物对， 上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.2 所示 ； 鉴别结核分枝杆菌复合群的两组引物对， 其中一对的上游引物和下游 引物的核苷酸序列分别如 SEQ ID No.4 和 SEQ ID No.5 所示 ； 另一对的上游引物和下游引 物的核苷酸序列分别如 SEQID No.7 和 SEQ ID No.8 所示 ； 鉴别副结核分枝杆菌的引物对， 上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ ID No.10 和 SEQ ID No.11 所示 ； 鉴别鸟分 枝杆菌的引物对， 上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ ID No.13 和 SEQ IDNo.14 所示。
一组检测及鉴别分枝杆菌的 mPCR-DHPLC 方法中使用的核酸， 其特征在于， 该组核 酸包括 ： 核苷酸序列分别如序列表 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.2 所示的检测分枝杆菌的引 物对和作为阳性对照的序列如 SEQ ID No.3 所示的 PCR 扩增产物 ； 核苷酸序列分别如序列 表 SEQ ID No.4 和 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.7 和 SEQ ID No.8 所示的鉴别结核分枝杆菌复 合群的两组引物对和作为阳性对照的序列如 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.9 所示的 PCR 扩增产 物； 核苷酸序列分别如序列表 SEQ ID No.10 和 SEQ ID No.11 所示的副结核分枝杆菌的引
物对和作为阳性对照的序列如 SEQ ID No.12 所示的 PCR 扩增产物 ； 核苷酸序列分别如序列 表 SEQ ID No.13 和 SEQ ID No.14 所示的鉴别鸟分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列 如 SEQ ID No.15 所示的 PCR 扩增产物。
一种检测及鉴别分枝杆菌的 mPCR-DHPLC 的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包 括：
PCR 缓冲液 ；
检测分枝杆菌的上游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.1 所示 ；
检测分枝杆菌的下游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.2 所示 ；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第一上游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ IDNo.4 所 示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第一下游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ IDNo.5 所 示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第二上游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ IDNo.7 所 示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第二下游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ IDNo.8 所 示；
鉴别副结核分枝杆菌的上游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.10 所示 ；
鉴别副结核分枝杆菌的下游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.10 和 SEQ ID No.11 所示 ；
鉴别鸟分枝杆菌的上游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.13 所示 ；
鉴别鸟分枝杆菌的下游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.14 所示 ；
dNTP ；
MgCl2 ；
Pfu 快速高保真聚合酶 ；
双蒸水 ；
阴性对照 ： 灭菌生理盐水 ；
阳性对照 ： 携带有分枝杆菌属特异性 16s rRNA 的序列、 结核分枝杆菌复合群的特 异性序列 IS6110、 IS1081、 副结核分枝杆菌的特异性序列 f57 基因和鸟分枝杆菌的特异性 序列 IS1245 的质粒 DNA， 所述特异序列依次如序列表 SEQID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.12 和 SEQ ID No.15 所示 ； 所述质粒可以是本领域内任意的可用质粒载体。
一种检测及鉴别分枝杆菌的 mPCR-DHPLC 方法 ：
（1） 采集样品并提取核酸 ： 本发明可检测细菌培养液、 动物活体采集的样品如血 液、 奶液、 痰液和粪便等， 以及通过剖检采集的组织样品， 如淋巴结等 ； 采集到的样品通过蛋 白酶 K 消化、 高温裂解之后用氯仿抽提提取核酸。
（2） 在反应管中分别加入反应液和核酸， 记录样品编号和对应管号， 放入 PCR 仪中 扩增 ；
其中， 优选的 PCR 反应体系如下 ：
优选的 PCR 反应条件如下 ：
第一步 ： 95℃ 2 分钟 ； 第二步 ： 95℃ 5 秒， 62℃ 5 秒， 68℃ 5 秒， 40 个循环 ； 第三步， 72℃ 1 分钟 ；
（3） 在 DHPLC 仪器上， DHPLC 的反应条件为 ： 在非变性分析模式下， 柱温为 50℃， 采用双链 DNA 多片段 （double stranded multiple fragment）分析模式， 清洗模式采用 active， 样品进样量设为 10μL， 分析检测过程仪器梯度参数由 Navigator software 分析 软件设定， 按照以下条件进行 DHPLC 分析 ：
时间 0 0.5 5 5.1 5.6 缓冲液 A（%） 缓冲液 B（%） 缓冲液 D（%） 46.3 41.3 32.3 0 0 53.7 58.7 67.7 0 0 100 1007CN 102808031 A 5.7 6.6
46.3 46.3说明书53.7 53.7 -5/13 页其中， 缓冲液 A 的成分为 0.1mol/L TEAA， 缓冲液 B 为 0.1mol/L TEAA 加入 25% （V/ V） 乙腈， 缓冲液 D 为 75%（V/V） 乙腈 ；
阴性对照为灭菌生理盐水 ；
阳性对照为携带有分枝杆菌属特异性 16s rRNA 的序列、 结核分枝杆菌复合群的 特异性序列 IS6110、 IS1081、 副结核分枝杆菌的特异性序列 f57 基因和鸟分枝杆菌的特异 性序列 IS1245 的质粒 DNA， 所述特异序列依次如序列表 SEQID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.12 和 SEQ ID No.15 所示 ； 所述质粒可以是本领域内任意的可用质粒载 体；
（4） 分析、 判定结果 ： 本发明结果判定标准为 ： 样品的洗脱峰与阳性对照的洗脱峰 位置一致， 且阴性对照无相应的洗脱峰， 则样品为阳性。
本发明的有益效果在于，
本发明提供了一种同步快速检测分枝杆菌感染及鉴别多种致病分枝杆菌群 （种） 感染的五重 mPCR-DHPLC 检测方法， 其具有以下特点 ：
（1） 特异性好， 分枝杆菌的 16s rRNA 基因具有种属特异性， 具有很高的准确性， 假阳性率低 ； 结核分枝杆菌复合群特异性序列 IS6110 和 IS1081、 鸟分枝杆菌特异性序列 IS1245 和副结核分枝杆菌的 F57 基因具有种特异性， 可以快速鉴别致病分枝杆菌。
