产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽ACAPC2融合蛋白基因工程菌株及其构建方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210585411.2	申请日：	2012.12.31
公开号：	CN103031267A	公开日：	2013.04.10
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N 1/21申请日:20121231授权公告日:20140625终止日期:20151231\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/21申请日:20121231\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N1/21; C12N15/70; C12R1/19(2006.01)N	主分类号：	C12N1/21
申请人：	黑龙江大学
发明人：	余琼
地址：	150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路74号
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内容摘要

产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，涉及一种基因工程菌株及其构建方法。本发明的目的在于提供一种产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产CGRP-AcAPc2融合蛋白，该融合蛋白具有治疗高血压和抗血栓双重作用。该基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAPc2基因。方法：一、融合蛋白CGRP/AcAPc2基因的合成；二、重组表达载体构建；三、将重组表达载体转化到大肠杆菌中，提取转化菌质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，基因测序，测序结果正确的为阳性重组菌。本发明用于生产具有抗血栓和治疗高血压双重作用的融合蛋白。

权利要求书

权利要求书产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株，其特征在于该基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因。
根据权利要求1所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株，其特征在于所述融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
如权利要求1所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、在CGRP和AcAPc2融合基因内设计一个KpnⅠ酶切位点，合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因两端分别添加BamHI和EcoRⅠ酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC（CGRP/AcAPc2）载体；
二、将步骤一获得的pUC（CGRP/AcAPc2）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切，再与同样经BamHI和EcoRⅠ双酶切的表达载体pGEX‑6P‑1连接，获得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重组表达载体pGEX‑CGRP/AcAPc2；
三、然后将载体pGEX‑CGRP/AcAPc2转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，随机挑取转化菌37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，并用空白质粒pGEX‑6P‑1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌。
根据权利要求3所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中pUC（CGRP/AcAPc2）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切的体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴，10h。
根据权利要求3所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中表达载体pGEX‑6P‑1双酶切的体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴，10h。
根据权利要求3所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中连接反应体系如下：

