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1、(10)申请公布号 CN 102864160 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102864160 A *CN102864160A* (21)申请号 201210333742.7 (22)申请日 2012.09.11 C12N 15/56(2006.01) C12N 9/42(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12P 19/14(2006.01) (71)申请人 南京林业大学 地址 210037 江。
2、苏省南京市龙蟠路 159 号 (72)发明人 王飞 时号 李迅 仲惠 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 邱兴天 (54) 发明名称 一种木聚糖酶基因及表达蛋白和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种木聚糖酶基因及其表达蛋 白和应用， 木聚糖酶基因的氨基酸序列如 SEQNO ： 1 所示， 所表达的适合中温下半纤维素水解的木 聚糖酶， 氨基酸序列如 SEQNO ： 2 所示。该木聚糖 酶具有较好的耐热性能和略偏酸性 pH 条件下高 活性的特性。在 80、 pH 为 6.0 的条件下酶活 性最高， 比酶活达到 35U/mg ； 该蛋白酶在温度为 6。
3、0-80、 pH为5.5-65的范围内， 均具有较高的酶 活。该木聚糖酶的耐热性能较高， 在 65， pH6.0 的反应体系中， 保温 2h 酶活性基本保持不变。上 述特性使得本发明得到的木聚糖酶比现有木聚糖 酶具有更大的优越性， 适用于 65以上高温、 略 偏酸性 pH 条件下半纤维素的降解， 具有潜在的工 业应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 5 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种木聚糖酶基因， 其 DNA 序列。
4、如 SEQ NO ： 1 所示。 2. 一种权利要求 1 所述木聚糖酶基因的表达蛋白， 为适合中温下半纤维素水解的木聚 糖酶， 其氨基酸序列如 SEQ NO ： 2 所示。 3. 一种权利要求 1 所述木聚糖酶基因的表达蛋白， 其特征在于 ： 氨基酸序列为权利要 求2所述的SEQ NO ： 2序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失及添加形成 的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白质。 4.一种重组载体， 其特征在于 ： 在所述的重组载体上克隆有如SEQ NO ： 1所示的DNA序 列。 5. 一种重组菌， 其特征在于 ： 在所述的重组菌内克隆有如 SEQ NO ： 1 所示的 DNA 序列。
5、。 6. 一种用于扩增权利要求 1 所述的木聚糖酶基因的引物， 其特征在于 ： 所使用的引物 对为 ： Tth-1 ： 5 -GGAATTCCATATGGGACCACAGCCCATGTCGTC-3 ； Tth-2 ： 5 -CCGCTCGAGCTTGGAAACTGATTCTATTACACTC-3 。 7. 权利要求 2 所述的木聚糖酶在酶解木聚糖中的应用。 8. 根据权利要求 7 所述的应用， 其特征在于 ： 酶解反应温度为 60-80， pH5.5-6.5。 9. 根据权利要求 7 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的木聚糖来源于纤维原料中的半纤 维素， 包括榉木木聚糖、 桦木木聚糖和燕麦木。
6、聚糖。 10. 权利要求 4 所述的重组载体在酶解木聚糖中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102864160 A 2 1/4 页 3 一种木聚糖酶基因及表达蛋白和应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及一种木聚糖酶基因及其表达蛋白和应 用。 背景技术 0002 半纤维素是植物细胞壁的主要成分， 是除纤维素之外自然界中最为丰富的可再生 资源。半纤维素一般由木聚糖即以 -D-1,4 木糖苷键连接起来的一种多聚五碳糖为主链， 并带有多种取代基， 如阿拉伯糖基， - 葡萄糖醛酸基等。木聚糖彻底降解则得到木糖、 阿 魏糖、 阿拉伯糖等， 其中以木糖为主。 木聚糖酶是木聚糖降解。
