用于检测发生颌骨坏死风险因子的方法和试剂盒及其治疗 方法 对相关申请的交叉引用
本申请要求 2010 年 1 月 6 日提交的美国临时申请序列 No.61/292,730 的利益， 其全部公开内容通过引用特此引入本文， 包括所有图、 表、 氨基酸和核酸序列 ； 本申请也是 2009 年 7 月 7 号提交的国际申请 No.PCT/US2009/049767 的部分继续申请， 其要求 2008 年 7 月 7 日提交的美国临时申请 No.61/078,680 的利益， 其各个的公开内容通过引用特此引入 本文， 包括所有图、 表、 氨基酸和核酸序列。
发明领域
本发明一般地涉及分子生物学、 遗传学和医学领域。 更特别的是， 本发明涉及用于 评估接受或被开具二膦酸盐处方的人中颌骨坏死风险的遗传多态性与血清中蛋白质的表 达。
发明背景
二膦酸盐类在许多癌症患者处方用于减轻骨痛、 骨破坏及高钙血症， 或在骨质疏 松个体中处方用于减少骨损失。二膦酸盐类是抑制破骨细胞 ( 骨再吸收细胞 ) 的活性和 功能并扰乱成骨细胞 ( 骨形成细胞 ) 的分化的一类药物。二膦酸盐有两种类型 ： 含氮和 非含氮的二膦酸盐。二膦酸盐类抑制骨再吸收， 并因此通过抑制破骨细胞的募集和活性 因而缩短其寿命而抑制骨重建。IV 二膦酸盐类主要用于治疗与多发性骨髓瘤和其他恶性 肿瘤的骨转移相关的骨侵蚀和高钙血症。口服二膦酸盐类也用来防止骨损失和处方用于 骨质疏松症患者。2003 年 Marx 首次报道了接受二膦酸盐帕米膦酸 (Aredia Pharmaceuticals) 和唑来膦酸 (Zometa Novartis Novartis Pharmaceuticals) 的患者颌骨疼痛问题。从那时起， 一些作者报道了另外的案例并且很多牙科专家尤其是口腔和上颌面外科 医生已经确认了许多未公布的案例。 二膦酸盐类通常在数以百万计的绝经后妇女中处方用于稳定由于骨质疏松症引 起的骨损失。骨质疏松症的治疗策略是抑制破骨细胞对松质骨 (trabecularbone) 的再
吸收， 从而保持其密度。为此， 开具口服二膦酸盐的处方并包括依替膦酸盐 (Didronel Procter 和 Gamble)、 利塞膦酸盐 (Actonel Procter 和 Gamble)、 替鲁膦酸盐 (Skelid Merck)。 更有效的二膦酸盐静脉内施 Sanofi-Synthe Lab Inc) 和阿伦膦酸盐 (Fosamax用并表明稳定沉着于骨中的转移癌 ( 主要是乳腺癌和前列腺癌 )， 并治疗多发性骨髓瘤的 骨再吸收缺陷和纠正严重的高钙血症。它们是帕米膦酸和唑来膦酸。除了本文提到的药物 外， 已知一些其他的二膦酸盐是在美国还未广泛使用或仍然处于实验阶段。
最近的报告表明， 二膦酸盐的使用和颌骨坏死之间有相关性。二膦酸盐引起的颌 骨坏死 (BONJ) 是患者亚群中的病态骨障碍。二膦酸盐使用者中表现出这种并发症的生理 机制仍然未知。因为与他们的日常活动和牙齿 ( 它们指导牙周膜周围的牙周骨重建 ) 的存 在相关， 颌骨具有比其他骨骼更大的血液供应和更快的骨更新率， 因此二膦酸盐高度集中 于颌骨中。与慢性侵入性牙科疾病和治疗及骨上的薄粘膜关联， 这种二膦酸盐的解剖学集中导致这种情况只在颌骨中出现。因此， 颌骨中外露的骨是这些二膦酸盐类对骨的日常重 建和更新发挥作用的直接结果。成骨细胞和骨细胞存活仅约 150 天。如果在其死亡时， 矿 物基质没有被破骨细胞 ( 其释放骨形态发生蛋白和胰岛素样生长因子的细胞因子以从干 细胞群诱导新的成骨细胞 ) 再吸收， 骨单位变成非蜂窝状的和坏死的。骨内的小毛细血管 消退， 因而骨变成无血管的。 上覆粘膜的自发破坏、 某些形式的损伤或颌骨的侵入性手术通 常会导致这种坏死的骨暴露， 其之后未能痊愈。
观察到的和报道的大多数 BONJ 病例是 IV 二膦酸盐治疗的患者， 但也报道几个与 口服二膦酸盐相关的病例 (Reid， Bone， 44(1) ： 4-10， 2009)。虽然高达 13％的接受 IV 二膦 酸盐治疗的患者发生 BONJ， 口服二膦酸盐的估计值是 1 ∶ 10,000 至 1 ∶ 100,000。虽然对 照的、 随机的、 前瞻性的、 盲法的研究来证明二膦酸盐治疗与骨外露之间的特定因果关系是 不可能的， 药物帕米膦酸、 唑来膦酸和更少用的阿伦膦酸盐已显示出直接的相关性。
大多数 BONJ 病例是在具有骨转移的癌症患者中诊断出来的。然而， 在骨质疏松症 口服治疗后也报道了 BONJ 病例。 因此， 总人口中的一大部分 ( 例如， 绝经妇女和癌症患者 ) 可能处于风险之中。
发明概述 本文描述了用于确定患者的 BONJ 易感性的遗传基础的方法， 用于鉴别在二膦酸 盐施用后易感 BONJ 的患者的方法和试剂盒， 和用于使医生根据 BONJ 患者的基因组 ( “个性 化 / 定制医疗” ) 和血清蛋白表达制订治疗方案的工具。 本文还描述了患者的生物液 ( 如血 清、 唾液 ) 中的表达可能与 BONJ 相关并且可用已知方法检测 ( 例如， Western 印迹、 ELISA 等等 ) 的蛋白质。本文所述的方法包含使用候选基因途径鉴别造成 BONJ 发生的基因。采 用了病例对照设计的研究， 其包括研究患有 BONJ 和未患 BONJ 的患者中基因 ( 例如， 表达和 特定的 SNP) 和血清蛋白表达的效应。
因此， 本文描述了鉴别二膦酸盐施用后易患 BONJ 的受试者的方法， 该方法包括以 下步骤 ： (a) 从受试者获得样品 ； (b) 分析样品以确定具有作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物 标志物的 SNP 的至少一个基因、 由该至少一个基因编码的蛋白质或作为 BONJ 或 BONJ 易感 性的生物标志物的至少一个 SNP 的存在 ； 和 (c) 将样品中作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物 标志物的基因、 蛋白质或 SNP 的存在与受试者的 BONJ 易感性相关联。样品可包括， 例如， 血液、 血清、 血浆或唾液。该至少一个基因可以是表 1、 表 3 或表 11 所示的基因， 且该至少 一个 SNP 可以是表 1、 表 3 或表 11 所示的 SNP。该至少一个基因可以包括， 例如， COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN。在一些实施方案中， 该基因包括 COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN 中 的二个、 三个、 四个或所有五个基因。在一些实施方案中， 该至少一个基因包括 OPG、 OPN 或 二者。该至少一个 SNP 可以是， 例如， rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)、 rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 或 rs11730582(SEQ ID NO ： 26)。 在一些实施方案中， 该 SNP 包括 rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)、 rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 和 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 中的 两个、 三个、 四个或所有五个 SNP。在一些实施方案中， 该至少一个 SNP 包括 rs2073618(SEQ ID NO ： 24)、 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 或这两者。 分析样品以确定具有作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的 SNP 的至少一个基因、 由该至少一个基因编码的蛋白质或作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的至少一个 SNP 的存在的步骤可以包括使用微阵列检测该至
少一个基因或至少一个 SNP 的存在
本文还描述了在易感 BONJ 且接受二膦酸盐治疗的受试者中防止 BONJ 的方法， 该 方法包括以下步骤 ： (a) 从受试者获得样品 ； (b) 分析样品以确定具有作为 BONJ 或 BONJ 易 感性的生物标志物的 SNP 的至少一个基因、 由该基因编码的蛋白质或作为 BONJ 或 BONJ 易 感性的生物标志物的至少一个 SNP 的存在 ； (c) 将样品中作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物 标志物的至少一个基因、 蛋白质或至少一个 SNP 的存在与受试者的 BONJ 易感性相关联 ； 和 (d) 向受试者施用与 BONJ 不相关的二膦酸盐或与其它二膦酸盐相比更少可能性引起 BONJ 的二膦酸盐、 以比常规处方更低的剂量或更低的频率向受试者施用二膦酸盐。可以以任何 对于特定的制剂合适的途径向受试者施用二膦酸盐 ( 例如， 静脉内、 口服 )。 样品可包括， 例 如， 血液、 血清、 血浆或唾液。该至少一个基因可以是表 1、 表 3 或表 11 所示的基因且该至 少一个 SNP 可以是表 1、 表 3 或表 11 所示的 SNP。该至少一个基因可以包括， 例如， COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN。在一些实施方案中， 该基因包括 COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN 中 的二个、 三个、 四个或所有五个基因。在一些实施方案中， 该至少一个基因包括 OPG、 OPN 或 这二者。该至少一个 SNP 可以是， 例如， rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)， rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 或 rs11730582(SEQ ID NO ： 26)。 在一些实施方案中， 该 SNP 包括 rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)、 rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 和 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 中的 两个、 三个、 四个或所有五个 SNP。在一些实施方案中， 该至少一个 SNP 包括 rs2073618(SEQ ID NO ： 24)、 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 或这二者。 分析样品以确定具有作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的 SNP 的至少一个基因、 由该至少一个基因编码的蛋白质或作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的至少一个 SNP 的存在的步骤可以包括使用微阵列检测该至 少一个基因或至少一个 SNP 的存在。
本文进一步描述了用于鉴别在二膦酸盐施用后易患 BONJ 的受试者的试剂盒。该 试剂盒包含 ： (a) 具有多个附着于其上的核酸的固体载体， 其中至少一个核酸与具有作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的 SNP 的基因特异性杂交 ； (b) 检测试剂 ； 和 (c) 使用 说明。基因可以是表 1、 表 3 或表 11 所示的基因并且 SNP 可以是表 1、 表 3 或表 11 所示的 SNP。基因可以包括， 例如， COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN。在一些实施方案中， 基因包括 COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN 中的两个、 三个、 四个或所有五个基因。在一些实施方案中， 该至少一个基因包括 OPG、 OPN 或这二者。该至少一个 SNP 可以是， 例如， rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)， rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 或 rs11730582(SEQ ID NO ： 26)。在一些实施方案中， 该 SNP 包括 rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)、 rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 和 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 中的两个、 三个、 四个或所有五个 SNP。在一些实施方案中， 该至少一个 SNP 包括 rs2073618(SEQ ID NO ： 24)、 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 或这二者。
本文也描述了用于评估二膦酸盐治疗后患者发生 BONJ 的风险的方法， 包括 a) 从 受试者获得生物样品 ； b) 检测所述样品中的一个或多个 BONJ 相关的生物标志物， 其中该生 物标志物与表 1、 表 3 或表 11 中所示的一个或多个基因相关或所述生物标志物与所述基因 编码的一个或多个多肽相关， 从而产生生物标志物数据集 ； c) 将该生物标志物数据集与健 康人群和患有 BONJ 的人群的生物标志物数据比较 ； 和确定受试者发生 BONJ 的风险。在该方法中， 至少一个生物标志物可以是存在于表 1、 表 3 或表 11 所示的基因中的 SNP， 与表 1、 表 3 或表 11 所示的一个或多个 SNP 标志物相关的至少一个 BONJ 相关多态性位点或表 1、 表 3 或表 11 所示的基因的表达产物。至少一个生物标志物可以是与表 1、 表 3 或表 11 所示的 一个或多个 SNP 标志物完全连锁不平衡的 SNP。
本文还进一步描述了用于鉴别二膦酸盐施用后易感 BONJ 的受试者的方法。该方 法包括以下步骤 ： (a) 从受试者获得样品 ； (b) 分析样品的参与骨稳态的蛋白质的表达 ； 和 (c) 将该蛋白质的表达与受试者的 BONJ 易感性相关联。参与骨稳态的蛋白质可以是 ： PTH、 胰岛素、 TNF-α、 瘦素、 OPN、 OC、 OPG 和 IL6 中的一种。可以分析样品以确定该蛋白质的过表 达。在该方法中， 该蛋白质可以是与表 4 中所列的蛋白质具有至少 90％的氨基酸序列同一 性的蛋白质。
任选地， 本发明的上述方法还包括确定是否受试者有其他的遗传的 ( 例如， 基于 基因、 SNP 和 / 或蛋白质的存在 ) 或非遗传的 ( 例如， 生活方式因素， 如吸烟史 ) 发生 BONJ 的预测风险因素。
除非另有界定， 此处使用的所有技术术语具有如本发明所属领域普通技术人员通 常理解的相同的含义。 如本文所述， 单数形式 “一” 、 “一种” 、 “及” 和 “该” 包含复数指代， 除非上下文明确 规定并非如此。因此， 例如， “一个 SNP” 的指代包含多个 SNP( 即， 至少一个 SNP)， “一个基 因” 的指代包括多个基因 ( 即， 至少有一个基因 )， 等等。
如本文所使用 “核酸” 、 “核酸分子” 或 “多核苷酸” 是指两个或多个核苷酸的链， 如 RNA( 核糖核酸 ) 和 DNA( 脱氧核糖核酸 )。 “纯化的” 核酸分子是从与该核酸自然存在的细 胞或生物体中的其它核酸序列实质分离或隔离的核酸 ( 例如， 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 95、 96、 97、 98、 99、 100％不含污染物 )。 该术语包括， 例如， 整合到载体、 质粒、 病毒或者原核生物 或真核生物的基因组中的重组核酸分子。
术语 “基因” 是指编码特定蛋白质的核酸分子， 或在某些情况下， 指功能或结构的 RNA 分子。例如， COL1A1 基因编码 COL1A1 蛋白质。
如本文所使用 “蛋白质” 或 “多肽” 是同义的， 是指肽键的氨基酸链， 而不论其长度 或翻译后修饰， 如糖基化或磷酸化。
当提及核酸分子或多肽时， 术语 “天然的” 是指自然发生 ( 例如， 野生型 ) 的核酸 或多肽。
术语 “骨桥蛋白” 或 “OPN” 或 “OPN 多肽” 是指 OPN 基因的表达产物， 如与天然人类 骨桥 (OPN) 蛋白具有至少 65％ ( 但优选 75、 80、 85、 90、 95、 96、 97、 98 或 99％ ) 的氨基酸序 列同一性并显示出天然 OPN 蛋白的功能活性的蛋白质。蛋白质的 “功能活性” 是与该蛋白 质的生理功能相关的任何活性。对于本文所述的其它蛋白质 ( 例如， 甲状旁腺激素 (PTH)、 胰岛素、 TNF-α、 骨钙蛋白 (OC)、 骨保护素 (OPG) 等等 )， 与这些另外的蛋白相关的术语含义 相似。
如本文所使用 “序列同一性” 是指当两个序列在进行比对以最大化亚单元匹配， 即 考虑间隙和插入时， 两个序列中相应位置的相同亚单元的百分比。当两个序列中的亚单元 位置都被相同的核苷酸或氨基酸占据时则存在序列同一性， 例如， 如果两个 DNA 分子中的 给定位置都被腺嘌呤占据， 那么该分子在该位置为相同。例如， 如果在长度为 10 个核苷酸
的序列中 7 个位置与第二个 10- 核苷酸序列中相应的位置相同， 那么这两个序列有 70％的 序列同一性。序列同一性通常采用序列分析软件测定 ( 例如， 遗传学计算机组的序列分析 软件包 (Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group)， 威斯 康星大学生物技术中心， 1710 University Avenue， Madison， Wis.53705)。
本发明中的 “生物标志物” 是指在表 1、 3 或 11 中公开的 SNP 标志物或者指表 1、 3 或 11 中公开的基因或与其紧密连锁的位点的多态性或者指与表 1、 3 或 11 中所示的基因相 关的且与取自未患 BONJ 的受试者的相当样品相比在取自患有 BONJ 的受试者 ( 患者 ) 的样 品中差异表达的有机生物分子。 “有机生物分子” 是指生物源的有机分子， 例如， 类固醇、 氨 基酸、 核苷酸、 糖类、 多肽、 多核苷酸、 复合碳水化合物或脂质。如果一个样品中的生物标志 物在量、 结构、 功能或生物活性上与另一个样品中的生物标志物的量、 结构、 功能或生物活 性上存在统计学显著的差异， 那么在两个样品之间该生物标志物是差异存在的。作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的一个或多个基因、 SNP 或蛋白质可以与 BONJ 易感性相关联， 以使得他们在生物样品 ( 如血液、 血清、 血浆或唾液 ) 中的存在表示易感 BONJ。
本文所述 “单倍型” 是指遗传标志物 (“等位基因” ) 的任何组合。单倍型可以包 含两个或多个等位基因并且包含单倍型的基因组区域的长度可以是从几百个碱基到几百 个 kb。如本领域技术人员所公认的， 相同的单倍型可以通过确定限定来自不同核酸链的等 位基因的单倍型而不同地描述。本文所述的单倍型在个体之间是有差异的， 在患有 BONJ 或 具有比未患 BONJ 的个体更高的 BONJ 风险的个体中是差异存在的。因此， 这些单倍型对于 个体的 BONJ 或 BONJ 风险的评估、 诊断和预后具有诊断价值。可以通过本领域已知用于检 测多态性位点的核苷酸的方法检测单倍型。本文所述的单倍型 ( 例如具有如表 1、 3 或 11 中所示的那些标志物 ) 在患有 BONJ 或具有比未患 BONJ 的个体更高的 BONJ 风险的个体中 更频繁地发现。因此， 这些单倍型对于检测个体的 BONJ 或 BONJ 易感性 ( 更高的风险 ) 具 有预测价值。
在群体中可能存在超过一种序列的基因组中的核苷酸位置在本文是称为 “多态性 位点” 或 “多态性” 。在多态性位点长度上是单核苷酸的情况中， 该位点称为 SNP。例如， 如 果在特定的染色体位置， 群体的一个成员具有腺嘌呤而群体的另一个成员在同一位置具有 胸腺嘧啶， 那么该位置就是多态性位点， 并且更明确地说该多态性位点是 SNP。多态性位点 可以是由于插入、 缺失、 转换或易位产生的长度为几个核苷酸。 关于多态性位点的序列各个 形式被称为多态性位点的 “等位基因” 。因此， 在前述的实例中， 该 SNP 允许腺嘌呤等位基因 和胸腺嘧啶等位基因。