连接反应条件：16℃水浴，8～12h。

说明书

说明书产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种基因工程菌株及其构建方法。
背景技术
Rosenfeld等于1983年发现降钙素基因相关肽（CGRP）是一种生物活性肽，它与降钙素（CT）均来源于位于11号染色体的CT/CGRP基因，但是由于CT/CGRP基因不同的RNA编码而翻译成CGRP和CT，CGRP是应DNA基因重组和分子生物技术研究发现的一种由37个氨基酸组成的生物活性多肽，是目前发现的最强的内源性扩血管肽类物质，对神经、心血管、呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系统具有重要作用。CGRP的舒张冠状血管的作用远强于P物质，心钠素和去甲肾上腺素（NE），比乙酰胆碱（Ach）、5‑羟色胺（5‑HT）等强10000倍左右，比异丙肾上腺素强10‑100倍。
犬钩虫吸血时，其头腺能分泌一种抗凝血活性物质，被称作犬钩虫抗凝血肽（anticoagulant peptide，AcAPs）。该物质本质是一种蛋白水解酶，具有延长血浆凝血酶原时间(pt)、抑制血液凝固以及促进纤维蛋白溶解的作用。目前发现的AcAPs有AcAP5，AcAP6，AcAPc2三种重组蛋白，其中AcAPc2(10KD)是Xa因子的高效特异抑制剂，其抗血栓效果明显优于凝血酶抑制剂，AcAPc2作为Xa因子的高效特异抑制剂对血小板聚集功能影响甚小，用于抗血栓治疗时引发出血的危险性小。1998年，Donnelly等报道AcAPc2在体内还具有抗肿瘤细胞转移的作用。AcAPc2的抗凝血、抗血栓作用，使之具有成为临床上一种新的抗凝剂和抗血栓治疗药物。
然而目前这两种蛋白单独作用，效果单一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产CGRP‑AcAPc2融合蛋白，CGRP‑AcAPc2融合蛋白具有抗血栓和治疗高血压双重作用。
本发明产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因。
所述融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
上述产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：
一、在CGRP和AcAPc2融合基因内设计一个KpnⅠ酶切位点，合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因两端分别添加BamHI和EcoRⅠ酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC（CGRP/AcAPc2）载体；
二、将步骤一获得的pUC（CGRP/AcAPc2）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切，再与同样经BamHI和EcoRⅠ双酶切的表达载体pGEX‑6P‑1连接，获得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重组表达载体pGEX‑CGRP/AcAPc2；
三、然后将载体pGEX‑CGRP/AcAPc2转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，随机挑取转化菌37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，并用空白质粒pGEX‑6P‑1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌。
本发明的有益效果：本发明基因工程菌株可以生产CGRP‑AcAPc2融合蛋白，降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2之间作用互补且协同增效，CGRP‑AcAPc2融合蛋白具有抗血栓和治疗高血压双重作用。本发明基因工程菌株生产的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白表达量为38.1%。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因。
具体实施方式二：具体实施方式一所述融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
具体实施方式三：具体实施方式一所述产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：
一、在CGRP和AcAPc2融合基因内设计一个KpnⅠ酶切位点，由上海生工公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因两端分别添加BamHI和EcoRⅠ酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC（CGRP/AcAPc2）载体；
二、将步骤一获得的pUC（CGRP/AcAPc2）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切，再与同样经BamHI和EcoRⅠ双酶切的表达载体pGEX‑6P‑1连接，获得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重组表达载体pGEX‑CGRP/AcAPc2；
三、然后将载体pGEX‑CGRP/AcAPc2转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，随机挑取转化菌37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒（购买自北京艾德莱生物科技有限公司）提取质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，并用空白质粒pGEX‑6P‑1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌；其中大肠杆菌BL21（DE3）为购买得到。
步骤二中pUC（CGRP/AcAPc2）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切的体系如下：
成分用量pUC（CGRP/AcAPc2）载体20µL10×M buffer6µLBamHI3µLEcoRⅠ3µLddH2O28µL
酶切反应条件：37℃水浴，10h。
步骤二中表达载体pGEX‑6P‑1双酶切的体系如下：
成分用量pGEX‑6P‑120µL10×M buffer6µLBamHI3µLEcoRⅠ3µLddH2O28µL
酶切反应条件：37℃水浴，10h。
步骤二中连接反应体系如下：
成分用量目的基因CGRP/AcAPc213µL酶切后pGEX‑6P‑1载体3µLT4 DNA连接酶2µL10×T4 DNA连接酶buffer2µL
连接反应条件：16℃水浴，8～12h。所述T4 DNA连接酶，购买自TaKaRa公司。
将本实施方式获得的阳性重组菌置于LB培养基28℃培养15h，然后采用GST标签融合蛋白方法进行蛋白的分离纯化，获得降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白。本实施方式获得的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白表达量为38.1%。
由生物工程公司将融合蛋白CGRP/AcAP5基因克隆到pUC57载体上。
为验证本实施方式基因工程菌株所产融合蛋白的效果，进行以下实验：
CGRP‑AcAPc2融合蛋白抗血栓实验：
取SD大鼠，随机分为11组，每组8只，每组给药剂量如下：阴性对照组给予同体积的生理盐水；阳性对照组选用肝素钠注射液，给药剂量为1650 U/kg；CGRP低剂量组给药40μg/kg；CGRP中剂量组给药200μg/kg；CGRP高剂量组给药1mg/kg；AcAPc2低剂量组给药40μg/kg；AcAPc2中剂量组给药200μg/kg；AcAPc2高剂量组给药1mg/kg；CGRP‑AcAPc2融合蛋白低剂量组给药40μg/kg；CGRP‑AcAPc2融合蛋白中剂量组给药200μg/kg；CGRP‑AcAPc2融合蛋白高剂量组给药1mg/kg。全部由静脉注射给药。经静脉注射给药后，立即将分离好的颈动脉置于YLS‑14B小动物血栓生成仪的探测接头内，启动血栓生成仪，用恒流直流电刺激(1 mA)。记录探头通过红外扫描测量血液的流通量并换算出血管堵塞程度（测量的时间间隔为4 s，以百分数表示数据，全部过程持续5 min）。结果如表1所示：
表1 CGRP‑AcAPc2融合蛋白抗大鼠颈总动脉血栓的效果[n, ]
组别n给药剂量颈总动脉的堵塞程度(%)阴性对照组80μg/kg100.00±0.00阳性对照组81650U/kg48.46±42.78CGRP低剂量组840μg/kg51.10±33.98*CGRP中剂量组8200μg/kg36.03±24.75*CGRP高剂量组81mg/kg26.39±22.47*AcAPc2低剂量组840μg/kg46.27±40.54*AcAPc2中剂量组8200μg/kg33.75±39.58*AcAPc2高剂量组81mg/kg21.49±13.77**CGRP‑AcAPc2融合蛋白低剂量组840μg/kg39.28±42.11*CGRP‑AcAPc2融合蛋白中剂量组8200μg/kg25.38±40.73*CGRP‑AcAPc2融合蛋白高剂量组81mg/kg11.89±12.56**
与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01
结果表明：注射AcAPc2蛋白溶液和CGRP‑AcAPc2融合蛋白溶液虽然都有抗血栓的作用，但CGRP‑AcAPc2融合蛋白的抗血栓效果最佳，且比单独注射AcAPc2蛋白溶液的效果有显著提高，说明CGRP和AcAPc2融合可以增强犬钩虫抗凝肽AcAPc2的作用。
由高血压实验和抗血栓实验结果可知，降钙素基因相关肽（CGRP）和犬钩虫抗凝肽（AcAPc2）融合可以互相促进，协同增效。
CGRP‑AcAPc2融合蛋白治疗大鼠心肌缺血的实验：
取SD大鼠30只，造成心肌缺血模型；大鼠随机分成三组（对照组、实验A组和实验B组），实验A组按2.5mg/kg·b.w剂量注射CGRP蛋白；实验B组按2.5mg/kg·b.w剂量注射CGRP‑AcAPc2融合蛋白；对照组注射同等剂量的生理盐水。
实验进行4次，对大鼠心肌进行危险区域、坏死区及坏死区与危险区域的比值检测，检测结果如表2所示，其中AAR（Area at risk）为危险区域，IS（Infarct size）为坏死区。
表2 梗死区大小（）

