用于改善基因调节化合物的递送的化学修饰的细胞渗透性 肽 技术领域 本发明涉及用于胞内递送运载物 ( 或负载物， cargo) 的系统， 该运载物包括选自 具有至少 4 个碳原子的脂肪族线性或分支基团和 / 或包含 2-4 个环的环体系的至少一种组 分 A， 该环可包含选自 N、 S、 O 和 P 的若干个杂原子， 其中该 ( 一种或多种 ) 组分 A 结合于细 胞渗透性肽 B 和 / 或其非肽类似物。
本发明还涉及所述系统在死亡诊断中作为研究工具和作为靶向系统的用途、 包含 该系统的组合物并且尤其是药物组合物、 覆盖有该系统的材料以及其中合并 ( 或掺入 ) 有 该递送系统的材料。最后， 本发明涉及新的肽。
背景技术 疏水性质膜构成活体动物中细胞的主要屏障， 其允许必要分子的构成性和调节性 内流进入而阻止其他大分子进入细胞内部。尽管跨越质膜的能力对于细胞维持非常关键， 但是其仍然是推进现有药物开发需要克服的主要障碍之一。在过去的 40 年中， 已开发了若
干种用于操纵基因表达的基于寡核苷酸 (ON) 的方法。所述基础方法涉及使用表达感兴趣 的基因的细菌质粒。 另外， 为了评价不同基因的功能方面， 这是在临床环境中可利用的非常 具有吸引力的策略， 即基因疗法。起初认为基因疗法用于遗传性基因疾病的矫正治疗。然 而， 在过去的 15 年中， 尽管还研究了其他获得性疾病， 但用于癌症的实验性基因疗法已成 为经常使用的治疗方法 [1]。
已出现了利用较短的 ON- 序列干扰基因表达的其他多种方法。最近积极开发了基 于用于实现基因沉默的短干扰 RNA(siRNA) 和用于操纵剪切模式的剪切校正 ON(SCO) 的反 义方法 [2， 3]。 尽管它们是调节基因表达的有效化合物， 但是其疏水性却阻止了细胞内摄作 用。
尽管基因疗法对于未来各种疾病的治疗具有很大潜力， 但是它具有一些严重的缺 陷。首先， 质粒较大， 其大小通常超过 1MDa， 这使其不能透过细胞膜。第二， 在临床试验中 已使用病毒来实现治疗性基因的细胞内摄作用。尽管提供了递送基因的有效方法， 但是这 些方法可能会引起严重的免疫应答。 因此， 为了推进现有的基因疗法， 需要更安全的递送系 统， 优选不依赖于病毒的使用。
因此， 人们加强了对有效的非病毒递送载体的研究。 在现今的技术领域中， 已在利 用基于阳离子脂质体 (Lipofectamine) 或多聚阳离子聚合物的载体， 并且这些载体对于常 用细胞系的转染非常有效。 然而， 大部分这些载体要么对血清蛋白敏感、 不能转染完整的细 胞群、 对于 “难转染的” 细胞无效， 要么毒性太强。对于现在市场上销售的载体而言， 似乎高 效力和高毒性之间存在正相关。因此， 急需寻找能够克服上述问题的递送媒介物。
细胞渗透性肽 (CPP) 是近些年来关注度不断提高的一类肽。这是由于它们具有 以相对无毒的方式运送各种本为非渗透性的大分子跨过细胞质膜的显著能力， 如 [4] 中综 述。这些肽的长度通常小于 30 个氨基酸 (aa) 并且具有阳离子和 / 或两性性质， 其已被广泛用于体外和体内递送各种 ON[5]。尽管这些肽一般是无毒的， 但是仍存在一些与它们的 用途有关的问题 [6]。就 ON- 递送而言， CPP 技术的一个缺点在于通常需要使肽共价结合至 ON， 这是一个繁杂的操作并且通常需要高浓度的肽结合物 ( 轭合物 ) 以获得显著的生物学 反应 [7， 8]。 一些研究已令人信服地显示简单地将 CPP 与 ON 混合的非共价共温育策略是有 效的并且是一种无毒的方式。当使用与未经修饰 CPP 的共温育策略时， 似乎所述复合物仍 然被捕获在内涵体中并因此不能发挥生物反应 [9]。 理想条件下， 将 CPP 设计成能够在胞吞 作用之后更有效地逃逸内涵体区室 (endosomal compartment)， 由此使得它们与寡核苷酸 或质粒非共价复合。已尝试将 CPP 的应用与已知的转染试剂组合以减少获得生物反应所需 的转染试剂的量或将 CPP 与已知的融合肽一起加入。另一种策略是一起加入高浓度的趋溶 酶体剂 ( 向溶酶体剂， lysosomotrophic agent) 氯喹以增加 CPP/ON 复合物的效力， 这显著 增加了转染但是却仅限于体外使用， 而且所需要的高浓度氯喹还带来了毒性问题。
相关专利 US 2007/0059353 公开了一种具有细胞和核进入能力的脂质体。所提供 的脂质体在其表面上具有包含多个连续精氨酸残基的肽， 特别提供了其中的肽用疏水基团 或疏水化合物修饰并且将该疏水基团或疏水化合物插入脂质双层中使得所述肽暴露在该 双层表面上的脂质体。除了构建此类复杂载体的困难之外， 这一递送系统的问题还在于它 们是以脂质体为基础的。 若干团队已报导了用基于脂质体的递送系统转染后基因表达谱发 生了变化， 这在很大程度上阻碍了它们的使用。 另外， 寡聚精氨酸倾向于保持与内涵体区室 结合并因此对于递送而言不是最优的。 一种改进的策略是用一种或多种能够促进内涵体逃 逸的化学物种 ( 或化学实存物， chemical entity) 化学修饰新设计的或现有的 CPP。
目前用于内涵体逃逸所选择的药物是氯喹 (CQ) 及其类似物。它是一种， 正如它还 被称作， 趋溶酶体剂， 其抑制内涵体酸化， 在较高浓度下导致内涵体溶胀和破裂。
若干美国专利公开了氯喹单独使用或与其他药物组合使用以抵抗各种疾病的用 途。例如， 第 4,181,725 号美国专利和 A.M.Krieg 等人的美国专利申请 20040009949 公开 了氯喹与抑制性核酸组合用于治疗各种自身免疫疾病的用途。
氯喹作为 “趋溶酶体” 剂能够从细胞内涵体 / 溶酶体释放物质的能力已被广泛 记载。[Marches， 2004 ； A.Cuatraro 1990 等 ]。然而， 由于其毒性已要求禁止氯喹的体内 使用， 因为需要给予高浓度的游离氯喹以到达内涵体。( 引用 J.M.Benns 等人， 1stpara.， Bioconj， Chem.11， 637-645， (2000) ： “尽管已证明氯喹有助于将质粒 DNA 释放进入细胞质， 但是已发现其具有毒性并因此不能在体内使用。 ” )
最近， 标题为 “氯喹偶合 ( 偶联 ) 的抗体和其他蛋白质以及它们的合成方法 (Chloroquine coupled antibodies and other proteins with methods fortheir synthesis)” 的第 2007166281 号 USPTO 申请公开了将氯喹和由其衍生的结构偶合于包含能 够在可控条件下释放氯喹的可生物裂解连接 (biocleavable linkage) 的不同的载体组合 物。第 20070166281 号申请的目的在于当载体到达其作用位点后提供使氯喹从蛋白质或肽 活性剂或抗体控释。
Kosak 及其同事的专利 US2006/0040879 公开了组合物和用于制备偶合了氯喹的 核酸组合物的方法。 该现有技术已显示以足够高浓度的游离药物给予的氯喹增强了各种药 剂从细胞内涵体释放进入细胞质。 这些组合物的目的在于在需要释放核酸的相同位点提供 可控量的氯喹， 从而降低需要的总体剂量。本专利的目的在于实现与核酸组合物结合的氯喹的控释， 这并不是该发明的主题， 但是增强并简化了体外和体内基因疗法的递送。 发明内容 本发明提供了用于细胞内运载物递送的系统， 其包括克服了非共价基因递送的所 述缺陷 ( 即低效和异源递送以及毒性 ) 的新的一系列分子。本发明不需要可生物裂解的连 接体 (linker) 来裂解氯喹类似物。本发明的系统包括不可逆地结合了氯喹的化合物。
该系统包括具有脂肪酸修饰的改进的 CPP 的化合物， 其可用于有效递送多种 ON， 而不具有现在市场上销售的递送物的毒性。新一代进一步衍生化的 CPP 能够将药物负载物 有效递送至群体中的所有细胞中并将 ON 从其内涵体捕获 (entrapment) 中释放。本发明的 权利要求描述了经修饰的和衍生化的递送肽以及它们的检测应用 ； 增强的转染、 剪接校正 和 siRNA 递送。
附图说明 图1
经修饰的荧光素酶基因的前体 -mRNA。 将来自在核苷酸 705 处携带点突变的 β- 球 蛋白基因的内含子 2 插入荧光素酶基因。用 SCO 对该位点实施的阻断使剪接重新定向至功 能性 mRNA。 因此， 这生成了依赖于 SCO 到达细胞核这一事实的阳性生物学判读 (read-out)。
图2
用未修饰的 CPP 或与 200nM SCO 复合的脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000) 处理后的定量摄取和剪接校正。A)Cy5-SCO 与不同 CPP 以 1 ∶ 5、 1 ∶ 10 和 1 ∶ 20 的摩尔比复合后 1 小时的摄取。B) 用 A 中相同组的复合物处理后的剪接校正。在无血清 DEME 中处理 2h， 然后用完全生长培养基替换培养基并再生长 20h。C) 用浓度不断增加的 SCO 处理后的剪接校正， 根据制造商的使用说明使用脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000)。D) 与 B 相同， 但是用阻止内涵体酸化的 75μM 氯喹 (CQ) 共处理， 并因此促进内涵体 逃逸。这些结果明确显示未修饰的 CPP 能够引起 SCO 摄取但是不能诱导剪接校正。由于氯 喹显著增加了剪接校正， 有理由推断 CPP/SCO 复合物仅存在于内涵体区室内。
图3
凝胶阻滞试验。如之前所述形成复合物并跑 PAGE 胶 1h。将肽与磷硫酰 2′ O- 甲 基 RNA( 即 SCO) 以 5、 10 和 20 的摩尔比混合。将保留在孔中的物质定义为肽 /SCO 复合物。 M918 和紧随其后的 TP10 是两种最强效的形成复合物的肽。
图4
用与 SCO 偶合的硬脂酰基修饰的 CPP 的摄取和剪接校正。A) 如图 2a 进行定量摄 取。与硬脂酰化的 Arg9 或 pentratin 复合的 Cy5-SCO 的摄取总体上高于 PepFect 肽。B) 相同的肽和比例用于剪接校正。令人感兴趣的是 PepFect3 诱导了正确剪接的显著增加而 硬脂酰化的 pentratin 和 Arg9 的活性可忽略。尽管观察到低摄取， 但 PepFect2 仍具有一 些活性。
图5
a)Pepfect 递送系统的一般结构， 其中 A ＝脂肪酸或二 - 四环体系， 1-8 个拷贝， 一 些可能在分支的间隔区 (spacer) 上， B ＝细胞渗透性肽或其非肽类似物并且 C ＝靶向部分
例如导向肽 (homing peptide) 或适体， 可为非共价结合。b) 脂肪酸的实例 ： 硬脂酸的示意 图， c) 环体系的实例 ： N-(2- 氨基乙基 )-N- 甲基 -N′ -[7-( 三氟甲基 )- 喹啉 -4- 基 ] 乙 烷 -1， 2- 二胺。D)Pepfect 递送系统的图示结构和名称。
图6
TP10、 TP10 与氯喹 (CQ) 以及 PepFect3(TP10 的硬脂酰化形式 ) 之间促进 SCO 介 导的剪接校正能力的比较。在较低的摩尔比 1 ∶ 5 时， PepFect3 诱导正确剪接的荧光素酶 增加接近 40 倍， 相比之下 TP10 增加 2 倍。然而， PepFect 似乎仍有改进空间， 因为用 TP10 和氯喹共处理产生剪接的 70 倍增加。
图7
PepFect3(N- 端硬脂酰化 ) 和 PepFect4(Lys7 上垂直硬脂酰化 ) 之间递送 SCO 的 比较。两种肽均促进了 SCO- 介导的剪接校正的剂量依赖性增加。将细胞在无血清培养基 中处理 4h， 然后为细胞替换完全生长培养基， 再生长 20 小时。细胞裂解后将发光数据测量 值标准化为每孔中的蛋白质含量并表示为与未处理细胞相比的剪接倍数增加。 PepFect3 与 SCO 以摩尔比 10 复合而 PepFect4 与 SCO 以摩尔比 7 复合。
图8 使用 200nM SCO 将 PepFect3 和 PepFect4 与脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000) 进行比较。尽管 PepFect3 的活性略低于基于商购脂质体的转染剂 Lipofectamine 2000， 但是 PepFect4 的活性超过该活性。如果与以 5μM 浓度临床前使用的 CPP- 吗啉轭合 物 (RXR)4-PMO 相比， 两种 PepFect 肽均在低 25 倍的 SCO 浓度下显示出优效。如图 6 进行 实验。
图9
在 Hela 细胞中用 PepFect 肽转染荧光素酶编码的质粒。根据材料和方法部分的 记载形成所有的转染复合物并在处理后 24 小时监测基因表达。 A、 C 和 E 示出了来自以不同 摩尔比分别与 PepFect1、 PepFect2 或 PepFect3 复合的 pGL3 质粒的荧光素酶表达。D) 电荷 比为 1 ∶ 1 时肽之间的比较。B) 用阳性对照脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000) 转染后的荧光素酶表达。
图 10
温育 24h 后， 将 CHO 细胞中的用脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine2000) 与用 PepFect3 对荧光素酶编码的质粒的转染进行比较。以范围为 CR 0.5-2 的不同电荷比制备 PF3 和质粒的复合物并与根据制造商的使用说明使用的脂质体 2000 转染试剂的转染效率 进行比较。将结果表示为相比于仅用质粒处理的细胞的基因表达的倍数增加。该图清楚地 表明 CR 超过 1 时， PF3 的活性大于脂质体 2000 转染试剂。
图 11
在 CHO 细胞中 24h 后测量的用 PF3 或阳离子脂质体 (Lipofectamine) 进行的 EGFP 表达质粒的转染。PF3 以不同 CR 与质粒复合并与脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000) 比较。结果显示， 尽管脂质体 2000 转染试剂的总体转染与 PF3 相当， 但是当研究 PF3 肽时被转染的细胞数目显著更高。这些试验均在无血清培养基中进行。
图 12
以不同细胞汇合度 (confluency) 在 HEK293 细胞中的质粒转染。基本按照图 10
进行试验， 使用 PF4 与脂质体 2000 转染试剂比较。令人惊讶的是， 在较高细胞密度并且 CR 高于 1 时转染增加， 在将质粒运送到肾细胞中时， PF4 的活性显著大于脂质体 2000 转染试 剂。
图 13
在不同的 CR 用 PF3 处理或用阳离子脂质体处理 24h 后 HeLa 细胞中的代谢活性。 Y 轴是相对于未处理细胞的代谢活性细胞的百分比。 所述结果来自 WST-1 测定， 其测量线粒 体中的代谢活性， 明显看出尽管与质粒复合的 PF3 对增殖的作用可忽略， 但是根据制造商 的使用说明用脂质体 2000 转染试剂处理后观察到显著的长期毒性。按照基因递送测定制 备复合物， 但是在 96 孔板而不是 24 孔板中进行处理。
图 14
比较 PepFect5 和脂质体 2000 转染试剂递送抗 -miR21 ON 的效力的剂量 - 反应曲 线。当以与 ON 的摩尔比非常低 ( 为 2) 使用 PepFect5 时， 两种试剂显示出等效。
图 15
100nM 浓度下 PepFect5 和脂质体 2000 转染试剂递送抗 -miR21 ON 的比较。当以 摩尔比 (MR) 为 5 使用 PepFect5 时， 该肽比脂质体 2000 转染试剂显著更有效。 如所预期的， 未载体化的 ON 无活性。 图 16
将脂质体 2000 转染试剂或 PepFect5 用作 siRNA 的递送剂时荧光素酶稳定的 Hela 细胞中荧光素酶下调的剂量 - 反应曲线。以摩尔比 40 使 PepFect5 与 siRNA 复合， 并且用 25nM siRNA 观察到的基因沉默与使用 100nM siRNA 的脂质体 2000 转染试剂所观察到的相 当。
图 17
比较以两个不同的摩尔比复合的 PepFect5(PF5) 和 PF6 在荧光素酶稳定的 BHK21 细胞中运送 siRNA 靶向荧光素酶的效力。PF6 优于 PF5， 特别是在低 siRNA 浓度时， 尽管与 PF6 一起使用的肽的量较低。
图 18
荧光素酶稳定的骨肉瘤细胞 (U2OS) 中高摩尔比 (80) 形成的 PF6/siRNA 复合物对 荧光素酶下调的剂量 - 反应曲线。在低至 5nM 的浓度观察到明显的 RNAi。
图 19
在完全生长培养基中进行的 PF6/siRNA 复合物转染的剂量 - 反应曲线。 随着 siRNA 浓度的增加观察到在荧光素酶稳定的 BHK21 细胞中荧光素酶表达的剂量依赖性降低。在 此， 预形成复合物并将其直接加入生长培养基中。转染后 24h 测量荧光素酶表达。
图 20
用以不同摩尔比与 50nM siRNA 复合的 PF6 处理 24h 后 BHK21 细胞中的 RNAi。即 使在如 10 这样的低 MR 下， 也有可能获得荧光素酶稳定的 BHK21 细胞中大于 80％的荧光素 酶下调。与使用脂质体 2000 转染试剂或任何其他基于脂质体的递送系统通常可能获得的 作用相比， 这是更强的 RNAi 作用。有趣的是， MR20 和 MR40 之间的响应差异很小。这使得 该递送系统比转染量的小变化对转染效率具有显著影响的脂质体 2000 转染试剂更易于使 用。
图 21
通过 FACS 测量的用与脂质体 2000 转染试剂或 PepFect6 复合的 siRNA 靶向 EGFP 处理后的 EGFP 稳定的 CHO 细胞中的下调。a) 表示来自未处理细胞的荧光 ( 蓝色 )。b) 分 图示出了用 100nM siRNA 和脂质体 2000 转染试剂处理后的 EGFP 表达。蓝色群体代表非下 调细胞， 红色群体代表 EGFP 下调细胞。左下分图 c) 是仅用与 PF6( 摩尔比 40) 复合的 25nM siRNA 处理的细胞。如图所示， 90-95％的细胞具有较低的 EGFP 表达 ( 红色 )。最后， 右下 分图 d) 示出了在完全血清培养基中用与 PF6 复合的 100nM siRNA 处理后的 EGFP 表达。处 理后 48h， 约 98％的细胞的 EGFP 表达可忽略。总而言之， 就诱导 RNAi 而言， PF6 远比脂质 体 2000 转染试剂更强效， 由于观察到几乎完整的 RNAi 所以该递送似乎是普遍存在的。即 使在完全血清培养基中， 该肽的作用也比脂质体 2000 转染试剂更显著。
图 22
用 siRNA 处理 48h 的活 EGFP-CHO 细胞中的共聚焦显微分析。100nMsiRNA 用作阴 性对照并且与 100nM siRNA 复合的脂质体 2000 转染试剂用作阳性对照。裸露的 siRNA 对 EGFP 表达具有非常小的影响而脂质体 2000 转染试剂如所预期的在一些细胞中诱导 RNAi。 与图 21 中显示的 FACS 柱状图一致， 与 50nM siRNA 共温育的 PF6 在无血清培养基和完全生 长培养基中均诱导完整的 RNAi。而且， 与脂质体 2000 转染试剂只进入细胞中的某一部分 ( 最可能是分裂细胞 ) 相比， PF6/siRNA 颗粒以普遍存在的形式进入细胞。
图 23
在 EGPF-CHO 细胞中经过单次 siRNA 处理后 RNAi 衰减动力学 (decaykinetics) 的流式细胞计量分析。以给定浓度的 siRNA 配制 PF6/siRNA 颗粒并在血清培养基 (FM) 或无血清培养基 (SFM) 中进行处理。然后将该效果与通过与脂质体 2000 转染试剂或寡 核苷酸转染试剂复合的 100nMsiRNA 诱导的 RNAi 进行比较。所得结果清楚地表明 24h 后 PF6 诱导几乎完整的 RNAi， 与 siRNA 浓度无关。应将这一结果与分别用寡核苷酸转染试剂 (Oligofectamine) 和脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000)( 转染 ) 观察到的 20％ 和 55％下降 (knock-down) 相比较。此外， 在最佳条件下， 当使用 PF6 时 RNAi 响应持续 4-5 天。MR， 摩尔比。
图 24
骨肉瘤细胞中 HPRT1 mRNA 的下调。在所有浓度的两个 PF6 摩尔比下均观察到显 著的下降， 而脂质体 2000 转染试剂在 50μM siRNA 浓度下未能诱导任何 RNAi。 在这些实验 中， 使用 Dicer 底物 siRNA( 用 dicer 加工的较长的形式 )。在无血清培养基中处理细胞并 在转染后 24h 通过 RT-PCR 分析 mRNA 水平。
图 25