具有如本文所述的新型 BONJ 相关性的 SNP 标志物 ( 例如， 在表 1、 3 或 11 中 ) 具有 由国家生物技术信息中心 (NCBI) 分配给各个独特 SNP 的官方参考 SNP(rs)ID 身份标签。 各 个 rs ID 已经与人类基因组的特定核苷酸位置中存在的特定的可变等位基因关联， 并且核 苷酸位置用各个 SNP 侧翼的核苷酸序列来指明。例如具有 rs ID rs1800211 的 COL1A1SNP 位于 17 号染色体中， 可变等位基因是 A 和 C， 并且指定为 rs1800211 的核苷酸序列是 SEQ ID NO ： 3。
本文所使用 “等位基因” 可以指在 SNP 位置的核苷酸 ( 其中根据 SNP 的固有定义， 在该 SNP 位置群体中存在至少两种可选的核苷酸 )， 或者对于 cSNP， 可以指由包含该 SNP 位 置的密码子编码的氨基酸残基 ( 其中群体中该 SNP 位置存在的可选核苷酸形成编码不同氨基酸残基的可选密码子 )。本文中 “等位基因” 也可指 “变体” 。此外， 由包含特定的 SNP 的 密码子编码的氨基酸残基可以简称为由该 SNP 编码。
“探针” 或 “引物” 是以碱基特异方式与核苷酸分子的互补链杂交的寡核苷酸。 “碱 基特异方式” 是指两个序列必须具有足以使引物或探针与其特异靶序列杂交的程度的核苷 酸互补性。因此， 引物或探针序列不必需与模板序列完全互补。非互补碱基或修饰的碱基 可以插入到引物或探针中， 只要碱基替换不抑制杂交。核酸模板也可以包括引物或探针对 其具有不同程度的互补性的 “非特异性启动序列” 或 “非特异性序列” 。探针和引物可以包 括修饰的碱基如在多肽核酸中。探针或引物通常包括约 15 至 30 个连续核苷酸， 并且他们 可以进一步包括可检测的标记， 例如， 放射性同位素、 荧光化合物、 酶或酶的辅因子。 用于表 1、 3 或 11 中公开的 SNP 标志物的探针和引物可以在市面买到或很容易使用对于 SNP rs ID 指定的侧翼核苷酸序列和标准的探针和引物设计工具来设计。用于表 1、 3 或 11 中公开的 SNP 标志物的探针和引物可以应用于风险评估以及本文所述的分子诊断方法和试剂盒中。
本文所使用 “阵列” 、 “微阵列” 和 “DNA 芯片” 可以互换使用， 是指固定在基质 ( 例 如玻璃、 塑料、 纸、 尼龙或其他类型的膜、 过滤器、 芯片或任何其他合适的固体载体 ) 上的不 同多核苷酸的阵列。多核苷酸可直接在基质上合成或与基质分离地合成并随后固定到基 质上。可以通过很多方法合成或使用微阵列， 包括美国专利 No.5,837,832(Chee 等 )、 PCT 申 请 WO95/11995(Chee 等 )、 Lockhart， D.J. 等 (Nat.Biotech.14 ： 1675-1680， 1996) 和 Schena， M. 等 (Proc.Natl.Acad.Sci.， 93 ： 10614-10619， 1996) 中所描述的方法， 所有这些 都引用以其全部内容纳入本文。在其他实施方案中， 这些阵列可以通过 Brown 等美国专利 No.5,807,522 中描述的方法制备。
短语 “风险基因” 、 “疾病的风险基因” 和 “疾病基因座” 意思是造成发生疾病的可 能性增加的遗传变异。
术语 “患者” 、 “受试者” 和 “个体” 在本文中可互换使用， 且指待治疗和 / 或由其获 得生物样品的哺乳动物 ( 如人类 ) 受试者。
虽然与本文所述方法和试剂盒相似或等同的方法和试剂盒可用于实施或测试本 发明中， 但合适的方法和试剂盒如下所述。本文提及的所有出版物、 专利申请、 专利和其他 参考文献通过引用完整纳入本文。在存在冲突的情况下， 本说明书 ( 包括定义 ) 优先。下 面讨论的具体实施方案仅是说明性的， 并不有意进行限制。
附图简要说明
图 1 是使用 Zometa (zoledronate， Novartis) 治疗的多发性骨髓瘤患者的下颚 骨中发生疼痛的未治愈的坏死颌骨外露的人口腔的照片。
序列简要说明
SEQ ID NO ： 1 是肿瘤坏死因子受体超家族成员 11a， NFKB 激活因子 (TNFRSF11A( 等 级 RANK)) 基因的指定为 SNP rs12458117 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 2 是基质金属肽酶 (MMP2) 基因的指定为 SNP rs243865 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 3 是 I 型， α1 胶原蛋白 (COL1A1) 基因的指定为 SNPrs1800211 的核苷 酸序列。
SEQ ID NO ： 4 是破骨细胞相关受体 (OSCAR) 基因的指定为 SNPrs4147630 的核苷 酸序列。SEQ ID NO ： 5 是组织蛋白酶 K(CTSK) 基因的指定为 SNP rs10788796 的核苷酸序 SEQ ID NO ： 6 是转化生长因子， β1(TGFB1) 基因的指定为 SNPrs1800471 的核苷酸列。
序列。 SEQ ID NO ： 7 是 RANK 基因的指定为 SNP rs1805034 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 8 是 NFKB 配体的受体激活因子 (RANKL) 基因的指定为 SNP rs9562415 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 9 是白介素 -6(IL6) 基因的指定为 SNP rs2069830 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 10 是维生素 D 受体 (VDR) 基因的指定为 SNP rs2228570 的核苷酸序 列。
SEQ ID NO ： 11 是 VDR 基因的指定为 SNP rs731236 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 12 是侏儒症相关转录因子 2(RUNX2) 基因的指定为 SNPrs11498198 的 核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 13 是 CYP2C8 基因的指定为 SNP rs1934980 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 14 是 CYP2C8 基因的指定为 SNP rs1934951 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 15 是 COL1A1 基因的指定为 SNP rs1800012 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 16 是甲状旁腺素 (PTH) 的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 17 是胰岛素的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 18 是 TNF-α 的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 19 是瘦素的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 20 是骨钙蛋白 (OC) 的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 21 是骨保护素 (OPG) 的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 22 是骨桥蛋白 (OPN) 的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 23 是白介素 -6(IL6) 的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 24 是肿瘤坏死因子受体超家族， 成员 11b(TNFRSF11B) 基因 (OPG) 的 指定为 SNP rs2073618 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 25 是 TNFRSF11B 基因 (OPG) 的指定为 SNP rs3102735 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 26 是分泌型磷蛋白 1(SPP1) 基因 (OPN) 的指定为 SNPrs11730582 的 核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 27 是 SPP1 基因 (OPN) 的指定为 SNP rs28357094 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 28 是肿瘤坏死因子 (TNF) 基因的指定为 SNP rs1800629 的核苷酸序 列。
本发明的详细说明
本发明涉及确认在接受二膦酸盐治疗或可能接受二膦酸盐治疗的患者或受试者 中发生 BONJ 的风险因子。本文描述的是确定 BONJ 的遗传药理学、 药代动力学和细胞学基 础的方法。本文还描述了用于确认患者的 BONJ 易感性的遗传基础的方法和试剂盒， 及鉴别 二膦酸盐施用后易发生 BONJ 的患者的方法以用于开发为医生提供了基于患者的基因组为 BONJ 患者制订治疗方案 ( “个性化 / 定制医学” ) 的工具。单倍型标记的 SNP 方法用来分析 参与骨吸收和破坏的候选基因和用来检验遗传变型为 BONJ 易感性的影响。采用分子细胞
技术检查 BONJ 的骨生物标志物。本文所述方法可以用来确定患者对于 BONJ 的遗传易感性 的差异以及患者之间造成这些患者从其体内清除二膦酸盐方面的差异的遗传差异。 确定这 些遗传差异提供了用于治疗 BONJ 的药物监测的改进、 BONJ 预防的改进和此类个体的治疗 的优化。任选地， 本发明的方法还包括确定受试者是否具有发生 BONJ 的其它遗传 ( 例如， 基于基因、 SNP 和 / 或蛋白质的存在 ) 或非遗传 ( 例如， 生活方式因素， 如吸烟史 ) 的预测 风险因子。
以下描述的优选实施方案说明了这些方法和试剂盒的适用。尽管如此， 从这些实 施方案的描述中， 本发明的其他方面可以根据下面提供的描述来进行和 / 或实施。
材料与方法
本文描述了涉及常规分子生物学技术的方法。这些技术一般是本领域已知的并 且在方法学论文中有详细描述， 如 Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 3rd ed.， vol.1-3， ed.Sambrook 等， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.， 2001 ； 和 Current Protocols in Molecular Biology， ed.Ausubel 等， Greene Publishing and Wiley-Interscience， New York， 1992(with periodic updates)。进行 SNP 和单倍型分析的方法以及基因分型技术在， 例如， Computational Methods for SNPs st and Haplotypes， 1 ed.， S.Istrail 等， Springer Press， Totowa， N.J.， 2004 ； N.Maniatis Methods Mol.Biol.376 ： 109-121， 2007 ； Genetic Analysis of Complex Disease by Jonathan L.Haines 和 Margaret A.Pericak-Vance， 2nded.， 2006， Wiley-Liss Publishing， Hoboken， NJ ； 和 Single Nucleotide Polymorphisms Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)by Pui-Yan Kwok， 1st ed.， 2002， Humana Press， New York， New York 中有描述。全基因组相关性研究综述于 Pearson 和 Manolio， JAMA vol.299 ： 1335-1344， 2008 中。
单核苷酸多态性 (SNP)
遗传序列的多种形式的并存导致了遗传多态性， 包括 SNP。SNP 是群体中存在不同 的等位基因或可选的核苷酸的 DNA 中的单个碱基位置， 并且是基因组中遗传变异的最常见 的形式。SNP 位置 ( 本文中可互换地称为 SNP、 SNP 位点、 SNP 基因座、 SNP 标志物、 生物标志 物或标志物 ) 通常在前面或后面具有等位基因的高度保守序列 ( 例如， 在群体中不到 1/100 或 1/1000 的成员发生变化的序列 )。 个体对应各个 SNP 位置的等位基因可以是纯合的或杂 合的。在一些实施方案中， SNP 是指 “cSNP” 以表示包含 SNP 的核苷酸序列是氨基酸编码序 列。
SNP 可以是由多态性位点处一个核苷酸置换成另一个核苷酸引起的。置换可以是 转换或颠换。转换是一个嘌呤核苷酸被另一个嘌呤核苷酸取代， 或一个嘧啶核苷酸被另一 嘧啶核苷酸取代。 颠换是嘧啶取代嘌呤， 反之亦然。 SNP 也可以是单个碱基的插入或缺失变 型， 称为 “indel” (Weber 等， Am.J.Hum.Genet.71 ： 854-62， 2002)。
如本文所使用的， 所称的 SNP 或 SNP 基因型包括单个 SNP 和 / 或单倍型 ( 其是通 常共同遗传的 SNP 的组 )。 与单个 SNP 相比， 单倍型可能与疾病或其他的表型效应具有更强 的相关性， 并因此在某些情况下， 可以提供更高的诊断准确性。致病性 SNP 是在基因表达中 或在基因产物的表达、 结构和 / 或功能中发生改变那些， 并因此成为最有预测性的可能的 临床表型。这样的一类包括落入编码多肽产物的基因区域中的 SNP， 即 cSNP。这些 SNP 可能导致多肽产物的氨基酸序列的改变 ( 即非同义密码子改变 ) 并引起缺陷的或其他突异的 蛋白质的表达。此外， 在无义突变的情况中， SNP 可以导致多肽产物的过早终止。这种变异 体产物可能会导致病理状态， 如遗传性疾病。
致病性 SNP 并不一定出现在编码区中 ； 致病性 SNP 可以出现在例如可能最终影响 核酸编码的蛋白质的表达、 结构和 / 或活性的任何遗传区域中。这些遗传区域包括， 例如， 参与转录的那些区域， 如转录因子结合域中的 SNP、 启动子区域中的 SNP， 参与转录物加工 的区域中的那些， 如可能导致缺陷性剪接的内含子 - 外显子边界处的 SNP 或 mRNA 的加工信 号序列 ( 如多腺苷酯化信区域 ) 中的 SNP。然而作为非致病性 SNP 的一些 SNP 是与致病序 列密切相关的， 并因此与致病序列隔离。在这种情况下， SNP 的存在与疾病的存在或者发生 疾病的易感性或风险增加相关。这些 SNP 尽管并不是致病性的， 但也可用于诊断、 疾病易感 性筛查和其他用途。
虽然在当前人类基因组的注释时 SNP 的染色体序号位置仍然可能发生改变， 但是 SNP 识别信息 ( 如可变等位基因和对 SNP 指定的侧翼核苷酸序列 ) 将保持相同。本领域技 术人员会很容易认识到， 个体的核酸中本发明的表 1、 3 和 11 中所示的一个或多个 SNP 中存 在的核苷酸的分析可以使用对于表 1、 3 和 11 中所列的 SNP 的 rs ID 的公开序列信息通过 任何能够确定多态性位点中存在的核苷酸的方法或技术进行。 从任一核苷酸链或从两条核 苷酸链确定多态性中存在的核苷酸。 可以理解， 表 1、 3 和 11 中所描述的 BONJ 相关的 SNP 标志物和单倍型可以与本文所 描述的相同 BONJ 相关基因或基因座中的其它多态性相关。标签 SNP 是可以用作很多其他 SNP 的代替物的基因座。 因为仅基因座的亚群需要基因分型， 标签 SNP 的使用大大地提高了 相关性研究的能力， 而同时保持好像已经对大量 SNP 进行基因分型一样的信息和能力。这 些与本发明的表 1、 3 和 11 所列的 SNP 标志物相关的其它多态性位点可以同样地用作生物 标志物或者甚至更可用作解释观察到的如本文所述的 SNP 标志物和单倍型的 BONJ 相关性 的致病性变异。
本文还描述了由表 1、 3 和 11 所列的基因编码的分离的肽和多肽， 包括本文公开的 多态性位置 ( 如 SNP)。 在一个实施方案中， 肽和多肽是用来鉴别治疗 BONJ 的药物的有用筛 选靶标。
识别参与颌骨坏死的基因
这里描述的是识别参与 BONJ 的基因的方法。为识别这类基因， 对来自国际单体型 项目 (International Hapmap project) 的单倍型标签 SNP 进行检查以构建有意义的单倍 型。根据与药物反应或疾病、 已知的或潜在的功能效应 ( 即非同义 cSNP) 和等位基因频率 正相关的公开报道， 对用于研究的 SNP 进行选择。由于具有相同的等位基因频率的 SNP 通 常是完全连锁不平衡的， 选择具有变化的等位基因频率的 SNP 以获取更大部分的基因变异 性。
在识别参与 BONJ 的基因和 SNP 的典型方法中， 分析了被认为在破骨细胞生成、 破 骨细胞分化和骨再吸收、 骨矿物质密度 (BMD) ； 患有 BONJ 的患者的破骨细胞介导的骨再吸 收组织及侵袭性牙周炎中发挥作用的基因和 SNP。 例如， 在表 1 中列出的基因是被认为破骨 细胞生成、 破骨细胞分化和骨吸收、 骨矿物质密度 (BMD) ； 在患有 BONJ 患者的组织中的破骨 细胞介导的骨再吸收及侵袭性牙周炎中发挥作用的基因和 SNP。这些基因在下面描述。
破骨细胞相关受体 (OSCAR)( 其在破骨细胞谱系细胞上特异表达 ) 调节破骨细胞 生成 ((Kim 等， J Exp Med 195 ： 201-209， 2002)。OSCAR 可能是破骨细胞分化的重要骨特异 性调节因子。该基因已发现编码不同同种型的多个可变剪接转录变异体。
已确认 OSCAR 基因中的变异体 (Hallman 等， Metabolism53 ： 1184-1191， 2004)。 OSCAR 基因的 5′侧翼 ( 启动子 ) 区域的 -2322 的 SNP A ＞ G 显示出与绝经后妇女中骨矿 物质密度 (BMD) 的显著相关性 (Kim 等 J Bone Miner Res.20 ： 1342-1348， 2005)。
组织蛋白酶 K 是参与骨重建和再吸收的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。该蛋白质 ( 其 是肽酶 C1 蛋白家族的成员 ) 主要在破骨细胞中表达。然而， 编码的蛋白质也在人乳腺癌 的主要部分中表达， 其中它可能促进肿瘤的侵袭性。这一基因中的突变是致密性成骨不 全症 (pycnodysostosis)( 以骨硬化和身材矮小为特征的常染色体隐性遗传疾病 ) 的原 因 (Saftig 等， Proc Natl Acad Sci USA 95 ： 13453-13458， 1998 ； Haagerup 等， Eur J Hum Genet8 ： 431-436， 2000)。
在 Hansen 等进行的最近研究中 (Hansen 等， Virchows Arch.449(4) ： 448-454， 2006)， 对患有 BONJ 的病人的破骨细胞介导的骨再吸收组织中的半胱氨酸蛋白酶组织蛋白 酶 K 的作用进行了研究。该研究证实了患有 BONJ 的患者中破骨细胞数量的增加。虽然已 知二膦酸盐降低破骨细胞的功能， 但是这些发现表明在相应损伤中破骨细胞在骨破坏机制 中的关键参与。Hansen 等还表明， 与对照组织相比， 在感染性射线性骨坏死和 BONJ 中破骨 细胞的数量和活性显着提高。可以得出结论， 破骨细胞参与负责颌骨坏死中的骨破坏的过 程。 TGFB 是控制多种细胞类型的增殖、 分化和其他功能的多功能肽。由 TGFB1 基因编 码的 TGF β1 是人类骨骼中最丰富的生长因子。TGF β1 由成骨细胞生成并抑制破骨细胞 的增殖和活性。它还起到骨质疏松症易感性的调节因子的作用， 并表明在体外影响成骨细 胞和破骨细胞的功能 (Massague J 和 Chen YG.， Genes&Dev.14 ： 627-644， 2000 ； Langdahl 等， Bone 32 ： 297-310， 2003)。