*P<0.05，**P<0.01
结果表明：实验A组和实验B组与对照组相比虽然都有治疗心肌缺血的作用，但是CGRP‑AcAPc2融合蛋白的治疗效果最佳，且比单独注射CGRP蛋白的效果有显著提高，说明AcAPc2和CGRP融合可以增强降钙素基因相关肽（CGRP）的作用。
由骨质疏松实验和心肌缺血实验结果可知，犬钩虫抗凝血肽（AcAPc2）和降钙素基因相关肽（CGRP）融合可以互相促进，协同增效。
CGRP‑AcAPc2融合蛋白毒性实验：
哈尔滨医科大学实验动物中心提供 SPF 级昆明小鼠。取60只6周龄、雌雄各半、体质量为18±2g的小鼠作为实验对象。将小鼠随机分为2组：实验组和对照组，采用最大耐药量给药（根据临床干扰素用量50μg/kg）。实验组注射CGRP‑AcAPc2融合蛋白，总剂量 1mg/kg，一次性给药0.02mL。对照组小鼠注射同等剂量生理盐水。
给药过程中小鼠表现正常，进食、饮水正常、尿粪正常、毛色顺白而有光泽、活动自如、反应性好、小鼠之间无相互撕咬现象。连续饲养14天和30天，小鼠均未出现死亡。
CGRP‑AcAPc2融合蛋白给药14天、30天后，处死小鼠，摘眼球取血，3000r/min离心 5 min，吸取血清，用 Beckman 全自动生化分析仪检测主要生化指标：天冬氨酸转氨酶( AST) 、丙氨酸转氨酶( ALT) 、肌酐( CREA) 、尿素氮( BUN) 、尿酸 ( URCA) 、总胆红素( TBIL) 、总胆汁酸( TBA) 。血生化指标如表3所示。
表3 血生化指标