siRNA 处理 20 小时后人 SHSY5Y 神经母细胞瘤细胞中的 HPRT1 下降。以两种不同 的摩尔比配制 PF6/siRNA 颗粒并系列稀释得到 100、 50 和 25nM siRNA 的终处理浓度。在 完全生长培养基中进行处理并将该 RNAi 响应与通过与脂质体 2000 转染试剂复合的 100nM siRNA 诱导的 RNAi 响应进行比较。当 PF60 与 siRNA 之比为 MR40 时， 与使用 100nMRNAi 的 脂质体 2000 转染试剂相比， 甚至在 25nM RNAi 浓度下 RNAi 响应显著更强。这表明 PF- 系 统不仅在血清中具有活性而且能以普遍存在的形式有效转染 “难转染的” 细胞。
图 26用 siRNA 靶向 HPRT1 处理后大鼠原代混合胶质细胞培养物中的 RNAi。 在含血清条 件和在无血清条件下， PF6 在引起 siRNA- 介导的基因沉默方面比脂质体 2000 转染试剂显 著更强效。
图 27
用脂质体 2000 转染试剂或 PF6 处理 24 小时后 CHO 细胞中表达荧光素酶的质粒的 转染。在肽与质粒的投料比 (charge ratio， CR) 为 2 时， 在无血清培养基中观察到与阳离 子脂质体相比 PF6 高一个对数级 (log) 的转染。甚至在血清培养基中， 在 CR4 的情况下， 该 肽促使质粒转染的效率是脂质体 2000 转染试剂的 2 倍。
图 28
Jurkat 悬浮细胞中的 EGFP 质粒的转染。尽管脂质体 2000 转染试剂几乎完全失 活， 但是用 PF6 特别是在较高的投料配比下仍观察到明显的转染。在无血清培养基中在转 染后 24 小时通过 FACS 测量 EGFP 表达。b) 对应的 Jurkat 转染的直方图。尽管总体转染水 平很低， 但是 PF6 具有转染群体中的大部分细胞的能力。c) 不依赖于细胞汇合度的 Jurkat 质粒转染。有趣的是， 用 PF6 可以不依赖汇合度而转染大部分的细胞。
图 29 用与 SCO 复合的 PF5 类似物处理后 Hela 细胞中的剪接校正。在这一条件下， 使用 具有与四个 1- 萘氧基乙酸 (1-naftoxy acetic acid) 形成垂直分支的赖氨酸的 TP10 代替 氟喹部分来评价融合性质 (fusogenic property) 的重要性。该图示出了使用 200nM SCO， 在血清培养基和无血清培养基中， 以 5 至 25 的不同肽 /SCO 摩尔比处理的 Hela pluc705 细 胞中相对于对照的荧光素酶表达的成倍增加。相比于之前观察到的 PF5 的 100 倍增加， 这 些结果表明该肽的活性显著较低， 在剪接时达到 12 倍增加。
图 30
A， 用 Pefect14/SCO 复合物处理 24h 后 Hela 细胞中的剪接校正。PF14 复合物具有 高活性， 与摩尔比和血清的存在无关。在 200nM SCO 浓度下， 与脂质体 2000 转染试剂相比， PF14 将 SCO 递送至细胞内部的活性显著更高。甚至在如 50nM SCO 这样的低浓度下也观察 到剪接的 50 倍增加。B) 该图示出了在血清培养基中以 30 至 40 的不同肽 /siRNA 摩尔比处 理稳定表达荧光素酶基因的 BHK-21 细胞后相对于对照的荧光素酶表达百分数， 并与根据 制造商的使用说明进行的阳离子脂质体转染相比较。在摩尔比为 35 时， PF14 的活性事实 上比阳离子脂质体更高， 即使是使用低 4 倍的 siRNA 浓度时也是如此。
图 31
用 PF3、 PF5 或它们的混合物处理细胞后 Hela 细胞中的剪接校正。当使用 PF3 和 PF5 的混合物时， 与以相同的摩尔量单独使用每一种肽相比， 剪接增加了将近 4 倍。
具体实施方式
本发明涉及被设计用于胞内运载物 ( 或负载物， cargo) 递送的系统， 其包括选自 具有至少 4 个碳原子的脂肪族线性或分支部分和 / 或包含 2-4 个环的环体系的至少一种组 分 A， 该环可包含选自 N、 S、 O 和 P 的若干个杂原子， 其中 ( 一种或多种 ) 组分 A 结合于细胞 渗透肽 B 和 / 或其非肽类似物， 并且其中所述递送系统能够通过共价或非共价结合递送运 载物。该递送系统被称作 PepFect( 参见示例性的表 1 和图 5c)。根据该递送系统的一种实施方式， 其进一步包括至少一个组分 C， 其为能够到达感 兴趣的特定细胞或组织的靶向部分。 该靶向部分可以是适体或诸如导向肽的靶向肽或受体 配体。
根据该递送系统的另一种实施方式， 其进一步包括被递送至细胞、 组织中或跨越 细胞层的运载物。
可将一种或多种组分 A、 一种或多种组分 C 以及一种或多种运载物共价偶合至肽 (B) 的氨基酸侧链和 / 或 N- 和 / 或 C- 端。在一些 PepFect 化合物中， 使用分支的树状结构 的间隔区。可通过非共价或共价结合 (covalentconjugation) 来添加靶向部分 C。
该细胞递送系统可包括通过肽键彼此结合的多于一种肽 B。
此外， 组分 A、 C 和运载物中的一种或多种可通过间隔臂与一个或多个肽 B 结合。
根据本发明， 该递送系统可包括在无任何运载物的条件下以任意顺序彼此偶合的 一种或多种组分 A、 一种或多种肽 B、 一种或多种靶向组分 C。 一个或多个肽 B 可与一种或多 种组分 A 在无任何靶向组分 C 且无任何运载物的条件下以任意顺序偶合。这些可被递送用 于在后续阶段进一步偶合运载物。 本发明涉及通过使用此类递送系统向靶细胞体内或体外 递送运载物的方法。 一个或多个肽 B 和一种或多种运载物可在无任何靶向组分 C 的条件下以任意顺序 与一种或多种组分 A 偶合。一个或多个肽 B 和一种或多种运载物可以任意顺序与一种或多 种组分 A 以及一种或多种靶向组分 C 偶合。
本发明还涉及新的细胞渗透性肽以及如何生产所述 PepFect 构建体的方法。
组分 A
组分 A 可以是一种或若干种具有至少 4 个碳原子的脂肪族线性或分支部分和 / 或 包含 2-4 个环的环体系， 该环可包含选自 N、 S、 O 和 P 的若干个杂原子， 其中 ( 一种或多种 ) 组分 A 结合于细胞渗透性肽 B 和 / 或其非肽类似物。
A 还可以是衍生自任意有机化合物优选脂肪酸的任何酰基、 硬脂酰基、 胆汁酸或其 衍生物、 胆甾醇基、 胆酸、 脱氧胆酸盐、 石胆酸盐或棕榈酸盐。
脂肪族组分 A 可以具有 4-30 个碳原子并且可以是脂肪酸。这样的脂肪族酸可以 包 含 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30 个碳原子或这些数字产生的任意区间。其还可以是它们的衍生物。( 一个或多个 ) 官能 团可以不是羧酸而是 -OH、 -SH、 -NH2、 -CHO、 COXR 中的任一种或多种但不限于此， 其中 X 是 O 或 S， R 是任意脂肪族或芳香部分， 或盐形成中的反离子例如 Na+、 K+ 等， 或卤素。根据一种 实施方式， 脂肪酸可包含 10-30 个碳原子并且可选自硬脂酸或其 C18 衍生物或月桂酸、 肉豆 蔻酸、 棕榈酸、 花生四烯酸和山萮酸， 它们结合于细胞渗透性肽的侧链残基、 C 端或 N 端。而 且， 该链可含有饱和 / 不饱和键。
此外， 组分 A 还可以是由 2-4 个饱和或不饱和的 3-8 元环组成的二 - 四稠环体系 的一个或多个拷贝， 其环体系中可包含选自 N、 S、 O、 B 或 P 的一个或若干个杂原子。其可以 是联苯基、 二苯醚、 胺、 硫化物或周位和 / 或邻位稠合的且选自但不限于喹啉、 异喹啉、 喹噁 啉、 戊搭烯 ( 并环戊二烯， pentalene)、 萘、 庚搭烯 ( 庚间三烯并庚间三烯， heptalene)、 辛搭 烯 ( 并环辛二烯， octalene)、 降莰烷 (norbonane)、 金刚烷、 吲哚、 二氢吲哚、 甘菊环烃 ( 环 戊并环庚五烯， azulene)、 苯并吖庚因 (benzazepine)、 吖啶、 蒽、 联苯撑、 苯并菲和苯并蒽以
及它们的类似物， 但不限于此。这样的类似物可包含一个或多个羧基和 / 或一个或多个另 外的官能团， 例如但不限于一个或多个胺、 一个或多个硫醇、 一个或多个羟基、 一个或多个 酯以及一个或多个醛。
根据一种实施方式， 组分 A 的四个拷贝可通过赖氨酸分支间隔而结合于侧链残基 上。
这些环体系还可被例如具有 pH 缓冲能力的其他基团取代以使内涵体不稳定或者 是用于核苷酸相互作用的缩合部分 (condensing moiety)。取代基的实例可以是但不限于 一个至若干个伯胺、 仲胺和 / 或叔胺， 被取代或以任何脂肪族或芳香族部分或它们组合被 包括其中， 还以线性、 分支或环状方式或它们的组合被零至若干个原子间隔开。
实例为 N′ -(7- 氯喹啉 -4- 基 )-N， N- 二乙基 - 戊烷 -1， 4- 二胺 ( 氯喹 ) 或其衍 生物、 二 - 四环体系 ( 萘和 / 或由联苯基连接 )、 4-8 元环、 环体系中的一个至若干个杂原子 结合至如 1 所述的建构体 ( 图 5) 的任意位置。另一有用的实例是 N-(2- 氨基乙基 )-N- 甲 基 -N′ -[7-( 三氟甲基 )- 喹啉 -4- 基 ] 乙烷 -1， 2- 二胺。它们可具有长度不同的 ( 一个 或多个 ) 间隔臂 ( 图 5c)。
通过偶合 ( 偶联 ) 至多个赖氨酸残基的活化的琥珀酰化侧链来完成喹啉类似物的 引入， 这提供了与载体共价结合的多个拷贝的喹啉类似物。实施例 12 中描述了优选的条 件。 本发明还涉及合成喹啉类似物偶合肽或其非肽类似物的方法， 该方法包括 (a) 活 化肽上的赖氨酸的步骤和 (b) 共价偶合喹啉类似物。为了能够偶合氯喹 - 胺衍生物 ( 进一 步公开于实施例 12)， 通过用琥珀酸酐对赖氨酸残基的 ε 氨基进行合适的修饰达到对肽的 赖氨酸侧基 (pendant group) 的活化。将如此获得的肽的多个羧基进一步原位活化， 即与 喹啉类似物的偶合同时进行。这一操作优于迄今为止的文献中描述的操作， 其中形成半稳 定的活性酯例如 NHS， 然后偶合由胺衍生化的羟基氯喹。 本文描述的方法是新颖的并达到对 反应更好的控制和更高的产率。 该喹啉类似物是新颖的， 据我们所知， 文献中没有通过伯二 胺衍生物进行氯 - 三氟甲基 - 喹啉的氨基烷基化的记载。
通过例如在烷基链末端引入额外的胺来促进共价结合。 烷基链的功能是为芳香性 环体系相互作用提供空间和缓冲能力。氯喹类似物由用三氟甲基、 具有被许多原子间隔的 两个胺的烷基链以及位于烷基链的另一末端与第二个胺间隔若干个原子用于进一步结合 的官能团取代的喹啉系统组成， 但不限于此。
优选四个拷贝的组分 A 通过赖氨酸分支间隔区而结合 ( 或轭合 ) 至侧链。
本发明进一步意在包括将多个拷贝的喹啉衍生物偶合 ( 偶联 ) 至包含合适数量的 多聚 (L- 赖氨酸 ) 侧基的肽 B， 均通过琥珀酸酐或本领域技术人员已知的任何其他合适的衍 生化试剂修饰。
肽组分 B
肽组分 B 可选自以下序列的一个或多个拷贝 ：
序列 AGYLLGKINLKALAALAKKIL 13 SEQ ID No 1.CN 102811744 A AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL RKKRKKKRXRHXRHXRHXR MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV RKKRKKK(HXH)4 LLOOLAAAALOOLL RQIKIWFQNRRMKWKK RRRRRRRRR MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV说明书2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25.10/25 页GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV FILFILFILGGKHKHKHKHKHK FILFILFILGKGKHKHKHKHKHK FILFILFILGKGKHRHKHRHKHR AGYLLGKINLKALAALAKKIL GDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTL PFLDRLRRDQKSLRGRGSTL PFLNRLRRDQKSLRGRGSTL PFLDRLRRNQKSLRGRGSTL PFLNRLRRNQKSLRGRGSTL PFLNRLRRNLKSLRGRLSTL PFLDRKRRDQKSLRGRGSTL RHRHRHHHGGPFLDRLRRDQKSLRGRGSTL PNNVRRDLDNLHACLNKAKLTVSRMVTSLLEK PNNVRRDLDNLHAMLNKAKLTVSRMVTSLLEK PNNVRRDLNNLHAMLNKAKLTVSRMVTSLLQK14CN 102811744 A PFLNRLRRNLKSLRGRLSTL PFLNRKRRNLKSLRGRLSTL INLKALAALAKKIL
说明书26. 27. 28.11/25 页可使用合成装置例如在 433A 型 Applied Biosystems 分步合成仪上合成这些肽。 使用 4- 甲基二苯甲胺 - 聚苯乙烯树脂 (MBHA) 通过 t-Boc 化学以产生酰胺化的 C- 端或在 Rink 树脂上通过 F-moc 化学来组装氨基酸。
另外， 肽 B 可选自包含 Ny1-Bx1-Ny2-Bx2-Ny3 的序列的肽， 其中 B 是碱性氨基酸 ( 例 如 arg、 lys、 orn、 或 his)， N 是中性氨基酸 ( 例如 leu、 ile、 ala、 val、 phe、 trp、 ser、 thr、 gly、 cys、 gln、 met、 pro、 tyr) 并且 x 和 y 是 2 至 8 的整数。
根 据 一 种 实 施 方 式， 肽 B 选 自 LLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No 6] 并 且 尤 其 是 AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No 2] 或 INLKALAALAKKIL[SEQ ID No 28] 并且尤其是 AGYLLGKINLKALAALAKKIL[SEQ ID No 1] 以及氨基酸的缺失、 加入、 插入和置换。本发明还 涉及与这些序列具有至少 50％、 至少 55％、 至少 60％、 至少 65％、 至少 70％、 至少 71％、 至 少 72％、 至少 73 ％、 至少 74％、 至少 75 ％、 至少 76 ％、 至少 77 ％、 至少 78 ％、 至少 79 ％、 至 少 80％、 至少 81 ％、 至少 82％、 至少 83 ％、 至少 84 ％、 至少 85 ％、 至少 86 ％、 至少 87 ％、 至 少 88％、 至少 89％、 至少 90％、 至少 91％、 至少 92％、 至少 93％、 至少 94％、 至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％或至少 99.5％同源性的肽。本发明还涉及具有相同 性质的上述肽的亚片段。
肽 B 还可是 CPP 的非肽类似物或 CPP 或其非肽类似物的乱序组分 (scrambled component)。
本文中的术语非肽类似物用于描述包含至少一个非编码的氨基酸和 / 或具有导 致氨基酸序列中没有肽连接 ( 即， 在一个氨基酸的羧基和另一氨基酸的氨基之间形成的 CO-NH 键 ) 的骨架修饰的任何氨基酸序列。非编码的氨基酸的实例为 D 型氨基酸、 二氨基 酸、 二苯胺、 Gly、 Pro 以及 Pyr 衍生物。
此外， 该氨基酸序列可为酰胺化的或以游离酸的形式存在。
乱序组分 B 表示具有相同的氨基酸组成但是具有完全随机化顺序的肽。另外， 部 分颠倒序列是以相反的顺序添加原始序列的两个或多个氨基酸的序列。
可向这些序列加入、 插入、 置换氨基酸 ( 也包括非天然氨基酸 ) 或使氨基酸 ( 也包 括非天然氨基酸 ) 缺失氨基酸而不改变它们的整体细胞渗透能力。
细胞渗透性肽 B 和 / 或其非肽类似物的 C- 端可被修饰并且选自半胱胺或含硫醇 的化合物、 线性或分支、 环状或非环状含胺化合物， 并优选具有一个另外的官能团的化合 物， 该官能团例如但不限于 COXR， 其中 X 是 O 或 S， R 是任何脂肪族或芳香性基团或者， 盐形 成中的反离子例如 Na、 K 等、 卤素、 -OH、 -NHR， 其中 R 是保护基团或任何脂肪族或芳香性基 团， -SSR 其中 R 是保护基团 / 活化基团或任何脂肪族或芳香性基团。
物种 B( 或实体 B) 的 C- 端的巯基酰胺基团 ( 或半胱酰胺基团， cysteamide group) 使其具有独特的性质， 该基团可在血清中被活化并由此形成二聚体。该二聚体化反应由存 在于血清中的氧化酶催化。根据本发明， 一个肽分子的巯基酰胺基团可与另一个肽分子的巯基酰胺基团在氧化反应中发生相互作用。 一个这样的序列是 AGYLLGKINLKALAALAKKIL- 巯 基酰胺。 这样的反应会导致通过在位于两个不同的巯基酰胺修饰的肽上的巯基之间产生二 硫桥而形成肽二聚体。因此， 当暴露于氧化环境中时巯基酰胺修饰的肽的巯基 (-SH) 形成 二硫键 (S-S 键、 二硫桥、 C-S-S-C)。
所述递送系统包含至少一个肽 B， 其可以是不同的或相同的肽。因此， 它可包含 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 和 10 个肽 B。它们可以是二聚体或多个 CPP 并且可以是环状的和 / 或分 支的。
组分 C
C 组分是靶向部分， 例如已知或未知受体的配体。底物可以是适体和 / 或靶向肽。
适体是结合于特定分子靶标例如蛋白质或代谢物的双链 DNA 或单链 RNA 分子。
靶向肽是结合于特异性分子靶标例如蛋白质或代谢物的肽， 例如导向肽。导向肽 是通常通过噬菌体展示被选择用于结合某些组织或细胞类型的肽序列。
另外， 组分 C 是将递送系统引导至某些细胞类型或组织的另一分子， 公知的实例 是作为肿瘤靶标的生长因子的过表达。
靶向部分 C 还可以作为组合物的一部分与所述递送系统的组分 A 和 B 非共价复 合。 一般而言， 细胞选择性 CPP 可用于将任何类型的药品或药物物质靶向运输至各种 特异的真核和 / 或原核细胞靶标。例如， 此类运载物的细胞选择性运输用于传染性疾病例 如由病毒、 细菌或寄生虫感染引起的疾病的改进的治疗或预防。
在本发明的另一种实施方式中， 提供了能够选择性进入某一细胞类型 / 组织 / 器 官或运输仅在某一细胞类型、 组织或器官类型中被活化的运载物的细胞渗透性肽和 / 或其 非肽类似物。
我们已经示出了添加用于将递送系统靶向至特定的细胞类型或组织的部分不会 破坏递送性质。例如 Pepfect7( 垂直的 (ortogonally)SA 并且具有 CREKA N- 端 ) 能够在 HeLa 和 CHO 细胞中递送 SCO 和质粒 ( 数据未示出 )。
间隔区
间隔区用于组分 A、 C 和运载物与组分 B 的结合。
根据一种实施方式， 所述间隔区包含一个或多个氨基酸， 例如赖氨酸单元， 例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个氨基酸， 例如赖氨酸单元， 其可以是直链或支链的并用官能团或另 外的碳原子修饰用于进一步结合。
所述间隔区是具有一个至若干个促进组分 A 或树状结构结合的取代基的线性或 支链基团， 所述树状结构优选由以树状形式排列的赖氨酸或鸟氨酸残基组成但不限于此， 如图 1 的实例所描绘的， 其包含 1、 2、 3、 4 或非限制数量的 Lys 或 Orn 残基。该树可具有任 意数量的支链并由任意数量的分支单元例如赖氨酸或鸟氨酸残基 ( 本文中以 Lys 示出 ) 组 成； “Nic” 可以是烟酸、 苯甲酸、 喹啉酸、 萘羧酸、 氯喹或其衍生物， 或任何其他有机分子。
间隔区优选用于通过组分 B 的侧链来轭合四个拷贝的环体系 ( 组分 A)。 该间隔区 可以是树枝状聚合物 (dendrimer)。
树枝状聚合物是重复分支的分子， 在这种情况下优选其具有肽骨架。
本文列出的不带有运载物的用于胞内递送的 Pepfect 系统的实例如下所示 ：
表 1. 根据上文所述包括 C- 端修饰的细胞渗透性肽 (CPP) 的序列X： 4- 氨基丁酸， Cya ： 巯基酰胺， Y： 己酸， sa ： 琥珀酸
qn ： 新的 2-4 环体系， 例如喹啉和萘类似物
根据本发明， 提供了一系列新的 CPP， 尤其是具有硬脂酰基修饰的 CPP。例如 (PepFect1-4 和 PepFect14) 可用于利用非共价方法有效递送 SCO。已显示在细胞内部运送 SCO 方面， PepFect 肽与市售的转染试剂脂质体 2000 转染试剂等效或甚至比其更有效， 并且 毒性更低。 另外， Pepfect1-4 的低毒性使它们适用于转染脂质体 2000 转染试剂不起作用的 敏感细胞系统。另外， PepFect 肽比常规使用的 CPP 更强效并且远比临床前使用的 CPP- 轭 合物 (RXR)4-PMO 更有效。另外， 可有效地开发该肽已用于质粒转染， 以及用于难转染的原 代胶质细胞这一难题。此外， 更重要的是仅需要非常少量的递送物和 ON 就能够获得生物学