人 巨 噬 细 胞 特 异 性 集 落 刺 激 因 子 (CSF-1) 连 同 NF-KB 配 体 受 体 激 活 因 子 (RANKL) 参与单核细胞亚群的活化和分化成破骨细胞 (Rabello 等， Biochem Biophys Res Commun.347 ： 791-796， 2006 ； Komano 等， Arthritis Res Ther.8 ： R152， 2006)。日本人群的 最近的一项研究显示在侵袭性牙周炎和位于 CSF1 中的三个多态性之间的正相关性。
体内破骨细胞生成是由表达膜结合的 NF-kB 配体受体激活因子 (RANKL) 的成骨 / 基质细胞的作用调节的。RANKL(TNF 家族的成员 ) 是对于破骨细胞生成的诱导必不可少的 细胞因子。 成骨细胞和基质细胞都产生这一细胞因子并且信号由定位在破骨细胞祖细胞表 面上的称为 RANK 的特定受体转导 (Boyle 等， Nature， 423 ： 337-342， 2003)。RANKL 和 CSF-1 对于单核细胞的刺激和分化成破骨细胞是必不可少的 (Komano 等， Arthritis Res Ther 8 ： R152， 2006)。研究表明， 破骨细胞参与骨侵蚀且通过控制 RANKL 抑制破骨细胞生成可以在 关节炎实验模型中限制骨破坏 (Walsh 等， Immunol Rev.208 ： 228-251， 2005)。 Koh 等 (2006) 确认了 RANK 的两个新的多态性 (+34863G ＞ A 和 +35928insdelC)， 其可以是绝经后妇女低 骨密度的可能遗传因子 (Koh 等， Osteoporos Int2006)。在另一项 Hsu Yh 等， 2006 进行的 研究中， 显示了男性 BMD 和 RANK 的外显子 7(Ala192Val) 和 RANKL 基因的 5′ UTR 的多态性 的显著正相关性 (Hsu 等， Hum Genet 118 ： 568-577， 2006)。
COL1A1 基因被认为是骨质疏松症发病机理的重要功能候选基因， 因为 I 型胶原蛋 白是骨的主要蛋白质， 并且该基因的突变引起称为成骨不全症的综合征 ( 其特征在于 BMD 下降和骨脆性增加 )(Boyde 等， Calcif Tissue Int.64 ： 185-190， 1999)。遗传变异可以通 过影响 COL1A1 基因的代谢在骨质疏松症或骨质疏松性骨折中发挥重要作用。Yamada 的研 究 (Yamada 等， Hum Biol.77 ： 27-36， 2005) 表明， 在 COL1A1 基因启动子中 -1997 处的 G ＞ T 多态性与西班牙绝经后妇女的腰椎的 BMD 相关。另一项研究表明， 影响 COL1A1 基因第 一内含子中 Sp1 转录因子结合位点的 G ＞ T 多态性， T 等位基因与骨质疏松症相关 (Grant 等， Nat Genet.14 ： 203-205， 1996)。Mann V 等进行的功能分析研究中表明， Sp1 多态性的 T 等位基因与转录增加和 COL1A1 的 mRNA 和蛋白质产生的异常增加相关 (Mann 等， J Clin Invest.107 ： 899-907， 2001)。Ralson SH 和同事在超过 20,000 人参加的大型前瞻性荟萃 分析研究 (GENOMOS) 中表明 Sp1 多态性的纯合子 T 等位基因与 BMD 和偶发脊椎骨折之间的 相关性 (Ralston 等， PLoS Med.3 ： e90， 2006)。
IL-6 是在骨再吸收中起关键作用的多效性细胞因子。Ferrari 等证明 IL-6 基因 启动子区域中 -174 的 G ＞ C 多态性在体内发挥功能效应并影响基因转录和引起 IL-6 循环 水平的下降 (Ferrari 等， Arthritis Rheum.44 ： 196-201， 2001)。还表明， IL-6 启动子区 域 -572 和 -174G 的两个等位基因变异体的单倍型与骨再吸收标志物相关 (Ferrari 等， J Clin Endocrinol Metab.88 ： 255-259， 2003)。
维生素 D 受体 (VDR)， 一种类固醇受体， 起到应答类固醇维生素 D 激素的转录因子 的作用。维生素 D 通过与维生素 D 受体的相互作用调节骨细胞分化、 成骨细胞分化、 骨转换 和钙稳态 (Haussler 等， J Bone Miner Res.13 ； 325-349， 1998)。
VDR 基因是骨质疏松相关研究的第一批基因之一。由 Fang 对 6418 个人进行了 VDR 及其与骨质疏松相关性的大的和广泛的研究 (Fang 等， Am J Hum Genet.77 ： 807-823， 2005)。作者采用单倍型标签 SNP 途径并分析了 15 个单倍型标签 SNP， 且表明在 VDR 基因 的启动子和 3′ UTR 区中的单倍型等位基因与骨质疏松性骨折的风险增加相关， 携带这两 个风险等位基因的受试者发生骨折的风险 (48％ ) 显著高于对照个体。风险单倍型的组合 导致由转录下降和 mRNA 降解增加引起的更低的 VDR 的 mRNA 表达水平 (Fang 等， Am J Hum Genet.77 ： 807-823， 2005)。
侏儒症相关转录因子 2(RUNX2)， 又称为 CBFA1 基因， 编码结合成骨细胞特异性顺 式作用元件并在成骨细胞分化的调节和诱导成骨细胞的特定转录物 ( 如编码骨钙蛋白的 转录物 ) 中发挥关键作用的蛋白 (Ducy 等， Cell 89 ： 747-754， 1997 ； Schinke 等， J Biol Chem.274 ： 30182-30189， 1999)。几项研究报道了 RUNX2 多态性与 BMD 的相关性。最近的 一项研究确信认了 RUNX2 基因和启动子 (P1 和 P2) 内的 16 个等位基因变异 (Doecke 等， J Bone Miner Res.21 ： 265-273， 2006)。多态性位于启动子或第一外显子的聚丙氨酸和聚谷 氨酰胺重复序列中。 在该项研究中表明， 在报告基因分析中启动子区域的多态性影响 RUNX2 转录， 并与 BMD 相关。还表明， 影响 BMD 的 RUNX2 基因的多态性是连锁不平衡的。
在确认任何 BONJ 相关的基因后， SNP 被标记 ( 对于各基因约 10 个 )， 且然后分型以 建立单倍型。分析显示为统计学显著的基因的单个 SNP。使用任何合适的提取方法， 例如， 采用 Qiagen 公司的 QIAamp DNA 血液试剂盒 (Valencia， CA) 从全血分离基因组 DNA(gDNA)。 分离的 gDNA 保存于 -20℃ ( 例如， 在带条码的 1.5 毫升微量离心管中 )。使用任何合适的方法 ( 如使用 96 孔板读板仪的分光光度方法 ) 定量分离的 gDNA。使用液体操作机器人系 统或其他合适的系统， 将各参与者的等份原 gDNA 样品从 1.5μL 的微量离心管转移到带条 码的 96 孔微量滴定板中， 并标准化为 20ng/ul。原 gDNA 样品包含用于识别的条码， 如 96 孔 板所做的一校。使用 Freezerworks 5.3 版软件管理冰箱内的所有样品。该软件可以允许 精确示踪冰箱内每个样品位置的和剩余的样品体积。
表1： 二膦酸盐相关颌骨坏死的候选基因
在典型的方法中， 使用三种基于 PCR 的基因分型方法中的一种。通过使用合适 的引物设计软件进行 PCR 引物选择和条件的优化 ( 例如， 寡核苷酸引物分析软件 (Oligo Primer Analysis Software) 第 6 版 )。
在典型的方法中， 用于基因分型的基因分型平台是 TaqMan。ABI Taqman Prism 7900HT Sequence Detection System 是具有高通量能力的第二代实时定量 PCR 系统， 其可 以使用 96 或 384 孔微滴定板和微流控卡 (Micro Fluidic Card)。该系统还配备了用于已 知 SNP 的大规模基因分型的新软件， 其以成本低产生可靠和可重现的结果。应用生物系统 公司 (Applied Biosystems)(Foster City， CA) 拥有超过 180,000 个验证的 TaqMan SNP 基因分型分析方法， 及用于非编码 SNP160 万个预设计的分析方法。也可以开发用于他们分 析文库中没有的 SNP 的定制分析方法。
焦磷酸测序技术是涉及与多个底物和酶一起， 测序引物与单链、 PCR 扩增的 DNA 杂 交的实时 DNS 测序技术。通过使用 Pyrosequencing 提供的特殊引物设计软件设计测序引 物。当通过 DNA 聚合酶将核苷酸掺入到核酸链中时， 释放出等摩尔量的无机焦磷酸， 随后由 ATP 硫酸化酶转化为 ATP。ATP 驱动萤光素酶反应， 其中萤光素分子被氧化后以产生光。该 光被电荷耦合器件照相机捕获并在热解图上作为峰观察到。焦磷酸测序反应生成 20-30bp 的序列数据， 并允许以＞ 99％的准确性和可重复性进行基因分型。PSQ HS 96A 系统支持高 达每工作日 3000 个基因型的通量。在另一种方法中， 通过限制性片段长度多态性 (RFLP) 分析实现基因分型。 鉴别具有 BONJ 易感性的患者
本发明提供了用于鉴别在二膦酸盐施用后易患 BONJ 或具有 BONJ 风险的患者或受 试者 ( 如人类 ) 的方法。在典型的实施方案中， 具有 BONJ 风险的个体是体内鉴定出选自于 表 1、 3 或 11 中的一个或多个 BONJ 相关多态性位点和 / 或在他们的血清中检测出表 4 中所 列的一个或多个蛋白 ( 或其前体、 成熟形式或裂解片段 ) 的表达 ( 例如， 超表达 ) 的个体。 在其它实施方案中， 与表 1、 3 或 11 中的 SNP 和单倍型相关的多态性和 / 或表 4 中所列的蛋 白质 ( 或其前体、 成熟形式或裂解片段 ) 的血清表达可以用于 BONJ 的风险评估。作为二磷 酸盐治疗候选者的患者进行特定基因或 SNP 或蛋白质存在的筛选。测试为阳性的患者可以 考虑替代的治疗或在二磷酸盐疗法之前另外完成完整的牙科治疗。
用于鉴别在二膦酸盐治疗后易患 BONJ 的患者的典型方法包括从受试者获得样 品； 分析样品以确定具有作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的 SNP 的至少一个基因、 由该基因编码的蛋白质或作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的至少一个 SNP 的存在 ； 和将样品中作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的该至少一个基因、 蛋白质或至少一个 SNP 的存在与受试者的 BONJ 易感性相关联。可获得任何合适的样品， 例如， 血液、 血清、 血 浆、 唾液等。如实施例中所描述的， SNP rs12458117(SEQ ID NO ： 1) 和 rs243865(SEQ ID NO ： 2) 显示在患有 BONJ 的患者中以比未患 BONJ 的患者更高的比率存在。因此， 在鉴别二 膦酸盐施用后易患 BONJ 或具有 BONJ 风险的患者或受试者 ( 例如， 人类 ) 的方法的一个实 施例中， 分析受试者样品以确定 SNP rs12458117(SEQ ID NO ： 1) 和 rs243865(SEQ ID NO ： 2) 的存在。该至少一个 SNP 可以是表 1、 表 3 或表 11 中所示的 SNP。例如， 该至少一个 SNP 可以是 rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)、 rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 或 rs11730582(SEQ ID NO ： 26)。在一些实施方案中， SNP
包括 rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)、 rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 和 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 中的二个、 三个、 四个或所有五个 SNP。 在一些实施方案中， 该至少一个 SNP 包括 rs2073618(SEQ ID NO ： 24)、 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 或这两者。可以使用任何合适的方法分析受试者的样品中这些 SNP 的存在， 包 括微阵列的使用。此外， 本领域已知用于 SNP 分型的几种方法和不同的基因分型平台 ( 如 TaqMan、 Pyrosequencing、 RFLP、 Direct Sequencing 等 )。微阵列或芯片通常包含数千到 百万或稍超过一百万的 SNP( 其用于基因分型 )。
替代分析受试者样品中特定 SNP 的存在或在此之外， 可以分析受试者样品以确定 特定 SNP 存在于其中的基因或由特定 SNP 存在于其中的基因编码的蛋白质的存在。该至少 一个基因可以是在表 1、 表 3 或表 11 中所示的一个或多个基因。 该至少一个基因可以包括， 例如， COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN 的基因。 在一些实施方案中， 该基因包括 COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 和 OPN 中的二个、 三个、 四个或所有五个基因。在一些实施方案中， 该至少一个基 因包括 OPG、 OPN 或这两者。分析样品中基因或蛋白质的存在的方法是本领域公知的， 并且 在方法学论文中有描述， 如 Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 3rd ed.， vol.1-3， ed.Sambrook 等 Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.， 2001 和 Current Protocols in Molecular Biology， ed.Ausubel 等 Greene Publishing 和 Wiley-Interscience， New York， 1992( 定期更新 )。这些方法包括用于验证基因存在的 PCR 技术和用于检测不同细胞或组织中蛋白质的存在的实时 PCR。
治疗患有 BONJ 的患者
本文描述了治疗患有 BONJ 的患者的方法。一些二膦酸盐倾向于具较低的副作用 如 BONJ。例如， Aredia 比 Zometa 引起 BONJ 的可能性更小。因此， 表达与 BONJ 相关的 特定基因的患者可以用较小可能引起 BONJ 的药物治疗。例如， 将不使用 Zometa 降低其 使用频率和 / 或减少其用量。在另一个实施例中， 将只使用 Aredia
试剂盒
本文描述了用于鉴别二膦酸盐施用后易发生 BONJ 的受试者的试剂盒。用于鉴别 二膦酸盐施用后易发生 BONJ 的受试者的体外测试试剂盒 ( 如试剂套装 ) 包括试剂、 材料和 评估一个或多个生物标志物 ( 如核酸、 蛋白质 ) 的方案， 及说明书和任选地将受试者的生物 标志物数据与来自健康受试者和患病受试者的生物标志物数据进行比较以进行风险评估、 BONJ 的诊断或预后的软件。试剂盒可用的试剂和材料包括， 但不限于本文所功述的 PCR 引 物、 杂交探针和引物 ( 例如， 标记的探针或引物 )、 等位基因特异性寡核苷酸、 用于 SNP 标志 物基因分型的试剂、 用于标记分子的检测的试剂、 限制性内切酶 ( 如， 用于 RFLP 分析 )、 DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶、 DNA 连接酶、 标志酶、 微阵列、 结合改变的或未改变的 ( 天然的 )BONJ 风 险基因编码的多肽的抗体、 用于扩增选自于表 1、 3 或 11 中的一个或多个 BONJ 风险基因的 核酸片段以用于分析该一个或多个 BONJ 风险基因或其片段的核酸序列的手段或用于分析 BONJ 风险基因编码的多肽的一个或多个氨基酸残基的序列的手段等等。
用于鉴别二膦酸盐施用后易发生 BONJ 的患者的典型试剂盒包括具有附着于其上 的多个核酸的固体载体 ( 例如核酸阵列 )、 其中至少一个 ( 例如， 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个 ) 核酸特异性地与具有引起 BONJ 或 BONJ 易感性的 SNP 的基因杂交 ； 检测试剂和使用说 明。通常， 固体载体具有两个或更多个 ( 例如、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个 ) 附着于其上的核酸， 它们特异性地与两个或更多个 ( 例如、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个 ) 具有作为 BONJ 易感性 的标志物的 SNP 的基因杂交。在一个实施方案中， 试剂盒包括用于检测 BONJ 相关的特定基 因和 SNP 的表达的血液测试和 / 或唾液测试。在另一个实施方案中， 用于诊断或预测 BONJ 易感性的试剂盒包括用于检测个体的核酸中存在于选自于表 1、 3 或 11 中的一个或多个 SNP 标志物中的核苷酸的引物和试剂。 使用本文所述试剂盒获得的信息可以用于优化患有 BONJ 或疑似患有 BONJ 的个体的治疗。
试剂盒的另一个实施例包括用于检测其在血清中的表达可用于评估个体发生 BONJ 的风险的一个或多个蛋白质 ( 表 4 中所列的蛋白质、 或者其前体、 成熟形式或裂解片 段 ) 的存在的试剂。这种试剂盒可以包括进行例如 Western 印迹或 ELISA 必需的试剂和说 明。
实施例 1- 对于 SNP 的等位基因频率确定
方法
使用市售试剂盒 (Qiagen DNA Blood Isolation Kit， Qiagen， Valencia， CA) 从 全血中的淋巴细胞分离基因组 DNA。用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳方法定量分离的 DNA 样品并标准化到 20ng/ul。
通过 PCR 和通过基于荧光的 TaqMan (Applied Biosystems， FosterCity， USA) 分型方法 (De la Vega 等 Mutat Res.573(1-2) ： 111-135， 2005) 对于两个等位基因 SNP， 17 号染色体 COL1A1 基因 SNP[A/C]， dbSNP ID(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15) 和 18 号染色体 TNFRSF11A 基因 SNP[A/G]， dbSNP ID(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1)， 进行基因分型。
从 Applied Biosystems， Foster City， USA 购 买 TaqMan 基 因 分 型 分 析 探 针 [ 用 于 17 号 染 色 体 COL1A1 基 因 SNP[A/C]， dbSNP ID(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15) 的 C__7477174_30， 和用于 18 号染色体 TNFRSF11A 基因 SNP[A/G]， dbSNP ID(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1) 的 C___31393804]。探针是由 ABI(Applied Biosystems) 设计用于基因分型的荧 光染料 (VIC and FAM) 标记的引物。
初步结果
对 六 个 样 品 进 行 了 上 述 两 个 SNP[17 号 染 色 体 COL1A1 基 因 SNP[A/C]， dbSNP ID(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15) 和 18 号 染 色 体 TNFRSF11A 基 因 SNP[A/G]， dbSNP ID(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1)] 的基因分型后， 确定两个 SNP 的小等位基因频率 (MAF) 为 17％。
SNP[A/C]， dbSNP ID(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15)， COL1A1 基因 C 等位基因＝ 17％
SNP[A/G]， dbSNP ID(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1)， TNFRSF11A 基因 G 等位基因＝ 17％