CGRP‑AcAPc2融合蛋白给药14天、30天后处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾，观察脏器颜色、形态，计算各脏器系数。根据统计学样本估计，在每组中随机抽取7只小鼠，取心、肝、脾、肺、肾 HE 染色做病理组织学检查；取骨髓组织瑞氏染色观察细胞有无水肿、变性、坏死等。主要脏器的病理观察结果如表4所示。
表4 脏器病理观察结果
组别天数心肝脾肺肾对照组143.69±0.8431.73±3.144.68±0.822.90±0.817.97±0.86实验组143.68±0.9030.68±2.864.76±0.802.90±0.737.88±0.92对照组303.55±0.8630.54±2.954.76±0.792.91±0.797.94±0.85实验组303.56±0.8831.49±3.114.59±0.772.90±0.857.93±0.83
实验组与对照组主要脏器心、肝、脾、肺、肾的 HE 染色及骨髓 Wright 染色对比观察发现：各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和骨髓均无水肿、变性、坏死等异常改变。
本实验对心、脾、肺、肾的病理切片和骨髓涂片进行了观察，均未见明显的损伤性改变。对5种脏器的脏器系数统计学分析得出各组间差异无显著性。均说明CGRP‑AcAPc2融合蛋白及其代谢产物未对脏器产生器质性损害。血生化指标检测各组间差异性无显著说明CGRP‑AcAPc2融合蛋白对肝脏、肾脏无功能性损害。表明CGRP‑AcAPc2融合蛋白具有较好的生物相容性，对小鼠无急性毒性、长期毒性。
本实施方式获得的CGRP‑AcAPc2融合蛋白在降钙素基因相关肽（CGRP）和犬钩虫抗凝血肽之间插入GlyThr，改变了多肽的二级结构，但不仅没有使AcAPc2和CGRP丧失生物活性，反而提高了其生物活性。本实施方式大肠杆菌BL21（DE3‑CGRP/AcAPc2）内CGRP‑AcAPc2融合蛋白的表达量也比单一的AcAPc2或CGRP在大肠杆菌中的表达量高。
本实施方式融合蛋白可通过注射或者口服的方式进行给药，不存在首过效应。
构建本实施方式大肠杆菌BL21（DE3‑CGRP/AcAPc2）时改变了CGRP和犬钩虫抗凝血肽AcAPc2的二级结构，这种改变没有产生体内毒性，发酵产生的融合蛋白具有安全性；而且二级结构的改变不影响层析和纯化，利用本实施方式大肠杆菌BL21（DE3‑CGRP/AcAPc2）发酵CGRP‑AcAPc2融合蛋白具有分离纯化容易的特点。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均购买获得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。

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1、(10)申请公布号 CN 103031267 A (43)申请公布日 2013.04.10 CN 103031267 A *CN103031267A* (21)申请号 201210585411.2 (22)申请日 2012.12.31 C12N 1/21(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人黑龙江大学地址 150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路 74 号 (72)发明人余琼 (54) 发明名称产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株及其构建方法 (57) 摘要产降钙素基因相关肽与。

2、犬钩虫抗凝肽AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，涉及一种基因工程菌株及其构建方法。本发明的目的在于提供一种产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产 CGRP-AcAPc2 融合蛋白，该融合蛋白具有治疗高血压和抗血栓双重作用。该基因工程菌株含有融合蛋白 CGRP/AcAPc2 基因。方法：一、融合蛋白 CGRP/AcAPc2 基因的合成；二、重组表达载体构建；三、将重组表达载体转化到大肠杆菌中，提取转化菌质粒DNA，用Kpn单酶切，基因测序，测序结果正确的为阳性重组菌。本发明用。

3、于生产具有抗血栓和治疗高血压双重作用的融合蛋白。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页说明书 6 页序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 2 页说明书 6 页序列表 2 页 1/2 页 2 1. 产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株，其特征在于该基因工程菌株含有融合蛋白 CGRP/ AcAPc2 基因。 2. 根据权利要求 1 所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株，其特征在于所述融合蛋白 CGRP/ AcAPc2 基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO。

4、： 1 所示。 3. 如权利要求 1 所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、在CGRP和AcAPc2融合基因内设计一个Kpn酶切位点，合成核苷酸序列如SEQ ID NO ： 1 所示的融合蛋白 CGRP/AcAPc2 基因，并在融合蛋白 CGRP/AcAPc2 基因两端分别添加 BamHI 和 EcoR 酶切位点，然后克隆在 pUC57 载体上，获得 pUC（CGRP/AcAPc2）载体；二、将步骤一获得的 pUC（CGRP/AcAPc2）载体用 BamHI 和 EcoR 双酶切。