响应， 这减少了劳动和成本。
可对 PepFect5-13 类似物进行进一步修饰。不用硬脂酸物质修饰或除了用硬脂 酸物质修饰之外， 这些还可轭合于具有赖氨酸树的例如一个或多个如四个促进 ON 从泡状 隔室 (vesicular compartment) 释放的 QN 类似物。这些不仅具有运输在细胞核中发挥作 用的 ON 化合物的活性而且还能够有效用于递送具有胞质活性的 ON 例如抗 -miR 和 siRNA。 事实上， 就在各种细胞类型中递送 siRNA 而言， PepFect5 和 PepFect6， 特别是肽 PepFect6 的活性显著高于脂质体 2000 转染试剂。尽管在任何给定的 siRNA 浓度下阳离子脂质体 / siRNA 复合物很少产生大于 80％的基因表达下调， 但是与 siRNA 复合的两种 PepFect 均能 够在低 siRNA 浓度下引起几乎完整的 RNAi。此外， 它们转染完整的细胞群而不仅仅是分裂 细胞。最后， PepFect6 甚至在含血清培养基中也具有高活性并且能够转染包括 SHSY-5Y、 N2a、 Jurkat 悬浮细胞、 胚性成纤维素细胞和原代胶质细胞在内的非常 “难转染的” 细胞。上 述性质和与脂质体 2000 转染试剂或寡核苷酸转染试剂相比更低的毒性使这一特别的载体 非常独特。
表 2 示出了已经受用 PF6 进行 siRNA 处理的细胞的表格
运载物 ( 或负载物， cargo)
运载物 ( 或负载物， cargo) 可选自基因调节化合物， 例如寡核苷酸或质粒。它们 可通过共价结合或复合物形成与递送系统结合。
寡核苷酸家族包括用于 mRNA 沉默的反义寡核苷酸， 用于操纵前体 -mRNA 剪接方式 的剪接校正寡核苷酸、 以及用于基因沉默的短干扰 RNA。
运载物可选自由寡核苷酸及其被修饰形式、 单链寡核苷酸 (DNA、 RNA、 PNA、 LNA 以 及所有合成寡核苷酸 )、 双链寡核苷酸 (siRNA、 shRNA、 陷阱 dsDNA(decoy dsDNA) 等 )、 质粒 及其其他变异体、 用于抑制病毒复制的合成核苷酸类似物或抗病毒 ON。
所述递送系统使得能够在正确的胞内位置释放 ON( 作为运载物 ) 而不需额外添加 氯喹。因为四个拷贝的环体系 A 的结合使氯喹类似物的局部作用增加。这对于体内应用是 有价值的性质。而且， 通过将氯喹与肽结合 ( 或轭合 )， 可将有效浓度降低多于一个 log， 这 很可能解释了在 100μM 浓度下观察到的氯喹的毒性减小。
据估算， 20-30％的所有引起疾病的突变影响前体 -mRNA 剪接。若干遗传性疾病和 其他疾病， 包括 β- 地中海贫血 (β-thalassemia)、 囊性纤维病、 肌营养不良、 癌症、 和数种 神经性疾病均与选择性剪接中的变化相关。 破坏剪接的大部分突变是典型剪接位点的内含 子或外显子区段中的单核苷酸置换。这些突变引起外显子跳跃、 使用邻近的假 3′ - 或 5′ 剪接位点、 或保留突变的内含子。突变还能够在外显子和内含子中引入新的剪接位点。
最早记载的剪接突变之一发现于 β- 地中海患者中， 其中 β- 球蛋白前体 -mRNA 的内含子 2 中的突变产生了异常的 5′剪接位点， 同时激活了隐蔽的 3′剪接位点。这继续 导致了内含子保留 (intron inclusion) 和非功能性蛋白。已在囊性纤维病跨膜传导调节 基因中鉴定出相同类型的突变， 引起异常剪接和囊性纤维病的发展。以进行性退化性肌病 为特征的杜兴氏肌营养不良 (DMD) 及其较轻微的等位基因病贝克尔氏肌营养不良 (BMD) 均 由肌营养不良蛋白基因中的突变引起。 该基因中的大多数无义突变引起蛋白质合成的提前 终止并导致严重的 DMD， 而调控序列中的无义突变产生外显子的部分框内跳跃并与较轻的 BMD 相关。而且， 还已知若干种类型的癌症由影响选择性剪接的突变引起。因此， 通过使用 特异结合于这些内含子 / 外显子突变的寡核苷酸序列， 掩蔽了这些突变并恢复剪接。
另外， 本发明涉及体内或体外向靶细胞递送运载物的方法。 PepFect 和本文所述的 ON(siRNA、 质粒、 SCO( 剪接校正 Ons)) 之间形成复合物可在小体积的无菌水中在 RT 下进行 30 分钟， 然后， 在大多数试验中， 加入完全含血清培养基。与运载物形成复合物的实例 ： 在 1/10 终处理体积 ( 即 50μl) 中在 MQ 水中以不同的摩尔比 (1 ∶ 0-1 ∶ 20) 将磷硫酰 2′ O 甲基 RNA(SCO) 或抗 -miR212′ OMe RNA 与 CPP 混合。在 RT 下使复合物形成约 30 分钟。30 分钟后， 将复合物加入在 450μl 新鲜无血清培养基中生长的细胞中。
运载物 ( 或负载物 ) 还可以选自荧光标记物、 包含与失活肽偶合的可裂解位点的 细胞或连接子 (linker)、 肽配体、 细胞毒性肽、 生物活性肽、 诊断剂、 蛋白质、 药物例如抗癌 药、 抗生素、 化疗药物。
所述运载物可通过共价或非共价键结合至任意组分 A、 B 和 / 或 C。根据一种实施 方式， 该运载物可结合至肽组分 B。在本发明的一种实施方式中， 细胞渗透性肽可通过 S-S 桥与所述运载物偶合 ( 偶联 )。在自然条件下， 将运载物偶合至 CPP 的方法是多种多样的， 可根据 CPP 的性质、 运载物和预期用途进行单独选择。偶合方式可选自共价和非共价结合， 如生物素 - 亲和素结合、 酯键、 酰胺键、 抗体结合等。
抗癌药物可以是烷化剂、 抗代谢物和细胞毒性抗生素。烷化剂可以包括 4-[4- 双 (2- 氯乙基 ) 氨基 ) 苯基 ] 丁酸 ( 苯丁酸氮芥 ) 或 3-[4-( 双 (2- 氯乙基 ) 氨基 ) 苯基 ]-L- 丙 氨酸 ( 美法仑 )、 抗代谢物是 N-[4-(N-(2， 4- 二氨基 -6- 蝶啶基甲基 ) 甲基氨基 )- 苯甲酰 基 ]-L- 谷氨酸 ( 甲氨蝶呤 ) 以及细胞毒性抗生素是 (8S， 10S)-10-[(3- 氨基 -2， 3， 6- 三脱 氧 -α-L- 来苏 - 己吡喃基 ) 氧基 ]-8- 乙醇酰基 -7， 8， 9， 10- 四氢 -6， 8， 11- 三羟基 -1- 甲 氧基 -5， 12- 并四苯二酮 (naphthacenedione)( 多柔比星 )。
所述递送系统还进一步包括至少一种显像剂 ( 或成像剂 ) 和 / 或标记分子和 / 或 化疗药物。由此本发明的递送系统可被用作化疗药物和 / 或显像剂。这样的组合物也可以 包括靶向序列。化疗药物和 / 或显像剂可用于递送抗病毒寡核苷酸。
标记分子可以是用于标记或定量胞内 mRNA 的分子信标 (molecularbeacon)， 包括 基于淬灭荧光的信标和基于 FRET 技术的信标。分子信标是诸如单链寡核苷酸的分子， 其具有以发夹结构排列的内部荧光团和对 应的淬灭部分从而使这两个部分靠近。结合靶核酸序列或暴露于其他结构修饰后， 所述荧 光团与淬灭部分分离以使得能够检测到所述荧光团。 最经常使用的分子信标是用于检测特 异性 DNA 或 RNA 基序 (motif) 的寡核苷酸杂交探针。类似地， FRET 探针是位置相近的成对 荧光探针。选择荧光团使得其中一个的发射光谱与另一个的激发光谱显著重叠。从供体荧 光团到受体荧光团的能量转移与距离相关的， 因此基于 FRET 技术的信标能够用于研究使 两个荧光团的分子接近产生变化的各种生物学现象。
所述递送系统还可与循环清除修饰剂 (circulation clearance modifier) 例如 PEG 结合 ( 或轭合 ) 或复合。这样的系统可用于延迟运载物递送。循环清除修饰剂是延长 药物在体内的半衰期的分子， 例如聚乙二醇化 (pegyl)、 白蛋白结合或序列加帽。
所述递送系统可用于疾病诊断、 用作研究工具或用作靶向系统。
本发明还涉及包含一种或多种如本文定义的递送系统的组合物。 在这样的组合物 中， 所述递送系统可包括不同的组分 A、 和 / 或不同的肽 B、 和 / 或不同的靶向组分 C 和 / 或 不同的运载物。所述递送系统可包含如上所述的 A、 B、 C 和运载物的不同组合。
本发明还涉及包含如上定义的递送系统和 / 或组合物的药物组合物。
其还涉及一种或多种递送系统在制造药物组合物中的用途。
尤其是该组合物可包含具有叠加 ( 或加和， additative) 或协同作用的至少两种 不同的递送系统。这些可能以不同比率存在于组合物中。例如， 所述组合物可包含表 1 公 开的 Pepfect 的任意组合， 例如 Pepfect5 和 Pepfect6。
这样的组合物还可包含相同或不同的递送系统中的至少两种肽的混合物， 其中每 一种肽使复合物具有不同的性质， 例如靶向和转染。
这样的药物组合物可以是口服剂量单位形式 ； 注射液 ； 栓剂 ； 凝胶剂 ； 以及乳剂并 可包含赋形剂、 润滑剂、 粘结剂、 崩解剂、 增溶剂、 助悬剂、 等渗剂、 缓冲剂、 安抚剂 (soothing agent)、 防腐剂、 抗氧剂、 着色剂、 甜味剂。
例如， 所述递送剂还可用作抗微生物组合物、 类似裂解肽 (lyticpeptide) 的细胞 渗透性肽。
本发明还涉及用本发明的一种或多种递送系统覆盖的材料。
另外， 本发明涉及将权利要求 1-16 中任一项所述的一种或多种递送系统合并入 ( 或掺入到 ) 其中的材料。可将本发明的递送系统掺入树枝状聚合物、 脂质体等中。脂质体 是由磷脂组成的复合结构并且可含有少量的其他分子。
本发明还涉及含有式 Ny1-Bx1-Ny2-Bx2-Ny3 形式的新的肽， 其中 B 是碱性氨基酸 ( 例 如 arg、 lys、 orn、 或 his)， N 是中性氨基酸 ( 例如 leu、 ile、 ala、 val、 phe、 trp、 ser、 thr、 gly、 cys、 gln、 met、 pro、 tyr) 并且 x 和 y 是 2 至 8 的整数。
本发明尤其涉及其中的物种 ( 或实存物 )B 选自 LLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No 6] 且尤其是 AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No 2] 或 INLKALAALAKKIL[SEQ ID No 28] 且尤 其是 AGYLLGKINLKALAALAKKIL[SEQ ID No 1] 以及具有氨基酸的缺失、 加入、 插入和置换的 序列的肽。本发明还涉及与这些序列具有至少 50％、 至少 55％、 至少 60％、 至少 65％、 至 少 70％、 至少 71％、 至少 72％、 至少 73％、 至少 74 ％、 至少 75 ％、 至少 76 ％、 至少 77％、 至 少 78％、 至少 79 ％、 至少 80 ％、 至少 81 ％、 至少 82 ％、 至少 83 ％、 至少 84 ％、 至少 85％、 至少 86％、 至少 87％、 至少 88％、 至少 89％、 至少 90％、 至少 91％、 至少 92％、 至少 93％、 至少 94％、 至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％或至少 99.5％同源性的肽。本 发明还涉及具有相同性质的上述肽的亚片段。
如前所述， CPP 能够与运载物 ( 或负载物 ) 偶合 ( 偶联 ) 以作为将所述运载物运 送至细胞、 各种细胞区室、 组织或器官中的载体。所述运载物选自由任何药理学感兴趣的 运载物， 例如肽、 多肽、 蛋白质、 小分子物质、 药物、 单核苷酸、 寡核苷酸、 多聚核苷酸、 反义分 子、 双链和单链 DNA、 RNA 和 / 或任何人工的或部分人工的核酸例如 PNA、 低分子量分子、 糖 类、 质粒、 抗生素物质、 细胞毒性剂和 / 或抗病毒剂组成的组。此外， 对运载物的运输可用作 递送的研究工具 ( 例如标签和标记物 ) 以及用于改变膜电位和 / 或性质， 所述运载物可以 是例如标记物分子， 例如生物素。
在意图将运载物运输通过血脑屏障方面， 胞内和胞外运载物二者是同等优选的运 载物。
本文所述的所有实施方式的所有具体细节均可能变化。 当例如描述与递送系统的 组分 A、 B 和 C 相关的特定化学组分时， 在所述递送系统被掺入树枝状聚合物或脂质体时、 用 所述递送系统覆盖的材料时以及用循环清除修饰剂覆盖所述递送系统时仍然适用。
现通过以下实施方式的描述进一步说明本发明， 包括附图简述、 材料和方法、 包括 附图和图例说明以及序列表在内的实施例， 但是应理解的是本发明范围不限于任何具体描 述的实施方式或细节。
实施例和实验例
以下通过实施例和与不同 PepFect 系统以及与当今市场上占主导地位的用于体 内转染的脂质体 2000 转染试剂的比较来描述本发明。首先描述了对递送系统的改进和改 良。接着描述了用各种方法检测以证明 PepFect 对于递送剪接校正 ON、 质粒以及 miRNA 和 siRNA 的多种用途。此外， 通过较低的毒性、 同源转染和在 “难转染细胞” 中的高产率转染显 示了与根据制造商的使用说明应用的脂质体 2000 转染试剂相比的总体改进。所有试验均 在多于一种细胞类型中进行并且大多数情况下在血清存在下进行。
材料和方法
肽和寡核苷酸的合成
在 433A 型 Applied Biosystem 分步合成仪上合成 PepFect1、 PepFect2、 PepFect3、 PepFect4、 penetratin[10]、 TP10[11]、 M918[12]、 Arg9[13] 和硬脂酰基 -Arg9 形式的肽。 通过 t-Boc 化学利用 4- 甲基二苯甲胺 - 聚苯乙烯树脂 (MBHA) 来组装肽以产生酰胺化的 C- 端。 还可使用本领域技术人员公知的标准 Fmoc SPPS 条件来合成固相肽合成 (SPPS)。 本 发明中使用的肽是在 SYRO 多重肽合成仪 (MultiSyn Tech GmbH) 上用标准方案获得的。所 述方法涉及在 HBTU 活化试剂和作为碱组分的 DIEA 的辅助下从肽的羧基端到 N- 端重复偶 合 Fmoc- 保护的氨基酸。所使用的聚苯乙烯树脂固相载体是 Rink 酰胺树脂 ( 优选置换水 平为每克树脂 0.4 至 0.6 毫当量 )。氨基酸购自法国 Neosystem 公司并且被偶合为羟基苯 并三唑 (HOBt) 酯。用 HF 将肽从树脂上裂解后， 通过反相 HPLC lomega C18 柱纯化合成产物 TM 并利用 Perkin Elmer prOTOF 2000 MALDI O-TOF 质谱仪进行分析。肽的质量与理论值相 关性良好。肽序列示于表 1。
对于分支间隔区： 与 树 脂 结 合 的 完 全 保 护 的 序 列 Fmoc-AGYLLGK(ε-Mtt)INLKALAALAKKIL-Rink(Rink ＝ Rink 酰胺树脂， 如没有另外说明， 所有氨基酸均由标准保护 基团保护 ) 用作起始材料。遵循一般手册操作 ( 步骤 1 至步骤 7) 以获得四个游离羧基的 分支结构 ( 被设计为四个拷贝的新 QN 类似物的结合点 )。每一步骤之后， 进行定性茚三酮 颜色检测 (Kaiser test) 以监测反应的完全度。
1. 用 35％哌啶处理肽树脂 40 分钟以实现氨基的脱保护。
2. 偶合 ( 偶联 ) 硬脂酸 ( 优选的方法是使用 DCM 作为溶剂， BOP/DIEA 用于活化并 偶合 1 小时 )。
3. 用 1％ TFA、 3-4％ TIS、 DCM 重复洗涤 ( 共处理 1-1.5 小时 ) 除去 Mtt。为了确 保完全除去， 加入未添加 TIS 的 DCM 中的 1％ TFA 以监测离去三苯甲基 (trityl group) 的 黄色。
4. 将 3-5 当量的 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 偶合 45 分钟。优选的偶合 ( 偶联 ) 试剂是 BOP( 甚至更优选其非致癌类似物 PyBOP) 或 DIPCDI/HOAt。
5. 根据步骤 1 除去 Fmoc。
6. 重复步骤 4 和 5。
7. 在 3 当量 DIEA 存在下在 DMF 中偶合 1.5 当量的琥珀酸酐 10 分钟。
在 具 有 OligosyntTM15 预 填 充 合 成 柱 的oligopilotTM plus 10 上合 成 磷 硫 酰 2 ′ -O- 甲 基 RNA 寡 核 苷 酸。 以 5 当 量 过 量 加 入 0.1M 浓 度 的 亚 磷 酰 胺 (Phosphoroamidite)(ChemGenes Corporation， Boston， MA) 并且偶合 ( 偶联 ) 试剂的循 环时间是 5 分钟。在 3 分钟内用 3- 甲基吡啶 / 乙腈中的 0.2M 双 - 苯基乙酰基二硫化物 (ISIS Pharmaceuticals， Carlsbad， CA)(1 ∶ 1) 中进行硫醇化作用， 每个合成循环用 3ml。 将寡核苷酸从固相载体裂解并于 55℃在 25％氢氧化铵水溶液 (Merck， Darmstadt， 德国 ) 中脱保护过夜。用 100 系统和碱性 NaCl 缓冲液用填充了 SourceTM15Q阴离子交换介质的 TricoTM 柱进行纯化。用 HiTrapTM 脱盐柱对纯化的寡核苷酸进行后续处 理， 然后用 DNAPacTM-100 分析柱 (Dionex， Sunnyvale， CA) 进行 HPLC 分析 (Agilent 1100， Santa Clara， CA) 以验证＞ 97％的全长纯度。通过在 FinniganTMLGQTMDeca XP plus 质谱 仪 (ThermoFischer Scientific， Waltham， MA) 上进行质量分析验证正确产物。
细胞培养
使 Hela pLuc705 细 胞 ( 由 R.Kole 和 B.Leblue 提 供 ) 和 hek 293 细 胞 在 含 glutamax 的达尔伯克改良伊格尔培养基 (DMEM) 中生长， 其中添加了 0.1mM 非必需氨基酸、 1.0mM 丙酮酸钠、 10％ FBS、 100U/ml 青霉素、 100mg/ml 链霉素和 200μg/ml 潮霉素。CHO 细 胞在含 glutamax 的 DMEM-F12 培养基中生长， 其中添加了 0.1mM 非必需氨基酸、 1.0mM 丙酮 酸钠、 10％ FBS、 100U/ml 青霉素、 和 100mg/ml 链霉素。BHK21 细胞在生长 GMEM+2mM 谷氨酰 胺 +5％胰蛋白磷酸盐肉汤 +5-10％胎牛血清中。细胞于 37℃在 5％ CO2 气氛下生长。所有 培养基和化学试剂均购自 Invitrogen( 瑞典 )。
复合物形成
ON/CPP 复合物的形成 ： 在 1/10 终处理体积中 ( 即 50μl) 在 MQ 水中将磷硫酰 2′ O 甲基 RNA(SCO) 或抗 -miR21 2′ OMe RNA( 含 33％ LNA 取代 ) 与 CPP 以不同摩尔比 (1 ∶ 0-1 ∶ 20) 混合。在 RT 下使复合物形成 30 分钟， 同时用新鲜的无血清 DMEM(450μl)替换 24 孔板中的培养基。之后， 向各孔中加入复合物。使 SCO 的终浓度在 200nM 保持恒定 并变化肽的浓度或者用 400nM SCO 以给定的摩尔比形成复合物然后在水中系列稀释。当 使用商购转染剂 Lipofectamine 2000(Promega， USA) 时， 根据使用制造商的说明制备复合 物。用基本相似的方法形成 PepFect/siRNA 复合物， 但是用 100nM siRNA 作为起始浓度并 且摩尔比范围为 20-40。通过进行系列稀释得到较低的浓度。
质粒 /CPP 复合物的形成 ： 在 1/10 终处理体积中 (50μl) 在 MQ 水中将 0.5μg 的 pGL3 荧光素酶表达质粒或 pEGFP-C1 质粒以不同的投料比 (1 ∶ 1-1 ∶ 4) 与 CPP 混合。 30 分 钟后， 将复合物加入在 450μl 无血清培养基中生长的细胞中。 当使用脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000)(Promega， USA) 时， 根据制造商的使用说明制备复合物 (Promega， USA)。
凝胶移动检测
如前所述将肽与 SCO 混合。将 0.5μg 的 SCO 与浓度不断增加的肽混合以使得肽 / SCO 的摩尔比范围达到 5 至 20。通过在包含溴乙啶 (Sigma， 瑞典 ) 的 TBE 缓冲液中于 150V 在 20％聚丙烯酰胺凝胶上电泳 1h 对复合物进行分析。用 IR LAS-1000Llte v2.1 软件在 Fujifilm LAS-1000 IntelligentDark box II 中照相。 定量摄取