（2） 灵敏度高， 采用灵敏的紫外或荧光检测系统进行检测 ；
（3） 操作简单， 自动化程度高， 替代了传统的产物电泳检测等人工操作步骤 ；
（4） 全程仅通过一次 PCR 反应， 不仅可以检测分枝杆菌， 同时可以鉴别致病分枝杆 菌， 相对单重 PCR 既节约了试剂成本， 又降低了工作量。
（5） 高通量， 一次可以全自动检测 192 份样品。
本发明提供的快速检测分枝杆菌及致病分枝杆菌的高通量鉴别方法， 适用于医疗 和公共卫生、 动物分枝杆菌疫病疫情防控、 食品安全以及诊断和流行病学调查领域对分枝 杆菌感染的快速检测、 监控和防治， 对于临床辨别分枝杆菌感染与其它致病原具有重要实 用意义。
下面结合附图和具体实施方式对本发明发明作进一步说明， 并非对本发明的限 定， 本发明的实施方式并不限于此， 因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换， 均 属于本发明的保护范围。 附图说明
图 1 为采用本发明试剂盒及方法对人痰液样品的检测图。
图 2 为采用本发明试剂盒及方法特异性实验检测图， 其中，
图 2A 为对结核分枝杆菌 H37Rv ATCC27294、 牛分枝杆菌 ATCC27291 和牛分枝杆菌 BCG 的检测结果 ；
图 2B 为对副结核分枝杆菌 CVCC C68605、 副结核分枝杆菌 CVCC C68623、 副结核分 枝杆菌 CVCC C68627 和副结核分枝杆菌 CVCC C68635 的检测结果 ；图 2C 为对鸟分枝杆菌 CMCC（B） 95001 和鸟分枝杆菌 ATCC25291 的检测结果 ；
图 2D 为对胞内分枝杆菌 CMCC（B） 95002、 不产色分枝杆菌 CMCC（B） 95007、 马 尔摩分枝杆菌 CMCC（B） 95010、 产鼻分枝杆菌 CMCC（B） 95012、 堪萨斯分枝杆菌 CMCC（B） 95013、 海分枝杆菌 CMCC（B） 95014、 猿猴分枝杆菌 CMCC（B） 95015、 亚洲分枝杆菌 CMCC（B） 95016、 瘰疬分枝杆菌 CMCC（B） 95017、 戈登分枝杆菌 CMCC（B） 95018、 苏加分枝杆菌 CMCC （B） 95019、 龟分枝杆菌脓肿亚种 CMCC（B） 95021、 偶发分枝杆菌 CMCC（B） 95022、 耻垢分枝 杆菌 CMCC（B） 95023、 草分枝杆菌 CMCC（B） 95024、 胃分枝杆菌 CMCC（B） 95006、 微黄分枝 杆菌 CMCC（B） 95030 和牦牛分枝杆菌 CGMCC4.1181 的检测结果 ；
图 2E 为对 IS6110、 IS1081、 16rRNA、 IS1245 和 F57 五重 PCR 阳性对照的检测结果。
图 3 为采用本发明试剂盒及方法对阳性质粒模板的敏感性实验检测图， 其中，
图 3A 为引物 16s rRNA 的灵敏度检测结果 ； 图 3B 为引物 IS1245 的灵敏度检测结 果； 图 3C 为引物 IS1081 的灵敏度检测结果 ； 图 3D 为引物 F57 的灵敏度检测结果。 具体实施方式
本发明方法采用五重 mPCR-DHPLC 快速检测分枝杆菌及鉴别致病分枝杆菌， 其具 体原理为， 根据 16S rRNA 在分枝杆菌属的序列保守性， 设计特异性的分枝杆菌属引物进行 PCR 扩增， 同时设计针对结核分枝杆菌复合群、 副结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌的特异性引 物， 采用多重 PCR（multiplex-PCR， mPCR） 技术进行 PCR 扩增， 然后再结合 DHPLC（变性高 效液相色谱技术） 进行分析， 所建立的方法可用于快速检测分枝杆菌感染及鉴别致病菌群 （种） 。DHPLC 采用高压闭合液相流路， 将 DNA 样品自动注入并在缓冲液携带下流过 DNA 分离 柱， 通过缓冲液的不同梯度变化， 在不同分离柱温度条件下实现对 DNA 不同的分析 ； 由紫外 检测或荧光检测被分离的 DNA 样品。 DHPLC 在非变性条件分析样品， 样品峰的洗脱只由碱基 对的数量决定洗脱顺序。分子量较小的核酸片段含有相应较少的磷酸盐基团结合柱基质， 而分子量较大的片段则含有较多的磷酸盐基团结合柱基质。因此， 当将过柱的乙腈浓度提 高， 核酸片段就会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。产物分子量的 1% 大小的片段能 够被分离。因而， mPCR-DHPLC 方法具有快速、 灵敏、 特异性强的优点。
实施例 1 ： 分枝杆菌及致病分枝杆菌 mPCR-DHPLC 检测方法引物的制备
根据分枝杆菌属特异性 16s rRNA 的序列， 选择其中的一条序列 （GeneBankNo. CP000611） ， 根据引物的退火温度在 60℃左右， 设计出序列如 SEQ ID No.1、 SEQ ID No.2 所 示的引物对， PCR 产物长度为 230bp ：
上游引物 （引物 1） SEQ ID No.1 ： CGTGCGGGCGATAC ；
下游引物 （引物 2） SEQ ID No.2 ： GGCACGGATCCCAA。
根据结核分枝杆菌复合群的特异性序列 IS6110 和 IS1081， 选择其中的一条序列 （CP003248.1） ， 根据引物的退火温度在 60℃左右， 分别设计出 IS6110 和 IS1081 序列如 SEQ ID No.4 和 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.7 和 SEQ ID No.8 所示的引物对， PCR 产物长度分别为 178bp 和 379bp ：
上游引物 （引物 4） SEQ ID No.4 ： TGTATAGGCCGTTGATCG ；
下游引物 （引物 5） SEQ ID No.5 ： CCAACAAGAAGGCGTACTC ；
上游引物 （引物 7） SEQ ID No.7 ： CGATGAGCGGTCCAATC ；上游引物 （引物 8） SEQ ID No.8 ： GACGCGGCCTGCCT。
根据副结核分枝杆菌的特异性序列 f57 基因， 选择其中的一条序列 （GeneBank No.GQ140314.1） ， 根据引物的退火温度在 60℃左右， 设计出序列如 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11 所示的引物对， PCR 产物长度为 306bp ：
上游引物 （引物 10） SEQ ID No.10 ： ATGTTGTTGTCACCGAGC ；
下游引物 （引物 11） SEQ ID No.11 ： GGCATTCCAAGTCCTGA。
根 据 鸟 分 枝 杆 菌 的 特 异 性 序 列 IS1245， 选择其中的一条序列 （GeneBank No.L33879.1） ， 根据引物的退火温度在 60 ℃左右， 设计出序列如 SEQ ID No.13、 SEQ ID No.14 所示的引物对， PCR 产物长度为 256bp ：
上游引物 （引物 13） SEQ ID No.13 ： AGACCCGCTCCAATCA ；
下游引物 （引物 14） SEQ ID No.14 ： CGGCTGACCTCGCTT。
引物委托大连宝生物工程技术有限公司合成。
实施例 2 ： 分枝杆菌五重 mPCR-DHPLC 方法 PCR 检测反应体系的建立和优化
一、 方法
1. 引物浓度的优化
实 验 中 将 引 物 浓 度 从 0.1μmol/L 开 始， 以 0.1μmol/L 的 幅 度 递 增， 直至 0.6μmol/L， 采用矩阵法进行对比实验， 对比实验的其它条件完全一致。 2+
2.Mg 浓度的优化
Mg2+ 会影响 PCR 反应的特异性和扩增效率， 在固定其它反应成分不变的情况下， 采 2+ 2+ 2+ 用 Mg 浓度梯度， 对 Mg 浓度进行了优化， Mg 浓度从 1.5mmol/L 开始， 以 0.5mmol/L 的幅 度递增， 直至 6mmol/L。
3.PCR 反应条件的优化
为了提高 PCR 反应的灵敏度和特异性， 根据设计的引物退火温度， 以 60℃为基础， 以 0.5℃递加， 直到 65℃， 在此基础上进行退火温度优化。
采用的反应体系如下 ：