5、，再与同样经 BamHI 和 EcoR 双酶切的表达载体 pGEX-6P-1 连接，获得融合蛋白 CGRP/AcAPc2 基因重组表达载体 pGEX-CGRP/AcAPc2 ；三、然后将载体 pGEX-CGRP/AcAPc2 转化到大肠杆菌 BL21（DE3）中，随机挑取转化菌 37过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒 DNA，用 Kpn 单酶切，并用空白质粒 pGEX-6P-1 作为对照，将含有 Kpn 酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌。 4. 根据权利要求 3 所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株的构。

6、建方法，其特征在于步骤二中 pUC（CGRP/AcAPc2）载体用 BamHI 和 EcoR 双酶切的体系如下：酶切反应条件： 37水浴， 10h。 5. 根据权利要求 3 所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中表达载体 pGEX-6P-1 双酶切的体系如下：权利要求书 CN 103031267 A 2 2/2 页 3 酶切反应条件： 37水浴， 10h。 6. 根据权利要求 3 所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中连接反应体系。

7、如下：连接反应条件： 16水浴， 8 12h。权利要求书 CN 103031267 A 3 1/6 页 4 产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株及其构建方法技术领域 0001 本发明涉及一种基因工程菌株及其构建方法。背景技术 0002 Rosenfeld 等于 1983 年发现降钙素基因相关肽（CGRP）是一种生物活性肽，它与降钙素（CT）均来源于位于 11 号染色体的 CT/CGRP 基因，但是由于 CT/CGRP 基因不同的 RNA 编码而翻译成 CGRP 和 CT， CGRP 是应 DNA 基因重组和分子生物技术研究发现。

8、的一种由 37 个氨基酸组成的生物活性多肽，是目前发现的最强的内源性扩血管肽类物质，对神经、心血管、呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系统具有重要作用。CGRP 的舒张冠状血管的作用远强于 P 物质，心钠素和去甲肾上腺素（NE），比乙酰胆碱（Ach）、 5- 羟色胺（5-HT）等强 10000 倍左右，比异丙肾上腺素强 10-100 倍。 0003 犬钩虫吸血时，其头腺能分泌一种抗凝血活性物质，被称作犬钩虫抗凝血肽（anticoagulant peptide， AcAPs）。该物质本质是一种蛋白水解酶，具有延长血浆凝血酶原时间 (pt)、。

9、抑制血液凝固以及促进纤维蛋白溶解的作用。目前发现的 AcAPs 有 AcAP5， AcAP6， AcAPc2 三种重组蛋白，其中 AcAPc2(10KD) 是 Xa 因子的高效特异抑制剂，其抗血栓效果明显优于凝血酶抑制剂， AcAPc2 作为 Xa 因子的高效特异抑制剂对血小板聚集功能影响甚小，用于抗血栓治疗时引发出血的危险性小。1998 年， Donnelly 等报道 AcAPc2 在体内还具有抗肿瘤细胞转移的作用。 AcAPc2的抗凝血、抗血栓作用，使之具有成为临床上一种新的抗凝剂和抗血栓治疗药物。 0004 然而目前这两种蛋白单独作用，效果单一。发明内容 0005。

10、本发明的目的在于提供一种产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产 CGRP-AcAPc2 融合蛋白， CGRP-AcAPc2 融合蛋白具有抗血栓和治疗高血压双重作用。 0006 本发明产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白 CGRP/ AcAPc2 基因。 0007 所述融合蛋白 CGRP/ AcAPc2 基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 0008 上述产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行： 0009 。

11、一、在 CGRP 和 AcAPc2 融合基因内设计一个 Kpn 酶切位点，合成核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示的融合蛋白 CGRP/AcAPc2 基因，并在融合蛋白 CGRP/AcAPc2 基因两端分别添加 BamHI 和 EcoR 酶切位点，然后克隆在 pUC57 载体上，获得 pUC（CGRP/AcAPc2）载体； 0010 二、将步骤一获得的 pUC（CGRP/AcAPc2）载体用 BamHI 和 EcoR 双酶切，再与同说明书 CN 103031267 A 4 2/6 页 5 样经 BamHI 和 EcoR 双酶切的表达载体 pGEX-6P-。