用 200nM Cy5 标记的以摩尔比与肽复合的 SCO 处理实验前 24 小时接种的 100 000 个 Hela pLuc 705 细胞 1h。处理后， 在胰蛋白酶消化前在 HKR 中洗涤细胞两次。于 4℃将 细胞在 1000g 下离心 5 分钟并用 250μl0.1M NaOH 将细胞沉淀裂解 30 分钟， 之后将 200μl 裂解物转移至黑色 96- 孔板中。在 Spectra Max Gemeni XS 荧光计 (Molecular devices， USA) 上于 643/670nm 处测量荧光， 利用荧光素线性特性并标准化 ( 或归一化 ) 至蛋白质的 量 (Lowry BioRad， USA) 重新计算为内标化合物 (internalizedcompound) 的量。
荧光素酶测定
剪接校正试验 ： 在所有试验中于试验前 24 小时将 100 000 个 Hela pLuc705 细胞 接种至 24 孔板。 在无血清培养基中用复合物处理细胞 4h， 然后换成血清培养基再处理 20 小 时。 之后， 用 Hepes Krebs Ringer(HKR) 缓冲液洗涤细胞两次并在室温下在 HKR 中用 100μl 0.1 ％曲通 (triton)×100 裂解 15 分钟。用 Promega 荧光素酶测定系统在 Flexstation II(Moleculardevices， USA) 上测量荧光素酶活性。将 RLU 值标准化 ( 或归一化 ) 至蛋白 质含量， 并将结果表示为 RLU/mg 或与未处理细胞相比剪接的成倍增加。在使用促进内涵体 逃逸的试剂氯喹的试验中， 将复合物与 75μM 氯喹在无血清 DMEM 中共温育 2h， 然后使细胞 在完全 DMEM 中生长 20h。
质粒转染 ： 对于质粒转染， 在处理前 24h 接种 80 000 个 CHO 或 Jurkat 细胞。在无 血清 DMEMF12 中用 pGL3/CPP 复合物处理细胞 4 小时， 然后替换为完全培养基再生长 20 小 时。使细胞被裂解并根据剪接校正测定进行分析。
siRNA 转染 ： 如其他试验， 接种包括 HeLa、 BHK21 和 U2OS 细胞在内的不同的荧光素 酶稳定细胞系。在无血清培养基或完全生长培养基中处理细胞 4h， 然后向孔中加入 1ml 完 全生长培养基。使细胞被裂解并如前文所述在 20 小时后测量发光。将发光标准化 ( 或归 一化 ) 为每一个孔中的蛋白质含量并将来自未处理细胞的 RLU/mg 值当做 100％。 接着将不 同的处理表示为未处理细胞的百分比。
微小 RNA-21 测定 ： 将携带一个内部萤火虫荧光素酶基因 (fireflyluciferase gene) 和在 3′ UTR 携带微小 RNA-21 靶位点的第二海肾荧光素酶基因 (renilla luciferase gene) 的质粒 psi-CHECK2 转染至在 6cm 培养皿中生长的 HeLa 细胞。转染后一天， 通过胰蛋 白酶消化使细胞分离， 并以 70000 个细胞 / 孔的密度接种至 24 孔板中。又过了 24h 后， 如 之前对 SCO 所述用抗 miR-21 复合物处理细胞。使细胞被裂解， 然后检测充当转染内标的萤 火虫荧光素酶的表达， 然后检测海肾荧光素酶表达。如果 ON 到达了细胞质， miR21 被隐蔽 起来并预期海肾荧光素酶表达增加， 生成与剪接校正测定相似的阳性判读。将未处理细胞 的萤火虫 / 海肾荧光素酶之比设定为 1 并将处理后的海肾荧光素酶增加表示为与未处理细 胞相比的成倍增加。使用 HeLa 细胞是因为已知它们表达高水平的 miR21。
毒性测定
使用 Promega Cytox-ONETM 测定测量膜完整性。简言之， 在用肽处理前两天将 104 个细胞接种至 96 孔板中的无血清 DMEM 中。30 分钟后， 将培养基转移至黑色荧光板上并用 TM Cyto Tox-ONE 试剂温育 10 分钟， 然后加入终止溶液。在 560/590nm 处测量荧光。将未处 理细胞定义为 0， 将 HKR 中在 0.18％曲通 (triton) 中通过裂解释放的 LDH 定义为 100％裂 解。
Wst-1 测定
用 Wst-1 增殖测定评价肽的长期毒性作用。在处理前两天以 104 个细胞 / 孔将 HeLa pLuc 705 细胞接种至 96 孔板。在 100μl 血清或无血清 DMEM 中用复合物处理细胞 24h。然后根据制造商的使用说明 (Sigma， 瑞典 ) 将细胞暴露于 Wst-1。在吸光度读数仪 Digiscan(Labvision， 瑞典 ) 上测量吸光度 (450-690nm)。 将未处理细胞定义为 100％存活。
FACS
转染前一天将 24 孔板接种 EGFP 稳定的 CHO 细胞。转染当天， 用 PF6-siRNA 复 合物转染细胞， siRNA ∶ PF6 的摩尔比为 a) 对于无血清培养基温育 ： 1 ∶ 20 和 1 ∶ 40， siRNA 浓度为 50nM、 25nM 和 12.5nM ； 以及 1 ∶ 80， siRNA 浓度为 20nM、 10nM 和 5nM。b) 对 于完全培养基温育 ： 1 ∶ 20 和 1 ∶ 40， siRNA 浓度为 100nM、 50nM 和 25nM。对于对照试验， 用 Lipofectamine(100nM siRNA 和 2.8μl Lipofectamine) 用 EGFP siRNA 转染细胞， 或不 用复合物或仅用 siRNA 实施假转染 ( 以得到原始 EGFP 水平 )。转染过程中的温育体积是 500μl。在无血清培养基中或完全培养基中按要求将复合物与细胞温育 4 小时。然后向各 孔中加入 1ml 完全培养基并使细胞生长 24h( 或可替代地生长 48 小时 )。
在测试当天， 用 PBS 洗涤细胞， 并用胰蛋白酶消化从孔分离。使用 125μl 胰蛋白 酶溶液。细胞分离后， 加入 500μl 完全培养基并将细胞转移至埃彭道夫管中。500×g 离 心 10min， 除去上清并重悬浮在 500μl 添加了 2％ FBS 的 PBS 中 ( 该 FBS 非常重要， 当试管 在等待被分析时其使细胞保持较好的形状 )。将细胞悬液转移至 FACS 管中并将它们置于 冰上。尽快进行分析。在 FACS 中测量细胞悬液。在 FSC-SSC 图上界定活细胞群。在 FSC/ FITC-A 或 SSC/FITC-A 图上找出假转染细胞的 gate( 具有原始 EGFP 水平的细胞的 gate/ cloud)。用相同的 gate 检测样品。具有原始 EGFP 水平的位于 cloud 之外的以及具有较低 EGFP 水平的细胞被计数为发生了 siRNA 转染的细胞。 将结果表示为用 siRNA 转染的细胞的 百分比。可替代地， 用 FITC-A 直方图基于假转染细胞以相似的方式选择 gate。
实施例 1( 图 1- 图 3) ： 通过细胞渗透性肽进行的剪接校正为了评价不同的未修饰 CPP 将寡核苷酸运输至细胞内的效力， 我们使用所谓的剪 接校正测定 [14]。这一测定基于被稳定转染的 HeLa 细胞系， HeLa pLuc 705 细胞。所述细 胞具有稳定的质粒转染， 所述质粒携带被来自 β- 球蛋白前体 -mRNA 的内含子 2( 携带隐蔽 剪接位点 ) 的插入中断的编码荧光素酶的序列 ( 图 1)。在正常条件下， 该隐蔽剪接位点能 够激活异常剪接位点， 使具有内含子保留的成熟 mRNA 增加， 因此得到非功能性的荧光素酶 蛋白。然而， 如果该异常剪接位点被 SCO 遮蔽， 则荧光素酶的前体 -mRNA 很可能被加工并产 生功能性荧光素酶。通过使用 HeLapLuc 705 细胞， 可通过测量荧光素酶活性来评价各种载 体的核递送效率。
在第一组试验中， 我们欲评价若干已建立的 CPP 采用共温育策略将剪接校正磷硫 酰 2′ O- 甲基 RNA( 即 SCO) 递送至细胞内的能力 [15]。 如图 2a 所示， 所有被检测的未修饰 CPP 均能够在暴露后 1h 内转移至细胞内， 穿膜肽 (penetratin) 是最有效的肽。然而， 任何 一种肽都不能将生物活性 SCO 运输至细胞的细胞核中， 这可从荧光素酶表达的不显著增加 得以解释 ( 图 2b)。为证实该阴性结果不是由失活的 SCO 引起， 用脂质体 2000 转染试剂作 为递送载体进行对照试验。如图 2c 所示， 随着 SCO 浓度的增加观察到正确剪接的荧光素酶 的剂量依赖性增加。低活性的另一可能的原因是 CPP 和 SCO 之间不能形成复合物。然而， 这个原因也被排除了， 因为在凝胶延迟测定中所有的肽均促进复合物形成 ( 图 3)。这些结 果共同表明， 虽然 CPP 能够将 SCO 运输至细胞内， 但是它们很可能仍然被捕获在内涵体区室 中。 这一点进一步得到了共聚焦显微数据的支持， 其中， 如果不是全部的话， 大量标记的 SCO 存在于间隔的区室内， 例如内涵体或溶酶体 ( 数据未示出 )。更重要的是， 当用趋溶酶体剂 氯喹一起处理细胞时， 除 Arg9 之外所有肽的剪接校正显著增加 ( 图 2d)。 有趣的是， 尽管穿 膜肽 (penetratin) 产生最高的定量摄取但是 TP10 优于其他的肽。综合考虑， 这表明共温 育策略促进了细胞摄取而不是可生物利用的递送。此外， 得到了高细胞摄取与被运输运载 物的高活性不相关的结论。
实施例 2( 图 2、 图 4、 图 6) ： 促进剪接校正的双功能 CPP
接着， 尝试在 CPP 中引入修饰以增加它们的效率。将脂肪酸部分 ( 即硬脂酸 ) 引 入现有的 CPP 中， 并且还引入新设计的序列中 ( 参见图 5)。后一种肽 PepFect1 的设计原 理是形成双功能肽， 一个基团用于促进内涵体逃逸 ( 即 (RHbutRH)4)， 一部分实现核仁递送 (RKKRKKK)。 尽管在用肽核酸作为共价轭合物的转染中该肽非常强效， 但是它不能在非共价 环境中运输 SCO( 数据未示出 )。因此， 该肽是 N- 端硬脂酰化的。同样， 另外四种之前检测 的 CPP 也是硬脂酰化的， 并将 M918[12] 和 TP10[11] 分别重新命名为 PepFect2 和 PepFect3。 有趣的是， 在所检测的任何摩尔比下硬脂酰化的 Arg9 和穿膜肽 (penetratin) 均不能促进 剪接校正。然而， 当与 SCO 的摩尔比达到 10 ∶ 1 时 PepFect3 非常强效， 几乎达到了与使用 脂质体 2000 转染试剂时相同的荧光素酶表达水平 ( 图 4)。在使用 PepFect3 的条件下， 摄 取与剪接校正之间存在正相关性， 而其他的肽不存在这样的相关性。 事实上， 使用 PepFect3 的剪接校正与 TP10 和氯喹一起使用时几乎一样高 ( 图 6)。因为 TP10 和与 SCO 复合的 PepFect3 之间的定量摄取的差异不显著 ( 图 2a 和图 4a)， 由此得到该活性的增加是由内涵 体释放增加引起的结论。出人意料的是， 在剪接校正测定中只有 PepFect3 是有活性的而 PepFect2 仅具有很小的活性 ( 图 4b)。
越来越多的疾病例如 β- 地中海贫血、 囊性纤维化病、 肌营养不良、 癌症等都是由导致异常剪接的突变引起的， 所述异常剪接现在可使用不同的 SCO 得以恢复 [3， 17， 18]。 然 而， 需要高剂量的 SCO 以在体内获得显著的生物学作用。因此， 这些结果对于由缺陷性选择 性剪接引起的各种疾病的未来治疗具有非常广阔的前景。
实施例 3( 图 7- 图 8) ： 脂肪酸修饰位置的评价
为 了 评 价 和 表 征 脂 肪 酸 修 饰 的 位 置， 比 较 PepFect3(N 端 硬 脂 酰 基 修 饰 ) 和 PepFect4( 在 Lys7 上侧链被硬脂酰化 ) 递送 SCO 的效率。 图 7 示出了 PepFect4 在促进剪接 校正中比 PepFect3 更有效， 甚至在较低的摩尔比的情况下也是如此。而且， 与脂质体 2000 转染试剂相比， PepFect4 更强效。有趣的是， 在低 25 倍的 SCO 浓度下， 两种 PepFect 的活 性均显著高于临床前使用的共价 CPP- 吗啉结合物 ( 轭合物 )RXR4-PMO( 图 8)。
实施例 4( 图 9- 图 12) ： 用 PepFect3 和 PepFect4 递送质粒
在下一组试验中， 评价了上述 PepFect 肽促进 4.7kbp 表达荧光素酶的 pGL3 质粒 的摄取和表达的能力。 出人意料的是， 所有的 PepFect 肽均能够显著增加基因递送 ( 图 9)。 而且， 在投料比为 1 ∶ 1 至 1 ∶ 1.5 时， PepFect3 是最有效的肽。这些结果表明所述肽还 能够有效用于更生物学相关的质粒和 ON 的基因递送。以 CR 范围为 0.5-2 的不同投料比制 备 PF3 和质粒的复合物并与根据制造商的使用说明应用的脂质体 2000 转染试剂进行比较。 将结果表示为与仅用质粒处理的细胞相比基因表达的成倍增加。图 10 中的图示出了 CR 大 于 1 时， PF3 的活性高于脂质体 2000 转染试剂。另一优势是图 11 所示的同源转染。传统 的转染试剂需要一定的细胞汇合度以达到最佳功能， 然而图 12 显示 PF4 转染与接种的细胞 数量无关但效果一样好。
实施例 5( 图 11 和图 13) ： PepFect 的毒性小于 LF2000
当用于活组织时， 保持尽可能低的毒性作用是很重要的。如图 11 所示， 转染前在 不同的样品中接种相同数量的细胞， 然而， 处理后阳离子脂质体处理的细胞中细胞数量较 少。PepFect3 的毒性低于脂质体 2000 转染试剂 ( 图 13) 并且可能由此提供用于基因疗法 的新的非病毒工具。
实施例 6.( 图 14- 图 15) ： 通过 PepFect5 递送微小 RNA
微小 RNA(miRNA) 代表了在植物、 非脊椎动物和脊椎动物的基因组中被编码的一 类新的非编码 RNA。 微小 RNA 基于 ( 部分 ) 序列互补性调节靶 mRNA 的翻译和稳定性。 miRNA 变化与人类癌症的起始和发展有关。已显示 miR-21 起到癌基因的作用并通过调节诸如 bcl-2 的基因来调节肿瘤产生， 因此其可作为新的治疗靶 [19]。
本文中我们示出了与阳离子脂质体相比通过 PepFect5 递送 miR-21( 图 14)。 二者 在较低的 ON 摩尔比时等效。然而， 在摩尔比为 5 时， PepFect5 显著更佳 ( 图 15)。
实施例 7( 图 16- 图 19) ： 比较 PepFect5 和 PepFect6 的 siRNA 递送
在该实施例中， 不用硬脂酸物质修饰或除了用硬脂酸物质修饰之外， 还将其结合 ( 轭合 ) 于促进肽从泡状区室释放的具有四个氯喹类似物的赖氨酸树 ( 图 5)。该构建体不 仅具有运输在细胞核中发挥作用的 ON 化合物的活性， 而且还可以有效应用于胞质活性 ON 例如 siRNA( 图 16 和图 17) 的递送。事实上， PepFect5 和 PepFect6， 并且特别是后一种肽， 在各种细胞类型中递送 siRNA 的活性显著高于脂质体 2000 转染试剂 ( 图 16- 图 18)。尽 管在任何给定的 siRNA 浓度下阳离子脂质体 /siRNA 复合物很少产生大于 80％的基因表达 下调， 但是与 siRNA 复合的两种 PepFect 在低 siRNA 浓度下实现几乎完全的 RNAi。另外，PepFect6 在完全生长培养基、 含血清的培养基中也是有效的 ( 图 19)。其原因可能是与缺 乏硬脂酰基团的 PepFect5 相比， 它具有硬脂酸基团和氯喹树的双重修饰。
实施例 8.( 图 20- 图 28)PepFect 转染 ： 同源、 稳定并且在难转染的细胞中有效
用户友好的试剂应耐受例如复合物形成中摩尔比的细微变化。PF6 在不同摩尔比 下几乎是等效的 ( 图 20) ： 用与 50nM siRNA 复合的 PF6 处理 24 小时后的 BHK21 细胞中的 RNAi。即使在例如 10 这样低的 MR 下， 在荧光素酶稳定的 BHK21 细胞中也可获得大于 80％ 的荧光素酶下调。与使用脂质体 2000 转染试剂或任何其他基于脂质体的递送系统通常可 获得的结果相比， 这是更强的 RNAi 作用。有趣的是， 在 MR20 和 MR40 之间， 响应的差异非常 低。这使得与转染量的小变化对转染效率具有显著影响的脂质体 2000 转染试剂相比， 该递 送系统更加用户友好。除了在含血清培养基中具有高效率 ( 图 21- 图 27) 之外， PepFect6 构建体转染完整的细胞群而不仅仅是分裂细胞 ( 图 21)。 这一点通过图 22 中的荧光显微术 进一步可视化。此外， 较长的 siRNA( 即所谓的 dicer 底物 ) 也能够通过 PF6 有效递送 ( 图 24)。图 23 示出了在 EGFP-CHO 细胞中单次 siRNA 处理后 RNAi 衰减动力学的分析。以给定 的 siRNA 浓度制成 PF6/siRNA 颗粒并在含血清培养基或无血清培养基中进行处理。然后 将该作用与通过与脂质体 2000 转染试剂或寡核苷酸转染试剂复合的 100nM siRNA 诱导的 RNAi 比较。结果明确显示， 24h 后 PF6 已经诱导几乎完全的 RNAi， 与 siRNA 浓度无关。应将 该结果与使用寡核苷酸转染试剂和脂质体 2000 转染试剂分别观察到的 20％和 55％下降进 行比较。此外， 在最佳条件下， 当使用 PF6 时， RNAi 响应持续 4-5 天。最后， PepFect6 还能 够转染许多非常 “难转染的” 细胞， 包括 SHSY-5Y( 图 25)、 N2a、 大鼠原代胶质细胞 ( 图 26) 和 Jurkat 悬浮细胞 ( 图 28)。上述性质和与脂质体 2000 转染试剂或寡核苷酸转染试剂相 比更低的毒性使得这种特别的载体非常独特。
实施例 9( 图 29) ： 选择性环体系修饰
在图 29 中， 我们证明了物质 A 不必要是喹啉类似物。萘衍生物和相似的环结构执 行相似的功能。用与 SCO 复合的 PF5 类似物处理后在 HeLa 细胞中的剪接校正。在这种情 况下， 使用具有与四个拷贝的 1- 萘氧基丙酸 (1-naftoxy propanoic acid) 形成垂直分支 的赖氨酸的 TP10 代替喹啉类似物来评价融合性质的重要性。该结果显示， 与之前在 PF5 中 观察到的 100 倍增加相比， 剪接增加了 12 倍。
实施例 10.( 图 30) ： 新的细胞渗透性序列 ： PepFect14
在 PepFect 递送系统中检测了若干种不同的细胞渗透性肽， 本实施例是被称作 Pepfect14 的具有硬脂酰基结合的新序列的一个实例。如图 30 所示， PepFect14 能够在血 清存在下有效递送 siRNA 和 SCO 二者。
实施例 11( 图 31) ： 可将 PepFect 递送系统混合产生叠加效应
另外， 可如图 31 所示将 PepFect 递送系统混合在一起， 不同比例的 PF3 和 PF5 协 同发挥作用并且与两种 PepFects 自身相比能够更好地递送 SCO。另外， 可类似地混合两种 或多种 PepFect 递送系统的组合物以产生另外的性质， 例如靶向或半衰期延长。
实施例 12. 合成新的氨基 - 喹啉衍生物， N-(2- 氨基乙基 )-N- 甲基 -N′ -[7-( 三 氟甲基 )- 喹啉 -4- 基 ] 乙烷 -1， 2- 二胺
利 用 PEG 400 浴 将 安 装 有 磁 力 搅 拌 器 的 50mL 圆 底 烧 瓶 中 的 3.8g(16.3mmol)4- 氯 -7-( 三氟甲基 ) 喹啉和 12 倍摩尔过量的 N- 甲基 -2， 2′ - 二氨基二乙胺 (25ml) 的混合物在 2.5h 内边搅拌边从室温加热至 80℃， 然后在 3h 内使温度升高至 130℃， 并且最后于 140℃加热 2.5h。将该反应混合物冷却至室温， 加入冷 DCM 使其立即沉 淀， 滤掉沉淀物。用 5％ NaHCO3 水溶液洗涤有机层两次， 然后用水洗涤两次。在无水 MgSO4 上干燥有机相， 减压 ( 旋转蒸发器 ) 除去溶剂并且将残余物留在冷冻干燥器中。得到重量 为 4.5g(MW312.3)， 14.4mmol， 产率为 83％的粗产物， 未对其进行进一步纯化而用于与肽结 合 ( 轭合 )。
N-(2- 氨基乙基 )-N- 甲基 -N′ -[7-( 三氟甲基 )- 喹啉 -4- 基 ] 乙烷 -1， 2- 二胺 与琥珀酸修饰的多个赖氨酸残基的侧链偶合 ( 偶联 )， 提供多个拷贝的与载体分子共价结 合的 ON 类似物。 用 3 当量的 TBTU/HOBt 和 6 当量的 DIEA 实现固相载体上游离羧基的活化。 将待结合的过量 (2-5 当量 ) 新喹啉衍生物 (N-(2- 氨基乙基 )-N- 甲基 -N′ -[7-( 三氟甲 基 )- 喹啉 -4- 基 ] 乙烷 -1， 2- 二胺溶于 DMF 并与活化剂一起同时加入肽 - 树脂中以通过 其游离氨基基团使 QN 类似物与活化的树脂偶合 ( 偶联 )。为了确保完全偶合 ( 偶联 )， 由 于不能够通过 Kaiser 测定来监测， 可以使该反应进行较长的时间 ( 通常过夜 )。