在 Biometra PCR 仪上进行扩增， 按如下反应条件设置 ： 第一步 95℃， 2 分钟 ； 第二 步 95℃， 5 秒， 60-65℃， 5 秒， 68℃， 5 秒， 40 个循环 ； 第四步 72℃ 1 分钟。Biometra PCR 仪 具备梯度 PCR 功能， 可以同时进行温度梯度实验。
二、 结果
1. 引物浓度的优化
多次重复实验后选定检测分枝杆菌的 16s 引物浓度为 0.24μmol/L， 鉴别致病分 枝杆菌的四种引物浓度为 0.2μmol/L， 作为分枝杆菌检测及致病分枝杆菌 mPCR-DHPLC 检 测方法的引物浓度。
2.Mg2+ 浓度的优化
结果表明 Mg2+ 浓度越低， 反应的特异性越强， 但扩增效率有所下降 ； 反之 Mg2+ 浓度 越高， 扩增效率有所提高， 但特异性受到影响。 本发明最终选定的实际 Mg2+ 浓度为 1.5mmol/ L。
3.PCR 反应条件的优化
结果表明退火温度越高， 反应的特异性越强， 但扩增效率有所下降 ； 反之退火温度 越低， 扩增效率有所提高， 但特异性有所降低。本发明最终选择 62℃作为实际的退火温度， 保证特异性和扩增效率的组合能够达到最优。
实施例 3 ： 本发明方法检测临床样品
一、 样品采集
痰： 牛咯痰极少， 宜在清晨采集用橡胶管自口腔伸入至气管内， 外端连接注射器吸 取痰液。亦可取牛咳出的痰块 ； 人痰样采集按医院常规操作。
二、 样本的处理
痰的处理方法 ：
（1） 在样本中加入 2 ～ 3 倍于样本体积的 4g/L 的 NaOH 溶液， 摇匀， 室温液化 20min， 使其充分液化 ； 无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全 ； 若液化不完全， 可适 当再加入少量 4g/L 的 NaOH 溶液直至液化完全。
（2） 取样本 1.5mL， 10,000rpm 离心 10min， 弃上清。
（3） 加灭菌生理盐水 1mL， 充分振荡混匀使沉淀悬浮， 10,000rpm 离心 10min， 弃上 清。
（4） 重复一次步骤 （3） 。
（5）加入 50μL DNA 提取液， 振荡混匀， 4,000rpm 离心 5 秒， 56 ℃温浴 30min， 后 98℃温浴 10min。
（6） 4,000rpm 离心 5 秒， 待液体冷却， 加入等体积氯仿， 振荡混匀后， 10,000rpm 离 心 10min。 （7） 取上清， 直接用于 PCR 或贮存于 -20℃备用。
三、 扩增检测
1. 扩增试剂准备
取出按照实施例 2 配制的 PCR 反应液， 在室温下融化后， 6000rpm 离心 5 秒， 配制 PCR 反应混合液， 每 25μL 混合液中包含 PCR 反应液 24.6μL 和 KOD-Plus 0.4μL， 将以 上 PCR 反应混合液按照使用量吸取到一个离心管中， 充分混匀， 然后在每个 PCR 管中分装 25μL。
2. 加样
在已分装有 PCR 反应混合液的 PCR 管中分别加入已提取好的核酸， 盖上管盖， 将 PCR 管放入 PCR 仪内， 记录样本放置顺序。
3.PCR 扩增检测
反应条件设定 ： 第一步 ： 95℃， 2 分钟 ； 第三步 ： 每个循环依次为 95℃， 5 秒， 62℃， 5 秒， 68℃， 5 秒， 共 40 个循环 ； 第四步 ： 72℃， 1 分钟。
4.DHPLC 检测
将 PCR 产物放入 DHPLC 仪器的托盘内， 按以下条件进行检测 ：
时间 0 0.5 2.5 4.5 缓冲液 A（%） 缓冲液 B（%） 缓冲液 D（%） 55 50.2 43.9 40.5 45 49.8 56.1 59.5 -12CN 102808031 A 6.5 8.5 8.6 9.1 9.2 10.1
38.4 37 0 0 55 55说明书61.6 63 100 100 45 45 -10/13 页其中， 缓冲液 A 的成分为 0.1mol/L TEAA， 缓冲液 B 为 0.1mol/L TEAA 加入 25% （V/ V） 乙腈， 缓冲液 D 为 75%（V/V） 乙腈。
阴性对照为 ： 灭菌生理盐水 ；
阳性对照为 ： 携带有核苷酸序列分别如 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ IDNo.9、 SEQ ID No.12 和 SEQ ID No.15 所示的核酸的质粒 DNA， 所述各序列依次为分枝杆菌属特异 性 16s rRNA 的序列、 结核分枝杆菌复合群的特异性序列 IS6110、 IS1081、 副结核分枝杆菌 的特异性序列 f57 基因和鸟分枝杆菌的特异性序列 IS1245 ； 所述质粒可以是本领域内任意 的可用质粒载体。
四、 分析条件设定和结果判定
（1） 质控标准 ： 阴性对照无特异性的洗脱峰， 阳性对照的有五个特异性的洗脱峰， 洗脱时间依次为 IS6110、 16s RNA、 IS1245、 F57 和 IS1081。否则， 此次实验视为无效。
（2） 结果分析及判定 ： 无特异性洗脱峰的样本为阴性样本， 存在与阳性对照的洗脱 峰位置一致的样品为阳性。如与 16r RNA 洗脱峰一致， 则判定为分枝杆菌阳性， 进一步分析 如与 IS6110 和 IS1081 洗脱峰位置一致则判定为结核分枝杆菌复合群阳性， 如与 IS1245 洗 脱峰位置一致则判定为鸟分枝杆菌阳性， 如与 F57 洗脱峰位置一致则判定为副结核分枝杆 菌阳性。
五、 对临床样品的检测实例
按上述样品处理和 mPCR-DHPLC 检测方法， 采用本发明方法对门诊人群的痰液样 品进行检测实验， 结果检出多例阳性样品， 具体如图 1 所示。 图 1 显示有引物 IS6110、 IS1081 和 16rRNA 扩增产物大小相同的条带表示所测样本为阳性样本。
实施例 4 ： 本发明方法的特异性和敏感性实验
一、 方法
1. 特异性实验
提取培养的结核分枝杆菌标准菌株与临床分离株、 牛分枝杆菌标准菌株、 鸟分枝 杆菌、 副结核分枝杆菌、 龟、 蟾、 草、 堪萨斯、 胞内、 耻垢、 胃、 瘰疬、 偶发分枝杆菌等共 27 种分 枝杆菌菌种和 24 种各种环境微生物菌株样品进行检测实验。本实验用分枝杆菌菌种见下 列附表。
表 1 特异性实验分枝杆菌菌株列表
24 种 环 境 微 生 物 菌 株 样 品 为 ： 英 诺 克 李 斯 特 菌 (ATCC35897)， 单增李斯特菌 (ATCC7644)， 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 (CMCC50115)， 鼠伤寒沙门氏菌 （(ATCC7644)， 阪崎肠杆 菌 (ATCC29544)， 普 通 变 形 杆 菌 (C MCC49003)， 威 尔 氏 李 斯 特 菌 (ATCC35897)， 格式李 斯 特 菌 (ATCC25401)， 表 皮 葡 萄 球 菌 (CMCC26096)， 产 气 肠 杆 菌 (CMCC49003)， 宋内氏志
贺 氏 菌 (CMCC51334)， 乙 型 溶 血 链 球 菌 (CMCC32210)， 绿 脓 杆 菌 (CMCC AS1.0212)， 大肠 埃希氏菌 (ATCC25922)， 产肠毒素大肠埃希氏菌 (ATCC35401)， 肠致病性大肠埃希氏菌 Enteropathogenic E.coli(ATCC43887)， 肠侵袭性大肠埃希氏菌 (ATCC43893)， 溶藻弧菌 (ATCC17749)， 奇异变形杆菌 (CMCC AS1.1527)， 金黄色葡萄球菌 (ATCC29213)， 金黄色葡萄 球菌 （CMCC26003） ， 副溶血性弧菌 (ATCC17802)， 小肠结肠炎耶尔森氏菌 (ATCC96100)， 空肠 弯曲菌 (ATCC33560)， 珊瑚链霉菌 （ATCC23901） 和砖红链霉菌 （ATCC19776） 。
各菌种均为源自美国模式培养物集存库 ATCC 或中国医学微生物菌种保藏中心 CMCC 的标准菌株。
DHPLC 检测条件如下 ：
时间 0 0.5 2.5 4.5 6.5 8.5 8.6 9.1 9.2 10.1
缓冲液 A（%） 缓冲液 B（%） 55 50.2 43.9 40.5 38.4 37 0 0 55 55 45 49.8 56.1 59.5 61.6 63 100 100 45 452. 敏感性实验