BONJ 与 dbSNP ID(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15) 和 dbSNP ID(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1) 之间的相关性是统计显著的。
实施例 2-SNP 的基因分型
从 50 个受试者， 6 例 BONJ 患者和 45 例对照 ( 未患 BONJ 的患者 ) 的血液样品的 淋巴细胞分离基因组 DNA， 并进行 4 个单核苷酸多态性 (SNP) 的基因分型 ： CYP2C8 基因的 dbSNP ID(rs1934980)(SEQ ID NO ： 13) 和 rs1934951(SEQ ID NO ： 14))、 COL1A1 基因的 dbSNP ID(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15) 和 TNFRSF11A 基因的 dbSNP ID(rs12458117)(SEQ ID NO ：1)。
实施例 3- 候选基因 SNP 的 BONJ 相关性的分析
回顾了佛罗里达大学 (UF) 和相关的退伍军人管理局医疗中心 (VAMC) 的医疗和牙 科图表。如表 2 中所示， 鉴定了患有 BONJ 的 27 名患者， 中位年龄 62 岁， 其中 19 名患有骨 髓瘤、 3 例患有前列腺癌、 2 名患有乳腺癌、 2 名患有头颈癌和 1 名患有肾细胞癌。有 21 名 男性。12 名患者顺序接受帕米膦酸和唑来膦酸治疗， 11 名接受唑来膦酸治疗和 3 名接受帕 米膦酸治疗。14 名患者具有血清肌酐浓度的适度增加。先前的化疗 / 放疗方案的平均数 为 3.5 人。9 名患者使用沙立度胺， 5 名患者使用硼替佐米。原发疾病状况如下 ： 12 名患者 处于临床缓解中， 5 名具有稳定疾病和 10 名具有渐进性疾病。8 名患者接受他汀类治疗和 6 名患有糖尿病。在诊断 BONJ 之前二膦酸盐 (BP) 治疗的中位长度为 28 个月。BONJ 在 21 名患者中涉及下腭骨， 4 名中涉及上颌骨和 2 名中涉及两者。最频繁的表现是疼痛、 肿胀和 骨外露 ( 图 1)。10 名患者具有过往牙科过程。在这些患者接受治疗的 3 个中心间的 BONJ 发病率不同。 在其中所有患者患有骨髓瘤的门诊骨髓移植诊所中， 总发病率为 13％， 而对于 仅帕米膦酸总发病率为 4％。VAMC 中发病率为 4.2％， 而在 UF 的癌症中心诊所中发病率为 1.7％。在后两组中， 患者大多患有实体瘤。本文所描述的结果与更长治疗时间的 BONJ 的 发病率增加的报告是一致的， 且骨髓瘤患者比实体瘤更可能出现该并发症。本文所描述的 结果没有确定发生 BONJ 的其它特定预测风险因子。
表 2.BONJ 患者的人数学数据、 恶性肿瘤、 治疗和 ONJ 诊断时间
收集门诊观察的并且用 IV BP 治疗的骨髓瘤患者的血液样品。记录他们是否具 有证明的 BONJ。对已用 IV BP 治疗的 67 名骨髓瘤患者使用 5 个 SNP 进行基因分型， 其 中 8 例患有 BONJ ； 结果如表 2 所示。患有 BONJ 的患者与未患 BONJ 的患者相比较， 在2 个 SNP ： TNFRSF11A(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1) 和 MMP2(rs243865)(SEQ ID NO ： 2) 观 察 到 BONJ 患者有朝向更高优势比的趋势。两个 SNP 的携带者具有 50 ％的事件发生率， 而 那些没有携带任一 SNP 的受试者具有 7.9 ％的事件发生率。优势比 (95 ％置信区间 ) 为 11.6(1.34-100.8)。
表3： 5 个 SNP 及其与 BONJ 相关性的初步结果
BONJ 状态的蛋白质水平上的初步结果 ： 使用 Luminex’ s xMAP 技术， 分析这 67 名 患者的血清样品的几个已知参与骨稳态的因子的蛋白水平， 结果如以下表 4 中所示。研究 了甲状旁腺激素 (PTH)、 胰岛素、 TNF-α、 瘦素、 骨钙蛋白 (OC)、 骨保护素 (OPG)、 骨桥蛋白 (OPN) 和 IL-6。与对照相比， 在患有 BONJ 的患者中观察到显著更高的 (OPN) 血清水平 (p ＝ 0.037)。还注意到更高的 TNFα 水平 (p ＝ 0.06)。
表 4. 患有或未患 BONJ 的患者的蛋白质水平
这些结果表明， 基因 TNFRSF11A 和 MMP2 以及骨蛋白 OPN 明显参与破骨细胞的生 成、 再吸收和骨稳态。因此， 它们很可能涉及 BONJ 的病理生理学。
实施例 4- 与 BONJ 相关的遗传多态性 - 同龄组研究
病例报告表明， 并非所有的 BP 使用者都会发生 BONJ， 这表明个体之间的环境和 / 或遗传变异可能赋予 BONJ 发生的易感性或抗性。然而， 迄今为止只公布了几个 BONJ 的遗
传相关性研究。在全基因组相关性研究中， 只有细胞色素 P4502C8 基因 (CYP2C8) 表现出病 例和对照之间显著不同的分布 (Sarasquete 等， Blood， 112(7) ： 2709-12， 2008)。然而， BP 不是由 P450 酶代谢的， 且因此推测这种相关性是通过可能受 CYP2C8 影响的其他代谢途径 受 (Sarasquete 等， Blood， 112(7) ： 2709-12， 2008)。已提出基质金属蛋白酶 2(MMP2) 基因 为 BONJ 发生的候选基因， 因为 BP 治疗与心房纤颤相关并且 MMP2 是唯一已知与骨骼异常和 心房纤颤相关的基因 (Lehrer 等， J Oral Maxillofac Surg， 2009， 67(1) ： 159-61， 2009)。
本研究的目的是研究几个基因 ( 包括 CYP2C8、 COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPN 和 TNF) 中 的遗传多态性是否与在每月 IV BP 治疗的多发性骨髓瘤 (MM) 的患者组中发生 BONJ 的风险 相关。
方法概述
接受 IV BP 治疗的多发性骨髓瘤 (MM) 患者在一年时间内入组。用已知的可接受 的标准鉴别 BONJ， 并收集所有患者的人口学和临床数据。使用外周血对 7 个被认为与药物 代谢或骨代谢相关的基因上的 10 个单核苷酸多态性 (SNP) 进行基因分型。
结果概述
78 位患者入组和其中 12 名患有 BONJ。发生 BONJ 的中位时间为 28 个月。单因 素和多因素分析揭示了 BONJ 与吸烟 (P ＝ 0.017) 之间以及与唑来膦酸治疗之间 (P ＝ 0.00029) 的显著相关性。用 5 个 SNP 鉴定 BONJ 患者中与非 BONJ 患者相比的较高优势比 ： COL1A1(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15)、 RANK(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1)、 MMP2(rs243865) (SEQ ID NO ： 2)、 OPG(rs2073618)(SEQ ID NO ： 24) 和 OPN(rs11730582)(SEQ ID NO ： 26)。 当一起考虑所有 5 个 SNP 时， 基因得分＝ 5 的患者的事件发生率为 57％， 而基因得分＜ 5 的患者的事件发生率为 10％。调整的优势比为 11.2， 95％置信区间为 1.8-69.9 和 P 值为 0.0097。吸烟、 BP 治疗的类型及 COLA1、 RANK、 MMP2、 OPG 和 OPN 的综合基因型得分与进行 IV BP 治疗的 MM 患者中的 BONJ 显著相关。
方法
患者群体
招募进行静脉 BP( 唑来膦酸或帕米膦酸 ) 治疗的多发性骨髓瘤患者自愿参加人体 试验委员会 (Institution Review Board)(IRB) 批准的这一研究。这些患者签署知情同意 书， 并定期门诊随访。除了 MM 治疗， 患者还 IV 接受每月四次的帕米膦酸 90mg 或唑来膦酸 4mg。通过审查医疗记录验证人口统计和临床信息并做成图表以进行分析。某些生活习惯 因素， 如在过去任意时间的吸烟， 以及某些共病如糖尿病， 和以往使用过的药物等数据对于 所有患者都要收集。
如果以下三个特征都存在那么患者即被认为是患有 BONJ(American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons position paper， J Oral Maxillofac Surg， 65(3) ： 369-76， 2007) ： 1) 当前或以往的二膦酸盐治疗 ； 2) 已持续 8 周以上的颌面部区域骨暴露 ； 和 3) 颌骨无放射治疗史。随访期间记录口腔症状和主诉并进行恰当的治疗安排。所有的 BONJ 病例都是在佛罗里达大学的口腔医学门诊进行诊断。 每个病人提供一份血液样品进行 基因分型。
基因分型
根据他们在破骨细胞生成、 破骨细胞分化和骨再吸收中的潜在作用和以前的文献报道选择 7 个候选基因上的 10 个 SNP ：
COL1A1(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15) ；
RANK(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1) ；
CYP2C8(rs1934980 和 rs1934951)( 分别为 SEQ ID NO ： 13 和 14， )；
MMP2(rs243865)(SEQ ID NO ： 2) ；
OPN(rs11730582 和 rs28357094)( 分别为 SEQ ID NO ： 26 和 27) ；
OPG(rs2073618 和 rs3102735)( 分别为 SEQ ID NO ： 24 和 25) ； 和
TNF(rs1800629)(SEQ ID NO ： 28)。
使用市售试剂盒 (Qiagen DNA Blood Isolation Kit， Qiagen， Valencia， CA) 从 全血的淋巴细胞中提取基因组 DNA。 使用 TaqMan 基因分型方法或焦磷酸测序方法对多态 性进行基因分型 (Langaee 等 Mutat Res， 65(3) ： 369-76， 2007)。使用 Applied Biosystems 7900HT SNP 基 因 分 型 平 台 进 行 TaqMan 分 析。 用 于 COL1A1SNP G/T rs1800012(ID C____7477170_30)、 RANK SNP A/G rs12458117(ID C__31393804_10)、 CYP2C8SNP C/ T rs1934980(ID C____361427_10)、 CYP2C8 SNP A/Grs1934951(ID C____361409_1_) 和 MMP2 SNP C/T rs243865(ID C_3225943_10) 的 PCR 的 引 物 和 探 针 从 Applied Biosystems(Applied Biosystems， Foster City， USA) 购买。制备 384 孔板中各 5μL 的 反应物并根据制造商的建议进行检测和分析。其余的 SNP 使用 PSQ HS96A SNP 试剂套装 (Biotage AB， Uppsala， Sweden)( 根据需要可获得引物 ) 进行焦磷酸测序 (Langaee 等 Mutat Res， 65(3) ： 369-76， 2007)(Biotage， Uppsala， Sweden)。对于各个 SNP 通过对 5-10％随机 选取的重复样品进行基因分型验证基因型的准确度。
统计分析
需要时基线特征由 student’ s t- 检验或卡方检验进行比较。用具有一个自由度 的卡方检验评估等位基因频率对 Hardy-Weinberg 平衡 (HWE) 的偏离。显性遗传模式用于 单 SNP 相关性分析。用卡方检验比较携带者和非携带者之间的事件发生率。采用 Logistic 回归来评估 BONJ 的优势比， 使用野生纯合型作为参照组。
结果发现， 有 5 个 SNP 显示出 BONJ 的更高风险的趋势。然后基于各个受试者携带 的 5 个 SNP 中各 SNP 的不利等位基因 ( 与 BONJ 高风险相关的那些等位基因 ) 的数目构成 基因型评分。根据基因型评分数 < 或 > ＝ 5 的层级计算 BONJ 的粗发病率。
在多元逻辑回归中， 协变量如年龄、 性别、 种族、 吸烟史、 糖尿病、 BP 治疗类型和以 往治疗次数都包括在分析中。只有显著的 BONJ 预测子包括在最终的多元逻辑模型中。所 有统计分析采用 SAS 9.1 版 (SASInstitute， Cary， NC) 进行。P 值＜ 0.05 被认为是统计学 显著的。
发现
共有 78 名 MM 患者入组， 包括 12 名 BONJ 患者 (15.3％ )， 且其特征如表 9 所示。比 较两组患者 ： BONJ 组对所有其他接受 IV BP 治疗的患者。BONJ 组和 BP 组的中位年龄相似。 虽然 78 名患者多数为男性 (61.5％ )， 但是 50％的 BONJ 患者为女性。与 BP 组相比， 大多数 的 BONJ 患者为白种人。BONJ 患者没有非裔美国人。在该研究中， 3 个美籍西班牙人中的 2 个被诊断为患有 BONJ。然而， 这些差异没有一项是统计学显著的。
发生 BONJ 的中位时间为 28 个月， 但是， 这与整个组的 BP 治疗的中位长度没有不同。然而， 这一发现证实了之前公布的数据， 即 BONJ 通常在 BP 治疗超过 2 年后发生。
单因素分析显示 BONJ 与吸烟之间 (P ＝ 0.017) 以及与唑来膦酸治疗之间 (P ＝ 0.00029) 的显著相关性。这些显著相关在多因素逻辑回归分析 ( 表 10) 中仍然保持。
在该组中 7 个基因的十个 SNP 进行基因分型。 BONJ 的小等位基因频率和单变量优 势比如表 11 所示。BONJ 患者与未患 BONJ 的患者相比较， 且在 BONJ 患者中对于以下 5 个 SNP 中发现朝向较高优势比的趋势 ： OL1A1(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15)、 RANK(rs12458117) (SEQ ID NO ： 1)、 MMP2(rs243865)(SEQ ID NO ： 2)、 OPG(rs2073618)(SEQ ID NO ： 24) 和 OPN(rs11730582)(SEQ ID ON ： 26)。当一起考虑所有 5 个 SNP 时， 基因型评分为 5 或更高的 患者的事件发生率为 57％， 而那些基因评分低于 5 的患者的事件发生率为 10％。优势比为 11.8％， 95％置信区间为 2.2-63.9， 和 P 值为 0.0008。在针对吸烟状况和 BP 类型进行调整 后， 这 5 个 SNP 的基因型评分仍然保持为很强的 BONJ 独立预测子， 调整的优势比为 11.2， 95％置信区间为 1.8-69.9 和 P 值为 0.0097( 表 12)。基因型评分与吸烟史之间没有相互作 用， 其 p 值为 0.96。
解释
在该研究中， 接受 BP 治疗的 78 名 MM 患者中的 12 名被确认为 BONJ 患者， 相应的 BONJ 患病率为 15 ％。其他研究报告中已报道的患病率为 2.3-11 ％ (Reid， Bone， 44(1) ： 4-10， 2003)。在以往的研究中， 报道过 10％的患病率 (Katz 等， J Support Oncol， 7(1) ： 9-10， 2009)。但是， 所研究患者组包括多种恶性肿瘤患者如 MM、 乳腺癌和前列腺癌。患有 MM 的患者似乎比实体瘤患者更易发生 BONJ。
15％的 BONJ 患病率的发现显著高于最初在制造商发起的流行病学研究中报告的 0.1％至 1.8％的患病率， 并支持了提高 BP 使用的药物警戒性的主张 (Edwards 等， Lancet Oncol， 9(12) ： 1166-72， 2008)。
以往报道发生 BONJ 的平均时间为 26 个月、 不足 36 个月和更长时间 (Migliorati 等。Lancet Oncol， 7(6) ： 508-14)。
有趣的是， 与对照组的 38％相比， 75％的 BONJ 患者有吸烟史。这是独特的发现是 重要的， 因为已知吸烟在与牙周疾病和非 BP 诱导的骨坏死相关的骨再吸收中发挥重要作 用。吸烟可能会导致骨中血管收缩和血栓形成增加， 从而导致可能作为骨坏死的病理生理 学基础的缺血状态 (Assouline-Dayan 等， Semin Arthritis Rheum， 32(2) ： 94-124， 2002)。 在两组中没有发现糖尿病状态的不同， 正如其他人已提出的那样 (Khamaisi 等， J Clin Endocrinol Metab， 92(3) ： 1172-1175， 2006)。
有趣的是， 19 个非裔美国人患者中没有人患 BONJ 和 3 个美籍西班牙人中的 2 个患 有 BONJ。这一结果有助于研究在不同种族 / 人种背景人口中的 BONJ 发病率。
与血栓形成和凝血相关基因的多态性如因子 V Leiden 突变和编码药物转运蛋白， P- 糖蛋白， 的多耐药性基因 1(ABCB1) 的多态性已分别结合股骨头的无血管 ONJ 和类固醇 诱导的 ONJ 进行了描述 (Bjorkman 等， Arch Orthop Trauma Surg， 125(1) ： 51-5， 2005 和 Asano 等， Pharmacogenetics， 13(11) ： 675-82， 2003)， 然而， 截至目前 CYP2C8 的多态性是 在与 BONJ 相关的文献中发表的唯一遗传研究 (Sarasquete 等， Blood， 112(7) ： 2709-12， 2008)。
研究了细胞色素 P450CYP2C8 的多态性以及与骨代谢和破骨细胞的活性 ( 其被认为是 BP 的主要作用 ) 高度相关的基因的 SNP 之间的相关性。以往报道的 BONJ 和细胞 色素 P450 CYP2C8 的多态性之间的相关性未得到证实 (Sarasquete 等， Blood， 112(7) ： 2709-12， 2008)。这可能是由于不同的遗传背景和其他环境因素造成的。然而， 观察到 COL1A1rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 RANK rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 MMP2rs243865(SEQ ID NO ： 2) 和 OPN rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 的携带者发生 BONJ 的优势比高于 1.5。 还发 现， 综合基因型评分＞＝ 5 的患者在这一研究的患者退休中具有高 11 倍的发生 BONJ 的优 势比。
这些数据支持了是多个基因而不是一个基因参与 BONJ 易感性的假设。也表明所 有的 5 个基因参与破骨细胞生成、 破骨细胞分化、 骨再吸收或骨矿物质密度， 这支持了 BONJ 是由 BP 治疗的破骨细胞抑制效应导致的骨重建和骨代谢停止引起的假设 (Van Beek 等 Bone， 30(1) ： 64-70， 2002)。
这些发现可显著提高事先预测 BONJ 风险的能力， 并且对于使用 BP 治疗的患者的 治疗有一定影响。该研究显示 COLA1、 RANK、 MMP2、 OPG 和 OPN 的 SNP 的综合基因型评分与 接受 IV BP 治疗的 MM 患者中发生 ONJ 的风险相关。该发现可用于通过鉴别携带这些变异 体的患者以改进治疗方案， 旨在降低 ONJ 的发病率。
表 9. 患有和未患 BONJ 患者的特征
缩写 ： BONJ， 二膦酸盐诱导的颌骨坏死 ； W， 白种人 ； AA， 非裔美国人 ； H， 美籍西班牙 人； P， 帕米膦酸 ； Z， 唑来膦酸 ； THAL， 沙立度胺。 *
Z/P 表示患者接受唑来膦酸， 然后很快转换为帕米膦酸， 而 P/Z 表示相反。
表 10.BONJ 潜在风险因子的多变量逻辑回归分析
表 12.BONJ 优势比 ： 基因型评分≥ 5 对＜ 5 的患者30CN 102812132 A说明书p值 0.0008 0.009728/28 页BONJ 优势比 (95％置信区间 ) 基因型评分≥ 5 基因型评分≥ 5
§未调整 调整 §11.81(2.18-63.9) 11.20(1.80-69.86)对于吸烟史和所使用的 BP 类型进行调整
其他实施方案