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本发明还涉及所述系统在死亡诊断中作为研究工具和作为靶向系统的用途、 包含 该系统的组合物并且尤其是药物组合物、 覆盖有该系统的材料以及其中合并 ( 或掺入 ) 有 该递送系统的材料。最后， 本发明涉及新的肽。
背景技术 疏水性质膜构成活体动物中细胞的主要屏障， 其允许必要分子的构成性和调节性 内流进入而阻止其他大分子进入细胞内部。尽管跨越质膜的能力对于细胞维持非常关键， 但是其仍然是推进现有药物开发需要克服的主要障碍之一。在过去的 40 年中， 已开发了若
干种用于操纵基因表达的基于寡核苷酸 (ON) 的方法。所述基础方法涉及使用表达感兴趣 的基因的细菌质粒。 另外， 为了评价不同基因的功能方面， 这是在临床环境中可利用的非常 具有吸引力的策略， 即基因疗法。起初认为基因疗法用于遗传性基因疾病的矫正治疗。然 而， 在过去的 15 年中， 尽管还研究了其他获得性疾病， 但用于癌症的实验性基因疗法已成 为经常使用的治疗方法 [1]。
已出现了利用较短的 ON- 序列干扰基因表达的其他多种方法。最近积极开发了基 于用于实现基因沉默的短干扰 RNA(siRNA) 和用于操纵剪切模式的剪切校正 ON(SCO) 的反 义方法 [2， 3]。 尽管它们是调节基因表达的有效化合物， 但是其疏水性却阻止了细胞内摄作 用。
尽管基因疗法对于未来各种疾病的治疗具有很大潜力， 但是它具有一些严重的缺 陷。首先， 质粒较大， 其大小通常超过 1MDa， 这使其不能透过细胞膜。第二， 在临床试验中 已使用病毒来实现治疗性基因的细胞内摄作用。尽管提供了递送基因的有效方法， 但是这 些方法可能会引起严重的免疫应答。 因此， 为了推进现有的基因疗法， 需要更安全的递送系 统， 优选不依赖于病毒的使用。
因此， 人们加强了对有效的非病毒递送载体的研究。 在现今的技术领域中， 已在利 用基于阳离子脂质体 (Lipofectamine) 或多聚阳离子聚合物的载体， 并且这些载体对于常 用细胞系的转染非常有效。 然而， 大部分这些载体要么对血清蛋白敏感、 不能转染完整的细 胞群、 对于 “难转染的” 细胞无效， 要么毒性太强。对于现在市场上销售的载体而言， 似乎高 效力和高毒性之间存在正相关。因此， 急需寻找能够克服上述问题的递送媒介物。
细胞渗透性肽 (CPP) 是近些年来关注度不断提高的一类肽。这是由于它们具有 以相对无毒的方式运送各种本为非渗透性的大分子跨过细胞质膜的显著能力， 如 [4] 中综 述。这些肽的长度通常小于 30 个氨基酸 (aa) 并且具有阳离子和 / 或两性性质， 其已被广泛用于体外和体内递送各种 ON[5]。尽管这些肽一般是无毒的， 但是仍存在一些与它们的 用途有关的问题 [6]。就 ON- 递送而言， CPP 技术的一个缺点在于通常需要使肽共价结合至 ON， 这是一个繁杂的操作并且通常需要高浓度的肽结合物 ( 轭合物 ) 以获得显著的生物学 反应 [7， 8]。 一些研究已令人信服地显示简单地将 CPP 与 ON 混合的非共价共温育策略是有 效的并且是一种无毒的方式。当使用与未经修饰 CPP 的共温育策略时， 似乎所述复合物仍 然被捕获在内涵体中并因此不能发挥生物反应 [9]。 理想条件下， 将 CPP 设计成能够在胞吞 作用之后更有效地逃逸内涵体区室 (endosomal compartment)， 由此使得它们与寡核苷酸 或质粒非共价复合。已尝试将 CPP 的应用与已知的转染试剂组合以减少获得生物反应所需 的转染试剂的量或将 CPP 与已知的融合肽一起加入。另一种策略是一起加入高浓度的趋溶 酶体剂 ( 向溶酶体剂， lysosomotrophic agent) 氯喹以增加 CPP/ON 复合物的效力， 这显著 增加了转染但是却仅限于体外使用， 而且所需要的高浓度氯喹还带来了毒性问题。
相关专利 US 2007/0059353 公开了一种具有细胞和核进入能力的脂质体。所提供 的脂质体在其表面上具有包含多个连续精氨酸残基的肽， 特别提供了其中的肽用疏水基团 或疏水化合物修饰并且将该疏水基团或疏水化合物插入脂质双层中使得所述肽暴露在该 双层表面上的脂质体。除了构建此类复杂载体的困难之外， 这一递送系统的问题还在于它 们是以脂质体为基础的。 若干团队已报导了用基于脂质体的递送系统转染后基因表达谱发 生了变化， 这在很大程度上阻碍了它们的使用。 另外， 寡聚精氨酸倾向于保持与内涵体区室 结合并因此对于递送而言不是最优的。 一种改进的策略是用一种或多种能够促进内涵体逃 逸的化学物种 ( 或化学实存物， chemical entity) 化学修饰新设计的或现有的 CPP。
目前用于内涵体逃逸所选择的药物是氯喹 (CQ) 及其类似物。它是一种， 正如它还 被称作， 趋溶酶体剂， 其抑制内涵体酸化， 在较高浓度下导致内涵体溶胀和破裂。
若干美国专利公开了氯喹单独使用或与其他药物组合使用以抵抗各种疾病的用 途。例如， 第 4,181,725 号美国专利和 A.M.Krieg 等人的美国专利申请 20040009949 公开 了氯喹与抑制性核酸组合用于治疗各种自身免疫疾病的用途。
氯喹作为 “趋溶酶体” 剂能够从细胞内涵体 / 溶酶体释放物质的能力已被广泛 记载。[Marches， 2004 ； A.Cuatraro 1990 等 ]。然而， 由于其毒性已要求禁止氯喹的体内 使用， 因为需要给予高浓度的游离氯喹以到达内涵体。( 引用 J.M.Benns 等人， 1stpara.， Bioconj， Chem.11， 637-645， (2000) ： “尽管已证明氯喹有助于将质粒 DNA 释放进入细胞质， 但是已发现其具有毒性并因此不能在体内使用。 ” )
最近， 标题为 “氯喹偶合 ( 偶联 ) 的抗体和其他蛋白质以及它们的合成方法 (Chloroquine coupled antibodies and other proteins with methods fortheir synthesis)” 的第 2007166281 号 USPTO 申请公开了将氯喹和由其衍生的结构偶合于包含能 够在可控条件下释放氯喹的可生物裂解连接 (biocleavable linkage) 的不同的载体组合 物。第 20070166281 号申请的目的在于当载体到达其作用位点后提供使氯喹从蛋白质或肽 活性剂或抗体控释。
Kosak 及其同事的专利 US2006/0040879 公开了组合物和用于制备偶合了氯喹的 核酸组合物的方法。 该现有技术已显示以足够高浓度的游离药物给予的氯喹增强了各种药 剂从细胞内涵体释放进入细胞质。 这些组合物的目的在于在需要释放核酸的相同位点提供 可控量的氯喹， 从而降低需要的总体剂量。本专利的目的在于实现与核酸组合物结合的氯喹的控释， 这并不是该发明的主题， 但是增强并简化了体外和体内基因疗法的递送。 发明内容 本发明提供了用于细胞内运载物递送的系统， 其包括克服了非共价基因递送的所 述缺陷 ( 即低效和异源递送以及毒性 ) 的新的一系列分子。本发明不需要可生物裂解的连 接体 (linker) 来裂解氯喹类似物。本发明的系统包括不可逆地结合了氯喹的化合物。
该系统包括具有脂肪酸修饰的改进的 CPP 的化合物， 其可用于有效递送多种 ON， 而不具有现在市场上销售的递送物的毒性。新一代进一步衍生化的 CPP 能够将药物负载物 有效递送至群体中的所有细胞中并将 ON 从其内涵体捕获 (entrapment) 中释放。本发明的 权利要求描述了经修饰的和衍生化的递送肽以及它们的检测应用 ； 增强的转染、 剪接校正 和 siRNA 递送。
附图说明 图1
经修饰的荧光素酶基因的前体 -mRNA。 将来自在核苷酸 705 处携带点突变的 β- 球 蛋白基因的内含子 2 插入荧光素酶基因。用 SCO 对该位点实施的阻断使剪接重新定向至功 能性 mRNA。 因此， 这生成了依赖于 SCO 到达细胞核这一事实的阳性生物学判读 (read-out)。
图2
用未修饰的 CPP 或与 200nM SCO 复合的脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000) 处理后的定量摄取和剪接校正。A)Cy5-SCO 与不同 CPP 以 1 ∶ 5、 1 ∶ 10 和 1 ∶ 20 的摩尔比复合后 1 小时的摄取。B) 用 A 中相同组的复合物处理后的剪接校正。在无血清 DEME 中处理 2h， 然后用完全生长培养基替换培养基并再生长 20h。C) 用浓度不断增加的 SCO 处理后的剪接校正， 根据制造商的使用说明使用脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000)。D) 与 B 相同， 但是用阻止内涵体酸化的 75μM 氯喹 (CQ) 共处理， 并因此促进内涵体 逃逸。这些结果明确显示未修饰的 CPP 能够引起 SCO 摄取但是不能诱导剪接校正。由于氯 喹显著增加了剪接校正， 有理由推断 CPP/SCO 复合物仅存在于内涵体区室内。
图3
凝胶阻滞试验。如之前所述形成复合物并跑 PAGE 胶 1h。将肽与磷硫酰 2′ O- 甲 基 RNA( 即 SCO) 以 5、 10 和 20 的摩尔比混合。将保留在孔中的物质定义为肽 /SCO 复合物。 M918 和紧随其后的 TP10 是两种最强效的形成复合物的肽。
图4
用与 SCO 偶合的硬脂酰基修饰的 CPP 的摄取和剪接校正。A) 如图 2a 进行定量摄 取。与硬脂酰化的 Arg9 或 pentratin 复合的 Cy5-SCO 的摄取总体上高于 PepFect 肽。B) 相同的肽和比例用于剪接校正。令人感兴趣的是 PepFect3 诱导了正确剪接的显著增加而 硬脂酰化的 pentratin 和 Arg9 的活性可忽略。尽管观察到低摄取， 但 PepFect2 仍具有一 些活性。
图5
a)Pepfect 递送系统的一般结构， 其中 A ＝脂肪酸或二 - 四环体系， 1-8 个拷贝， 一 些可能在分支的间隔区 (spacer) 上， B ＝细胞渗透性肽或其非肽类似物并且 C ＝靶向部分
例如导向肽 (homing peptide) 或适体， 可为非共价结合。b) 脂肪酸的实例 ： 硬脂酸的示意 图， c) 环体系的实例 ： N-(2- 氨基乙基 )-N- 甲基 -N′ -[7-( 三氟甲基 )- 喹啉 -4- 基 ] 乙 烷 -1， 2- 二胺。D)Pepfect 递送系统的图示结构和名称。
图6
TP10、 TP10 与氯喹 (CQ) 以及 PepFect3(TP10 的硬脂酰化形式 ) 之间促进 SCO 介 导的剪接校正能力的比较。在较低的摩尔比 1 ∶ 5 时， PepFect3 诱导正确剪接的荧光素酶 增加接近 40 倍， 相比之下 TP10 增加 2 倍。然而， PepFect 似乎仍有改进空间， 因为用 TP10 和氯喹共处理产生剪接的 70 倍增加。
图7
PepFect3(N- 端硬脂酰化 ) 和 PepFect4(Lys7 上垂直硬脂酰化 ) 之间递送 SCO 的 比较。两种肽均促进了 SCO- 介导的剪接校正的剂量依赖性增加。将细胞在无血清培养基 中处理 4h， 然后为细胞替换完全生长培养基， 再生长 20 小时。细胞裂解后将发光数据测量 值标准化为每孔中的蛋白质含量并表示为与未处理细胞相比的剪接倍数增加。 PepFect3 与 SCO 以摩尔比 10 复合而 PepFect4 与 SCO 以摩尔比 7 复合。
图8 使用 200nM SCO 将 PepFect3 和 PepFect4 与脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000) 进行比较。尽管 PepFect3 的活性略低于基于商购脂质体的转染剂 Lipofectamine 2000， 但是 PepFect4 的活性超过该活性。如果与以 5μM 浓度临床前使用的 CPP- 吗啉轭合 物 (RXR)4-PMO 相比， 两种 PepFect 肽均在低 25 倍的 SCO 浓度下显示出优效。如图 6 进行 实验。
图9
在 Hela 细胞中用 PepFect 肽转染荧光素酶编码的质粒。根据材料和方法部分的 记载形成所有的转染复合物并在处理后 24 小时监测基因表达。 A、 C 和 E 示出了来自以不同 摩尔比分别与 PepFect1、 PepFect2 或 PepFect3 复合的 pGL3 质粒的荧光素酶表达。D) 电荷 比为 1 ∶ 1 时肽之间的比较。B) 用阳性对照脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000) 转染后的荧光素酶表达。
图 10
温育 24h 后， 将 CHO 细胞中的用脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine2000) 与用 PepFect3 对荧光素酶编码的质粒的转染进行比较。以范围为 CR 0.5-2 的不同电荷比制备 PF3 和质粒的复合物并与根据制造商的使用说明使用的脂质体 2000 转染试剂的转染效率 进行比较。将结果表示为相比于仅用质粒处理的细胞的基因表达的倍数增加。该图清楚地 表明 CR 超过 1 时， PF3 的活性大于脂质体 2000 转染试剂。
图 11
在 CHO 细胞中 24h 后测量的用 PF3 或阳离子脂质体 (Lipofectamine) 进行的 EGFP 表达质粒的转染。PF3 以不同 CR 与质粒复合并与脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000) 比较。结果显示， 尽管脂质体 2000 转染试剂的总体转染与 PF3 相当， 但是当研究 PF3 肽时被转染的细胞数目显著更高。这些试验均在无血清培养基中进行。
图 12
以不同细胞汇合度 (confluency) 在 HEK293 细胞中的质粒转染。基本按照图 10
进行试验， 使用 PF4 与脂质体 2000 转染试剂比较。令人惊讶的是， 在较高细胞密度并且 CR 高于 1 时转染增加， 在将质粒运送到肾细胞中时， PF4 的活性显著大于脂质体 2000 转染试 剂。
图 13
在不同的 CR 用 PF3 处理或用阳离子脂质体处理 24h 后 HeLa 细胞中的代谢活性。 Y 轴是相对于未处理细胞的代谢活性细胞的百分比。 所述结果来自 WST-1 测定， 其测量线粒 体中的代谢活性， 明显看出尽管与质粒复合的 PF3 对增殖的作用可忽略， 但是根据制造商 的使用说明用脂质体 2000 转染试剂处理后观察到显著的长期毒性。按照基因递送测定制 备复合物， 但是在 96 孔板而不是 24 孔板中进行处理。
图 14
比较 PepFect5 和脂质体 2000 转染试剂递送抗 -miR21 ON 的效力的剂量 - 反应曲 线。当以与 ON 的摩尔比非常低 ( 为 2) 使用 PepFect5 时， 两种试剂显示出等效。
图 15
100nM 浓度下 PepFect5 和脂质体 2000 转染试剂递送抗 -miR21 ON 的比较。当以 摩尔比 (MR) 为 5 使用 PepFect5 时， 该肽比脂质体 2000 转染试剂显著更有效。 如所预期的， 未载体化的 ON 无活性。 图 16
将脂质体 2000 转染试剂或 PepFect5 用作 siRNA 的递送剂时荧光素酶稳定的 Hela 细胞中荧光素酶下调的剂量 - 反应曲线。以摩尔比 40 使 PepFect5 与 siRNA 复合， 并且用 25nM siRNA 观察到的基因沉默与使用 100nM siRNA 的脂质体 2000 转染试剂所观察到的相 当。
图 17
比较以两个不同的摩尔比复合的 PepFect5(PF5) 和 PF6 在荧光素酶稳定的 BHK21 细胞中运送 siRNA 靶向荧光素酶的效力。PF6 优于 PF5， 特别是在低 siRNA 浓度时， 尽管与 PF6 一起使用的肽的量较低。
图 18
荧光素酶稳定的骨肉瘤细胞 (U2OS) 中高摩尔比 (80) 形成的 PF6/siRNA 复合物对 荧光素酶下调的剂量 - 反应曲线。在低至 5nM 的浓度观察到明显的 RNAi。
图 19
在完全生长培养基中进行的 PF6/siRNA 复合物转染的剂量 - 反应曲线。 随着 siRNA 浓度的增加观察到在荧光素酶稳定的 BHK21 细胞中荧光素酶表达的剂量依赖性降低。在 此， 预形成复合物并将其直接加入生长培养基中。转染后 24h 测量荧光素酶表达。
图 20
用以不同摩尔比与 50nM siRNA 复合的 PF6 处理 24h 后 BHK21 细胞中的 RNAi。即 使在如 10 这样的低 MR 下， 也有可能获得荧光素酶稳定的 BHK21 细胞中大于 80％的荧光素 酶下调。与使用脂质体 2000 转染试剂或任何其他基于脂质体的递送系统通常可能获得的 作用相比， 这是更强的 RNAi 作用。有趣的是， MR20 和 MR40 之间的响应差异很小。这使得 该递送系统比转染量的小变化对转染效率具有显著影响的脂质体 2000 转染试剂更易于使 用。
图 21
通过 FACS 测量的用与脂质体 2000 转染试剂或 PepFect6 复合的 siRNA 靶向 EGFP 处理后的 EGFP 稳定的 CHO 细胞中的下调。a) 表示来自未处理细胞的荧光 ( 蓝色 )。b) 分 图示出了用 100nM siRNA 和脂质体 2000 转染试剂处理后的 EGFP 表达。蓝色群体代表非下 调细胞， 红色群体代表 EGFP 下调细胞。左下分图 c) 是仅用与 PF6( 摩尔比 40) 复合的 25nM siRNA 处理的细胞。如图所示， 90-95％的细胞具有较低的 EGFP 表达 ( 红色 )。最后， 右下 分图 d) 示出了在完全血清培养基中用与 PF6 复合的 100nM siRNA 处理后的 EGFP 表达。处 理后 48h， 约 98％的细胞的 EGFP 表达可忽略。总而言之， 就诱导 RNAi 而言， PF6 远比脂质 体 2000 转染试剂更强效， 由于观察到几乎完整的 RNAi 所以该递送似乎是普遍存在的。即 使在完全血清培养基中， 该肽的作用也比脂质体 2000 转染试剂更显著。
图 22
用 siRNA 处理 48h 的活 EGFP-CHO 细胞中的共聚焦显微分析。100nMsiRNA 用作阴 性对照并且与 100nM siRNA 复合的脂质体 2000 转染试剂用作阳性对照。裸露的 siRNA 对 EGFP 表达具有非常小的影响而脂质体 2000 转染试剂如所预期的在一些细胞中诱导 RNAi。 与图 21 中显示的 FACS 柱状图一致， 与 50nM siRNA 共温育的 PF6 在无血清培养基和完全生 长培养基中均诱导完整的 RNAi。而且， 与脂质体 2000 转染试剂只进入细胞中的某一部分 ( 最可能是分裂细胞 ) 相比， PF6/siRNA 颗粒以普遍存在的形式进入细胞。
图 23
在 EGPF-CHO 细胞中经过单次 siRNA 处理后 RNAi 衰减动力学 (decaykinetics) 的流式细胞计量分析。以给定浓度的 siRNA 配制 PF6/siRNA 颗粒并在血清培养基 (FM) 或无血清培养基 (SFM) 中进行处理。然后将该效果与通过与脂质体 2000 转染试剂或寡 核苷酸转染试剂复合的 100nMsiRNA 诱导的 RNAi 进行比较。所得结果清楚地表明 24h 后 PF6 诱导几乎完整的 RNAi， 与 siRNA 浓度无关。应将这一结果与分别用寡核苷酸转染试剂 (Oligofectamine) 和脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000)( 转染 ) 观察到的 20％ 和 55％下降 (knock-down) 相比较。此外， 在最佳条件下， 当使用 PF6 时 RNAi 响应持续 4-5 天。MR， 摩尔比。
图 24
骨肉瘤细胞中 HPRT1 mRNA 的下调。在所有浓度的两个 PF6 摩尔比下均观察到显 著的下降， 而脂质体 2000 转染试剂在 50μM siRNA 浓度下未能诱导任何 RNAi。 在这些实验 中， 使用 Dicer 底物 siRNA( 用 dicer 加工的较长的形式 )。在无血清培养基中处理细胞并 在转染后 24h 通过 RT-PCR 分析 mRNA 水平。
图 25
siRNA 处理 20 小时后人 SHSY5Y 神经母细胞瘤细胞中的 HPRT1 下降。以两种不同 的摩尔比配制 PF6/siRNA 颗粒并系列稀释得到 100、 50 和 25nM siRNA 的终处理浓度。在 完全生长培养基中进行处理并将该 RNAi 响应与通过与脂质体 2000 转染试剂复合的 100nM siRNA 诱导的 RNAi 响应进行比较。当 PF60 与 siRNA 之比为 MR40 时， 与使用 100nMRNAi 的 脂质体 2000 转染试剂相比， 甚至在 25nM RNAi 浓度下 RNAi 响应显著更强。这表明 PF- 系 统不仅在血清中具有活性而且能以普遍存在的形式有效转染 “难转染的” 细胞。