12、1 连接，获得融合蛋白 CGRP/AcAPc2 基因重组表达载体 pGEX-CGRP/AcAPc2 ； 0011 三、然后将载体 pGEX-CGRP/AcAPc2 转化到大肠杆菌 BL21（DE3）中，随机挑取转化菌 37过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒 DNA，用 Kpn 单酶切，并用空白质粒 pGEX-6P-1 作为对照，将含有 Kpn 酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌。 0012 本发明的有益效果：本发明基因工程菌株可以生产 CGRP-AcAPc2 融合蛋白，降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 之间作用互补且协同增效，。

13、 CGRP-AcAPc2 融合蛋白具有抗血栓和治疗高血压双重作用。本发明基因工程菌株生产的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白表达量为 38.1%。具体实施方式 0013 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。 0014 具体实施方式一：本实施方式产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白 CGRP/ AcAPc2 基因。 0015 具体实施方式二：具体实施方式一所述融合蛋白 CGRP/ AcAPc2 基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 0016 具体实施方式三：具体实。

14、施方式一所述产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行： 0017 一、在 CGRP 和 AcAPc2 融合基因内设计一个 Kpn 酶切位点，由上海生工公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO ： 1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2 基因两端分别添加 BamHI 和 EcoR 酶切位点，然后克隆在 pUC57 载体上，获得 pUC（CGRP/ AcAPc2）载体； 0018 二、将步骤一获得的 pUC（CGRP/AcAPc2）载体用 BamHI 和 EcoR 双酶切，再与同。

15、样经 BamHI 和 EcoR 双酶切的表达载体 pGEX-6P-1 连接，获得融合蛋白 CGRP/AcAPc2 基因重组表达载体 pGEX-CGRP/AcAPc2 ； 0019 三、然后将载体 pGEX-CGRP/AcAPc2 转化到大肠杆菌 BL21（DE3）中，随机挑取转化菌 37过夜培养，采用质粒提取试剂盒（购买自北京艾德莱生物科技有限公司）提取质粒 DNA，用 Kpn 单酶切，并用空白质粒 pGEX-6P-1 作为对照，将含有 Kpn 酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌；其中大肠杆菌 BL21（DE3）为购买得到。 0020 步。

16、骤二中 pUC（CGRP/AcAPc2）载体用 BamHI 和 EcoR 双酶切的体系如下： 0021 成分用量 pUC（CGRP/AcAPc2）载体20L 10M buffer6L 说明书 CN 103031267 A 5 3/6 页 6 BamHI3L EcoR 3L ddH2O28L 0022 酶切反应条件： 37水浴， 10h。 0023 步骤二中表达载体 pGEX-6P-1 双酶切的体系如下： 0024 成分用量 pGEX-6P-120L 10M buffer6L BamHI3L EcoR 3L ddH2O28L 0025 酶切反应条件： 37水浴， 10h。 002。

17、6 步骤二中连接反应体系如下： 0027 成分用量目的基因 CGRP/AcAPc213L 酶切后 pGEX-6P-1 载体3L T4 DNA 连接酶2L 10T4 DNA 连接酶 buffer2L 0028 连接反应条件： 16水浴， 8 12h。所述 T4 DNA 连接酶，购买自 TaKaRa 公司。 0029 将本实施方式获得的阳性重组菌置于 LB 培养基 28培养 15h，然后采用 GST 标签融合蛋白方法进行蛋白的分离纯化，获得降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽 AcAPc2 融合蛋白。本实施方式获得的融合蛋白的纯度为 98%，融合蛋白表达量为 38.1%。 0030 由。

18、生物工程公司将融合蛋白 CGRP/AcAP5 基因克隆到 pUC57 载体上。 0031 为验证本实施方式基因工程菌株所产融合蛋白的效果，进行以下实验： 0032 CGRP-AcAPc2 融合蛋白抗血栓实验： 0033 取 SD 大鼠，随机分为 11 组，每组 8 只，每组给药剂量如下：阴性对照组给予同体积的生理盐水；阳性对照组选用肝素钠注射液，给药剂量为 1650 U/kg ； CGRP 低剂量组给药 40g/kg ； CGRP 中剂量组给药 200g/kg ； CGRP 高剂量组给药 1mg/kg ； AcAPc2 低剂量组给说明书 CN 103031267 。