本申请要求 2010 年 1 月 6 日提交的美国临时申请序列 No.61/292,730 的利益， 其全部公开内容通过引用特此引入本文， 包括所有图、 表、 氨基酸和核酸序列 ； 本申请也是 2009 年 7 月 7 号提交的国际申请 No.PCT/US2009/049767 的部分继续申请， 其要求 2008 年 7 月 7 日提交的美国临时申请 No.61/078,680 的利益， 其各个的公开内容通过引用特此引入 本文， 包括所有图、 表、 氨基酸和核酸序列。
【发明领域】
本发明一般地涉及分子生物学、 遗传学和医学领域。 更特别的是， 本发明涉及用于 评估接受或被开具二膦酸盐处方的人中颌骨坏死风险的遗传多态性与血清中蛋白质的表 达。
发明背景
二膦酸盐类在许多癌症患者处方用于减轻骨痛、 骨破坏及高钙血症， 或在骨质疏 松个体中处方用于减少骨损失。二膦酸盐类是抑制破骨细胞 ( 骨再吸收细胞 ) 的活性和 功能并扰乱成骨细胞 ( 骨形成细胞 ) 的分化的一类药物。二膦酸盐有两种类型 ： 含氮和 非含氮的二膦酸盐。二膦酸盐类抑制骨再吸收， 并因此通过抑制破骨细胞的募集和活性 因而缩短其寿命而抑制骨重建。IV 二膦酸盐类主要用于治疗与多发性骨髓瘤和其他恶性 肿瘤的骨转移相关的骨侵蚀和高钙血症。口服二膦酸盐类也用来防止骨损失和处方用于 骨质疏松症患者。2003 年 Marx 首次报道了接受二膦酸盐帕米膦酸 (Aredia Pharmaceuticals) 和唑来膦酸 (Zometa Novartis Novartis Pharmaceuticals) 的患者颌骨疼痛问题。从那时起， 一些作者报道了另外的案例并且很多牙科专家尤其是口腔和上颌面外科 医生已经确认了许多未公布的案例。 二膦酸盐类通常在数以百万计的绝经后妇女中处方用于稳定由于骨质疏松症引 起的骨损失。骨质疏松症的治疗策略是抑制破骨细胞对松质骨 (trabecularbone) 的再
吸收， 从而保持其密度。为此， 开具口服二膦酸盐的处方并包括依替膦酸盐 (Didronel Procter 和 Gamble)、 利塞膦酸盐 (Actonel Procter 和 Gamble)、 替鲁膦酸盐 (Skelid Merck)。 更有效的二膦酸盐静脉内施 Sanofi-Synthe Lab Inc) 和阿伦膦酸盐 (Fosamax用并表明稳定沉着于骨中的转移癌 ( 主要是乳腺癌和前列腺癌 )， 并治疗多发性骨髓瘤的 骨再吸收缺陷和纠正严重的高钙血症。它们是帕米膦酸和唑来膦酸。除了本文提到的药物 外， 已知一些其他的二膦酸盐是在美国还未广泛使用或仍然处于实验阶段。
最近的报告表明， 二膦酸盐的使用和颌骨坏死之间有相关性。二膦酸盐引起的颌 骨坏死 (BONJ) 是患者亚群中的病态骨障碍。二膦酸盐使用者中表现出这种并发症的生理 机制仍然未知。因为与他们的日常活动和牙齿 ( 它们指导牙周膜周围的牙周骨重建 ) 的存 在相关， 颌骨具有比其他骨骼更大的血液供应和更快的骨更新率， 因此二膦酸盐高度集中 于颌骨中。与慢性侵入性牙科疾病和治疗及骨上的薄粘膜关联， 这种二膦酸盐的解剖学集中导致这种情况只在颌骨中出现。因此， 颌骨中外露的骨是这些二膦酸盐类对骨的日常重 建和更新发挥作用的直接结果。成骨细胞和骨细胞存活仅约 150 天。如果在其死亡时， 矿 物基质没有被破骨细胞 ( 其释放骨形态发生蛋白和胰岛素样生长因子的细胞因子以从干 细胞群诱导新的成骨细胞 ) 再吸收， 骨单位变成非蜂窝状的和坏死的。骨内的小毛细血管 消退， 因而骨变成无血管的。 上覆粘膜的自发破坏、 某些形式的损伤或颌骨的侵入性手术通 常会导致这种坏死的骨暴露， 其之后未能痊愈。
观察到的和报道的大多数 BONJ 病例是 IV 二膦酸盐治疗的患者， 但也报道几个与 口服二膦酸盐相关的病例 (Reid， Bone， 44(1) ： 4-10， 2009)。虽然高达 13％的接受 IV 二膦 酸盐治疗的患者发生 BONJ， 口服二膦酸盐的估计值是 1 ∶ 10,000 至 1 ∶ 100,000。虽然对 照的、 随机的、 前瞻性的、 盲法的研究来证明二膦酸盐治疗与骨外露之间的特定因果关系是 不可能的， 药物帕米膦酸、 唑来膦酸和更少用的阿伦膦酸盐已显示出直接的相关性。
大多数 BONJ 病例是在具有骨转移的癌症患者中诊断出来的。然而， 在骨质疏松症 口服治疗后也报道了 BONJ 病例。 因此， 总人口中的一大部分 ( 例如， 绝经妇女和癌症患者 ) 可能处于风险之中。
发明概述 本文描述了用于确定患者的 BONJ 易感性的遗传基础的方法， 用于鉴别在二膦酸 盐施用后易感 BONJ 的患者的方法和试剂盒， 和用于使医生根据 BONJ 患者的基因组 ( “个性 化 / 定制医疗” ) 和血清蛋白表达制订治疗方案的工具。 本文还描述了患者的生物液 ( 如血 清、 唾液 ) 中的表达可能与 BONJ 相关并且可用已知方法检测 ( 例如， Western 印迹、 ELISA 等等 ) 的蛋白质。本文所述的方法包含使用候选基因途径鉴别造成 BONJ 发生的基因。采 用了病例对照设计的研究， 其包括研究患有 BONJ 和未患 BONJ 的患者中基因 ( 例如， 表达和 特定的 SNP) 和血清蛋白表达的效应。
因此， 本文描述了鉴别二膦酸盐施用后易患 BONJ 的受试者的方法， 该方法包括以 下步骤 ： (a) 从受试者获得样品 ； (b) 分析样品以确定具有作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物 标志物的 SNP 的至少一个基因、 由该至少一个基因编码的蛋白质或作为 BONJ 或 BONJ 易感 性的生物标志物的至少一个 SNP 的存在 ； 和 (c) 将样品中作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物 标志物的基因、 蛋白质或 SNP 的存在与受试者的 BONJ 易感性相关联。样品可包括， 例如， 血液、 血清、 血浆或唾液。该至少一个基因可以是表 1、 表 3 或表 11 所示的基因， 且该至少 一个 SNP 可以是表 1、 表 3 或表 11 所示的 SNP。该至少一个基因可以包括， 例如， COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN。在一些实施方案中， 该基因包括 COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN 中 的二个、 三个、 四个或所有五个基因。在一些实施方案中， 该至少一个基因包括 OPG、 OPN 或 二者。该至少一个 SNP 可以是， 例如， rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)、 rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 或 rs11730582(SEQ ID NO ： 26)。 在一些实施方案中， 该 SNP 包括 rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)、 rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 和 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 中的 两个、 三个、 四个或所有五个 SNP。在一些实施方案中， 该至少一个 SNP 包括 rs2073618(SEQ ID NO ： 24)、 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 或这两者。 分析样品以确定具有作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的 SNP 的至少一个基因、 由该至少一个基因编码的蛋白质或作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的至少一个 SNP 的存在的步骤可以包括使用微阵列检测该至
少一个基因或至少一个 SNP 的存在
本文还描述了在易感 BONJ 且接受二膦酸盐治疗的受试者中防止 BONJ 的方法， 该 方法包括以下步骤 ： (a) 从受试者获得样品 ； (b) 分析样品以确定具有作为 BONJ 或 BONJ 易 感性的生物标志物的 SNP 的至少一个基因、 由该基因编码的蛋白质或作为 BONJ 或 BONJ 易 感性的生物标志物的至少一个 SNP 的存在 ； (c) 将样品中作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物 标志物的至少一个基因、 蛋白质或至少一个 SNP 的存在与受试者的 BONJ 易感性相关联 ； 和 (d) 向受试者施用与 BONJ 不相关的二膦酸盐或与其它二膦酸盐相比更少可能性引起 BONJ 的二膦酸盐、 以比常规处方更低的剂量或更低的频率向受试者施用二膦酸盐。可以以任何 对于特定的制剂合适的途径向受试者施用二膦酸盐 ( 例如， 静脉内、 口服 )。 样品可包括， 例 如， 血液、 血清、 血浆或唾液。该至少一个基因可以是表 1、 表 3 或表 11 所示的基因且该至 少一个 SNP 可以是表 1、 表 3 或表 11 所示的 SNP。该至少一个基因可以包括， 例如， COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN。在一些实施方案中， 该基因包括 COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN 中 的二个、 三个、 四个或所有五个基因。在一些实施方案中， 该至少一个基因包括 OPG、 OPN 或 这二者。该至少一个 SNP 可以是， 例如， rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)， rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 或 rs11730582(SEQ ID NO ： 26)。 在一些实施方案中， 该 SNP 包括 rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)、 rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 和 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 中的 两个、 三个、 四个或所有五个 SNP。在一些实施方案中， 该至少一个 SNP 包括 rs2073618(SEQ ID NO ： 24)、 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 或这二者。 分析样品以确定具有作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的 SNP 的至少一个基因、 由该至少一个基因编码的蛋白质或作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的至少一个 SNP 的存在的步骤可以包括使用微阵列检测该至 少一个基因或至少一个 SNP 的存在。
本文进一步描述了用于鉴别在二膦酸盐施用后易患 BONJ 的受试者的试剂盒。该 试剂盒包含 ： (a) 具有多个附着于其上的核酸的固体载体， 其中至少一个核酸与具有作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的 SNP 的基因特异性杂交 ； (b) 检测试剂 ； 和 (c) 使用 说明。基因可以是表 1、 表 3 或表 11 所示的基因并且 SNP 可以是表 1、 表 3 或表 11 所示的 SNP。基因可以包括， 例如， COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN。在一些实施方案中， 基因包括 COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN 中的两个、 三个、 四个或所有五个基因。在一些实施方案中， 该至少一个基因包括 OPG、 OPN 或这二者。该至少一个 SNP 可以是， 例如， rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)， rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 或 rs11730582(SEQ ID NO ： 26)。在一些实施方案中， 该 SNP 包括 rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)、 rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 和 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 中的两个、 三个、 四个或所有五个 SNP。在一些实施方案中， 该至少一个 SNP 包括 rs2073618(SEQ ID NO ： 24)、 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 或这二者。
本文也描述了用于评估二膦酸盐治疗后患者发生 BONJ 的风险的方法， 包括 a) 从 受试者获得生物样品 ； b) 检测所述样品中的一个或多个 BONJ 相关的生物标志物， 其中该生 物标志物与表 1、 表 3 或表 11 中所示的一个或多个基因相关或所述生物标志物与所述基因 编码的一个或多个多肽相关， 从而产生生物标志物数据集 ； c) 将该生物标志物数据集与健 康人群和患有 BONJ 的人群的生物标志物数据比较 ； 和确定受试者发生 BONJ 的风险。在该方法中， 至少一个生物标志物可以是存在于表 1、 表 3 或表 11 所示的基因中的 SNP， 与表 1、 表 3 或表 11 所示的一个或多个 SNP 标志物相关的至少一个 BONJ 相关多态性位点或表 1、 表 3 或表 11 所示的基因的表达产物。至少一个生物标志物可以是与表 1、 表 3 或表 11 所示的 一个或多个 SNP 标志物完全连锁不平衡的 SNP。
本文还进一步描述了用于鉴别二膦酸盐施用后易感 BONJ 的受试者的方法。该方 法包括以下步骤 ： (a) 从受试者获得样品 ； (b) 分析样品的参与骨稳态的蛋白质的表达 ； 和 (c) 将该蛋白质的表达与受试者的 BONJ 易感性相关联。参与骨稳态的蛋白质可以是 ： PTH、 胰岛素、 TNF-α、 瘦素、 OPN、 OC、 OPG 和 IL6 中的一种。可以分析样品以确定该蛋白质的过表 达。在该方法中， 该蛋白质可以是与表 4 中所列的蛋白质具有至少 90％的氨基酸序列同一 性的蛋白质。
任选地， 本发明的上述方法还包括确定是否受试者有其他的遗传的 ( 例如， 基于 基因、 SNP 和 / 或蛋白质的存在 ) 或非遗传的 ( 例如， 生活方式因素， 如吸烟史 ) 发生 BONJ 的预测风险因素。
除非另有界定， 此处使用的所有技术术语具有如本发明所属领域普通技术人员通 常理解的相同的含义。 如本文所述， 单数形式 “一” 、 “一种” 、 “及” 和 “该” 包含复数指代， 除非上下文明确 规定并非如此。因此， 例如， “一个 SNP” 的指代包含多个 SNP( 即， 至少一个 SNP)， “一个基 因” 的指代包括多个基因 ( 即， 至少有一个基因 )， 等等。
如本文所使用 “核酸” 、 “核酸分子” 或 “多核苷酸” 是指两个或多个核苷酸的链， 如 RNA( 核糖核酸 ) 和 DNA( 脱氧核糖核酸 )。 “纯化的” 核酸分子是从与该核酸自然存在的细 胞或生物体中的其它核酸序列实质分离或隔离的核酸 ( 例如， 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 95、 96、 97、 98、 99、 100％不含污染物 )。 该术语包括， 例如， 整合到载体、 质粒、 病毒或者原核生物 或真核生物的基因组中的重组核酸分子。
术语 “基因” 是指编码特定蛋白质的核酸分子， 或在某些情况下， 指功能或结构的 RNA 分子。例如， COL1A1 基因编码 COL1A1 蛋白质。
如本文所使用 “蛋白质” 或 “多肽” 是同义的， 是指肽键的氨基酸链， 而不论其长度 或翻译后修饰， 如糖基化或磷酸化。
当提及核酸分子或多肽时， 术语 “天然的” 是指自然发生 ( 例如， 野生型 ) 的核酸 或多肽。
术语 “骨桥蛋白” 或 “OPN” 或 “OPN 多肽” 是指 OPN 基因的表达产物， 如与天然人类 骨桥 (OPN) 蛋白具有至少 65％ ( 但优选 75、 80、 85、 90、 95、 96、 97、 98 或 99％ ) 的氨基酸序 列同一性并显示出天然 OPN 蛋白的功能活性的蛋白质。蛋白质的 “功能活性” 是与该蛋白 质的生理功能相关的任何活性。对于本文所述的其它蛋白质 ( 例如， 甲状旁腺激素 (PTH)、 胰岛素、 TNF-α、 骨钙蛋白 (OC)、 骨保护素 (OPG) 等等 )， 与这些另外的蛋白相关的术语含义 相似。
如本文所使用 “序列同一性” 是指当两个序列在进行比对以最大化亚单元匹配， 即 考虑间隙和插入时， 两个序列中相应位置的相同亚单元的百分比。当两个序列中的亚单元 位置都被相同的核苷酸或氨基酸占据时则存在序列同一性， 例如， 如果两个 DNA 分子中的 给定位置都被腺嘌呤占据， 那么该分子在该位置为相同。例如， 如果在长度为 10 个核苷酸
的序列中 7 个位置与第二个 10- 核苷酸序列中相应的位置相同， 那么这两个序列有 70％的 序列同一性。序列同一性通常采用序列分析软件测定 ( 例如， 遗传学计算机组的序列分析 软件包 (Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group)， 威斯 康星大学生物技术中心， 1710 University Avenue， Madison， Wis.53705)。
本发明中的 “生物标志物” 是指在表 1、 3 或 11 中公开的 SNP 标志物或者指表 1、 3 或 11 中公开的基因或与其紧密连锁的位点的多态性或者指与表 1、 3 或 11 中所示的基因相 关的且与取自未患 BONJ 的受试者的相当样品相比在取自患有 BONJ 的受试者 ( 患者 ) 的样 品中差异表达的有机生物分子。 “有机生物分子” 是指生物源的有机分子， 例如， 类固醇、 氨 基酸、 核苷酸、 糖类、 多肽、 多核苷酸、 复合碳水化合物或脂质。如果一个样品中的生物标志 物在量、 结构、 功能或生物活性上与另一个样品中的生物标志物的量、 结构、 功能或生物活 性上存在统计学显著的差异， 那么在两个样品之间该生物标志物是差异存在的。作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的一个或多个基因、 SNP 或蛋白质可以与 BONJ 易感性相关联， 以使得他们在生物样品 ( 如血液、 血清、 血浆或唾液 ) 中的存在表示易感 BONJ。
本文所述 “单倍型” 是指遗传标志物 (“等位基因” ) 的任何组合。单倍型可以包 含两个或多个等位基因并且包含单倍型的基因组区域的长度可以是从几百个碱基到几百 个 kb。如本领域技术人员所公认的， 相同的单倍型可以通过确定限定来自不同核酸链的等 位基因的单倍型而不同地描述。本文所述的单倍型在个体之间是有差异的， 在患有 BONJ 或 具有比未患 BONJ 的个体更高的 BONJ 风险的个体中是差异存在的。因此， 这些单倍型对于 个体的 BONJ 或 BONJ 风险的评估、 诊断和预后具有诊断价值。可以通过本领域已知用于检 测多态性位点的核苷酸的方法检测单倍型。本文所述的单倍型 ( 例如具有如表 1、 3 或 11 中所示的那些标志物 ) 在患有 BONJ 或具有比未患 BONJ 的个体更高的 BONJ 风险的个体中 更频繁地发现。因此， 这些单倍型对于检测个体的 BONJ 或 BONJ 易感性 ( 更高的风险 ) 具 有预测价值。
在群体中可能存在超过一种序列的基因组中的核苷酸位置在本文是称为 “多态性 位点” 或 “多态性” 。在多态性位点长度上是单核苷酸的情况中， 该位点称为 SNP。例如， 如 果在特定的染色体位置， 群体的一个成员具有腺嘌呤而群体的另一个成员在同一位置具有 胸腺嘧啶， 那么该位置就是多态性位点， 并且更明确地说该多态性位点是 SNP。多态性位点 可以是由于插入、 缺失、 转换或易位产生的长度为几个核苷酸。 关于多态性位点的序列各个 形式被称为多态性位点的 “等位基因” 。因此， 在前述的实例中， 该 SNP 允许腺嘌呤等位基因 和胸腺嘧啶等位基因。