图 26用 siRNA 靶向 HPRT1 处理后大鼠原代混合胶质细胞培养物中的 RNAi。 在含血清条 件和在无血清条件下， PF6 在引起 siRNA- 介导的基因沉默方面比脂质体 2000 转染试剂显 著更强效。
图 27
用脂质体 2000 转染试剂或 PF6 处理 24 小时后 CHO 细胞中表达荧光素酶的质粒的 转染。在肽与质粒的投料比 (charge ratio， CR) 为 2 时， 在无血清培养基中观察到与阳离 子脂质体相比 PF6 高一个对数级 (log) 的转染。甚至在血清培养基中， 在 CR4 的情况下， 该 肽促使质粒转染的效率是脂质体 2000 转染试剂的 2 倍。
图 28
Jurkat 悬浮细胞中的 EGFP 质粒的转染。尽管脂质体 2000 转染试剂几乎完全失 活， 但是用 PF6 特别是在较高的投料配比下仍观察到明显的转染。在无血清培养基中在转 染后 24 小时通过 FACS 测量 EGFP 表达。b) 对应的 Jurkat 转染的直方图。尽管总体转染水 平很低， 但是 PF6 具有转染群体中的大部分细胞的能力。c) 不依赖于细胞汇合度的 Jurkat 质粒转染。有趣的是， 用 PF6 可以不依赖汇合度而转染大部分的细胞。
图 29 用与 SCO 复合的 PF5 类似物处理后 Hela 细胞中的剪接校正。在这一条件下， 使用 具有与四个 1- 萘氧基乙酸 (1-naftoxy acetic acid) 形成垂直分支的赖氨酸的 TP10 代替 氟喹部分来评价融合性质 (fusogenic property) 的重要性。该图示出了使用 200nM SCO， 在血清培养基和无血清培养基中， 以 5 至 25 的不同肽 /SCO 摩尔比处理的 Hela pluc705 细 胞中相对于对照的荧光素酶表达的成倍增加。相比于之前观察到的 PF5 的 100 倍增加， 这 些结果表明该肽的活性显著较低， 在剪接时达到 12 倍增加。
图 30
A， 用 Pefect14/SCO 复合物处理 24h 后 Hela 细胞中的剪接校正。PF14 复合物具有 高活性， 与摩尔比和血清的存在无关。在 200nM SCO 浓度下， 与脂质体 2000 转染试剂相比， PF14 将 SCO 递送至细胞内部的活性显著更高。甚至在如 50nM SCO 这样的低浓度下也观察 到剪接的 50 倍增加。B) 该图示出了在血清培养基中以 30 至 40 的不同肽 /siRNA 摩尔比处 理稳定表达荧光素酶基因的 BHK-21 细胞后相对于对照的荧光素酶表达百分数， 并与根据 制造商的使用说明进行的阳离子脂质体转染相比较。在摩尔比为 35 时， PF14 的活性事实 上比阳离子脂质体更高， 即使是使用低 4 倍的 siRNA 浓度时也是如此。
图 31
用 PF3、 PF5 或它们的混合物处理细胞后 Hela 细胞中的剪接校正。当使用 PF3 和 PF5 的混合物时， 与以相同的摩尔量单独使用每一种肽相比， 剪接增加了将近 4 倍。
具体实施方式
本发明涉及被设计用于胞内运载物 ( 或负载物， cargo) 递送的系统， 其包括选自 具有至少 4 个碳原子的脂肪族线性或分支部分和 / 或包含 2-4 个环的环体系的至少一种组 分 A， 该环可包含选自 N、 S、 O 和 P 的若干个杂原子， 其中 ( 一种或多种 ) 组分 A 结合于细胞 渗透肽 B 和 / 或其非肽类似物， 并且其中所述递送系统能够通过共价或非共价结合递送运 载物。该递送系统被称作 PepFect( 参见示例性的表 1 和图 5c)。根据该递送系统的一种实施方式， 其进一步包括至少一个组分 C， 其为能够到达感 兴趣的特定细胞或组织的靶向部分。 该靶向部分可以是适体或诸如导向肽的靶向肽或受体 配体。
根据该递送系统的另一种实施方式， 其进一步包括被递送至细胞、 组织中或跨越 细胞层的运载物。
可将一种或多种组分 A、 一种或多种组分 C 以及一种或多种运载物共价偶合至肽 (B) 的氨基酸侧链和 / 或 N- 和 / 或 C- 端。在一些 PepFect 化合物中， 使用分支的树状结构 的间隔区。可通过非共价或共价结合 (covalentconjugation) 来添加靶向部分 C。
该细胞递送系统可包括通过肽键彼此结合的多于一种肽 B。
此外， 组分 A、 C 和运载物中的一种或多种可通过间隔臂与一个或多个肽 B 结合。
根据本发明， 该递送系统可包括在无任何运载物的条件下以任意顺序彼此偶合的 一种或多种组分 A、 一种或多种肽 B、 一种或多种靶向组分 C。 一个或多个肽 B 可与一种或多 种组分 A 在无任何靶向组分 C 且无任何运载物的条件下以任意顺序偶合。这些可被递送用 于在后续阶段进一步偶合运载物。 本发明涉及通过使用此类递送系统向靶细胞体内或体外 递送运载物的方法。 一个或多个肽 B 和一种或多种运载物可在无任何靶向组分 C 的条件下以任意顺序 与一种或多种组分 A 偶合。一个或多个肽 B 和一种或多种运载物可以任意顺序与一种或多 种组分 A 以及一种或多种靶向组分 C 偶合。
本发明还涉及新的细胞渗透性肽以及如何生产所述 PepFect 构建体的方法。
组分 A
组分 A 可以是一种或若干种具有至少 4 个碳原子的脂肪族线性或分支部分和 / 或 包含 2-4 个环的环体系， 该环可包含选自 N、 S、 O 和 P 的若干个杂原子， 其中 ( 一种或多种 ) 组分 A 结合于细胞渗透性肽 B 和 / 或其非肽类似物。
A 还可以是衍生自任意有机化合物优选脂肪酸的任何酰基、 硬脂酰基、 胆汁酸或其 衍生物、 胆甾醇基、 胆酸、 脱氧胆酸盐、 石胆酸盐或棕榈酸盐。
脂肪族组分 A 可以具有 4-30 个碳原子并且可以是脂肪酸。这样的脂肪族酸可以 包 含 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30 个碳原子或这些数字产生的任意区间。其还可以是它们的衍生物。( 一个或多个 ) 官能 团可以不是羧酸而是 -OH、 -SH、 -NH2、 -CHO、 COXR 中的任一种或多种但不限于此， 其中 X 是 O 或 S， R 是任意脂肪族或芳香部分， 或盐形成中的反离子例如 Na+、 K+ 等， 或卤素。根据一种 实施方式， 脂肪酸可包含 10-30 个碳原子并且可选自硬脂酸或其 C18 衍生物或月桂酸、 肉豆 蔻酸、 棕榈酸、 花生四烯酸和山萮酸， 它们结合于细胞渗透性肽的侧链残基、 C 端或 N 端。而 且， 该链可含有饱和 / 不饱和键。
此外， 组分 A 还可以是由 2-4 个饱和或不饱和的 3-8 元环组成的二 - 四稠环体系 的一个或多个拷贝， 其环体系中可包含选自 N、 S、 O、 B 或 P 的一个或若干个杂原子。其可以 是联苯基、 二苯醚、 胺、 硫化物或周位和 / 或邻位稠合的且选自但不限于喹啉、 异喹啉、 喹噁 啉、 戊搭烯 ( 并环戊二烯， pentalene)、 萘、 庚搭烯 ( 庚间三烯并庚间三烯， heptalene)、 辛搭 烯 ( 并环辛二烯， octalene)、 降莰烷 (norbonane)、 金刚烷、 吲哚、 二氢吲哚、 甘菊环烃 ( 环 戊并环庚五烯， azulene)、 苯并吖庚因 (benzazepine)、 吖啶、 蒽、 联苯撑、 苯并菲和苯并蒽以
及它们的类似物， 但不限于此。这样的类似物可包含一个或多个羧基和 / 或一个或多个另 外的官能团， 例如但不限于一个或多个胺、 一个或多个硫醇、 一个或多个羟基、 一个或多个 酯以及一个或多个醛。
根据一种实施方式， 组分 A 的四个拷贝可通过赖氨酸分支间隔而结合于侧链残基 上。
这些环体系还可被例如具有 pH 缓冲能力的其他基团取代以使内涵体不稳定或者 是用于核苷酸相互作用的缩合部分 (condensing moiety)。取代基的实例可以是但不限于 一个至若干个伯胺、 仲胺和 / 或叔胺， 被取代或以任何脂肪族或芳香族部分或它们组合被 包括其中， 还以线性、 分支或环状方式或它们的组合被零至若干个原子间隔开。
实例为 N′ -(7- 氯喹啉 -4- 基 )-N， N- 二乙基 - 戊烷 -1， 4- 二胺 ( 氯喹 ) 或其衍 生物、 二 - 四环体系 ( 萘和 / 或由联苯基连接 )、 4-8 元环、 环体系中的一个至若干个杂原子 结合至如 1 所述的建构体 ( 图 5) 的任意位置。另一有用的实例是 N-(2- 氨基乙基 )-N- 甲 基 -N′ -[7-( 三氟甲基 )- 喹啉 -4- 基 ] 乙烷 -1， 2- 二胺。它们可具有长度不同的 ( 一个 或多个 ) 间隔臂 ( 图 5c)。
通过偶合 ( 偶联 ) 至多个赖氨酸残基的活化的琥珀酰化侧链来完成喹啉类似物的 引入， 这提供了与载体共价结合的多个拷贝的喹啉类似物。实施例 12 中描述了优选的条 件。 本发明还涉及合成喹啉类似物偶合肽或其非肽类似物的方法， 该方法包括 (a) 活 化肽上的赖氨酸的步骤和 (b) 共价偶合喹啉类似物。为了能够偶合氯喹 - 胺衍生物 ( 进一 步公开于实施例 12)， 通过用琥珀酸酐对赖氨酸残基的 ε 氨基进行合适的修饰达到对肽的 赖氨酸侧基 (pendant group) 的活化。将如此获得的肽的多个羧基进一步原位活化， 即与 喹啉类似物的偶合同时进行。这一操作优于迄今为止的文献中描述的操作， 其中形成半稳 定的活性酯例如 NHS， 然后偶合由胺衍生化的羟基氯喹。 本文描述的方法是新颖的并达到对 反应更好的控制和更高的产率。 该喹啉类似物是新颖的， 据我们所知， 文献中没有通过伯二 胺衍生物进行氯 - 三氟甲基 - 喹啉的氨基烷基化的记载。
通过例如在烷基链末端引入额外的胺来促进共价结合。 烷基链的功能是为芳香性 环体系相互作用提供空间和缓冲能力。氯喹类似物由用三氟甲基、 具有被许多原子间隔的 两个胺的烷基链以及位于烷基链的另一末端与第二个胺间隔若干个原子用于进一步结合 的官能团取代的喹啉系统组成， 但不限于此。
优选四个拷贝的组分 A 通过赖氨酸分支间隔区而结合 ( 或轭合 ) 至侧链。
本发明进一步意在包括将多个拷贝的喹啉衍生物偶合 ( 偶联 ) 至包含合适数量的 多聚 (L- 赖氨酸 ) 侧基的肽 B， 均通过琥珀酸酐或本领域技术人员已知的任何其他合适的衍 生化试剂修饰。
肽组分 B
肽组分 B 可选自以下序列的一个或多个拷贝 ：
序列 AGYLLGKINLKALAALAKKIL 13 SEQ ID No 1.CN 102811744 A AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL RKKRKKKRXRHXRHXRHXR MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV RKKRKKK(HXH)4 LLOOLAAAALOOLL RQIKIWFQNRRMKWKK RRRRRRRRR MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV说明书2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25.10/25 页GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV FILFILFILGGKHKHKHKHKHK FILFILFILGKGKHKHKHKHKHK FILFILFILGKGKHRHKHRHKHR AGYLLGKINLKALAALAKKIL GDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTL PFLDRLRRDQKSLRGRGSTL PFLNRLRRDQKSLRGRGSTL PFLDRLRRNQKSLRGRGSTL PFLNRLRRNQKSLRGRGSTL PFLNRLRRNLKSLRGRLSTL PFLDRKRRDQKSLRGRGSTL RHRHRHHHGGPFLDRLRRDQKSLRGRGSTL PNNVRRDLDNLHACLNKAKLTVSRMVTSLLEK PNNVRRDLDNLHAMLNKAKLTVSRMVTSLLEK PNNVRRDLNNLHAMLNKAKLTVSRMVTSLLQK14CN 102811744 A PFLNRLRRNLKSLRGRLSTL PFLNRKRRNLKSLRGRLSTL INLKALAALAKKIL
说明书26. 27. 28.11/25 页可使用合成装置例如在 433A 型 Applied Biosystems 分步合成仪上合成这些肽。 使用 4- 甲基二苯甲胺 - 聚苯乙烯树脂 (MBHA) 通过 t-Boc 化学以产生酰胺化的 C- 端或在 Rink 树脂上通过 F-moc 化学来组装氨基酸。
另外， 肽 B 可选自包含 Ny1-Bx1-Ny2-Bx2-Ny3 的序列的肽， 其中 B 是碱性氨基酸 ( 例 如 arg、 lys、 orn、 或 his)， N 是中性氨基酸 ( 例如 leu、 ile、 ala、 val、 phe、 trp、 ser、 thr、 gly、 cys、 gln、 met、 pro、 tyr) 并且 x 和 y 是 2 至 8 的整数。
根 据 一 种 实 施 方 式， 肽 B 选 自 LLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No 6] 并 且 尤 其 是 AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No 2] 或 INLKALAALAKKIL[SEQ ID No 28] 并且尤其是 AGYLLGKINLKALAALAKKIL[SEQ ID No 1] 以及氨基酸的缺失、 加入、 插入和置换。本发明还 涉及与这些序列具有至少 50％、 至少 55％、 至少 60％、 至少 65％、 至少 70％、 至少 71％、 至 少 72％、 至少 73 ％、 至少 74％、 至少 75 ％、 至少 76 ％、 至少 77 ％、 至少 78 ％、 至少 79 ％、 至 少 80％、 至少 81 ％、 至少 82％、 至少 83 ％、 至少 84 ％、 至少 85 ％、 至少 86 ％、 至少 87 ％、 至 少 88％、 至少 89％、 至少 90％、 至少 91％、 至少 92％、 至少 93％、 至少 94％、 至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％或至少 99.5％同源性的肽。本发明还涉及具有相同 性质的上述肽的亚片段。
肽 B 还可是 CPP 的非肽类似物或 CPP 或其非肽类似物的乱序组分 (scrambled component)。
本文中的术语非肽类似物用于描述包含至少一个非编码的氨基酸和 / 或具有导 致氨基酸序列中没有肽连接 ( 即， 在一个氨基酸的羧基和另一氨基酸的氨基之间形成的 CO-NH 键 ) 的骨架修饰的任何氨基酸序列。非编码的氨基酸的实例为 D 型氨基酸、 二氨基 酸、 二苯胺、 Gly、 Pro 以及 Pyr 衍生物。
此外， 该氨基酸序列可为酰胺化的或以游离酸的形式存在。
乱序组分 B 表示具有相同的氨基酸组成但是具有完全随机化顺序的肽。另外， 部 分颠倒序列是以相反的顺序添加原始序列的两个或多个氨基酸的序列。
可向这些序列加入、 插入、 置换氨基酸 ( 也包括非天然氨基酸 ) 或使氨基酸 ( 也包 括非天然氨基酸 ) 缺失氨基酸而不改变它们的整体细胞渗透能力。
细胞渗透性肽 B 和 / 或其非肽类似物的 C- 端可被修饰并且选自半胱胺或含硫醇 的化合物、 线性或分支、 环状或非环状含胺化合物， 并优选具有一个另外的官能团的化合 物， 该官能团例如但不限于 COXR， 其中 X 是 O 或 S， R 是任何脂肪族或芳香性基团或者， 盐形 成中的反离子例如 Na、 K 等、 卤素、 -OH、 -NHR， 其中 R 是保护基团或任何脂肪族或芳香性基 团， -SSR 其中 R 是保护基团 / 活化基团或任何脂肪族或芳香性基团。
物种 B( 或实体 B) 的 C- 端的巯基酰胺基团 ( 或半胱酰胺基团， cysteamide group) 使其具有独特的性质， 该基团可在血清中被活化并由此形成二聚体。该二聚体化反应由存 在于血清中的氧化酶催化。根据本发明， 一个肽分子的巯基酰胺基团可与另一个肽分子的巯基酰胺基团在氧化反应中发生相互作用。 一个这样的序列是 AGYLLGKINLKALAALAKKIL- 巯 基酰胺。 这样的反应会导致通过在位于两个不同的巯基酰胺修饰的肽上的巯基之间产生二 硫桥而形成肽二聚体。因此， 当暴露于氧化环境中时巯基酰胺修饰的肽的巯基 (-SH) 形成 二硫键 (S-S 键、 二硫桥、 C-S-S-C)。
所述递送系统包含至少一个肽 B， 其可以是不同的或相同的肽。因此， 它可包含 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 和 10 个肽 B。它们可以是二聚体或多个 CPP 并且可以是环状的和 / 或分 支的。
组分 C
C 组分是靶向部分， 例如已知或未知受体的配体。底物可以是适体和 / 或靶向肽。
适体是结合于特定分子靶标例如蛋白质或代谢物的双链 DNA 或单链 RNA 分子。
靶向肽是结合于特异性分子靶标例如蛋白质或代谢物的肽， 例如导向肽。导向肽 是通常通过噬菌体展示被选择用于结合某些组织或细胞类型的肽序列。
另外， 组分 C 是将递送系统引导至某些细胞类型或组织的另一分子， 公知的实例 是作为肿瘤靶标的生长因子的过表达。
靶向部分 C 还可以作为组合物的一部分与所述递送系统的组分 A 和 B 非共价复 合。 一般而言， 细胞选择性 CPP 可用于将任何类型的药品或药物物质靶向运输至各种 特异的真核和 / 或原核细胞靶标。例如， 此类运载物的细胞选择性运输用于传染性疾病例 如由病毒、 细菌或寄生虫感染引起的疾病的改进的治疗或预防。
在本发明的另一种实施方式中， 提供了能够选择性进入某一细胞类型 / 组织 / 器 官或运输仅在某一细胞类型、 组织或器官类型中被活化的运载物的细胞渗透性肽和 / 或其 非肽类似物。
我们已经示出了添加用于将递送系统靶向至特定的细胞类型或组织的部分不会 破坏递送性质。例如 Pepfect7( 垂直的 (ortogonally)SA 并且具有 CREKA N- 端 ) 能够在 HeLa 和 CHO 细胞中递送 SCO 和质粒 ( 数据未示出 )。
间隔区
间隔区用于组分 A、 C 和运载物与组分 B 的结合。
根据一种实施方式， 所述间隔区包含一个或多个氨基酸， 例如赖氨酸单元， 例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个氨基酸， 例如赖氨酸单元， 其可以是直链或支链的并用官能团或另 外的碳原子修饰用于进一步结合。
所述间隔区是具有一个至若干个促进组分 A 或树状结构结合的取代基的线性或 支链基团， 所述树状结构优选由以树状形式排列的赖氨酸或鸟氨酸残基组成但不限于此， 如图 1 的实例所描绘的， 其包含 1、 2、 3、 4 或非限制数量的 Lys 或 Orn 残基。该树可具有任 意数量的支链并由任意数量的分支单元例如赖氨酸或鸟氨酸残基 ( 本文中以 Lys 示出 ) 组 成； “Nic” 可以是烟酸、 苯甲酸、 喹啉酸、 萘羧酸、 氯喹或其衍生物， 或任何其他有机分子。
间隔区优选用于通过组分 B 的侧链来轭合四个拷贝的环体系 ( 组分 A)。 该间隔区 可以是树枝状聚合物 (dendrimer)。
树枝状聚合物是重复分支的分子， 在这种情况下优选其具有肽骨架。
本文列出的不带有运载物的用于胞内递送的 Pepfect 系统的实例如下所示 ：
表 1. 根据上文所述包括 C- 端修饰的细胞渗透性肽 (CPP) 的序列X： 4- 氨基丁酸， Cya ： 巯基酰胺， Y： 己酸， sa ： 琥珀酸
qn ： 新的 2-4 环体系， 例如喹啉和萘类似物
根据本发明， 提供了一系列新的 CPP， 尤其是具有硬脂酰基修饰的 CPP。例如 (PepFect1-4 和 PepFect14) 可用于利用非共价方法有效递送 SCO。已显示在细胞内部运送 SCO 方面， PepFect 肽与市售的转染试剂脂质体 2000 转染试剂等效或甚至比其更有效， 并且 毒性更低。 另外， Pepfect1-4 的低毒性使它们适用于转染脂质体 2000 转染试剂不起作用的 敏感细胞系统。另外， PepFect 肽比常规使用的 CPP 更强效并且远比临床前使用的 CPP- 轭 合物 (RXR)4-PMO 更有效。另外， 可有效地开发该肽已用于质粒转染， 以及用于难转染的原 代胶质细胞这一难题。此外， 更重要的是仅需要非常少量的递送物和 ON 就能够获得生物学