19、A 6 4/6 页 7 药40g/kg ； AcAPc2中剂量组给药200g/kg ； AcAPc2高剂量组给药1mg/kg ； CGRP-AcAPc2 融合蛋白低剂量组给药 40g/kg ； CGRP-AcAPc2 融合蛋白中剂量组给药 200g/kg ； CGRP-AcAPc2 融合蛋白高剂量组给药 1mg/kg。全部由静脉注射给药。经静脉注射给药后，立即将分离好的颈动脉置于 YLS-14B 小动物血栓生成仪的探测接头内，启动血栓生成仪，用恒流直流电刺激(1 mA)。记录探头通过红外扫描测量血液的流通量并换算出血管堵塞程度（测量的时间间隔为 4 s，以百分数表示数据，全部过。

20、程持续 5 min）。结果如表 1 所示： 0034 表 1 CGRP-AcAPc2 融合蛋白抗大鼠颈总动脉血栓的效果 n, 0035 组别n给药剂量颈总动脉的堵塞程度 (%) 阴性对照组80g/kg100.000.00 阳性对照组81650U/kg48.4642.78 CGRP 低剂量组840g/kg51.1033.98* CGRP 中剂量组8200g/kg 36.0324.75* CGRP 高剂量组81mg/kg26.3922.47* AcAPc2 低剂量组840g/kg46.2740.54* AcAPc2 中剂量组8200g/kg 33.7539.58* AcAPc2 高剂量组81m。

21、g/kg21.4913.77* CGRP-AcAPc2 融合蛋白低剂量组840g/kg39.2842.11* CGRP-AcAPc2 融合蛋白中剂量组8200g/kg 25.3840.73* CGRP-AcAPc2 融合蛋白高剂量组81mg/kg11.8912.56* 0036 与对照组比较： *P0.05， *P0.01 0037 结果表明：注射AcAPc2蛋白溶液和CGRP-AcAPc2融合蛋白溶液虽然都有抗血栓的作用，但 CGRP-AcAPc2 融合蛋白的抗血栓效果最佳，且比单独注射 AcAPc2 蛋白溶液的效果有显著提高，说明 CGRP 和 AcAPc2 融合可以增强犬。

22、钩虫抗凝肽 AcAPc2 的作用。 0038 由高血压实验和抗血栓实验结果可知，降钙素基因相关肽（CGRP）和犬钩虫抗凝肽（AcAPc2）融合可以互相促进，协同增效。 0039 CGRP-AcAPc2 融合蛋白治疗大鼠心肌缺血的实验： 0040 取SD大鼠30只，造成心肌缺血模型；大鼠随机分成三组（对照组、实验A组和实验 B 组），实验 A 组按 2.5mg/kgb.w 剂量注射 CGRP 蛋白；实验 B 组按 2.5mg/kgb.w 剂量注射 CGRP-AcAPc2 融合蛋白；对照组注射同等剂量的生理盐水。 0041 实验进行 4 次，对大鼠心肌进行危。

23、险区域、坏死区及坏死区与危险区域的比值检说明书 CN 103031267 A 7 5/6 页 8 测，检测结果如表 2 所示，其中 AAR（Area at risk）为危险区域， IS（Infarct size）为坏死区。 0042 表 2 梗死区大小（） 0043 0044 *P0.05， *P0.01 0045 结果表明：实验A组和实验B组与对照组相比虽然都有治疗心肌缺血的作用，但是 CGRP-AcAPc2 融合蛋白的治疗效果最佳，且比单独注射 CGRP 蛋白的效果有显著提高，说明 AcAPc2 和 CGRP 融合可以增强降钙素基因相关肽（CGRP）的作用。