分别采用 16s rRNA、 IS1081、 IS6110、 F57 和 IS1245 的上下游引物以其对应的分枝 杆菌 DNA 为模板， 分别进行 PCR 扩增， 回收并纯化 PCR 产物， 与 pEASY-Blunt 平端载体 （购于 北京全式金生物技术有限公司） 连接， 并转化大肠杆菌， 采用常规 PCR 和测序对重组质粒进 行验证。 将含重组质粒的大肠杆菌进行增菌培养后， 采用质粒提取试剂盒 （购于大连宝生物 工程有限公司） 纯化重组质粒 DNA， 重组质粒稀释后作为阳性对照。 测 OD260 吸光度值， 根据 17 公式 ： 质粒拷贝数 /μL={ 总含量 （μg/μL） }/{ 质粒分子量 }×6.02×10 换算成对应基因 拷贝数。将质粒 DNA 采用无 RNase， 无 DNase 水进行 10 倍系列稀释， 取各稀释度样品 5μL， 采用本发明方法按照实施例 3 描述的扩增检测步骤进行检测实验， 以测试 mPCR-DHPLC 的检 测灵敏度 （基因拷贝数） ， DHPLC 检测条件如下 ：
缓冲液 A（%） 缓冲液 B（%） 缓冲液 D（%） 46.3 41.3 32.3 0 0 46.3 46.3 53.7 58.7 67.7 0 0 53.7 53.7 100 100 -二、 结果
1. 特异性实验 ： 本发明方法对 27 种分枝杆菌标准菌株与临床分离株， 检测结果与 理论推导相符， 具体如图 2A 至图 2D 所示。其中， 图 2A 为本发明试剂盒及方法对结核分枝 杆菌 H37Rv ATCC27294、 牛分枝杆菌 ATCC27291 和牛分枝杆菌 BCG 的检测结果 ； 图 2B 为对 副结核分枝杆菌 CVCC C68605、 副结核分枝杆菌 CVCC C68623、 副结核分枝杆菌 CVCC C68627 和副结核分枝杆菌 CVCC C68635 的检测结果 ； 图 2C 为对鸟分枝杆菌 CMCC （B） 95001 和鸟分 枝杆菌 ATCC25291 的检测结果 ； 图 2D 为检测为发明方法对胞内分枝杆菌 CMCC（B） 95002、 不产色分枝杆菌 CMCC（B） 95007、 马尔摩分枝杆菌 CMCC（B） 95010、 产鼻分枝杆菌 CMCC（B） 95012、 堪萨斯分枝杆菌 CMCC（B） 95013、 海分枝杆菌 CMCC（B） 95014、 猿猴分枝杆菌 CMCC （B） 95015、 亚洲分枝杆菌 CMCC （B） 95016、 瘰疬分枝杆菌 CMCC （B） 95017、 戈登分枝杆菌 CMCC （B） 95018、 苏加分枝杆菌 CMCC（B） 95019、 龟分枝杆菌脓肿亚种 CMCC（B） 95021、 偶发分枝 杆菌 CMCC（B） 95022、 耻垢分枝杆菌 CMCC（B） 95023、 草分枝杆菌 CMCC（B） 95024、 胃分枝 杆菌 CMCC（B） 95006、 微黄分枝杆菌 CMCC（B） 95030 和牦牛分枝杆菌 CGMCC4.1181。
图 2E 为本发明方法对 IS6110、 IS1081、 16rRNA、 IS1245 和 F57 五重 PCR 阳性对照 的检测结果。
对 24 种环境微生物菌株样品采用本发明方法按照实施例 3 描述的扩增检测步骤 进行检测实验， 结果显示均呈典型阴性反应。表明本发明方法检测特异性强。
背景技术 分枝杆菌属 （Mycobacterium） ， 除结核分枝杆菌复合群 （包括结核分枝杆菌、 牛分 枝杆菌、 非洲分枝杆菌、 田鼠分枝杆菌） 和麻风分枝杆菌外， 统称为非结核分枝杆菌。据目前 所知， 自然界中有致病性和非致病分枝杆菌共 200 多种。
结核病是威胁人类及动物健康的重大传染病。世界卫生组织 （WHO） 专门发布了 全球结核控制战略， 并把每年的 3 月 24 号定为世界防治结核病日。结核分枝杆菌复合群 （Mycobacterium tuberculosis complex， MTC） 是人及哺乳动物的结核病原菌， 包括结核分 枝杆菌 （又称人型结核分枝杆菌， Mycobacterium tuberculosis， M.tuberculosis） ， 牛分枝 杆菌 （牛型结核分枝杆菌， Mycobacterium bovis， M.bovis） ， 卡介苗 BCG（Mycobacterium bovis BCG， BCG） ， 非洲分枝杆菌 （Mycobacterium africanum， M.africanum） 和田鼠分枝杆 菌 （Mycobacterium microti， M.microti） 。其中， 结核分枝杆菌、 牛分枝杆菌为主要的人畜 结核致病菌。
与结核分枝杆菌复合群对应的是各种非结核分枝杆菌， 目前已发现上百种， 广泛 存在于土壤、 环境、 动物中。临床上， 各种非结核分枝杆菌感染患者的临床症状及病理变化 与 MTC 引起的结核病极为相似， 但多数非结核分枝杆菌对抗结核药物有天然耐药性 ； 因此， 鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染在临床诊疗中就有着非常重要的作用。 由 于非结核分枝杆菌感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性， 因此准确鉴别 结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染对动物结核病确诊也非常重要。
鸟分枝杆菌 （Mycobacterium avium） 是人型结核分枝杆菌的近支抗酸菌， 在结核 分枝杆菌以外的抗酸菌中是从人分离频度最高的菌种。 鸟分枝杆菌是鸟类和猪等家畜的病 原， 也可感染人。 它是一种机会性细菌， 在 AIDS 病人细菌感染合并症中占第一位 ； 在抗酸菌 中对化疗药物耐药性最强， 并广泛存在于天然土壤和水中。
副结核分枝杆菌 （Mycobacterium paratuberculosis） 是引起牛、 羊、 羊驼等动物 副结核病的病原。副结核病自 1895 年首次被报道后， 现已广泛流行于世界各国。2002 年韩 国某地区调查研究显示 162 个奶牛场中存在副结核病流行 ； 在我国该病分布广泛， 感染率 在近年有上升趋势， 部分地区甚至达 44.8%， 严重危害着畜牧业发展。目前副结核病尚无特 效治疗方法或药物。对于副结核病的控制常采用检测、 隔离、 淘汰病畜等方法。
2000 年第四次全国结核病流行病学抽样调查报告显示， 我国现有活动性肺结核患 者 451 万， 菌阳性肺结核患者 196 万。 分枝杆菌培养阳性者中， 结核分枝杆菌占 86.4%， 牛结 核分枝杆菌占 2.5%， 非结核分枝杆菌占 11.1%。而 1990 年第三次全国结核病流调时非结核 分枝杆菌仅占 4.9%， 由此可见， 非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。 非结核分枝杆菌患者 对大多数一线抗结核药物耐药， 采用目前标准的化疗方案治疗无效。传统的分枝杆菌菌种
结核病是威胁人类及动物健康的重大传染病。世界卫生组织 （WHO） 专门发布了 全球结核控制战略， 并把每年的 3 月 24 号定为世界防治结核病日。结核分枝杆菌复合群 （Mycobacterium tuberculosis complex， MTC） 是人及哺乳动物的结核病原菌， 包括结核分 枝杆菌 （又称人型结核分枝杆菌， Mycobacterium tuberculosis， M.tuberculosis） ， 牛分枝 杆菌 （牛型结核分枝杆菌， Mycobacterium bovis， M.bovis） ， 卡介苗 BCG（Mycobacterium bovis BCG， BCG） ， 非洲分枝杆菌 （Mycobacterium africanum， M.africanum） 和田鼠分枝杆 菌 （Mycobacterium microti， M.microti） 。其中， 结核分枝杆菌、 牛分枝杆菌为主要的人畜 结核致病菌。
与结核分枝杆菌复合群对应的是各种非结核分枝杆菌， 目前已发现上百种， 广泛 存在于土壤、 环境、 动物中。临床上， 各种非结核分枝杆菌感染患者的临床症状及病理变化 与 MTC 引起的结核病极为相似， 但多数非结核分枝杆菌对抗结核药物有天然耐药性 ； 因此， 鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染在临床诊疗中就有着非常重要的作用。 由 于非结核分枝杆菌感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性， 因此准确鉴别 结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染对动物结核病确诊也非常重要。