具有如本文所述的新型 BONJ 相关性的 SNP 标志物 ( 例如， 在表 1、 3 或 11 中 ) 具有 由国家生物技术信息中心 (NCBI) 分配给各个独特 SNP 的官方参考 SNP(rs)ID 身份标签。 各 个 rs ID 已经与人类基因组的特定核苷酸位置中存在的特定的可变等位基因关联， 并且核 苷酸位置用各个 SNP 侧翼的核苷酸序列来指明。例如具有 rs ID rs1800211 的 COL1A1SNP 位于 17 号染色体中， 可变等位基因是 A 和 C， 并且指定为 rs1800211 的核苷酸序列是 SEQ ID NO ： 3。
本文所使用 “等位基因” 可以指在 SNP 位置的核苷酸 ( 其中根据 SNP 的固有定义， 在该 SNP 位置群体中存在至少两种可选的核苷酸 )， 或者对于 cSNP， 可以指由包含该 SNP 位 置的密码子编码的氨基酸残基 ( 其中群体中该 SNP 位置存在的可选核苷酸形成编码不同氨基酸残基的可选密码子 )。本文中 “等位基因” 也可指 “变体” 。此外， 由包含特定的 SNP 的 密码子编码的氨基酸残基可以简称为由该 SNP 编码。
“探针” 或 “引物” 是以碱基特异方式与核苷酸分子的互补链杂交的寡核苷酸。 “碱 基特异方式” 是指两个序列必须具有足以使引物或探针与其特异靶序列杂交的程度的核苷 酸互补性。因此， 引物或探针序列不必需与模板序列完全互补。非互补碱基或修饰的碱基 可以插入到引物或探针中， 只要碱基替换不抑制杂交。核酸模板也可以包括引物或探针对 其具有不同程度的互补性的 “非特异性启动序列” 或 “非特异性序列” 。探针和引物可以包 括修饰的碱基如在多肽核酸中。探针或引物通常包括约 15 至 30 个连续核苷酸， 并且他们 可以进一步包括可检测的标记， 例如， 放射性同位素、 荧光化合物、 酶或酶的辅因子。 用于表 1、 3 或 11 中公开的 SNP 标志物的探针和引物可以在市面买到或很容易使用对于 SNP rs ID 指定的侧翼核苷酸序列和标准的探针和引物设计工具来设计。用于表 1、 3 或 11 中公开的 SNP 标志物的探针和引物可以应用于风险评估以及本文所述的分子诊断方法和试剂盒中。
本文所使用 “阵列” 、 “微阵列” 和 “DNA 芯片” 可以互换使用， 是指固定在基质 ( 例 如玻璃、 塑料、 纸、 尼龙或其他类型的膜、 过滤器、 芯片或任何其他合适的固体载体 ) 上的不 同多核苷酸的阵列。多核苷酸可直接在基质上合成或与基质分离地合成并随后固定到基 质上。可以通过很多方法合成或使用微阵列， 包括美国专利 No.5,837,832(Chee 等 )、 PCT 申 请 WO95/11995(Chee 等 )、 Lockhart， D.J. 等 (Nat.Biotech.14 ： 1675-1680， 1996) 和 Schena， M. 等 (Proc.Natl.Acad.Sci.， 93 ： 10614-10619， 1996) 中所描述的方法， 所有这些 都引用以其全部内容纳入本文。在其他实施方案中， 这些阵列可以通过 Brown 等美国专利 No.5,807,522 中描述的方法制备。
短语 “风险基因” 、 “疾病的风险基因” 和 “疾病基因座” 意思是造成发生疾病的可 能性增加的遗传变异。
术语 “患者” 、 “受试者” 和 “个体” 在本文中可互换使用， 且指待治疗和 / 或由其获 得生物样品的哺乳动物 ( 如人类 ) 受试者。
虽然与本文所述方法和试剂盒相似或等同的方法和试剂盒可用于实施或测试本 发明中， 但合适的方法和试剂盒如下所述。本文提及的所有出版物、 专利申请、 专利和其他 参考文献通过引用完整纳入本文。在存在冲突的情况下， 本说明书 ( 包括定义 ) 优先。下 面讨论的具体实施方案仅是说明性的， 并不有意进行限制。
附图简要说明
图 1 是使用 Zometa (zoledronate， Novartis) 治疗的多发性骨髓瘤患者的下颚 骨中发生疼痛的未治愈的坏死颌骨外露的人口腔的照片。
序列简要说明
SEQ ID NO ： 1 是肿瘤坏死因子受体超家族成员 11a， NFKB 激活因子 (TNFRSF11A( 等 级 RANK)) 基因的指定为 SNP rs12458117 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 2 是基质金属肽酶 (MMP2) 基因的指定为 SNP rs243865 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 3 是 I 型， α1 胶原蛋白 (COL1A1) 基因的指定为 SNPrs1800211 的核苷 酸序列。
SEQ ID NO ： 4 是破骨细胞相关受体 (OSCAR) 基因的指定为 SNPrs4147630 的核苷 酸序列。SEQ ID NO ： 5 是组织蛋白酶 K(CTSK) 基因的指定为 SNP rs10788796 的核苷酸序 SEQ ID NO ： 6 是转化生长因子， β1(TGFB1) 基因的指定为 SNPrs1800471 的核苷酸列。
序列。 SEQ ID NO ： 7 是 RANK 基因的指定为 SNP rs1805034 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 8 是 NFKB 配体的受体激活因子 (RANKL) 基因的指定为 SNP rs9562415 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 9 是白介素 -6(IL6) 基因的指定为 SNP rs2069830 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 10 是维生素 D 受体 (VDR) 基因的指定为 SNP rs2228570 的核苷酸序 列。
SEQ ID NO ： 11 是 VDR 基因的指定为 SNP rs731236 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 12 是侏儒症相关转录因子 2(RUNX2) 基因的指定为 SNPrs11498198 的 核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 13 是 CYP2C8 基因的指定为 SNP rs1934980 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 14 是 CYP2C8 基因的指定为 SNP rs1934951 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 15 是 COL1A1 基因的指定为 SNP rs1800012 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 16 是甲状旁腺素 (PTH) 的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 17 是胰岛素的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 18 是 TNF-α 的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 19 是瘦素的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 20 是骨钙蛋白 (OC) 的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 21 是骨保护素 (OPG) 的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 22 是骨桥蛋白 (OPN) 的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 23 是白介素 -6(IL6) 的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 24 是肿瘤坏死因子受体超家族， 成员 11b(TNFRSF11B) 基因 (OPG) 的 指定为 SNP rs2073618 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 25 是 TNFRSF11B 基因 (OPG) 的指定为 SNP rs3102735 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 26 是分泌型磷蛋白 1(SPP1) 基因 (OPN) 的指定为 SNPrs11730582 的 核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 27 是 SPP1 基因 (OPN) 的指定为 SNP rs28357094 的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 28 是肿瘤坏死因子 (TNF) 基因的指定为 SNP rs1800629 的核苷酸序 列。
本发明的详细说明
本发明涉及确认在接受二膦酸盐治疗或可能接受二膦酸盐治疗的患者或受试者 中发生 BONJ 的风险因子。本文描述的是确定 BONJ 的遗传药理学、 药代动力学和细胞学基 础的方法。本文还描述了用于确认患者的 BONJ 易感性的遗传基础的方法和试剂盒， 及鉴别 二膦酸盐施用后易发生 BONJ 的患者的方法以用于开发为医生提供了基于患者的基因组为 BONJ 患者制订治疗方案 ( “个性化 / 定制医学” ) 的工具。单倍型标记的 SNP 方法用来分析 参与骨吸收和破坏的候选基因和用来检验遗传变型为 BONJ 易感性的影响。采用分子细胞
技术检查 BONJ 的骨生物标志物。本文所述方法可以用来确定患者对于 BONJ 的遗传易感性 的差异以及患者之间造成这些患者从其体内清除二膦酸盐方面的差异的遗传差异。 确定这 些遗传差异提供了用于治疗 BONJ 的药物监测的改进、 BONJ 预防的改进和此类个体的治疗 的优化。任选地， 本发明的方法还包括确定受试者是否具有发生 BONJ 的其它遗传 ( 例如， 基于基因、 SNP 和 / 或蛋白质的存在 ) 或非遗传 ( 例如， 生活方式因素， 如吸烟史 ) 的预测 风险因子。
以下描述的优选实施方案说明了这些方法和试剂盒的适用。尽管如此， 从这些实 施方案的描述中， 本发明的其他方面可以根据下面提供的描述来进行和 / 或实施。
材料与方法
本文描述了涉及常规分子生物学技术的方法。这些技术一般是本领域已知的并 且在方法学论文中有详细描述， 如 Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 3rd ed.， vol.1-3， ed.Sambrook 等， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.， 2001 ； 和 Current Protocols in Molecular Biology， ed.Ausubel 等， Greene Publishing and Wiley-Interscience， New York， 1992(with periodic updates)。进行 SNP 和单倍型分析的方法以及基因分型技术在， 例如， Computational Methods for SNPs st and Haplotypes， 1 ed.， S.Istrail 等， Springer Press， Totowa， N.J.， 2004 ； N.Maniatis Methods Mol.Biol.376 ： 109-121， 2007 ； Genetic Analysis of Complex Disease by Jonathan L.Haines 和 Margaret A.Pericak-Vance， 2nded.， 2006， Wiley-Liss Publishing， Hoboken， NJ ； 和 Single Nucleotide Polymorphisms Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)by Pui-Yan Kwok， 1st ed.， 2002， Humana Press， New York， New York 中有描述。全基因组相关性研究综述于 Pearson 和 Manolio， JAMA vol.299 ： 1335-1344， 2008 中。
单核苷酸多态性 (SNP)
遗传序列的多种形式的并存导致了遗传多态性， 包括 SNP。SNP 是群体中存在不同 的等位基因或可选的核苷酸的 DNA 中的单个碱基位置， 并且是基因组中遗传变异的最常见 的形式。SNP 位置 ( 本文中可互换地称为 SNP、 SNP 位点、 SNP 基因座、 SNP 标志物、 生物标志 物或标志物 ) 通常在前面或后面具有等位基因的高度保守序列 ( 例如， 在群体中不到 1/100 或 1/1000 的成员发生变化的序列 )。 个体对应各个 SNP 位置的等位基因可以是纯合的或杂 合的。在一些实施方案中， SNP 是指 “cSNP” 以表示包含 SNP 的核苷酸序列是氨基酸编码序 列。
SNP 可以是由多态性位点处一个核苷酸置换成另一个核苷酸引起的。置换可以是 转换或颠换。转换是一个嘌呤核苷酸被另一个嘌呤核苷酸取代， 或一个嘧啶核苷酸被另一 嘧啶核苷酸取代。 颠换是嘧啶取代嘌呤， 反之亦然。 SNP 也可以是单个碱基的插入或缺失变 型， 称为 “indel” (Weber 等， Am.J.Hum.Genet.71 ： 854-62， 2002)。
如本文所使用的， 所称的 SNP 或 SNP 基因型包括单个 SNP 和 / 或单倍型 ( 其是通 常共同遗传的 SNP 的组 )。 与单个 SNP 相比， 单倍型可能与疾病或其他的表型效应具有更强 的相关性， 并因此在某些情况下， 可以提供更高的诊断准确性。致病性 SNP 是在基因表达中 或在基因产物的表达、 结构和 / 或功能中发生改变那些， 并因此成为最有预测性的可能的 临床表型。这样的一类包括落入编码多肽产物的基因区域中的 SNP， 即 cSNP。这些 SNP 可能导致多肽产物的氨基酸序列的改变 ( 即非同义密码子改变 ) 并引起缺陷的或其他突异的 蛋白质的表达。此外， 在无义突变的情况中， SNP 可以导致多肽产物的过早终止。这种变异 体产物可能会导致病理状态， 如遗传性疾病。
致病性 SNP 并不一定出现在编码区中 ； 致病性 SNP 可以出现在例如可能最终影响 核酸编码的蛋白质的表达、 结构和 / 或活性的任何遗传区域中。这些遗传区域包括， 例如， 参与转录的那些区域， 如转录因子结合域中的 SNP、 启动子区域中的 SNP， 参与转录物加工 的区域中的那些， 如可能导致缺陷性剪接的内含子 - 外显子边界处的 SNP 或 mRNA 的加工信 号序列 ( 如多腺苷酯化信区域 ) 中的 SNP。然而作为非致病性 SNP 的一些 SNP 是与致病序 列密切相关的， 并因此与致病序列隔离。在这种情况下， SNP 的存在与疾病的存在或者发生 疾病的易感性或风险增加相关。这些 SNP 尽管并不是致病性的， 但也可用于诊断、 疾病易感 性筛查和其他用途。
虽然在当前人类基因组的注释时 SNP 的染色体序号位置仍然可能发生改变， 但是 SNP 识别信息 ( 如可变等位基因和对 SNP 指定的侧翼核苷酸序列 ) 将保持相同。本领域技 术人员会很容易认识到， 个体的核酸中本发明的表 1、 3 和 11 中所示的一个或多个 SNP 中存 在的核苷酸的分析可以使用对于表 1、 3 和 11 中所列的 SNP 的 rs ID 的公开序列信息通过 任何能够确定多态性位点中存在的核苷酸的方法或技术进行。 从任一核苷酸链或从两条核 苷酸链确定多态性中存在的核苷酸。 可以理解， 表 1、 3 和 11 中所描述的 BONJ 相关的 SNP 标志物和单倍型可以与本文所 描述的相同 BONJ 相关基因或基因座中的其它多态性相关。标签 SNP 是可以用作很多其他 SNP 的代替物的基因座。 因为仅基因座的亚群需要基因分型， 标签 SNP 的使用大大地提高了 相关性研究的能力， 而同时保持好像已经对大量 SNP 进行基因分型一样的信息和能力。这 些与本发明的表 1、 3 和 11 所列的 SNP 标志物相关的其它多态性位点可以同样地用作生物 标志物或者甚至更可用作解释观察到的如本文所述的 SNP 标志物和单倍型的 BONJ 相关性 的致病性变异。
本文还描述了由表 1、 3 和 11 所列的基因编码的分离的肽和多肽， 包括本文公开的 多态性位置 ( 如 SNP)。 在一个实施方案中， 肽和多肽是用来鉴别治疗 BONJ 的药物的有用筛 选靶标。
识别参与颌骨坏死的基因
这里描述的是识别参与 BONJ 的基因的方法。为识别这类基因， 对来自国际单体型 项目 (International Hapmap project) 的单倍型标签 SNP 进行检查以构建有意义的单倍 型。根据与药物反应或疾病、 已知的或潜在的功能效应 ( 即非同义 cSNP) 和等位基因频率 正相关的公开报道， 对用于研究的 SNP 进行选择。由于具有相同的等位基因频率的 SNP 通 常是完全连锁不平衡的， 选择具有变化的等位基因频率的 SNP 以获取更大部分的基因变异 性。
在识别参与 BONJ 的基因和 SNP 的典型方法中， 分析了被认为在破骨细胞生成、 破 骨细胞分化和骨再吸收、 骨矿物质密度 (BMD) ； 患有 BONJ 的患者的破骨细胞介导的骨再吸 收组织及侵袭性牙周炎中发挥作用的基因和 SNP。 例如， 在表 1 中列出的基因是被认为破骨 细胞生成、 破骨细胞分化和骨吸收、 骨矿物质密度 (BMD) ； 在患有 BONJ 患者的组织中的破骨 细胞介导的骨再吸收及侵袭性牙周炎中发挥作用的基因和 SNP。这些基因在下面描述。
破骨细胞相关受体 (OSCAR)( 其在破骨细胞谱系细胞上特异表达 ) 调节破骨细胞 生成 ((Kim 等， J Exp Med 195 ： 201-209， 2002)。OSCAR 可能是破骨细胞分化的重要骨特异 性调节因子。该基因已发现编码不同同种型的多个可变剪接转录变异体。
已确认 OSCAR 基因中的变异体 (Hallman 等， Metabolism53 ： 1184-1191， 2004)。 OSCAR 基因的 5′侧翼 ( 启动子 ) 区域的 -2322 的 SNP A ＞ G 显示出与绝经后妇女中骨矿 物质密度 (BMD) 的显著相关性 (Kim 等 J Bone Miner Res.20 ： 1342-1348， 2005)。
组织蛋白酶 K 是参与骨重建和再吸收的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。该蛋白质 ( 其 是肽酶 C1 蛋白家族的成员 ) 主要在破骨细胞中表达。然而， 编码的蛋白质也在人乳腺癌 的主要部分中表达， 其中它可能促进肿瘤的侵袭性。这一基因中的突变是致密性成骨不 全症 (pycnodysostosis)( 以骨硬化和身材矮小为特征的常染色体隐性遗传疾病 ) 的原 因 (Saftig 等， Proc Natl Acad Sci USA 95 ： 13453-13458， 1998 ； Haagerup 等， Eur J Hum Genet8 ： 431-436， 2000)。
在 Hansen 等进行的最近研究中 (Hansen 等， Virchows Arch.449(4) ： 448-454， 2006)， 对患有 BONJ 的病人的破骨细胞介导的骨再吸收组织中的半胱氨酸蛋白酶组织蛋白 酶 K 的作用进行了研究。该研究证实了患有 BONJ 的患者中破骨细胞数量的增加。虽然已 知二膦酸盐降低破骨细胞的功能， 但是这些发现表明在相应损伤中破骨细胞在骨破坏机制 中的关键参与。Hansen 等还表明， 与对照组织相比， 在感染性射线性骨坏死和 BONJ 中破骨 细胞的数量和活性显着提高。可以得出结论， 破骨细胞参与负责颌骨坏死中的骨破坏的过 程。 TGFB 是控制多种细胞类型的增殖、 分化和其他功能的多功能肽。由 TGFB1 基因编 码的 TGF β1 是人类骨骼中最丰富的生长因子。TGF β1 由成骨细胞生成并抑制破骨细胞 的增殖和活性。它还起到骨质疏松症易感性的调节因子的作用， 并表明在体外影响成骨细 胞和破骨细胞的功能 (Massague J 和 Chen YG.， Genes&Dev.14 ： 627-644， 2000 ； Langdahl 等， Bone 32 ： 297-310， 2003)。
人 巨 噬 细 胞 特 异 性 集 落 刺 激 因 子 (CSF-1) 连 同 NF-KB 配 体 受 体 激 活 因 子 (RANKL) 参与单核细胞亚群的活化和分化成破骨细胞 (Rabello 等， Biochem Biophys Res Commun.347 ： 791-796， 2006 ； Komano 等， Arthritis Res Ther.8 ： R152， 2006)。日本人群的 最近的一项研究显示在侵袭性牙周炎和位于 CSF1 中的三个多态性之间的正相关性。