24、。 0046 由骨质疏松实验和心肌缺血实验结果可知，犬钩虫抗凝血肽（AcAPc2）和降钙素基因相关肽（CGRP）融合可以互相促进，协同增效。 0047 CGRP-AcAPc2 融合蛋白毒性实验： 0048 哈尔滨医科大学实验动物中心提供 SPF 级昆明小鼠。取 60 只 6 周龄、雌雄各半、体质量为 182g 的小鼠作为实验对象。将小鼠随机分为 2 组：实验组和对照组，采用最大耐药量给药（根据临床干扰素用量 50g/kg）。实验组注射 CGRP-AcAPc2 融合蛋白，总剂量 1mg/kg，一次性给药 0.02mL。对照组小鼠注射同等剂量生理盐水。 0049。

25、给药过程中小鼠表现正常，进食、饮水正常、尿粪正常、毛色顺白而有光泽、活动自如、反应性好、小鼠之间无相互撕咬现象。连续饲养 14 天和 30 天，小鼠均未出现死亡。 0050 CGRP-AcAPc2 融合蛋白给药 14 天、 30 天后，处死小鼠，摘眼球取血， 3000r/min 离心 5 min，吸取血清，用 Beckman 全自动生化分析仪检测主要生化指标：天冬氨酸转氨酶( AST) 、丙氨酸转氨酶( ALT) 、肌酐( CREA) 、尿素氮( BUN) 、尿酸 ( URCA) 、总胆红素( TBIL) 、总胆汁酸 ( TBA) 。血生化指标如表。

26、 3 所示。 0051 表 3 血生化指标 0052 0053 CGRP-AcAPc2融合蛋白给药14天、 30天后处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾，观察脏器颜色、形态，计算各脏器系数。根据统计学样本估计，在每组中随机抽取 7 只小鼠，取心、肝、脾、肺、肾 HE 染色做病理组织学检查；取骨髓组织瑞氏染色观察细胞有无水肿、变性、坏死说明书 CN 103031267 A 8 6/6 页 9 等。主要脏器的病理观察结果如表 4 所示。 0054 表 4 脏器病理观察结果 0055 组别天数心肝脾肺肾对照组143.690.8431.733.144.680.8。

27、22.900.817.970.86 实验组143.680.9030.682.864.760.802.900.737.880.92 对照组303.550.8630.542.954.760.792.910.797.940.85 实验组303.560.8831.493.114.590.772.900.857.930.83 0056 实验组与对照组主要脏器心、肝、脾、肺、肾的 HE 染色及骨髓 Wright 染色对比观察发现：各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和骨髓均无水肿、变性、坏死等异常改变。 0057 本实验对心、脾、肺、肾的病理切片和骨髓涂片进行了观察，均未见明显的。

28、损伤性改变。对 5 种脏器的脏器系数统计学分析得出各组间差异无显著性。均说明 CGRP-AcAPc2 融合蛋白及其代谢产物未对脏器产生器质性损害。血生化指标检测各组间差异性无显著说明 CGRP-AcAPc2 融合蛋白对肝脏、肾脏无功能性损害。表明 CGRP-AcAPc2 融合蛋白具有较好的生物相容性，对小鼠无急性毒性、长期毒性。 0058 本实施方式获得的 CGRP-AcAPc2 融合蛋白在降钙素基因相关肽（CGRP）和犬钩虫抗凝血肽之间插入 GlyThr，改变了多肽的二级结构，但不仅没有使 AcAPc2 和 CGRP 丧失生物活性，反而提高了其生物活性。本实施方式大。

29、肠杆菌 BL21（DE3-CGRP/AcAPc2）内 CGRP-AcAPc2 融合蛋白的表达量也比单一的 AcAPc2 或 CGRP 在大肠杆菌中的表达量高。 0059 本实施方式融合蛋白可通过注射或者口服的方式进行给药，不存在首过效应。 0060 构建本实施方式大肠杆菌 BL21（DE3-CGRP/AcAPc2）时改变了 CGRP 和犬钩虫抗凝血肽 AcAPc2 的二级结构，这种改变没有产生体内毒性，发酵产生的融合蛋白具有安全性；而且二级结构的改变不影响层析和纯化，利用本实施方式大肠杆菌 BL21（DE3-CGRP/ AcAPc2）发酵 CGRP-AcAPc2 融合蛋白具有分离纯化容易的特点。 0061 本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均购买获得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。说明书 CN 103031267 A 9 1/2 页 10 0001 0002 序列表 CN 103031267 A 10 2/2 页 11 序列表 CN 103031267 A 11 。

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