鸟分枝杆菌 （Mycobacterium avium） 是人型结核分枝杆菌的近支抗酸菌， 在结核 分枝杆菌以外的抗酸菌中是从人分离频度最高的菌种。 鸟分枝杆菌是鸟类和猪等家畜的病 原， 也可感染人。 它是一种机会性细菌， 在 AIDS 病人细菌感染合并症中占第一位 ； 在抗酸菌 中对化疗药物耐药性最强， 并广泛存在于天然土壤和水中。
副结核分枝杆菌 （Mycobacterium paratuberculosis） 是引起牛、 羊、 羊驼等动物 副结核病的病原。副结核病自 1895 年首次被报道后， 现已广泛流行于世界各国。2002 年韩 国某地区调查研究显示 162 个奶牛场中存在副结核病流行 ； 在我国该病分布广泛， 感染率 在近年有上升趋势， 部分地区甚至达 44.8%， 严重危害着畜牧业发展。目前副结核病尚无特 效治疗方法或药物。对于副结核病的控制常采用检测、 隔离、 淘汰病畜等方法。
2000 年第四次全国结核病流行病学抽样调查报告显示， 我国现有活动性肺结核患 者 451 万， 菌阳性肺结核患者 196 万。 分枝杆菌培养阳性者中， 结核分枝杆菌占 86.4%， 牛结 核分枝杆菌占 2.5%， 非结核分枝杆菌占 11.1%。而 1990 年第三次全国结核病流调时非结核 分枝杆菌仅占 4.9%， 由此可见， 非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。 非结核分枝杆菌患者 对大多数一线抗结核药物耐药， 采用目前标准的化疗方案治疗无效。传统的分枝杆菌菌种
鉴定和药敏实验方法建立在培养基础上， 烦琐、 费时， 需 1 ～ 2 月时间， 不能满足临床开展早 期有效化疗的需要， 使非结核分枝杆菌患者经长期规则化疗而疗效不佳， 疗程延长， 成为难 治、 复治患者， 细菌可能在局部播散。 因此， 分枝杆菌的快速鉴定对结核病的早期诊断、 鉴别 诊断、 有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。
目前国内外用于诊断分枝杆菌的检验方法， 大体上可分为 3 类 ： 第一类是细菌学 检验方法， 如染色镜检、 细菌培养和动物接种等 ； 第二类是采用免疫学方法检测结核菌的特 异性抗体， 如皮内变态反应、 酶联免疫吸附实验 （ELISA） 和补体结合实验 （CF） 方法等 ； 第三 类是采用分子生物学检验方法， 如 PCR-RFLP、 PCR- 核酸探针、 多重 PCR 等。
由于分枝杆菌生长缓慢， 细菌分离培养周期长 （常需数周时间） ， 传统的细菌学检 查方法难于适应进出境检验检疫快速通关需求， 也不利于疾病临床诊疗。皮内变态反应是 世界动物卫生组织 （OIE） 推荐的牛结核病诊断方法， 也是目前在进出境动物检疫、 牛结核病 疾病防控、 根除等方面常采用的方法， 但由于试剂质量以及非典型分枝杆菌的干扰等原因， 常造成非特异性反应。ELISA 和 CF 方法等免疫学方法在特异性方面尚存在争议， 国内目前 尚缺乏可靠的免疫学诊断试剂。随着分子生物学技术的发展， 国内外众多实验室开展了结 核、 副结核 PCR 方法研究， 但检测方法和试剂盒缺乏规范化、 标准化是影响 PCR 结果准确性 的关键。世界卫生组织于 2006 年 10 月发表报告指出， 世界迫切需要投资研究更有效和费 用更低的结核病诊断方法， 尽早发现病情尽早治疗， 以减少这种疾病对人类、 特别是对发展 中国家人口的危害。 发明内容 本发明的主要目的在于， 提供一组检测分枝杆菌的核苷酸序列 （分枝杆菌通用型 检测引物） ， 一组鉴别多种致病分枝杆菌群 （种） 的核苷酸序列。
本发明的又一目的在于， 提供一种同步检测分枝杆菌及鉴别多种重要致病分枝杆 菌群 （种） 的方法。
为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案 ：
一组检测及鉴别分枝杆菌的 mPCR-DHPLC 方法中使用的引物， 其特征在于， 其组成 为： 检测分枝杆菌的引物对， 上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.2 所示 ； 鉴别结核分枝杆菌复合群的两组引物对， 其中一对的上游引物和下游 引物的核苷酸序列分别如 SEQ ID No.4 和 SEQ ID No.5 所示 ； 另一对的上游引物和下游引 物的核苷酸序列分别如 SEQID No.7 和 SEQ ID No.8 所示 ； 鉴别副结核分枝杆菌的引物对， 上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ ID No.10 和 SEQ ID No.11 所示 ； 鉴别鸟分 枝杆菌的引物对， 上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ ID No.13 和 SEQ IDNo.14 所示。
一组检测及鉴别分枝杆菌的 mPCR-DHPLC 方法中使用的核酸， 其特征在于， 该组核 酸包括 ： 核苷酸序列分别如序列表 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.2 所示的检测分枝杆菌的引 物对和作为阳性对照的序列如 SEQ ID No.3 所示的 PCR 扩增产物 ； 核苷酸序列分别如序列 表 SEQ ID No.4 和 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.7 和 SEQ ID No.8 所示的鉴别结核分枝杆菌复 合群的两组引物对和作为阳性对照的序列如 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.9 所示的 PCR 扩增产 物； 核苷酸序列分别如序列表 SEQ ID No.10 和 SEQ ID No.11 所示的副结核分枝杆菌的引
物对和作为阳性对照的序列如 SEQ ID No.12 所示的 PCR 扩增产物 ； 核苷酸序列分别如序列 表 SEQ ID No.13 和 SEQ ID No.14 所示的鉴别鸟分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列 如 SEQ ID No.15 所示的 PCR 扩增产物。
一种检测及鉴别分枝杆菌的 mPCR-DHPLC 的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包 括：
PCR 缓冲液 ；
检测分枝杆菌的上游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.1 所示 ；
检测分枝杆菌的下游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.2 所示 ；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第一上游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ IDNo.4 所 示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第一下游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ IDNo.5 所 示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第二上游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ IDNo.7 所 示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第二下游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ IDNo.8 所 示；