响应， 这减少了劳动和成本。
可对 PepFect5-13 类似物进行进一步修饰。不用硬脂酸物质修饰或除了用硬脂 酸物质修饰之外， 这些还可轭合于具有赖氨酸树的例如一个或多个如四个促进 ON 从泡状 隔室 (vesicular compartment) 释放的 QN 类似物。这些不仅具有运输在细胞核中发挥作 用的 ON 化合物的活性而且还能够有效用于递送具有胞质活性的 ON 例如抗 -miR 和 siRNA。 事实上， 就在各种细胞类型中递送 siRNA 而言， PepFect5 和 PepFect6， 特别是肽 PepFect6 的活性显著高于脂质体 2000 转染试剂。尽管在任何给定的 siRNA 浓度下阳离子脂质体 / siRNA 复合物很少产生大于 80％的基因表达下调， 但是与 siRNA 复合的两种 PepFect 均能 够在低 siRNA 浓度下引起几乎完整的 RNAi。此外， 它们转染完整的细胞群而不仅仅是分裂 细胞。最后， PepFect6 甚至在含血清培养基中也具有高活性并且能够转染包括 SHSY-5Y、 N2a、 Jurkat 悬浮细胞、 胚性成纤维素细胞和原代胶质细胞在内的非常 “难转染的” 细胞。上 述性质和与脂质体 2000 转染试剂或寡核苷酸转染试剂相比更低的毒性使这一特别的载体 非常独特。
表 2 示出了已经受用 PF6 进行 siRNA 处理的细胞的表格
运载物 ( 或负载物， cargo)
运载物 ( 或负载物， cargo) 可选自基因调节化合物， 例如寡核苷酸或质粒。它们 可通过共价结合或复合物形成与递送系统结合。
寡核苷酸家族包括用于 mRNA 沉默的反义寡核苷酸， 用于操纵前体 -mRNA 剪接方式 的剪接校正寡核苷酸、 以及用于基因沉默的短干扰 RNA。
运载物可选自由寡核苷酸及其被修饰形式、 单链寡核苷酸 (DNA、 RNA、 PNA、 LNA 以 及所有合成寡核苷酸 )、 双链寡核苷酸 (siRNA、 shRNA、 陷阱 dsDNA(decoy dsDNA) 等 )、 质粒 及其其他变异体、 用于抑制病毒复制的合成核苷酸类似物或抗病毒 ON。
所述递送系统使得能够在正确的胞内位置释放 ON( 作为运载物 ) 而不需额外添加 氯喹。因为四个拷贝的环体系 A 的结合使氯喹类似物的局部作用增加。这对于体内应用是 有价值的性质。而且， 通过将氯喹与肽结合 ( 或轭合 )， 可将有效浓度降低多于一个 log， 这 很可能解释了在 100μM 浓度下观察到的氯喹的毒性减小。
据估算， 20-30％的所有引起疾病的突变影响前体 -mRNA 剪接。若干遗传性疾病和 其他疾病， 包括 β- 地中海贫血 (β-thalassemia)、 囊性纤维病、 肌营养不良、 癌症、 和数种 神经性疾病均与选择性剪接中的变化相关。 破坏剪接的大部分突变是典型剪接位点的内含 子或外显子区段中的单核苷酸置换。这些突变引起外显子跳跃、 使用邻近的假 3′ - 或 5′ 剪接位点、 或保留突变的内含子。突变还能够在外显子和内含子中引入新的剪接位点。
最早记载的剪接突变之一发现于 β- 地中海患者中， 其中 β- 球蛋白前体 -mRNA 的内含子 2 中的突变产生了异常的 5′剪接位点， 同时激活了隐蔽的 3′剪接位点。这继续 导致了内含子保留 (intron inclusion) 和非功能性蛋白。已在囊性纤维病跨膜传导调节 基因中鉴定出相同类型的突变， 引起异常剪接和囊性纤维病的发展。以进行性退化性肌病 为特征的杜兴氏肌营养不良 (DMD) 及其较轻微的等位基因病贝克尔氏肌营养不良 (BMD) 均 由肌营养不良蛋白基因中的突变引起。 该基因中的大多数无义突变引起蛋白质合成的提前 终止并导致严重的 DMD， 而调控序列中的无义突变产生外显子的部分框内跳跃并与较轻的 BMD 相关。而且， 还已知若干种类型的癌症由影响选择性剪接的突变引起。因此， 通过使用 特异结合于这些内含子 / 外显子突变的寡核苷酸序列， 掩蔽了这些突变并恢复剪接。
另外， 本发明涉及体内或体外向靶细胞递送运载物的方法。 PepFect 和本文所述的 ON(siRNA、 质粒、 SCO( 剪接校正 Ons)) 之间形成复合物可在小体积的无菌水中在 RT 下进行 30 分钟， 然后， 在大多数试验中， 加入完全含血清培养基。与运载物形成复合物的实例 ： 在 1/10 终处理体积 ( 即 50μl) 中在 MQ 水中以不同的摩尔比 (1 ∶ 0-1 ∶ 20) 将磷硫酰 2′ O 甲基 RNA(SCO) 或抗 -miR212′ OMe RNA 与 CPP 混合。在 RT 下使复合物形成约 30 分钟。30 分钟后， 将复合物加入在 450μl 新鲜无血清培养基中生长的细胞中。
运载物 ( 或负载物 ) 还可以选自荧光标记物、 包含与失活肽偶合的可裂解位点的 细胞或连接子 (linker)、 肽配体、 细胞毒性肽、 生物活性肽、 诊断剂、 蛋白质、 药物例如抗癌 药、 抗生素、 化疗药物。
所述运载物可通过共价或非共价键结合至任意组分 A、 B 和 / 或 C。根据一种实施 方式， 该运载物可结合至肽组分 B。在本发明的一种实施方式中， 细胞渗透性肽可通过 S-S 桥与所述运载物偶合 ( 偶联 )。在自然条件下， 将运载物偶合至 CPP 的方法是多种多样的， 可根据 CPP 的性质、 运载物和预期用途进行单独选择。偶合方式可选自共价和非共价结合， 如生物素 - 亲和素结合、 酯键、 酰胺键、 抗体结合等。
抗癌药物可以是烷化剂、 抗代谢物和细胞毒性抗生素。烷化剂可以包括 4-[4- 双 (2- 氯乙基 ) 氨基 ) 苯基 ] 丁酸 ( 苯丁酸氮芥 ) 或 3-[4-( 双 (2- 氯乙基 ) 氨基 ) 苯基 ]-L- 丙 氨酸 ( 美法仑 )、 抗代谢物是 N-[4-(N-(2， 4- 二氨基 -6- 蝶啶基甲基 ) 甲基氨基 )- 苯甲酰 基 ]-L- 谷氨酸 ( 甲氨蝶呤 ) 以及细胞毒性抗生素是 (8S， 10S)-10-[(3- 氨基 -2， 3， 6- 三脱 氧 -α-L- 来苏 - 己吡喃基 ) 氧基 ]-8- 乙醇酰基 -7， 8， 9， 10- 四氢 -6， 8， 11- 三羟基 -1- 甲 氧基 -5， 12- 并四苯二酮 (naphthacenedione)( 多柔比星 )。
所述递送系统还进一步包括至少一种显像剂 ( 或成像剂 ) 和 / 或标记分子和 / 或 化疗药物。由此本发明的递送系统可被用作化疗药物和 / 或显像剂。这样的组合物也可以 包括靶向序列。化疗药物和 / 或显像剂可用于递送抗病毒寡核苷酸。
标记分子可以是用于标记或定量胞内 mRNA 的分子信标 (molecularbeacon)， 包括 基于淬灭荧光的信标和基于 FRET 技术的信标。分子信标是诸如单链寡核苷酸的分子， 其具有以发夹结构排列的内部荧光团和对 应的淬灭部分从而使这两个部分靠近。结合靶核酸序列或暴露于其他结构修饰后， 所述荧 光团与淬灭部分分离以使得能够检测到所述荧光团。 最经常使用的分子信标是用于检测特 异性 DNA 或 RNA 基序 (motif) 的寡核苷酸杂交探针。类似地， FRET 探针是位置相近的成对 荧光探针。选择荧光团使得其中一个的发射光谱与另一个的激发光谱显著重叠。从供体荧 光团到受体荧光团的能量转移与距离相关的， 因此基于 FRET 技术的信标能够用于研究使 两个荧光团的分子接近产生变化的各种生物学现象。
所述递送系统还可与循环清除修饰剂 (circulation clearance modifier) 例如 PEG 结合 ( 或轭合 ) 或复合。这样的系统可用于延迟运载物递送。循环清除修饰剂是延长 药物在体内的半衰期的分子， 例如聚乙二醇化 (pegyl)、 白蛋白结合或序列加帽。
所述递送系统可用于疾病诊断、 用作研究工具或用作靶向系统。
本发明还涉及包含一种或多种如本文定义的递送系统的组合物。 在这样的组合物 中， 所述递送系统可包括不同的组分 A、 和 / 或不同的肽 B、 和 / 或不同的靶向组分 C 和 / 或 不同的运载物。所述递送系统可包含如上所述的 A、 B、 C 和运载物的不同组合。
本发明还涉及包含如上定义的递送系统和 / 或组合物的药物组合物。
其还涉及一种或多种递送系统在制造药物组合物中的用途。
尤其是该组合物可包含具有叠加 ( 或加和， additative) 或协同作用的至少两种 不同的递送系统。这些可能以不同比率存在于组合物中。例如， 所述组合物可包含表 1 公 开的 Pepfect 的任意组合， 例如 Pepfect5 和 Pepfect6。
这样的组合物还可包含相同或不同的递送系统中的至少两种肽的混合物， 其中每 一种肽使复合物具有不同的性质， 例如靶向和转染。
这样的药物组合物可以是口服剂量单位形式 ； 注射液 ； 栓剂 ； 凝胶剂 ； 以及乳剂并 可包含赋形剂、 润滑剂、 粘结剂、 崩解剂、 增溶剂、 助悬剂、 等渗剂、 缓冲剂、 安抚剂 (soothing agent)、 防腐剂、 抗氧剂、 着色剂、 甜味剂。
例如， 所述递送剂还可用作抗微生物组合物、 类似裂解肽 (lyticpeptide) 的细胞 渗透性肽。
本发明还涉及用本发明的一种或多种递送系统覆盖的材料。
另外， 本发明涉及将权利要求 1-16 中任一项所述的一种或多种递送系统合并入 ( 或掺入到 ) 其中的材料。可将本发明的递送系统掺入树枝状聚合物、 脂质体等中。脂质体 是由磷脂组成的复合结构并且可含有少量的其他分子。
本发明还涉及含有式 Ny1-Bx1-Ny2-Bx2-Ny3 形式的新的肽， 其中 B 是碱性氨基酸 ( 例 如 arg、 lys、 orn、 或 his)， N 是中性氨基酸 ( 例如 leu、 ile、 ala、 val、 phe、 trp、 ser、 thr、 gly、 cys、 gln、 met、 pro、 tyr) 并且 x 和 y 是 2 至 8 的整数。
本发明尤其涉及其中的物种 ( 或实存物 )B 选自 LLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No 6] 且尤其是 AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No 2] 或 INLKALAALAKKIL[SEQ ID No 28] 且尤 其是 AGYLLGKINLKALAALAKKIL[SEQ ID No 1] 以及具有氨基酸的缺失、 加入、 插入和置换的 序列的肽。本发明还涉及与这些序列具有至少 50％、 至少 55％、 至少 60％、 至少 65％、 至 少 70％、 至少 71％、 至少 72％、 至少 73％、 至少 74 ％、 至少 75 ％、 至少 76 ％、 至少 77％、 至 少 78％、 至少 79 ％、 至少 80 ％、 至少 81 ％、 至少 82 ％、 至少 83 ％、 至少 84 ％、 至少 85％、 至少 86％、 至少 87％、 至少 88％、 至少 89％、 至少 90％、 至少 91％、 至少 92％、 至少 93％、 至少 94％、 至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％或至少 99.5％同源性的肽。本 发明还涉及具有相同性质的上述肽的亚片段。
如前所述， CPP 能够与运载物 ( 或负载物 ) 偶合 ( 偶联 ) 以作为将所述运载物运 送至细胞、 各种细胞区室、 组织或器官中的载体。所述运载物选自由任何药理学感兴趣的 运载物， 例如肽、 多肽、 蛋白质、 小分子物质、 药物、 单核苷酸、 寡核苷酸、 多聚核苷酸、 反义分 子、 双链和单链 DNA、 RNA 和 / 或任何人工的或部分人工的核酸例如 PNA、 低分子量分子、 糖 类、 质粒、 抗生素物质、 细胞毒性剂和 / 或抗病毒剂组成的组。此外， 对运载物的运输可用作 递送的研究工具 ( 例如标签和标记物 ) 以及用于改变膜电位和 / 或性质， 所述运载物可以 是例如标记物分子， 例如生物素。
在意图将运载物运输通过血脑屏障方面， 胞内和胞外运载物二者是同等优选的运 载物。
本文所述的所有实施方式的所有具体细节均可能变化。 当例如描述与递送系统的 组分 A、 B 和 C 相关的特定化学组分时， 在所述递送系统被掺入树枝状聚合物或脂质体时、 用 所述递送系统覆盖的材料时以及用循环清除修饰剂覆盖所述递送系统时仍然适用。
现通过以下实施方式的描述进一步说明本发明， 包括附图简述、 材料和方法、 包括 附图和图例说明以及序列表在内的实施例， 但是应理解的是本发明范围不限于任何具体描 述的实施方式或细节。
实施例和实验例
以下通过实施例和与不同 PepFect 系统以及与当今市场上占主导地位的用于体 内转染的脂质体 2000 转染试剂的比较来描述本发明。首先描述了对递送系统的改进和改 良。接着描述了用各种方法检测以证明 PepFect 对于递送剪接校正 ON、 质粒以及 miRNA 和 siRNA 的多种用途。此外， 通过较低的毒性、 同源转染和在 “难转染细胞” 中的高产率转染显 示了与根据制造商的使用说明应用的脂质体 2000 转染试剂相比的总体改进。所有试验均 在多于一种细胞类型中进行并且大多数情况下在血清存在下进行。
材料和方法
肽和寡核苷酸的合成
在 433A 型 Applied Biosystem 分步合成仪上合成 PepFect1、 PepFect2、 PepFect3、 PepFect4、 penetratin[10]、 TP10[11]、 M918[12]、 Arg9[13] 和硬脂酰基 -Arg9 形式的肽。 通过 t-Boc 化学利用 4- 甲基二苯甲胺 - 聚苯乙烯树脂 (MBHA) 来组装肽以产生酰胺化的 C- 端。 还可使用本领域技术人员公知的标准 Fmoc SPPS 条件来合成固相肽合成 (SPPS)。 本 发明中使用的肽是在 SYRO 多重肽合成仪 (MultiSyn Tech GmbH) 上用标准方案获得的。所 述方法涉及在 HBTU 活化试剂和作为碱组分的 DIEA 的辅助下从肽的羧基端到 N- 端重复偶 合 Fmoc- 保护的氨基酸。所使用的聚苯乙烯树脂固相载体是 Rink 酰胺树脂 ( 优选置换水 平为每克树脂 0.4 至 0.6 毫当量 )。氨基酸购自法国 Neosystem 公司并且被偶合为羟基苯 并三唑 (HOBt) 酯。用 HF 将肽从树脂上裂解后， 通过反相 HPLC lomega C18 柱纯化合成产物 TM 并利用 Perkin Elmer prOTOF 2000 MALDI O-TOF 质谱仪进行分析。肽的质量与理论值相 关性良好。肽序列示于表 1。
对于分支间隔区： 与 树 脂 结 合 的 完 全 保 护 的 序 列 Fmoc-AGYLLGK(ε-Mtt)INLKALAALAKKIL-Rink(Rink ＝ Rink 酰胺树脂， 如没有另外说明， 所有氨基酸均由标准保护 基团保护 ) 用作起始材料。遵循一般手册操作 ( 步骤 1 至步骤 7) 以获得四个游离羧基的 分支结构 ( 被设计为四个拷贝的新 QN 类似物的结合点 )。每一步骤之后， 进行定性茚三酮 颜色检测 (Kaiser test) 以监测反应的完全度。
1. 用 35％哌啶处理肽树脂 40 分钟以实现氨基的脱保护。
2. 偶合 ( 偶联 ) 硬脂酸 ( 优选的方法是使用 DCM 作为溶剂， BOP/DIEA 用于活化并 偶合 1 小时 )。
3. 用 1％ TFA、 3-4％ TIS、 DCM 重复洗涤 ( 共处理 1-1.5 小时 ) 除去 Mtt。为了确 保完全除去， 加入未添加 TIS 的 DCM 中的 1％ TFA 以监测离去三苯甲基 (trityl group) 的 黄色。
4. 将 3-5 当量的 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 偶合 45 分钟。优选的偶合 ( 偶联 ) 试剂是 BOP( 甚至更优选其非致癌类似物 PyBOP) 或 DIPCDI/HOAt。
5. 根据步骤 1 除去 Fmoc。
6. 重复步骤 4 和 5。
7. 在 3 当量 DIEA 存在下在 DMF 中偶合 1.5 当量的琥珀酸酐 10 分钟。
在 具 有 OligosyntTM15 预 填 充 合 成 柱 的oligopilotTM plus 10 上合 成 磷 硫 酰 2 ′ -O- 甲 基 RNA 寡 核 苷 酸。 以 5 当 量 过 量 加 入 0.1M 浓 度 的 亚 磷 酰 胺 (Phosphoroamidite)(ChemGenes Corporation， Boston， MA) 并且偶合 ( 偶联 ) 试剂的循 环时间是 5 分钟。在 3 分钟内用 3- 甲基吡啶 / 乙腈中的 0.2M 双 - 苯基乙酰基二硫化物 (ISIS Pharmaceuticals， Carlsbad， CA)(1 ∶ 1) 中进行硫醇化作用， 每个合成循环用 3ml。 将寡核苷酸从固相载体裂解并于 55℃在 25％氢氧化铵水溶液 (Merck， Darmstadt， 德国 ) 中脱保护过夜。用 100 系统和碱性 NaCl 缓冲液用填充了 SourceTM15Q阴离子交换介质的 TricoTM 柱进行纯化。用 HiTrapTM 脱盐柱对纯化的寡核苷酸进行后续处 理， 然后用 DNAPacTM-100 分析柱 (Dionex， Sunnyvale， CA) 进行 HPLC 分析 (Agilent 1100， Santa Clara， CA) 以验证＞ 97％的全长纯度。通过在 FinniganTMLGQTMDeca XP plus 质谱 仪 (ThermoFischer Scientific， Waltham， MA) 上进行质量分析验证正确产物。
细胞培养
使 Hela pLuc705 细 胞 ( 由 R.Kole 和 B.Leblue 提 供 ) 和 hek 293 细 胞 在 含 glutamax 的达尔伯克改良伊格尔培养基 (DMEM) 中生长， 其中添加了 0.1mM 非必需氨基酸、 1.0mM 丙酮酸钠、 10％ FBS、 100U/ml 青霉素、 100mg/ml 链霉素和 200μg/ml 潮霉素。CHO 细 胞在含 glutamax 的 DMEM-F12 培养基中生长， 其中添加了 0.1mM 非必需氨基酸、 1.0mM 丙酮 酸钠、 10％ FBS、 100U/ml 青霉素、 和 100mg/ml 链霉素。BHK21 细胞在生长 GMEM+2mM 谷氨酰 胺 +5％胰蛋白磷酸盐肉汤 +5-10％胎牛血清中。细胞于 37℃在 5％ CO2 气氛下生长。所有 培养基和化学试剂均购自 Invitrogen( 瑞典 )。
复合物形成
ON/CPP 复合物的形成 ： 在 1/10 终处理体积中 ( 即 50μl) 在 MQ 水中将磷硫酰 2′ O 甲基 RNA(SCO) 或抗 -miR21 2′ OMe RNA( 含 33％ LNA 取代 ) 与 CPP 以不同摩尔比 (1 ∶ 0-1 ∶ 20) 混合。在 RT 下使复合物形成 30 分钟， 同时用新鲜的无血清 DMEM(450μl)替换 24 孔板中的培养基。之后， 向各孔中加入复合物。使 SCO 的终浓度在 200nM 保持恒定 并变化肽的浓度或者用 400nM SCO 以给定的摩尔比形成复合物然后在水中系列稀释。当 使用商购转染剂 Lipofectamine 2000(Promega， USA) 时， 根据使用制造商的说明制备复合 物。用基本相似的方法形成 PepFect/siRNA 复合物， 但是用 100nM siRNA 作为起始浓度并 且摩尔比范围为 20-40。通过进行系列稀释得到较低的浓度。
质粒 /CPP 复合物的形成 ： 在 1/10 终处理体积中 (50μl) 在 MQ 水中将 0.5μg 的 pGL3 荧光素酶表达质粒或 pEGFP-C1 质粒以不同的投料比 (1 ∶ 1-1 ∶ 4) 与 CPP 混合。 30 分 钟后， 将复合物加入在 450μl 无血清培养基中生长的细胞中。 当使用脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000)(Promega， USA) 时， 根据制造商的使用说明制备复合物 (Promega， USA)。
凝胶移动检测
如前所述将肽与 SCO 混合。将 0.5μg 的 SCO 与浓度不断增加的肽混合以使得肽 / SCO 的摩尔比范围达到 5 至 20。通过在包含溴乙啶 (Sigma， 瑞典 ) 的 TBE 缓冲液中于 150V 在 20％聚丙烯酰胺凝胶上电泳 1h 对复合物进行分析。用 IR LAS-1000Llte v2.1 软件在 Fujifilm LAS-1000 IntelligentDark box II 中照相。 定量摄取