体内破骨细胞生成是由表达膜结合的 NF-kB 配体受体激活因子 (RANKL) 的成骨 / 基质细胞的作用调节的。RANKL(TNF 家族的成员 ) 是对于破骨细胞生成的诱导必不可少的 细胞因子。 成骨细胞和基质细胞都产生这一细胞因子并且信号由定位在破骨细胞祖细胞表 面上的称为 RANK 的特定受体转导 (Boyle 等， Nature， 423 ： 337-342， 2003)。RANKL 和 CSF-1 对于单核细胞的刺激和分化成破骨细胞是必不可少的 (Komano 等， Arthritis Res Ther 8 ： R152， 2006)。研究表明， 破骨细胞参与骨侵蚀且通过控制 RANKL 抑制破骨细胞生成可以在 关节炎实验模型中限制骨破坏 (Walsh 等， Immunol Rev.208 ： 228-251， 2005)。 Koh 等 (2006) 确认了 RANK 的两个新的多态性 (+34863G ＞ A 和 +35928insdelC)， 其可以是绝经后妇女低 骨密度的可能遗传因子 (Koh 等， Osteoporos Int2006)。在另一项 Hsu Yh 等， 2006 进行的 研究中， 显示了男性 BMD 和 RANK 的外显子 7(Ala192Val) 和 RANKL 基因的 5′ UTR 的多态性 的显著正相关性 (Hsu 等， Hum Genet 118 ： 568-577， 2006)。
COL1A1 基因被认为是骨质疏松症发病机理的重要功能候选基因， 因为 I 型胶原蛋 白是骨的主要蛋白质， 并且该基因的突变引起称为成骨不全症的综合征 ( 其特征在于 BMD 下降和骨脆性增加 )(Boyde 等， Calcif Tissue Int.64 ： 185-190， 1999)。遗传变异可以通 过影响 COL1A1 基因的代谢在骨质疏松症或骨质疏松性骨折中发挥重要作用。Yamada 的研 究 (Yamada 等， Hum Biol.77 ： 27-36， 2005) 表明， 在 COL1A1 基因启动子中 -1997 处的 G ＞ T 多态性与西班牙绝经后妇女的腰椎的 BMD 相关。另一项研究表明， 影响 COL1A1 基因第 一内含子中 Sp1 转录因子结合位点的 G ＞ T 多态性， T 等位基因与骨质疏松症相关 (Grant 等， Nat Genet.14 ： 203-205， 1996)。Mann V 等进行的功能分析研究中表明， Sp1 多态性的 T 等位基因与转录增加和 COL1A1 的 mRNA 和蛋白质产生的异常增加相关 (Mann 等， J Clin Invest.107 ： 899-907， 2001)。Ralson SH 和同事在超过 20,000 人参加的大型前瞻性荟萃 分析研究 (GENOMOS) 中表明 Sp1 多态性的纯合子 T 等位基因与 BMD 和偶发脊椎骨折之间的 相关性 (Ralston 等， PLoS Med.3 ： e90， 2006)。
IL-6 是在骨再吸收中起关键作用的多效性细胞因子。Ferrari 等证明 IL-6 基因 启动子区域中 -174 的 G ＞ C 多态性在体内发挥功能效应并影响基因转录和引起 IL-6 循环 水平的下降 (Ferrari 等， Arthritis Rheum.44 ： 196-201， 2001)。还表明， IL-6 启动子区 域 -572 和 -174G 的两个等位基因变异体的单倍型与骨再吸收标志物相关 (Ferrari 等， J Clin Endocrinol Metab.88 ： 255-259， 2003)。
维生素 D 受体 (VDR)， 一种类固醇受体， 起到应答类固醇维生素 D 激素的转录因子 的作用。维生素 D 通过与维生素 D 受体的相互作用调节骨细胞分化、 成骨细胞分化、 骨转换 和钙稳态 (Haussler 等， J Bone Miner Res.13 ； 325-349， 1998)。
VDR 基因是骨质疏松相关研究的第一批基因之一。由 Fang 对 6418 个人进行了 VDR 及其与骨质疏松相关性的大的和广泛的研究 (Fang 等， Am J Hum Genet.77 ： 807-823， 2005)。作者采用单倍型标签 SNP 途径并分析了 15 个单倍型标签 SNP， 且表明在 VDR 基因 的启动子和 3′ UTR 区中的单倍型等位基因与骨质疏松性骨折的风险增加相关， 携带这两 个风险等位基因的受试者发生骨折的风险 (48％ ) 显著高于对照个体。风险单倍型的组合 导致由转录下降和 mRNA 降解增加引起的更低的 VDR 的 mRNA 表达水平 (Fang 等， Am J Hum Genet.77 ： 807-823， 2005)。
侏儒症相关转录因子 2(RUNX2)， 又称为 CBFA1 基因， 编码结合成骨细胞特异性顺 式作用元件并在成骨细胞分化的调节和诱导成骨细胞的特定转录物 ( 如编码骨钙蛋白的 转录物 ) 中发挥关键作用的蛋白 (Ducy 等， Cell 89 ： 747-754， 1997 ； Schinke 等， J Biol Chem.274 ： 30182-30189， 1999)。几项研究报道了 RUNX2 多态性与 BMD 的相关性。最近的 一项研究确信认了 RUNX2 基因和启动子 (P1 和 P2) 内的 16 个等位基因变异 (Doecke 等， J Bone Miner Res.21 ： 265-273， 2006)。多态性位于启动子或第一外显子的聚丙氨酸和聚谷 氨酰胺重复序列中。 在该项研究中表明， 在报告基因分析中启动子区域的多态性影响 RUNX2 转录， 并与 BMD 相关。还表明， 影响 BMD 的 RUNX2 基因的多态性是连锁不平衡的。
在确认任何 BONJ 相关的基因后， SNP 被标记 ( 对于各基因约 10 个 )， 且然后分型以 建立单倍型。分析显示为统计学显著的基因的单个 SNP。使用任何合适的提取方法， 例如， 采用 Qiagen 公司的 QIAamp DNA 血液试剂盒 (Valencia， CA) 从全血分离基因组 DNA(gDNA)。 分离的 gDNA 保存于 -20℃ ( 例如， 在带条码的 1.5 毫升微量离心管中 )。使用任何合适的方法 ( 如使用 96 孔板读板仪的分光光度方法 ) 定量分离的 gDNA。使用液体操作机器人系 统或其他合适的系统， 将各参与者的等份原 gDNA 样品从 1.5μL 的微量离心管转移到带条 码的 96 孔微量滴定板中， 并标准化为 20ng/ul。原 gDNA 样品包含用于识别的条码， 如 96 孔 板所做的一校。使用 Freezerworks 5.3 版软件管理冰箱内的所有样品。该软件可以允许 精确示踪冰箱内每个样品位置的和剩余的样品体积。
表1： 二膦酸盐相关颌骨坏死的候选基因
在典型的方法中， 使用三种基于 PCR 的基因分型方法中的一种。通过使用合适 的引物设计软件进行 PCR 引物选择和条件的优化 ( 例如， 寡核苷酸引物分析软件 (Oligo Primer Analysis Software) 第 6 版 )。
在典型的方法中， 用于基因分型的基因分型平台是 TaqMan。ABI Taqman Prism 7900HT Sequence Detection System 是具有高通量能力的第二代实时定量 PCR 系统， 其可 以使用 96 或 384 孔微滴定板和微流控卡 (Micro Fluidic Card)。该系统还配备了用于已 知 SNP 的大规模基因分型的新软件， 其以成本低产生可靠和可重现的结果。应用生物系统 公司 (Applied Biosystems)(Foster City， CA) 拥有超过 180,000 个验证的 TaqMan SNP 基因分型分析方法， 及用于非编码 SNP160 万个预设计的分析方法。也可以开发用于他们分 析文库中没有的 SNP 的定制分析方法。
焦磷酸测序技术是涉及与多个底物和酶一起， 测序引物与单链、 PCR 扩增的 DNA 杂 交的实时 DNS 测序技术。通过使用 Pyrosequencing 提供的特殊引物设计软件设计测序引 物。当通过 DNA 聚合酶将核苷酸掺入到核酸链中时， 释放出等摩尔量的无机焦磷酸， 随后由 ATP 硫酸化酶转化为 ATP。ATP 驱动萤光素酶反应， 其中萤光素分子被氧化后以产生光。该 光被电荷耦合器件照相机捕获并在热解图上作为峰观察到。焦磷酸测序反应生成 20-30bp 的序列数据， 并允许以＞ 99％的准确性和可重复性进行基因分型。PSQ HS 96A 系统支持高 达每工作日 3000 个基因型的通量。在另一种方法中， 通过限制性片段长度多态性 (RFLP) 分析实现基因分型。 鉴别具有 BONJ 易感性的患者
本发明提供了用于鉴别在二膦酸盐施用后易患 BONJ 或具有 BONJ 风险的患者或受 试者 ( 如人类 ) 的方法。在典型的实施方案中， 具有 BONJ 风险的个体是体内鉴定出选自于 表 1、 3 或 11 中的一个或多个 BONJ 相关多态性位点和 / 或在他们的血清中检测出表 4 中所 列的一个或多个蛋白 ( 或其前体、 成熟形式或裂解片段 ) 的表达 ( 例如， 超表达 ) 的个体。 在其它实施方案中， 与表 1、 3 或 11 中的 SNP 和单倍型相关的多态性和 / 或表 4 中所列的蛋 白质 ( 或其前体、 成熟形式或裂解片段 ) 的血清表达可以用于 BONJ 的风险评估。作为二磷 酸盐治疗候选者的患者进行特定基因或 SNP 或蛋白质存在的筛选。测试为阳性的患者可以 考虑替代的治疗或在二磷酸盐疗法之前另外完成完整的牙科治疗。
用于鉴别在二膦酸盐治疗后易患 BONJ 的患者的典型方法包括从受试者获得样 品； 分析样品以确定具有作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的 SNP 的至少一个基因、 由该基因编码的蛋白质或作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的至少一个 SNP 的存在 ； 和将样品中作为 BONJ 或 BONJ 易感性的生物标志物的该至少一个基因、 蛋白质或至少一个 SNP 的存在与受试者的 BONJ 易感性相关联。可获得任何合适的样品， 例如， 血液、 血清、 血 浆、 唾液等。如实施例中所描述的， SNP rs12458117(SEQ ID NO ： 1) 和 rs243865(SEQ ID NO ： 2) 显示在患有 BONJ 的患者中以比未患 BONJ 的患者更高的比率存在。因此， 在鉴别二 膦酸盐施用后易患 BONJ 或具有 BONJ 风险的患者或受试者 ( 例如， 人类 ) 的方法的一个实 施例中， 分析受试者样品以确定 SNP rs12458117(SEQ ID NO ： 1) 和 rs243865(SEQ ID NO ： 2) 的存在。该至少一个 SNP 可以是表 1、 表 3 或表 11 中所示的 SNP。例如， 该至少一个 SNP 可以是 rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)、 rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 或 rs11730582(SEQ ID NO ： 26)。在一些实施方案中， SNP
包括 rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 rs243865(SEQ ID NO ： 2)、 rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 rs2073618(SEQ ID NO ： 24) 和 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 中的二个、 三个、 四个或所有五个 SNP。 在一些实施方案中， 该至少一个 SNP 包括 rs2073618(SEQ ID NO ： 24)、 rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 或这两者。可以使用任何合适的方法分析受试者的样品中这些 SNP 的存在， 包 括微阵列的使用。此外， 本领域已知用于 SNP 分型的几种方法和不同的基因分型平台 ( 如 TaqMan、 Pyrosequencing、 RFLP、 Direct Sequencing 等 )。微阵列或芯片通常包含数千到 百万或稍超过一百万的 SNP( 其用于基因分型 )。
替代分析受试者样品中特定 SNP 的存在或在此之外， 可以分析受试者样品以确定 特定 SNP 存在于其中的基因或由特定 SNP 存在于其中的基因编码的蛋白质的存在。该至少 一个基因可以是在表 1、 表 3 或表 11 中所示的一个或多个基因。 该至少一个基因可以包括， 例如， COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 或 OPN 的基因。 在一些实施方案中， 该基因包括 COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPG 和 OPN 中的二个、 三个、 四个或所有五个基因。在一些实施方案中， 该至少一个基 因包括 OPG、 OPN 或这两者。分析样品中基因或蛋白质的存在的方法是本领域公知的， 并且 在方法学论文中有描述， 如 Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 3rd ed.， vol.1-3， ed.Sambrook 等 Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.， 2001 和 Current Protocols in Molecular Biology， ed.Ausubel 等 Greene Publishing 和 Wiley-Interscience， New York， 1992( 定期更新 )。这些方法包括用于验证基因存在的 PCR 技术和用于检测不同细胞或组织中蛋白质的存在的实时 PCR。
治疗患有 BONJ 的患者
本文描述了治疗患有 BONJ 的患者的方法。一些二膦酸盐倾向于具较低的副作用 如 BONJ。例如， Aredia 比 Zometa 引起 BONJ 的可能性更小。因此， 表达与 BONJ 相关的 特定基因的患者可以用较小可能引起 BONJ 的药物治疗。例如， 将不使用 Zometa 降低其 使用频率和 / 或减少其用量。在另一个实施例中， 将只使用 Aredia
试剂盒
本文描述了用于鉴别二膦酸盐施用后易发生 BONJ 的受试者的试剂盒。用于鉴别 二膦酸盐施用后易发生 BONJ 的受试者的体外测试试剂盒 ( 如试剂套装 ) 包括试剂、 材料和 评估一个或多个生物标志物 ( 如核酸、 蛋白质 ) 的方案， 及说明书和任选地将受试者的生物 标志物数据与来自健康受试者和患病受试者的生物标志物数据进行比较以进行风险评估、 BONJ 的诊断或预后的软件。试剂盒可用的试剂和材料包括， 但不限于本文所功述的 PCR 引 物、 杂交探针和引物 ( 例如， 标记的探针或引物 )、 等位基因特异性寡核苷酸、 用于 SNP 标志 物基因分型的试剂、 用于标记分子的检测的试剂、 限制性内切酶 ( 如， 用于 RFLP 分析 )、 DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶、 DNA 连接酶、 标志酶、 微阵列、 结合改变的或未改变的 ( 天然的 )BONJ 风 险基因编码的多肽的抗体、 用于扩增选自于表 1、 3 或 11 中的一个或多个 BONJ 风险基因的 核酸片段以用于分析该一个或多个 BONJ 风险基因或其片段的核酸序列的手段或用于分析 BONJ 风险基因编码的多肽的一个或多个氨基酸残基的序列的手段等等。
用于鉴别二膦酸盐施用后易发生 BONJ 的患者的典型试剂盒包括具有附着于其上 的多个核酸的固体载体 ( 例如核酸阵列 )、 其中至少一个 ( 例如， 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个 ) 核酸特异性地与具有引起 BONJ 或 BONJ 易感性的 SNP 的基因杂交 ； 检测试剂和使用说 明。通常， 固体载体具有两个或更多个 ( 例如、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个 ) 附着于其上的核酸， 它们特异性地与两个或更多个 ( 例如、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 个 ) 具有作为 BONJ 易感性 的标志物的 SNP 的基因杂交。在一个实施方案中， 试剂盒包括用于检测 BONJ 相关的特定基 因和 SNP 的表达的血液测试和 / 或唾液测试。在另一个实施方案中， 用于诊断或预测 BONJ 易感性的试剂盒包括用于检测个体的核酸中存在于选自于表 1、 3 或 11 中的一个或多个 SNP 标志物中的核苷酸的引物和试剂。 使用本文所述试剂盒获得的信息可以用于优化患有 BONJ 或疑似患有 BONJ 的个体的治疗。
试剂盒的另一个实施例包括用于检测其在血清中的表达可用于评估个体发生 BONJ 的风险的一个或多个蛋白质 ( 表 4 中所列的蛋白质、 或者其前体、 成熟形式或裂解片 段 ) 的存在的试剂。这种试剂盒可以包括进行例如 Western 印迹或 ELISA 必需的试剂和说 明。
实施例 1- 对于 SNP 的等位基因频率确定
方法
使用市售试剂盒 (Qiagen DNA Blood Isolation Kit， Qiagen， Valencia， CA) 从 全血中的淋巴细胞分离基因组 DNA。用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳方法定量分离的 DNA 样品并标准化到 20ng/ul。
通过 PCR 和通过基于荧光的 TaqMan (Applied Biosystems， FosterCity， USA) 分型方法 (De la Vega 等 Mutat Res.573(1-2) ： 111-135， 2005) 对于两个等位基因 SNP， 17 号染色体 COL1A1 基因 SNP[A/C]， dbSNP ID(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15) 和 18 号染色体 TNFRSF11A 基因 SNP[A/G]， dbSNP ID(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1)， 进行基因分型。
从 Applied Biosystems， Foster City， USA 购 买 TaqMan 基 因 分 型 分 析 探 针 [ 用 于 17 号 染 色 体 COL1A1 基 因 SNP[A/C]， dbSNP ID(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15) 的 C__7477174_30， 和用于 18 号染色体 TNFRSF11A 基因 SNP[A/G]， dbSNP ID(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1) 的 C___31393804]。探针是由 ABI(Applied Biosystems) 设计用于基因分型的荧 光染料 (VIC and FAM) 标记的引物。
初步结果
对 六 个 样 品 进 行 了 上 述 两 个 SNP[17 号 染 色 体 COL1A1 基 因 SNP[A/C]， dbSNP ID(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15) 和 18 号 染 色 体 TNFRSF11A 基 因 SNP[A/G]， dbSNP ID(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1)] 的基因分型后， 确定两个 SNP 的小等位基因频率 (MAF) 为 17％。
SNP[A/C]， dbSNP ID(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15)， COL1A1 基因 C 等位基因＝ 17％
SNP[A/G]， dbSNP ID(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1)， TNFRSF11A 基因 G 等位基因＝ 17％