鉴别副结核分枝杆菌的上游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.10 所示 ；
鉴别副结核分枝杆菌的下游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.10 和 SEQ ID No.11 所示 ；
鉴别鸟分枝杆菌的上游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.13 所示 ；
鉴别鸟分枝杆菌的下游引物， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.14 所示 ；
dNTP ；
MgCl2 ；
Pfu 快速高保真聚合酶 ；
双蒸水 ；
阴性对照 ： 灭菌生理盐水 ；
阳性对照 ： 携带有分枝杆菌属特异性 16s rRNA 的序列、 结核分枝杆菌复合群的特 异性序列 IS6110、 IS1081、 副结核分枝杆菌的特异性序列 f57 基因和鸟分枝杆菌的特异性 序列 IS1245 的质粒 DNA， 所述特异序列依次如序列表 SEQID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.12 和 SEQ ID No.15 所示 ； 所述质粒可以是本领域内任意的可用质粒载体。
一种检测及鉴别分枝杆菌的 mPCR-DHPLC 方法 ：
（1） 采集样品并提取核酸 ： 本发明可检测细菌培养液、 动物活体采集的样品如血 液、 奶液、 痰液和粪便等， 以及通过剖检采集的组织样品， 如淋巴结等 ； 采集到的样品通过蛋 白酶 K 消化、 高温裂解之后用氯仿抽提提取核酸。
（2） 在反应管中分别加入反应液和核酸， 记录样品编号和对应管号， 放入 PCR 仪中 扩增 ；
其中， 优选的 PCR 反应体系如下 ：
优选的 PCR 反应条件如下 ：
第一步 ： 95℃ 2 分钟 ； 第二步 ： 95℃ 5 秒， 62℃ 5 秒， 68℃ 5 秒， 40 个循环 ； 第三步， 72℃ 1 分钟 ；
（3） 在 DHPLC 仪器上， DHPLC 的反应条件为 ： 在非变性分析模式下， 柱温为 50℃， 采用双链 DNA 多片段 （double stranded multiple fragment）分析模式， 清洗模式采用 active， 样品进样量设为 10μL， 分析检测过程仪器梯度参数由 Navigator software 分析 软件设定， 按照以下条件进行 DHPLC 分析 ：
时间 0 0.5 5 5.1 5.6 缓冲液 A（%） 缓冲液 B（%） 缓冲液 D（%） 46.3 41.3 32.3 0 0 53.7 58.7 67.7 0 0 100 1007CN 102808031 A 5.7 6.6
46.3 46.3说明书53.7 53.7 -5/13 页其中， 缓冲液 A 的成分为 0.1mol/L TEAA， 缓冲液 B 为 0.1mol/L TEAA 加入 25% （V/ V） 乙腈， 缓冲液 D 为 75%（V/V） 乙腈 ；
阴性对照为灭菌生理盐水 ；
阳性对照为携带有分枝杆菌属特异性 16s rRNA 的序列、 结核分枝杆菌复合群的 特异性序列 IS6110、 IS1081、 副结核分枝杆菌的特异性序列 f57 基因和鸟分枝杆菌的特异 性序列 IS1245 的质粒 DNA， 所述特异序列依次如序列表 SEQID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.12 和 SEQ ID No.15 所示 ； 所述质粒可以是本领域内任意的可用质粒载 体；
（4） 分析、 判定结果 ： 本发明结果判定标准为 ： 样品的洗脱峰与阳性对照的洗脱峰 位置一致， 且阴性对照无相应的洗脱峰， 则样品为阳性。
本发明的有益效果在于，
本发明提供了一种同步快速检测分枝杆菌感染及鉴别多种致病分枝杆菌群 （种） 感染的五重 mPCR-DHPLC 检测方法， 其具有以下特点 ：
（1） 特异性好， 分枝杆菌的 16s rRNA 基因具有种属特异性， 具有很高的准确性， 假阳性率低 ； 结核分枝杆菌复合群特异性序列 IS6110 和 IS1081、 鸟分枝杆菌特异性序列 IS1245 和副结核分枝杆菌的 F57 基因具有种特异性， 可以快速鉴别致病分枝杆菌。
（2） 灵敏度高， 采用灵敏的紫外或荧光检测系统进行检测 ；
（3） 操作简单， 自动化程度高， 替代了传统的产物电泳检测等人工操作步骤 ；
（4） 全程仅通过一次 PCR 反应， 不仅可以检测分枝杆菌， 同时可以鉴别致病分枝杆 菌， 相对单重 PCR 既节约了试剂成本， 又降低了工作量。
（5） 高通量， 一次可以全自动检测 192 份样品。
本发明提供的快速检测分枝杆菌及致病分枝杆菌的高通量鉴别方法， 适用于医疗 和公共卫生、 动物分枝杆菌疫病疫情防控、 食品安全以及诊断和流行病学调查领域对分枝 杆菌感染的快速检测、 监控和防治， 对于临床辨别分枝杆菌感染与其它致病原具有重要实 用意义。
下面结合附图和具体实施方式对本发明发明作进一步说明， 并非对本发明的限 定， 本发明的实施方式并不限于此， 因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换， 均 属于本发明的保护范围。 附图说明
图 1 为采用本发明试剂盒及方法对人痰液样品的检测图。
图 2 为采用本发明试剂盒及方法特异性实验检测图， 其中，
图 2A 为对结核分枝杆菌 H37Rv ATCC27294、 牛分枝杆菌 ATCC27291 和牛分枝杆菌 BCG 的检测结果 ；
图 2B 为对副结核分枝杆菌 CVCC C68605、 副结核分枝杆菌 CVCC C68623、 副结核分 枝杆菌 CVCC C68627 和副结核分枝杆菌 CVCC C68635 的检测结果 ；图 2C 为对鸟分枝杆菌 CMCC（B） 95001 和鸟分枝杆菌 ATCC25291 的检测结果 ；
图 2D 为对胞内分枝杆菌 CMCC（B） 95002、 不产色分枝杆菌 CMCC（B） 95007、 马 尔摩分枝杆菌 CMCC（B） 95010、 产鼻分枝杆菌 CMCC（B） 95012、 堪萨斯分枝杆菌 CMCC（B） 95013、 海分枝杆菌 CMCC（B） 95014、 猿猴分枝杆菌 CMCC（B） 95015、 亚洲分枝杆菌 CMCC（B） 95016、 瘰疬分枝杆菌 CMCC（B） 95017、 戈登分枝杆菌 CMCC（B） 95018、 苏加分枝杆菌 CMCC （B） 95019、 龟分枝杆菌脓肿亚种 CMCC（B） 95021、 偶发分枝杆菌 CMCC（B） 95022、 耻垢分枝 杆菌 CMCC（B） 95023、 草分枝杆菌 CMCC（B） 95024、 胃分枝杆菌 CMCC（B） 95006、 微黄分枝 杆菌 CMCC（B） 95030 和牦牛分枝杆菌 CGMCC4.1181 的检测结果 ；
图 2E 为对 IS6110、 IS1081、 16rRNA、 IS1245 和 F57 五重 PCR 阳性对照的检测结果。
图 3 为采用本发明试剂盒及方法对阳性质粒模板的敏感性实验检测图， 其中，
图 3A 为引物 16s rRNA 的灵敏度检测结果 ； 图 3B 为引物 IS1245 的灵敏度检测结 果； 图 3C 为引物 IS1081 的灵敏度检测结果 ； 图 3D 为引物 F57 的灵敏度检测结果。 具体实施方式
本发明方法采用五重 mPCR-DHPLC 快速检测分枝杆菌及鉴别致病分枝杆菌， 其具 体原理为， 根据 16S rRNA 在分枝杆菌属的序列保守性， 设计特异性的分枝杆菌属引物进行 PCR 扩增， 同时设计针对结核分枝杆菌复合群、 副结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌的特异性引 物， 采用多重 PCR（multiplex-PCR， mPCR） 技术进行 PCR 扩增， 然后再结合 DHPLC（变性高 效液相色谱技术） 进行分析， 所建立的方法可用于快速检测分枝杆菌感染及鉴别致病菌群 （种） 。DHPLC 采用高压闭合液相流路， 将 DNA 样品自动注入并在缓冲液携带下流过 DNA 分离 柱， 通过缓冲液的不同梯度变化， 在不同分离柱温度条件下实现对 DNA 不同的分析 ； 由紫外 检测或荧光检测被分离的 DNA 样品。 DHPLC 在非变性条件分析样品， 样品峰的洗脱只由碱基 对的数量决定洗脱顺序。分子量较小的核酸片段含有相应较少的磷酸盐基团结合柱基质， 而分子量较大的片段则含有较多的磷酸盐基团结合柱基质。因此， 当将过柱的乙腈浓度提 高， 核酸片段就会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。产物分子量的 1% 大小的片段能 够被分离。因而， mPCR-DHPLC 方法具有快速、 灵敏、 特异性强的优点。