用 200nM Cy5 标记的以摩尔比与肽复合的 SCO 处理实验前 24 小时接种的 100 000 个 Hela pLuc 705 细胞 1h。处理后， 在胰蛋白酶消化前在 HKR 中洗涤细胞两次。于 4℃将 细胞在 1000g 下离心 5 分钟并用 250μl0.1M NaOH 将细胞沉淀裂解 30 分钟， 之后将 200μl 裂解物转移至黑色 96- 孔板中。在 Spectra Max Gemeni XS 荧光计 (Molecular devices， USA) 上于 643/670nm 处测量荧光， 利用荧光素线性特性并标准化 ( 或归一化 ) 至蛋白质的 量 (Lowry BioRad， USA) 重新计算为内标化合物 (internalizedcompound) 的量。
荧光素酶测定
剪接校正试验 ： 在所有试验中于试验前 24 小时将 100 000 个 Hela pLuc705 细胞 接种至 24 孔板。 在无血清培养基中用复合物处理细胞 4h， 然后换成血清培养基再处理 20 小 时。 之后， 用 Hepes Krebs Ringer(HKR) 缓冲液洗涤细胞两次并在室温下在 HKR 中用 100μl 0.1 ％曲通 (triton)×100 裂解 15 分钟。用 Promega 荧光素酶测定系统在 Flexstation II(Moleculardevices， USA) 上测量荧光素酶活性。将 RLU 值标准化 ( 或归一化 ) 至蛋白 质含量， 并将结果表示为 RLU/mg 或与未处理细胞相比剪接的成倍增加。在使用促进内涵体 逃逸的试剂氯喹的试验中， 将复合物与 75μM 氯喹在无血清 DMEM 中共温育 2h， 然后使细胞 在完全 DMEM 中生长 20h。
质粒转染 ： 对于质粒转染， 在处理前 24h 接种 80 000 个 CHO 或 Jurkat 细胞。在无 血清 DMEMF12 中用 pGL3/CPP 复合物处理细胞 4 小时， 然后替换为完全培养基再生长 20 小 时。使细胞被裂解并根据剪接校正测定进行分析。
siRNA 转染 ： 如其他试验， 接种包括 HeLa、 BHK21 和 U2OS 细胞在内的不同的荧光素 酶稳定细胞系。在无血清培养基或完全生长培养基中处理细胞 4h， 然后向孔中加入 1ml 完 全生长培养基。使细胞被裂解并如前文所述在 20 小时后测量发光。将发光标准化 ( 或归 一化 ) 为每一个孔中的蛋白质含量并将来自未处理细胞的 RLU/mg 值当做 100％。 接着将不 同的处理表示为未处理细胞的百分比。
微小 RNA-21 测定 ： 将携带一个内部萤火虫荧光素酶基因 (fireflyluciferase gene) 和在 3′ UTR 携带微小 RNA-21 靶位点的第二海肾荧光素酶基因 (renilla luciferase gene) 的质粒 psi-CHECK2 转染至在 6cm 培养皿中生长的 HeLa 细胞。转染后一天， 通过胰蛋 白酶消化使细胞分离， 并以 70000 个细胞 / 孔的密度接种至 24 孔板中。又过了 24h 后， 如 之前对 SCO 所述用抗 miR-21 复合物处理细胞。使细胞被裂解， 然后检测充当转染内标的萤 火虫荧光素酶的表达， 然后检测海肾荧光素酶表达。如果 ON 到达了细胞质， miR21 被隐蔽 起来并预期海肾荧光素酶表达增加， 生成与剪接校正测定相似的阳性判读。将未处理细胞 的萤火虫 / 海肾荧光素酶之比设定为 1 并将处理后的海肾荧光素酶增加表示为与未处理细 胞相比的成倍增加。使用 HeLa 细胞是因为已知它们表达高水平的 miR21。
毒性测定
使用 Promega Cytox-ONETM 测定测量膜完整性。简言之， 在用肽处理前两天将 104 个细胞接种至 96 孔板中的无血清 DMEM 中。30 分钟后， 将培养基转移至黑色荧光板上并用 TM Cyto Tox-ONE 试剂温育 10 分钟， 然后加入终止溶液。在 560/590nm 处测量荧光。将未处 理细胞定义为 0， 将 HKR 中在 0.18％曲通 (triton) 中通过裂解释放的 LDH 定义为 100％裂 解。
Wst-1 测定
用 Wst-1 增殖测定评价肽的长期毒性作用。在处理前两天以 104 个细胞 / 孔将 HeLa pLuc 705 细胞接种至 96 孔板。在 100μl 血清或无血清 DMEM 中用复合物处理细胞 24h。然后根据制造商的使用说明 (Sigma， 瑞典 ) 将细胞暴露于 Wst-1。在吸光度读数仪 Digiscan(Labvision， 瑞典 ) 上测量吸光度 (450-690nm)。 将未处理细胞定义为 100％存活。
FACS
转染前一天将 24 孔板接种 EGFP 稳定的 CHO 细胞。转染当天， 用 PF6-siRNA 复 合物转染细胞， siRNA ∶ PF6 的摩尔比为 a) 对于无血清培养基温育 ： 1 ∶ 20 和 1 ∶ 40， siRNA 浓度为 50nM、 25nM 和 12.5nM ； 以及 1 ∶ 80， siRNA 浓度为 20nM、 10nM 和 5nM。b) 对 于完全培养基温育 ： 1 ∶ 20 和 1 ∶ 40， siRNA 浓度为 100nM、 50nM 和 25nM。对于对照试验， 用 Lipofectamine(100nM siRNA 和 2.8μl Lipofectamine) 用 EGFP siRNA 转染细胞， 或不 用复合物或仅用 siRNA 实施假转染 ( 以得到原始 EGFP 水平 )。转染过程中的温育体积是 500μl。在无血清培养基中或完全培养基中按要求将复合物与细胞温育 4 小时。然后向各 孔中加入 1ml 完全培养基并使细胞生长 24h( 或可替代地生长 48 小时 )。
在测试当天， 用 PBS 洗涤细胞， 并用胰蛋白酶消化从孔分离。使用 125μl 胰蛋白 酶溶液。细胞分离后， 加入 500μl 完全培养基并将细胞转移至埃彭道夫管中。500×g 离 心 10min， 除去上清并重悬浮在 500μl 添加了 2％ FBS 的 PBS 中 ( 该 FBS 非常重要， 当试管 在等待被分析时其使细胞保持较好的形状 )。将细胞悬液转移至 FACS 管中并将它们置于 冰上。尽快进行分析。在 FACS 中测量细胞悬液。在 FSC-SSC 图上界定活细胞群。在 FSC/ FITC-A 或 SSC/FITC-A 图上找出假转染细胞的 gate( 具有原始 EGFP 水平的细胞的 gate/ cloud)。用相同的 gate 检测样品。具有原始 EGFP 水平的位于 cloud 之外的以及具有较低 EGFP 水平的细胞被计数为发生了 siRNA 转染的细胞。 将结果表示为用 siRNA 转染的细胞的 百分比。可替代地， 用 FITC-A 直方图基于假转染细胞以相似的方式选择 gate。
实施例 1( 图 1- 图 3) ： 通过细胞渗透性肽进行的剪接校正为了评价不同的未修饰 CPP 将寡核苷酸运输至细胞内的效力， 我们使用所谓的剪 接校正测定 [14]。这一测定基于被稳定转染的 HeLa 细胞系， HeLa pLuc 705 细胞。所述细 胞具有稳定的质粒转染， 所述质粒携带被来自 β- 球蛋白前体 -mRNA 的内含子 2( 携带隐蔽 剪接位点 ) 的插入中断的编码荧光素酶的序列 ( 图 1)。在正常条件下， 该隐蔽剪接位点能 够激活异常剪接位点， 使具有内含子保留的成熟 mRNA 增加， 因此得到非功能性的荧光素酶 蛋白。然而， 如果该异常剪接位点被 SCO 遮蔽， 则荧光素酶的前体 -mRNA 很可能被加工并产 生功能性荧光素酶。通过使用 HeLapLuc 705 细胞， 可通过测量荧光素酶活性来评价各种载 体的核递送效率。
在第一组试验中， 我们欲评价若干已建立的 CPP 采用共温育策略将剪接校正磷硫 酰 2′ O- 甲基 RNA( 即 SCO) 递送至细胞内的能力 [15]。 如图 2a 所示， 所有被检测的未修饰 CPP 均能够在暴露后 1h 内转移至细胞内， 穿膜肽 (penetratin) 是最有效的肽。然而， 任何 一种肽都不能将生物活性 SCO 运输至细胞的细胞核中， 这可从荧光素酶表达的不显著增加 得以解释 ( 图 2b)。为证实该阴性结果不是由失活的 SCO 引起， 用脂质体 2000 转染试剂作 为递送载体进行对照试验。如图 2c 所示， 随着 SCO 浓度的增加观察到正确剪接的荧光素酶 的剂量依赖性增加。低活性的另一可能的原因是 CPP 和 SCO 之间不能形成复合物。然而， 这个原因也被排除了， 因为在凝胶延迟测定中所有的肽均促进复合物形成 ( 图 3)。这些结 果共同表明， 虽然 CPP 能够将 SCO 运输至细胞内， 但是它们很可能仍然被捕获在内涵体区室 中。 这一点进一步得到了共聚焦显微数据的支持， 其中， 如果不是全部的话， 大量标记的 SCO 存在于间隔的区室内， 例如内涵体或溶酶体 ( 数据未示出 )。更重要的是， 当用趋溶酶体剂 氯喹一起处理细胞时， 除 Arg9 之外所有肽的剪接校正显著增加 ( 图 2d)。 有趣的是， 尽管穿 膜肽 (penetratin) 产生最高的定量摄取但是 TP10 优于其他的肽。综合考虑， 这表明共温 育策略促进了细胞摄取而不是可生物利用的递送。此外， 得到了高细胞摄取与被运输运载 物的高活性不相关的结论。
实施例 2( 图 2、 图 4、 图 6) ： 促进剪接校正的双功能 CPP
接着， 尝试在 CPP 中引入修饰以增加它们的效率。将脂肪酸部分 ( 即硬脂酸 ) 引 入现有的 CPP 中， 并且还引入新设计的序列中 ( 参见图 5)。后一种肽 PepFect1 的设计原 理是形成双功能肽， 一个基团用于促进内涵体逃逸 ( 即 (RHbutRH)4)， 一部分实现核仁递送 (RKKRKKK)。 尽管在用肽核酸作为共价轭合物的转染中该肽非常强效， 但是它不能在非共价 环境中运输 SCO( 数据未示出 )。因此， 该肽是 N- 端硬脂酰化的。同样， 另外四种之前检测 的 CPP 也是硬脂酰化的， 并将 M918[12] 和 TP10[11] 分别重新命名为 PepFect2 和 PepFect3。 有趣的是， 在所检测的任何摩尔比下硬脂酰化的 Arg9 和穿膜肽 (penetratin) 均不能促进 剪接校正。然而， 当与 SCO 的摩尔比达到 10 ∶ 1 时 PepFect3 非常强效， 几乎达到了与使用 脂质体 2000 转染试剂时相同的荧光素酶表达水平 ( 图 4)。在使用 PepFect3 的条件下， 摄 取与剪接校正之间存在正相关性， 而其他的肽不存在这样的相关性。 事实上， 使用 PepFect3 的剪接校正与 TP10 和氯喹一起使用时几乎一样高 ( 图 6)。因为 TP10 和与 SCO 复合的 PepFect3 之间的定量摄取的差异不显著 ( 图 2a 和图 4a)， 由此得到该活性的增加是由内涵 体释放增加引起的结论。出人意料的是， 在剪接校正测定中只有 PepFect3 是有活性的而 PepFect2 仅具有很小的活性 ( 图 4b)。
越来越多的疾病例如 β- 地中海贫血、 囊性纤维化病、 肌营养不良、 癌症等都是由导致异常剪接的突变引起的， 所述异常剪接现在可使用不同的 SCO 得以恢复 [3， 17， 18]。 然 而， 需要高剂量的 SCO 以在体内获得显著的生物学作用。因此， 这些结果对于由缺陷性选择 性剪接引起的各种疾病的未来治疗具有非常广阔的前景。
实施例 3( 图 7- 图 8) ： 脂肪酸修饰位置的评价
为 了 评 价 和 表 征 脂 肪 酸 修 饰 的 位 置， 比 较 PepFect3(N 端 硬 脂 酰 基 修 饰 ) 和 PepFect4( 在 Lys7 上侧链被硬脂酰化 ) 递送 SCO 的效率。 图 7 示出了 PepFect4 在促进剪接 校正中比 PepFect3 更有效， 甚至在较低的摩尔比的情况下也是如此。而且， 与脂质体 2000 转染试剂相比， PepFect4 更强效。有趣的是， 在低 25 倍的 SCO 浓度下， 两种 PepFect 的活 性均显著高于临床前使用的共价 CPP- 吗啉结合物 ( 轭合物 )RXR4-PMO( 图 8)。
实施例 4( 图 9- 图 12) ： 用 PepFect3 和 PepFect4 递送质粒
在下一组试验中， 评价了上述 PepFect 肽促进 4.7kbp 表达荧光素酶的 pGL3 质粒 的摄取和表达的能力。 出人意料的是， 所有的 PepFect 肽均能够显著增加基因递送 ( 图 9)。 而且， 在投料比为 1 ∶ 1 至 1 ∶ 1.5 时， PepFect3 是最有效的肽。这些结果表明所述肽还 能够有效用于更生物学相关的质粒和 ON 的基因递送。以 CR 范围为 0.5-2 的不同投料比制 备 PF3 和质粒的复合物并与根据制造商的使用说明应用的脂质体 2000 转染试剂进行比较。 将结果表示为与仅用质粒处理的细胞相比基因表达的成倍增加。图 10 中的图示出了 CR 大 于 1 时， PF3 的活性高于脂质体 2000 转染试剂。另一优势是图 11 所示的同源转染。传统 的转染试剂需要一定的细胞汇合度以达到最佳功能， 然而图 12 显示 PF4 转染与接种的细胞 数量无关但效果一样好。
实施例 5( 图 11 和图 13) ： PepFect 的毒性小于 LF2000
当用于活组织时， 保持尽可能低的毒性作用是很重要的。如图 11 所示， 转染前在 不同的样品中接种相同数量的细胞， 然而， 处理后阳离子脂质体处理的细胞中细胞数量较 少。PepFect3 的毒性低于脂质体 2000 转染试剂 ( 图 13) 并且可能由此提供用于基因疗法 的新的非病毒工具。
实施例 6.( 图 14- 图 15) ： 通过 PepFect5 递送微小 RNA
微小 RNA(miRNA) 代表了在植物、 非脊椎动物和脊椎动物的基因组中被编码的一 类新的非编码 RNA。 微小 RNA 基于 ( 部分 ) 序列互补性调节靶 mRNA 的翻译和稳定性。 miRNA 变化与人类癌症的起始和发展有关。已显示 miR-21 起到癌基因的作用并通过调节诸如 bcl-2 的基因来调节肿瘤产生， 因此其可作为新的治疗靶 [19]。
本文中我们示出了与阳离子脂质体相比通过 PepFect5 递送 miR-21( 图 14)。 二者 在较低的 ON 摩尔比时等效。然而， 在摩尔比为 5 时， PepFect5 显著更佳 ( 图 15)。
实施例 7( 图 16- 图 19) ： 比较 PepFect5 和 PepFect6 的 siRNA 递送
在该实施例中， 不用硬脂酸物质修饰或除了用硬脂酸物质修饰之外， 还将其结合 ( 轭合 ) 于促进肽从泡状区室释放的具有四个氯喹类似物的赖氨酸树 ( 图 5)。该构建体不 仅具有运输在细胞核中发挥作用的 ON 化合物的活性， 而且还可以有效应用于胞质活性 ON 例如 siRNA( 图 16 和图 17) 的递送。事实上， PepFect5 和 PepFect6， 并且特别是后一种肽， 在各种细胞类型中递送 siRNA 的活性显著高于脂质体 2000 转染试剂 ( 图 16- 图 18)。尽 管在任何给定的 siRNA 浓度下阳离子脂质体 /siRNA 复合物很少产生大于 80％的基因表达 下调， 但是与 siRNA 复合的两种 PepFect 在低 siRNA 浓度下实现几乎完全的 RNAi。另外，PepFect6 在完全生长培养基、 含血清的培养基中也是有效的 ( 图 19)。其原因可能是与缺 乏硬脂酰基团的 PepFect5 相比， 它具有硬脂酸基团和氯喹树的双重修饰。
实施例 8.( 图 20- 图 28)PepFect 转染 ： 同源、 稳定并且在难转染的细胞中有效
用户友好的试剂应耐受例如复合物形成中摩尔比的细微变化。PF6 在不同摩尔比 下几乎是等效的 ( 图 20) ： 用与 50nM siRNA 复合的 PF6 处理 24 小时后的 BHK21 细胞中的 RNAi。即使在例如 10 这样低的 MR 下， 在荧光素酶稳定的 BHK21 细胞中也可获得大于 80％ 的荧光素酶下调。与使用脂质体 2000 转染试剂或任何其他基于脂质体的递送系统通常可 获得的结果相比， 这是更强的 RNAi 作用。有趣的是， 在 MR20 和 MR40 之间， 响应的差异非常 低。这使得与转染量的小变化对转染效率具有显著影响的脂质体 2000 转染试剂相比， 该递 送系统更加用户友好。除了在含血清培养基中具有高效率 ( 图 21- 图 27) 之外， PepFect6 构建体转染完整的细胞群而不仅仅是分裂细胞 ( 图 21)。 这一点通过图 22 中的荧光显微术 进一步可视化。此外， 较长的 siRNA( 即所谓的 dicer 底物 ) 也能够通过 PF6 有效递送 ( 图 24)。图 23 示出了在 EGFP-CHO 细胞中单次 siRNA 处理后 RNAi 衰减动力学的分析。以给定 的 siRNA 浓度制成 PF6/siRNA 颗粒并在含血清培养基或无血清培养基中进行处理。然后 将该作用与通过与脂质体 2000 转染试剂或寡核苷酸转染试剂复合的 100nM siRNA 诱导的 RNAi 比较。结果明确显示， 24h 后 PF6 已经诱导几乎完全的 RNAi， 与 siRNA 浓度无关。应将 该结果与使用寡核苷酸转染试剂和脂质体 2000 转染试剂分别观察到的 20％和 55％下降进 行比较。此外， 在最佳条件下， 当使用 PF6 时， RNAi 响应持续 4-5 天。最后， PepFect6 还能 够转染许多非常 “难转染的” 细胞， 包括 SHSY-5Y( 图 25)、 N2a、 大鼠原代胶质细胞 ( 图 26) 和 Jurkat 悬浮细胞 ( 图 28)。上述性质和与脂质体 2000 转染试剂或寡核苷酸转染试剂相 比更低的毒性使得这种特别的载体非常独特。
实施例 9( 图 29) ： 选择性环体系修饰
在图 29 中， 我们证明了物质 A 不必要是喹啉类似物。萘衍生物和相似的环结构执 行相似的功能。用与 SCO 复合的 PF5 类似物处理后在 HeLa 细胞中的剪接校正。在这种情 况下， 使用具有与四个拷贝的 1- 萘氧基丙酸 (1-naftoxy propanoic acid) 形成垂直分支 的赖氨酸的 TP10 代替喹啉类似物来评价融合性质的重要性。该结果显示， 与之前在 PF5 中 观察到的 100 倍增加相比， 剪接增加了 12 倍。
实施例 10.( 图 30) ： 新的细胞渗透性序列 ： PepFect14
在 PepFect 递送系统中检测了若干种不同的细胞渗透性肽， 本实施例是被称作 Pepfect14 的具有硬脂酰基结合的新序列的一个实例。如图 30 所示， PepFect14 能够在血 清存在下有效递送 siRNA 和 SCO 二者。
实施例 11( 图 31) ： 可将 PepFect 递送系统混合产生叠加效应
另外， 可如图 31 所示将 PepFect 递送系统混合在一起， 不同比例的 PF3 和 PF5 协 同发挥作用并且与两种 PepFects 自身相比能够更好地递送 SCO。另外， 可类似地混合两种 或多种 PepFect 递送系统的组合物以产生另外的性质， 例如靶向或半衰期延长。
实施例 12. 合成新的氨基 - 喹啉衍生物， N-(2- 氨基乙基 )-N- 甲基 -N′ -[7-( 三 氟甲基 )- 喹啉 -4- 基 ] 乙烷 -1， 2- 二胺
利 用 PEG 400 浴 将 安 装 有 磁 力 搅 拌 器 的 50mL 圆 底 烧 瓶 中 的 3.8g(16.3mmol)4- 氯 -7-( 三氟甲基 ) 喹啉和 12 倍摩尔过量的 N- 甲基 -2， 2′ - 二氨基二乙胺 (25ml) 的混合物在 2.5h 内边搅拌边从室温加热至 80℃， 然后在 3h 内使温度升高至 130℃， 并且最后于 140℃加热 2.5h。将该反应混合物冷却至室温， 加入冷 DCM 使其立即沉 淀， 滤掉沉淀物。用 5％ NaHCO3 水溶液洗涤有机层两次， 然后用水洗涤两次。在无水 MgSO4 上干燥有机相， 减压 ( 旋转蒸发器 ) 除去溶剂并且将残余物留在冷冻干燥器中。得到重量 为 4.5g(MW312.3)， 14.4mmol， 产率为 83％的粗产物， 未对其进行进一步纯化而用于与肽结 合 ( 轭合 )。
N-(2- 氨基乙基 )-N- 甲基 -N′ -[7-( 三氟甲基 )- 喹啉 -4- 基 ] 乙烷 -1， 2- 二胺 与琥珀酸修饰的多个赖氨酸残基的侧链偶合 ( 偶联 )， 提供多个拷贝的与载体分子共价结 合的 ON 类似物。 用 3 当量的 TBTU/HOBt 和 6 当量的 DIEA 实现固相载体上游离羧基的活化。 将待结合的过量 (2-5 当量 ) 新喹啉衍生物 (N-(2- 氨基乙基 )-N- 甲基 -N′ -[7-( 三氟甲 基 )- 喹啉 -4- 基 ] 乙烷 -1， 2- 二胺溶于 DMF 并与活化剂一起同时加入肽 - 树脂中以通过 其游离氨基基团使 QN 类似物与活化的树脂偶合 ( 偶联 )。为了确保完全偶合 ( 偶联 )， 由 于不能够通过 Kaiser 测定来监测， 可以使该反应进行较长的时间 ( 通常过夜 )。
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