BONJ 与 dbSNP ID(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15) 和 dbSNP ID(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1) 之间的相关性是统计显著的。
实施例 2-SNP 的基因分型
从 50 个受试者， 6 例 BONJ 患者和 45 例对照 ( 未患 BONJ 的患者 ) 的血液样品的 淋巴细胞分离基因组 DNA， 并进行 4 个单核苷酸多态性 (SNP) 的基因分型 ： CYP2C8 基因的 dbSNP ID(rs1934980)(SEQ ID NO ： 13) 和 rs1934951(SEQ ID NO ： 14))、 COL1A1 基因的 dbSNP ID(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15) 和 TNFRSF11A 基因的 dbSNP ID(rs12458117)(SEQ ID NO ：1)。
实施例 3- 候选基因 SNP 的 BONJ 相关性的分析
回顾了佛罗里达大学 (UF) 和相关的退伍军人管理局医疗中心 (VAMC) 的医疗和牙 科图表。如表 2 中所示， 鉴定了患有 BONJ 的 27 名患者， 中位年龄 62 岁， 其中 19 名患有骨 髓瘤、 3 例患有前列腺癌、 2 名患有乳腺癌、 2 名患有头颈癌和 1 名患有肾细胞癌。有 21 名 男性。12 名患者顺序接受帕米膦酸和唑来膦酸治疗， 11 名接受唑来膦酸治疗和 3 名接受帕 米膦酸治疗。14 名患者具有血清肌酐浓度的适度增加。先前的化疗 / 放疗方案的平均数 为 3.5 人。9 名患者使用沙立度胺， 5 名患者使用硼替佐米。原发疾病状况如下 ： 12 名患者 处于临床缓解中， 5 名具有稳定疾病和 10 名具有渐进性疾病。8 名患者接受他汀类治疗和 6 名患有糖尿病。在诊断 BONJ 之前二膦酸盐 (BP) 治疗的中位长度为 28 个月。BONJ 在 21 名患者中涉及下腭骨， 4 名中涉及上颌骨和 2 名中涉及两者。最频繁的表现是疼痛、 肿胀和 骨外露 ( 图 1)。10 名患者具有过往牙科过程。在这些患者接受治疗的 3 个中心间的 BONJ 发病率不同。 在其中所有患者患有骨髓瘤的门诊骨髓移植诊所中， 总发病率为 13％， 而对于 仅帕米膦酸总发病率为 4％。VAMC 中发病率为 4.2％， 而在 UF 的癌症中心诊所中发病率为 1.7％。在后两组中， 患者大多患有实体瘤。本文所描述的结果与更长治疗时间的 BONJ 的 发病率增加的报告是一致的， 且骨髓瘤患者比实体瘤更可能出现该并发症。本文所描述的 结果没有确定发生 BONJ 的其它特定预测风险因子。
表 2.BONJ 患者的人数学数据、 恶性肿瘤、 治疗和 ONJ 诊断时间
收集门诊观察的并且用 IV BP 治疗的骨髓瘤患者的血液样品。记录他们是否具 有证明的 BONJ。对已用 IV BP 治疗的 67 名骨髓瘤患者使用 5 个 SNP 进行基因分型， 其 中 8 例患有 BONJ ； 结果如表 2 所示。患有 BONJ 的患者与未患 BONJ 的患者相比较， 在2 个 SNP ： TNFRSF11A(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1) 和 MMP2(rs243865)(SEQ ID NO ： 2) 观 察 到 BONJ 患者有朝向更高优势比的趋势。两个 SNP 的携带者具有 50 ％的事件发生率， 而 那些没有携带任一 SNP 的受试者具有 7.9 ％的事件发生率。优势比 (95 ％置信区间 ) 为 11.6(1.34-100.8)。
表3： 5 个 SNP 及其与 BONJ 相关性的初步结果
BONJ 状态的蛋白质水平上的初步结果 ： 使用 Luminex’ s xMAP 技术， 分析这 67 名 患者的血清样品的几个已知参与骨稳态的因子的蛋白水平， 结果如以下表 4 中所示。研究 了甲状旁腺激素 (PTH)、 胰岛素、 TNF-α、 瘦素、 骨钙蛋白 (OC)、 骨保护素 (OPG)、 骨桥蛋白 (OPN) 和 IL-6。与对照相比， 在患有 BONJ 的患者中观察到显著更高的 (OPN) 血清水平 (p ＝ 0.037)。还注意到更高的 TNFα 水平 (p ＝ 0.06)。
表 4. 患有或未患 BONJ 的患者的蛋白质水平
这些结果表明， 基因 TNFRSF11A 和 MMP2 以及骨蛋白 OPN 明显参与破骨细胞的生 成、 再吸收和骨稳态。因此， 它们很可能涉及 BONJ 的病理生理学。
实施例 4- 与 BONJ 相关的遗传多态性 - 同龄组研究
病例报告表明， 并非所有的 BP 使用者都会发生 BONJ， 这表明个体之间的环境和 / 或遗传变异可能赋予 BONJ 发生的易感性或抗性。然而， 迄今为止只公布了几个 BONJ 的遗
传相关性研究。在全基因组相关性研究中， 只有细胞色素 P4502C8 基因 (CYP2C8) 表现出病 例和对照之间显著不同的分布 (Sarasquete 等， Blood， 112(7) ： 2709-12， 2008)。然而， BP 不是由 P450 酶代谢的， 且因此推测这种相关性是通过可能受 CYP2C8 影响的其他代谢途径 受 (Sarasquete 等， Blood， 112(7) ： 2709-12， 2008)。已提出基质金属蛋白酶 2(MMP2) 基因 为 BONJ 发生的候选基因， 因为 BP 治疗与心房纤颤相关并且 MMP2 是唯一已知与骨骼异常和 心房纤颤相关的基因 (Lehrer 等， J Oral Maxillofac Surg， 2009， 67(1) ： 159-61， 2009)。
本研究的目的是研究几个基因 ( 包括 CYP2C8、 COL1A1、 RANK、 MMP2、 OPN 和 TNF) 中 的遗传多态性是否与在每月 IV BP 治疗的多发性骨髓瘤 (MM) 的患者组中发生 BONJ 的风险 相关。
方法概述
接受 IV BP 治疗的多发性骨髓瘤 (MM) 患者在一年时间内入组。用已知的可接受 的标准鉴别 BONJ， 并收集所有患者的人口学和临床数据。使用外周血对 7 个被认为与药物 代谢或骨代谢相关的基因上的 10 个单核苷酸多态性 (SNP) 进行基因分型。
结果概述
78 位患者入组和其中 12 名患有 BONJ。发生 BONJ 的中位时间为 28 个月。单因 素和多因素分析揭示了 BONJ 与吸烟 (P ＝ 0.017) 之间以及与唑来膦酸治疗之间 (P ＝ 0.00029) 的显著相关性。用 5 个 SNP 鉴定 BONJ 患者中与非 BONJ 患者相比的较高优势比 ： COL1A1(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15)、 RANK(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1)、 MMP2(rs243865) (SEQ ID NO ： 2)、 OPG(rs2073618)(SEQ ID NO ： 24) 和 OPN(rs11730582)(SEQ ID NO ： 26)。 当一起考虑所有 5 个 SNP 时， 基因得分＝ 5 的患者的事件发生率为 57％， 而基因得分＜ 5 的患者的事件发生率为 10％。调整的优势比为 11.2， 95％置信区间为 1.8-69.9 和 P 值为 0.0097。吸烟、 BP 治疗的类型及 COLA1、 RANK、 MMP2、 OPG 和 OPN 的综合基因型得分与进行 IV BP 治疗的 MM 患者中的 BONJ 显著相关。
方法
患者群体
招募进行静脉 BP( 唑来膦酸或帕米膦酸 ) 治疗的多发性骨髓瘤患者自愿参加人体 试验委员会 (Institution Review Board)(IRB) 批准的这一研究。这些患者签署知情同意 书， 并定期门诊随访。除了 MM 治疗， 患者还 IV 接受每月四次的帕米膦酸 90mg 或唑来膦酸 4mg。通过审查医疗记录验证人口统计和临床信息并做成图表以进行分析。某些生活习惯 因素， 如在过去任意时间的吸烟， 以及某些共病如糖尿病， 和以往使用过的药物等数据对于 所有患者都要收集。
如果以下三个特征都存在那么患者即被认为是患有 BONJ(American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons position paper， J Oral Maxillofac Surg， 65(3) ： 369-76， 2007) ： 1) 当前或以往的二膦酸盐治疗 ； 2) 已持续 8 周以上的颌面部区域骨暴露 ； 和 3) 颌骨无放射治疗史。随访期间记录口腔症状和主诉并进行恰当的治疗安排。所有的 BONJ 病例都是在佛罗里达大学的口腔医学门诊进行诊断。 每个病人提供一份血液样品进行 基因分型。
基因分型
根据他们在破骨细胞生成、 破骨细胞分化和骨再吸收中的潜在作用和以前的文献报道选择 7 个候选基因上的 10 个 SNP ：
COL1A1(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15) ；
RANK(rs12458117)(SEQ ID NO ： 1) ；
CYP2C8(rs1934980 和 rs1934951)( 分别为 SEQ ID NO ： 13 和 14， )；
MMP2(rs243865)(SEQ ID NO ： 2) ；
OPN(rs11730582 和 rs28357094)( 分别为 SEQ ID NO ： 26 和 27) ；
OPG(rs2073618 和 rs3102735)( 分别为 SEQ ID NO ： 24 和 25) ； 和
TNF(rs1800629)(SEQ ID NO ： 28)。
使用市售试剂盒 (Qiagen DNA Blood Isolation Kit， Qiagen， Valencia， CA) 从 全血的淋巴细胞中提取基因组 DNA。 使用 TaqMan 基因分型方法或焦磷酸测序方法对多态 性进行基因分型 (Langaee 等 Mutat Res， 65(3) ： 369-76， 2007)。使用 Applied Biosystems 7900HT SNP 基 因 分 型 平 台 进 行 TaqMan 分 析。 用 于 COL1A1SNP G/T rs1800012(ID C____7477170_30)、 RANK SNP A/G rs12458117(ID C__31393804_10)、 CYP2C8SNP C/ T rs1934980(ID C____361427_10)、 CYP2C8 SNP A/Grs1934951(ID C____361409_1_) 和 MMP2 SNP C/T rs243865(ID C_3225943_10) 的 PCR 的 引 物 和 探 针 从 Applied Biosystems(Applied Biosystems， Foster City， USA) 购买。制备 384 孔板中各 5μL 的 反应物并根据制造商的建议进行检测和分析。其余的 SNP 使用 PSQ HS96A SNP 试剂套装 (Biotage AB， Uppsala， Sweden)( 根据需要可获得引物 ) 进行焦磷酸测序 (Langaee 等 Mutat Res， 65(3) ： 369-76， 2007)(Biotage， Uppsala， Sweden)。对于各个 SNP 通过对 5-10％随机 选取的重复样品进行基因分型验证基因型的准确度。
统计分析
需要时基线特征由 student’ s t- 检验或卡方检验进行比较。用具有一个自由度 的卡方检验评估等位基因频率对 Hardy-Weinberg 平衡 (HWE) 的偏离。显性遗传模式用于 单 SNP 相关性分析。用卡方检验比较携带者和非携带者之间的事件发生率。采用 Logistic 回归来评估 BONJ 的优势比， 使用野生纯合型作为参照组。
结果发现， 有 5 个 SNP 显示出 BONJ 的更高风险的趋势。然后基于各个受试者携带 的 5 个 SNP 中各 SNP 的不利等位基因 ( 与 BONJ 高风险相关的那些等位基因 ) 的数目构成 基因型评分。根据基因型评分数 < 或 > ＝ 5 的层级计算 BONJ 的粗发病率。
在多元逻辑回归中， 协变量如年龄、 性别、 种族、 吸烟史、 糖尿病、 BP 治疗类型和以 往治疗次数都包括在分析中。只有显著的 BONJ 预测子包括在最终的多元逻辑模型中。所 有统计分析采用 SAS 9.1 版 (SASInstitute， Cary， NC) 进行。P 值＜ 0.05 被认为是统计学 显著的。
发现
共有 78 名 MM 患者入组， 包括 12 名 BONJ 患者 (15.3％ )， 且其特征如表 9 所示。比 较两组患者 ： BONJ 组对所有其他接受 IV BP 治疗的患者。BONJ 组和 BP 组的中位年龄相似。 虽然 78 名患者多数为男性 (61.5％ )， 但是 50％的 BONJ 患者为女性。与 BP 组相比， 大多数 的 BONJ 患者为白种人。BONJ 患者没有非裔美国人。在该研究中， 3 个美籍西班牙人中的 2 个被诊断为患有 BONJ。然而， 这些差异没有一项是统计学显著的。
发生 BONJ 的中位时间为 28 个月， 但是， 这与整个组的 BP 治疗的中位长度没有不同。然而， 这一发现证实了之前公布的数据， 即 BONJ 通常在 BP 治疗超过 2 年后发生。
单因素分析显示 BONJ 与吸烟之间 (P ＝ 0.017) 以及与唑来膦酸治疗之间 (P ＝ 0.00029) 的显著相关性。这些显著相关在多因素逻辑回归分析 ( 表 10) 中仍然保持。
在该组中 7 个基因的十个 SNP 进行基因分型。 BONJ 的小等位基因频率和单变量优 势比如表 11 所示。BONJ 患者与未患 BONJ 的患者相比较， 且在 BONJ 患者中对于以下 5 个 SNP 中发现朝向较高优势比的趋势 ： OL1A1(rs1800012)(SEQ ID NO ： 15)、 RANK(rs12458117) (SEQ ID NO ： 1)、 MMP2(rs243865)(SEQ ID NO ： 2)、 OPG(rs2073618)(SEQ ID NO ： 24) 和 OPN(rs11730582)(SEQ ID ON ： 26)。当一起考虑所有 5 个 SNP 时， 基因型评分为 5 或更高的 患者的事件发生率为 57％， 而那些基因评分低于 5 的患者的事件发生率为 10％。优势比为 11.8％， 95％置信区间为 2.2-63.9， 和 P 值为 0.0008。在针对吸烟状况和 BP 类型进行调整 后， 这 5 个 SNP 的基因型评分仍然保持为很强的 BONJ 独立预测子， 调整的优势比为 11.2， 95％置信区间为 1.8-69.9 和 P 值为 0.0097( 表 12)。基因型评分与吸烟史之间没有相互作 用， 其 p 值为 0.96。
解释
在该研究中， 接受 BP 治疗的 78 名 MM 患者中的 12 名被确认为 BONJ 患者， 相应的 BONJ 患病率为 15 ％。其他研究报告中已报道的患病率为 2.3-11 ％ (Reid， Bone， 44(1) ： 4-10， 2003)。在以往的研究中， 报道过 10％的患病率 (Katz 等， J Support Oncol， 7(1) ： 9-10， 2009)。但是， 所研究患者组包括多种恶性肿瘤患者如 MM、 乳腺癌和前列腺癌。患有 MM 的患者似乎比实体瘤患者更易发生 BONJ。
15％的 BONJ 患病率的发现显著高于最初在制造商发起的流行病学研究中报告的 0.1％至 1.8％的患病率， 并支持了提高 BP 使用的药物警戒性的主张 (Edwards 等， Lancet Oncol， 9(12) ： 1166-72， 2008)。
以往报道发生 BONJ 的平均时间为 26 个月、 不足 36 个月和更长时间 (Migliorati 等。Lancet Oncol， 7(6) ： 508-14)。
有趣的是， 与对照组的 38％相比， 75％的 BONJ 患者有吸烟史。这是独特的发现是 重要的， 因为已知吸烟在与牙周疾病和非 BP 诱导的骨坏死相关的骨再吸收中发挥重要作 用。吸烟可能会导致骨中血管收缩和血栓形成增加， 从而导致可能作为骨坏死的病理生理 学基础的缺血状态 (Assouline-Dayan 等， Semin Arthritis Rheum， 32(2) ： 94-124， 2002)。 在两组中没有发现糖尿病状态的不同， 正如其他人已提出的那样 (Khamaisi 等， J Clin Endocrinol Metab， 92(3) ： 1172-1175， 2006)。
有趣的是， 19 个非裔美国人患者中没有人患 BONJ 和 3 个美籍西班牙人中的 2 个患 有 BONJ。这一结果有助于研究在不同种族 / 人种背景人口中的 BONJ 发病率。
与血栓形成和凝血相关基因的多态性如因子 V Leiden 突变和编码药物转运蛋白， P- 糖蛋白， 的多耐药性基因 1(ABCB1) 的多态性已分别结合股骨头的无血管 ONJ 和类固醇 诱导的 ONJ 进行了描述 (Bjorkman 等， Arch Orthop Trauma Surg， 125(1) ： 51-5， 2005 和 Asano 等， Pharmacogenetics， 13(11) ： 675-82， 2003)， 然而， 截至目前 CYP2C8 的多态性是 在与 BONJ 相关的文献中发表的唯一遗传研究 (Sarasquete 等， Blood， 112(7) ： 2709-12， 2008)。
研究了细胞色素 P450CYP2C8 的多态性以及与骨代谢和破骨细胞的活性 ( 其被认为是 BP 的主要作用 ) 高度相关的基因的 SNP 之间的相关性。以往报道的 BONJ 和细胞 色素 P450 CYP2C8 的多态性之间的相关性未得到证实 (Sarasquete 等， Blood， 112(7) ： 2709-12， 2008)。这可能是由于不同的遗传背景和其他环境因素造成的。然而， 观察到 COL1A1rs1800012(SEQ ID NO ： 15)、 RANK rs12458117(SEQ ID NO ： 1)、 MMP2rs243865(SEQ ID NO ： 2) 和 OPN rs11730582(SEQ ID NO ： 26) 的携带者发生 BONJ 的优势比高于 1.5。 还发 现， 综合基因型评分＞＝ 5 的患者在这一研究的患者退休中具有高 11 倍的发生 BONJ 的优 势比。
这些数据支持了是多个基因而不是一个基因参与 BONJ 易感性的假设。也表明所 有的 5 个基因参与破骨细胞生成、 破骨细胞分化、 骨再吸收或骨矿物质密度， 这支持了 BONJ 是由 BP 治疗的破骨细胞抑制效应导致的骨重建和骨代谢停止引起的假设 (Van Beek 等 Bone， 30(1) ： 64-70， 2002)。
这些发现可显著提高事先预测 BONJ 风险的能力， 并且对于使用 BP 治疗的患者的 治疗有一定影响。该研究显示 COLA1、 RANK、 MMP2、 OPG 和 OPN 的 SNP 的综合基因型评分与 接受 IV BP 治疗的 MM 患者中发生 ONJ 的风险相关。该发现可用于通过鉴别携带这些变异 体的患者以改进治疗方案， 旨在降低 ONJ 的发病率。
表 9. 患有和未患 BONJ 患者的特征
缩写 ： BONJ， 二膦酸盐诱导的颌骨坏死 ； W， 白种人 ； AA， 非裔美国人 ； H， 美籍西班牙 人； P， 帕米膦酸 ； Z， 唑来膦酸 ； THAL， 沙立度胺。 *
Z/P 表示患者接受唑来膦酸， 然后很快转换为帕米膦酸， 而 P/Z 表示相反。
表 10.BONJ 潜在风险因子的多变量逻辑回归分析
表 12.BONJ 优势比 ： 基因型评分≥ 5 对＜ 5 的患者30CN 102812132 A说明书p值 0.0008 0.009728/28 页BONJ 优势比 (95％置信区间 ) 基因型评分≥ 5 基因型评分≥ 5
§未调整 调整 §11.81(2.18-63.9) 11.20(1.80-69.86)对于吸烟史和所使用的 BP 类型进行调整
其他实施方案
应理解本文所描述的实施例和实施方案仅作说明目的， 并且根据本发明的实施例 和实施方案的多种修改或变化是本领域技术人员容易想到的和将包括在本发明的精神和 界限及所附权利要求的范围内。此外， 本文公开的任何发明或其实施方案的任何元素或限 度可以结合任何和 / 或所有的其它元素或限度 ( 单独或以任意组合 ) 或任何本文公开的其 他发明或实施方案， 且所有这些组合意图包括在本发明的范围内但不限于此。31CN 102812132 A
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