实施例 1 ： 分枝杆菌及致病分枝杆菌 mPCR-DHPLC 检测方法引物的制备
根据分枝杆菌属特异性 16s rRNA 的序列， 选择其中的一条序列 （GeneBankNo. CP000611） ， 根据引物的退火温度在 60℃左右， 设计出序列如 SEQ ID No.1、 SEQ ID No.2 所 示的引物对， PCR 产物长度为 230bp ：
上游引物 （引物 1） SEQ ID No.1 ： CGTGCGGGCGATAC ；
下游引物 （引物 2） SEQ ID No.2 ： GGCACGGATCCCAA。
根据结核分枝杆菌复合群的特异性序列 IS6110 和 IS1081， 选择其中的一条序列 （CP003248.1） ， 根据引物的退火温度在 60℃左右， 分别设计出 IS6110 和 IS1081 序列如 SEQ ID No.4 和 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.7 和 SEQ ID No.8 所示的引物对， PCR 产物长度分别为 178bp 和 379bp ：
上游引物 （引物 4） SEQ ID No.4 ： TGTATAGGCCGTTGATCG ；
下游引物 （引物 5） SEQ ID No.5 ： CCAACAAGAAGGCGTACTC ；
上游引物 （引物 7） SEQ ID No.7 ： CGATGAGCGGTCCAATC ；上游引物 （引物 8） SEQ ID No.8 ： GACGCGGCCTGCCT。
根据副结核分枝杆菌的特异性序列 f57 基因， 选择其中的一条序列 （GeneBank No.GQ140314.1） ， 根据引物的退火温度在 60℃左右， 设计出序列如 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11 所示的引物对， PCR 产物长度为 306bp ：
上游引物 （引物 10） SEQ ID No.10 ： ATGTTGTTGTCACCGAGC ；
下游引物 （引物 11） SEQ ID No.11 ： GGCATTCCAAGTCCTGA。
根 据 鸟 分 枝 杆 菌 的 特 异 性 序 列 IS1245， 选择其中的一条序列 （GeneBank No.L33879.1） ， 根据引物的退火温度在 60 ℃左右， 设计出序列如 SEQ ID No.13、 SEQ ID No.14 所示的引物对， PCR 产物长度为 256bp ：
上游引物 （引物 13） SEQ ID No.13 ： AGACCCGCTCCAATCA ；
下游引物 （引物 14） SEQ ID No.14 ： CGGCTGACCTCGCTT。
引物委托大连宝生物工程技术有限公司合成。
实施例 2 ： 分枝杆菌五重 mPCR-DHPLC 方法 PCR 检测反应体系的建立和优化
一、 方法
1. 引物浓度的优化
实 验 中 将 引 物 浓 度 从 0.1μmol/L 开 始， 以 0.1μmol/L 的 幅 度 递 增， 直至 0.6μmol/L， 采用矩阵法进行对比实验， 对比实验的其它条件完全一致。 2+
2.Mg 浓度的优化
Mg2+ 会影响 PCR 反应的特异性和扩增效率， 在固定其它反应成分不变的情况下， 采 2+ 2+ 2+ 用 Mg 浓度梯度， 对 Mg 浓度进行了优化， Mg 浓度从 1.5mmol/L 开始， 以 0.5mmol/L 的幅 度递增， 直至 6mmol/L。
3.PCR 反应条件的优化
为了提高 PCR 反应的灵敏度和特异性， 根据设计的引物退火温度， 以 60℃为基础， 以 0.5℃递加， 直到 65℃， 在此基础上进行退火温度优化。
采用的反应体系如下 ：
在 Biometra PCR 仪上进行扩增， 按如下反应条件设置 ： 第一步 95℃， 2 分钟 ； 第二 步 95℃， 5 秒， 60-65℃， 5 秒， 68℃， 5 秒， 40 个循环 ； 第四步 72℃ 1 分钟。Biometra PCR 仪 具备梯度 PCR 功能， 可以同时进行温度梯度实验。
二、 结果
1. 引物浓度的优化
多次重复实验后选定检测分枝杆菌的 16s 引物浓度为 0.24μmol/L， 鉴别致病分 枝杆菌的四种引物浓度为 0.2μmol/L， 作为分枝杆菌检测及致病分枝杆菌 mPCR-DHPLC 检 测方法的引物浓度。
2.Mg2+ 浓度的优化
结果表明 Mg2+ 浓度越低， 反应的特异性越强， 但扩增效率有所下降 ； 反之 Mg2+ 浓度 越高， 扩增效率有所提高， 但特异性受到影响。 本发明最终选定的实际 Mg2+ 浓度为 1.5mmol/ L。
3.PCR 反应条件的优化
结果表明退火温度越高， 反应的特异性越强， 但扩增效率有所下降 ； 反之退火温度 越低， 扩增效率有所提高， 但特异性有所降低。本发明最终选择 62℃作为实际的退火温度， 保证特异性和扩增效率的组合能够达到最优。
实施例 3 ： 本发明方法检测临床样品
一、 样品采集
痰： 牛咯痰极少， 宜在清晨采集用橡胶管自口腔伸入至气管内， 外端连接注射器吸 取痰液。亦可取牛咳出的痰块 ； 人痰样采集按医院常规操作。
二、 样本的处理
痰的处理方法 ：
（1） 在样本中加入 2 ～ 3 倍于样本体积的 4g/L 的 NaOH 溶液， 摇匀， 室温液化 20min， 使其充分液化 ； 无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全 ； 若液化不完全， 可适 当再加入少量 4g/L 的 NaOH 溶液直至液化完全。
（2） 取样本 1.5mL， 10,000rpm 离心 10min， 弃上清。
（3） 加灭菌生理盐水 1mL， 充分振荡混匀使沉淀悬浮， 10,000rpm 离心 10min， 弃上 清。
（4） 重复一次步骤 （3） 。
（5）加入 50μL DNA 提取液， 振荡混匀， 4,000rpm 离心 5 秒， 56 ℃温浴 30min， 后 98℃温浴 10min。
（6） 4,000rpm 离心 5 秒， 待液体冷却， 加入等体积氯仿， 振荡混匀后， 10,000rpm 离 心 10min。 （7） 取上清， 直接用于 PCR 或贮存于 -20℃备用。
三、 扩增检测
1. 扩增试剂准备
取出按照实施例 2 配制的 PCR 反应液， 在室温下融化后， 6000rpm 离心 5 秒， 配制 PCR 反应混合液， 每 25μL 混合液中包含 PCR 反应液 24.6μL 和 KOD-Plus 0.4μL， 将以 上 PCR 反应混合液按照使用量吸取到一个离心管中， 充分混匀， 然后在每个 PCR 管中分装 25μL。
2. 加样
在已分装有 PCR 反应混合液的 PCR 管中分别加入已提取好的核酸， 盖上管盖， 将 PCR 管放入 PCR 仪内， 记录样本放置顺序。
3.PCR 扩增检测
反应条件设定 ： 第一步 ： 95℃， 2 分钟 ； 第三步 ： 每个循环依次为 95℃， 5 秒， 62℃， 5 秒， 68℃， 5 秒， 共 40 个循环 ； 第四步 ： 72℃， 1 分钟。
4.DHPLC 检测
将 PCR 产物放入 DHPLC 仪器的托盘内， 按以下条件进行检测 ：
时间 0 0.5 2.5 4.5 缓冲液 A（%） 缓冲液 B（%） 缓冲液 D（%） 55 50.2 43.9 40.5 45 49.8 56.1 59.5 -12CN 102808031 A 6.5 8.5 8.6 9.1 9.2 10.1
38.4 37 0 0 55 55说明书61.6 63 100 100 45 45 -10/13 页其中， 缓冲液 A 的成分为 0.1mol/L TEAA， 缓冲液 B 为 0.1mol/L TEAA 加入 25% （V/ V） 乙腈， 缓冲液 D 为 75%（V/V） 乙腈。
阴性对照为 ： 灭菌生理盐水 ；
阳性对照为 ： 携带有核苷酸序列分别如 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ IDNo.9、 SEQ ID No.12 和 SEQ ID No.15 所示的核酸的质粒 DNA， 所述各序列依次为分枝杆菌属特异 性 16s rRNA 的序列、 结核分枝杆菌复合群的特异性序列 IS6110、 IS1081、 副结核分枝杆菌 的特异性序列 f57 基因和鸟分枝杆菌的特异性序列 IS1245 ； 所述质粒可以是本领域内任意 的可用质粒载体。
四、 分析条件设定和结果判定
（1） 质控标准 ： 阴性对照无特异性的洗脱峰， 阳性对照的有五个特异性的洗脱峰， 洗脱时间依次为 IS6110、 16s RNA、 IS1245、 F57 和 IS1081。否则， 此次实验视为无效。
（2） 结果分析及判定 ： 无特异性洗脱峰的样本为阴性样本， 存在与阳性对照的洗脱 峰位置一致的样品为阳性。如与 16r RNA 洗脱峰一致， 则判定为分枝杆菌阳性， 进一步分析 如与 IS6110 和 IS1081 洗脱峰位置一致则判定为结核分枝杆菌复合群阳性， 如与 IS1245 洗 脱峰位置一致则判定为鸟分枝杆菌阳性， 如与 F57 洗脱峰位置一致则判定为副结核分枝杆 菌阳性。
五、 对临床样品的检测实例
按上述样品处理和 mPCR-DHPLC 检测方法， 采用本发明方法对门诊人群的痰液样 品进行检测实验， 结果检出多例阳性样品， 具体如图 1 所示。 图 1 显示有引物 IS6110、 IS1081 和 16rRNA 扩增产物大小相同的条带表示所测样本为阳性样本。
实施例 4 ： 本发明方法的特异性和敏感性实验
一、 方法
1. 特异性实验
提取培养的结核分枝杆菌标准菌株与临床分离株、 牛分枝杆菌标准菌株、 鸟分枝 杆菌、 副结核分枝杆菌、 龟、 蟾、 草、 堪萨斯、 胞内、 耻垢、 胃、 瘰疬、 偶发分枝杆菌等共 27 种分 枝杆菌菌种和 24 种各种环境微生物菌株样品进行检测实验。本实验用分枝杆菌菌种见下 列附表。
表 1 特异性实验分枝杆菌菌株列表
24 种 环 境 微 生 物 菌 株 样 品 为 ： 英 诺 克 李 斯 特 菌 (ATCC35897)， 单增李斯特菌 (ATCC7644)， 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 (CMCC50115)， 鼠伤寒沙门氏菌 （(ATCC7644)， 阪崎肠杆 菌 (ATCC29544)， 普 通 变 形 杆 菌 (C MCC49003)， 威 尔 氏 李 斯 特 菌 (ATCC35897)， 格式李 斯 特 菌 (ATCC25401)， 表 皮 葡 萄 球 菌 (CMCC26096)， 产 气 肠 杆 菌 (CMCC49003)， 宋内氏志
贺 氏 菌 (CMCC51334)， 乙 型 溶 血 链 球 菌 (CMCC32210)， 绿 脓 杆 菌 (CMCC AS1.0212)， 大肠 埃希氏菌 (ATCC25922)， 产肠毒素大肠埃希氏菌 (ATCC35401)， 肠致病性大肠埃希氏菌 Enteropathogenic E.coli(ATCC43887)， 肠侵袭性大肠埃希氏菌 (ATCC43893)， 溶藻弧菌 (ATCC17749)， 奇异变形杆菌 (CMCC AS1.1527)， 金黄色葡萄球菌 (ATCC29213)， 金黄色葡萄 球菌 （CMCC26003） ， 副溶血性弧菌 (ATCC17802)， 小肠结肠炎耶尔森氏菌 (ATCC96100)， 空肠 弯曲菌 (ATCC33560)， 珊瑚链霉菌 （ATCC23901） 和砖红链霉菌 （ATCC19776） 。
各菌种均为源自美国模式培养物集存库 ATCC 或中国医学微生物菌种保藏中心 CMCC 的标准菌株。
DHPLC 检测条件如下 ：
时间 0 0.5 2.5 4.5 6.5 8.5 8.6 9.1 9.2 10.1
缓冲液 A（%） 缓冲液 B（%） 55 50.2 43.9 40.5 38.4 37 0 0 55 55 45 49.8 56.1 59.5 61.6 63 100 100 45 452. 敏感性实验
分别采用 16s rRNA、 IS1081、 IS6110、 F57 和 IS1245 的上下游引物以其对应的分枝 杆菌 DNA 为模板， 分别进行 PCR 扩增， 回收并纯化 PCR 产物， 与 pEASY-Blunt 平端载体 （购于 北京全式金生物技术有限公司） 连接， 并转化大肠杆菌， 采用常规 PCR 和测序对重组质粒进 行验证。 将含重组质粒的大肠杆菌进行增菌培养后， 采用质粒提取试剂盒 （购于大连宝生物 工程有限公司） 纯化重组质粒 DNA， 重组质粒稀释后作为阳性对照。 测 OD260 吸光度值， 根据 17 公式 ： 质粒拷贝数 /μL={ 总含量 （μg/μL） }/{ 质粒分子量 }×6.02×10 换算成对应基因 拷贝数。将质粒 DNA 采用无 RNase， 无 DNase 水进行 10 倍系列稀释， 取各稀释度样品 5μL， 采用本发明方法按照实施例 3 描述的扩增检测步骤进行检测实验， 以测试 mPCR-DHPLC 的检 测灵敏度 （基因拷贝数） ， DHPLC 检测条件如下 ：
缓冲液 A（%） 缓冲液 B（%） 缓冲液 D（%） 46.3 41.3 32.3 0 0 46.3 46.3 53.7 58.7 67.7 0 0 53.7 53.7 100 100 -二、 结果
1. 特异性实验 ： 本发明方法对 27 种分枝杆菌标准菌株与临床分离株， 检测结果与 理论推导相符， 具体如图 2A 至图 2D 所示。其中， 图 2A 为本发明试剂盒及方法对结核分枝 杆菌 H37Rv ATCC27294、 牛分枝杆菌 ATCC27291 和牛分枝杆菌 BCG 的检测结果 ； 图 2B 为对 副结核分枝杆菌 CVCC C68605、 副结核分枝杆菌 CVCC C68623、 副结核分枝杆菌 CVCC C68627 和副结核分枝杆菌 CVCC C68635 的检测结果 ； 图 2C 为对鸟分枝杆菌 CMCC （B） 95001 和鸟分 枝杆菌 ATCC25291 的检测结果 ； 图 2D 为检测为发明方法对胞内分枝杆菌 CMCC（B） 95002、 不产色分枝杆菌 CMCC（B） 95007、 马尔摩分枝杆菌 CMCC（B） 95010、 产鼻分枝杆菌 CMCC（B） 95012、 堪萨斯分枝杆菌 CMCC（B） 95013、 海分枝杆菌 CMCC（B） 95014、 猿猴分枝杆菌 CMCC （B） 95015、 亚洲分枝杆菌 CMCC （B） 95016、 瘰疬分枝杆菌 CMCC （B） 95017、 戈登分枝杆菌 CMCC （B） 95018、 苏加分枝杆菌 CMCC（B） 95019、 龟分枝杆菌脓肿亚种 CMCC（B） 95021、 偶发分枝 杆菌 CMCC（B） 95022、 耻垢分枝杆菌 CMCC（B） 95023、 草分枝杆菌 CMCC（B） 95024、 胃分枝 杆菌 CMCC（B） 95006、 微黄分枝杆菌 CMCC（B） 95030 和牦牛分枝杆菌 CGMCC4.1181。
图 2E 为本发明方法对 IS6110、 IS1081、 16rRNA、 IS1245 和 F57 五重 PCR 阳性对照 的检测结果。
对 24 种环境微生物菌株样品采用本发明方法按照实施例 3 描述的扩增检测步骤 进行检测实验， 结果显示均呈典型阴性反应。表明本发明方法检测特异性强。
2. 敏感性实验 ： 检测结果显示， 本发明方法的检测灵敏度可达 106— 108 质粒稀释 度， 相当于 400— 40000 个基因拷贝， 部分检测结果如图 3A 至图 3D 所示。其中， 图 3A 为引 物 16s rRNA 的灵敏度检测结果 ； 图 3B 为鉴别鸟分支杆菌的引物 IS1245 的灵敏度检测结 果； 图 3C 为鉴别结核分支杆菌复合群插入序列的引物 IS1081 的灵敏度检测结果 ； 图 3D 为 鉴别副结核分支杆菌 F57 基因的引物 F57 的灵敏度检测结果。16CN 102808031 A
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