7、酶系中的最为关键的多糖水解 酶， 通过随机切割木聚糖的 -1,4- 糖苷键， 将木聚糖水解为木寡糖、 低聚木糖及少量的木 糖和阿拉伯糖。 木聚糖酶在造纸纸浆、 酿造及饲料工业等方面已体现显著的应用价值， 因此 可作为一种高效的工业酶制剂应用于上述几个方面。 耐热纤维水解酶包括木聚糖酶及葡聚 糖酶的开发利用是当今纤维类生物质精炼技术领域的重要发展方向。 发明内容 0003 发明目的 ： 针对现有技术中存在的不足， 本发明的目的是提供一种木聚糖酶基因。 本发明的另一目的是提供一种上述木聚糖酶基因表达的适合中温下半纤维素水解的木聚 糖酶。本发明还有一目的是提供上述一种木聚糖酶的应用。 0004 技术。
8、方案 ： 为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案如下 ： 一种木聚糖酶基因， 其 DNA 序列如 SEQ NO ： 1 所示。 0005 一种木聚糖酶基因的表达蛋白， 为适合中温下半纤维素水解的木聚糖酶， 其氨基 酸序列如 SEQ NO ： 2 所示。 0006 一种木聚糖酶基因的表达蛋白， 氨基酸序列为 SEQ NO ： 2 序列中的氨基酸经过一 个或多个氨基酸残基的取代、 缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白质。 0007 一种重组载体， 在所述的重组载体上克隆有如 SEQ NO ： 1 所示的 DNA 序列。 0008 一种重组菌， 在所述的重组菌内克隆有如 SEQ NO ：。
9、 1 所示的 DNA 序列。 0009 一种用于扩增木聚糖酶基因的引物， 所使用的引物对为 ： Tth-1 ： 5 -GGAATTCCATATGGGACCACAGCCCATGTCGTC-3 ； Tth-2 ： 5 -CCGCTCGAGCTTGGAAACTGATTCTATTACACTC-3 。 0010 上述的木聚糖酶在酶解木聚糖中的应用。酶解反应温度为 60-80， pH5.5-6.5。 所述的木聚糖来源于纤维原料中的半纤维素， 包括榉木木聚糖、 桦木木聚糖和燕麦木聚糖。 0011 上述的重组载体或重组菌在酶解木聚糖中的应用。 0012 有益效果 ： 与现有技术相比， 本发明所提供的木聚糖酶具。
10、有较好的的耐热性能和 略偏酸性 pH 条件下高活性的特性。在 80、 pH 为 6.0 的条件下酶活性最高， 比酶活达到 35 U/mg ； 该蛋白酶在温度为 60 -80、 pH 为 5.5-65 的范围内， 均具有较高的酶活。该木 聚糖酶的耐热性能较高， 在 65， pH6.0 的反应体系中， 保温 2h 酶活性基本保持不变。上 说 明 书 CN 102864160 A 3 2/4 页 4 述特性使得本发明得到的木聚糖酶比现有木聚糖酶具有更大的优越性， 适用于 65以上高 温、 略偏酸性 pH 条件下半纤维素的降解， 具有潜在的工业应用价值。 附图说明 0013 图 1 是 Tth xyn。
11、10B 蛋白的 SDS-PAGE 图 ； 图 2 是 Tth xyn10B 蛋白的最适温度结果图 ； 图 3 是 Tth xyn10B 蛋白的最适 pH 结果图 ； 图 4 是 Tth xyn10B 蛋白的热稳定性结果图。 具体实施方式 0014 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。 0015 以下实施例中所使用的材料、 试剂等， 若无特殊说明， 均可从商业途径获得。 0016 实施例 1 嗜热陆地热泉高温神袍菌基因组 DNA 的提取 采用嗜热陆地热泉高温神袍菌Thermotoga thermarum DSM5069（购自德国微生物菌 种保藏中心） 新鲜菌体 10g， 悬于 5mL 50。
12、mM Tris 缓冲溶液中 （pH8.0） ， 混匀后在 37放置 20min， 然后加入2mL 10%SDS， 55放置5min， 用等体积的酚-氯仿 （24:1） 抽提一次， 取上清 液加入 2 倍体积的无水乙醇， 于 -20放置 30min， 4 13000rpm 离心 20min， 收集沉淀。沉 淀溶于 0.5mL TE 缓冲液 （pH8.0， 10mM Tris， 1mM EDTA） ， 加入 10mg/mL RNase 3L， 37保 温 1 h， 用等体积的酚 - 氯仿 （24:1） 抽提一次， 取上清加入 2 倍体积的无水乙醇， 于 -20 放置 30min， 4 13000r。
13、pm 离心 20min， 收集沉淀， 真空冷冻干燥， 用 0.5mL 超纯水溶解。 0017 实施例 2 木聚糖酶基因Tth xyn10B的制备 可采用如下方法制备Tth xyn10B基因， 也可以采用人工合成的方式得到。 0018 以Thermotoga thermarum DSM5069 的总 DNA（实施例 1 制备） 为模版， 用下述引 物对进行 PCR 扩增 ： Tth-1 ： 5 -GGAATTCCATATGGGACCACAGCCCATGTCGTC-3 ； Tth-2 ： 5 -CCGCTCGAGCTTGGAAACTGATTCTATTACACTC-3 ； 引物合成时， Tth-1 。
14、引入 Nde I 酶切位点， Tth-2 引入 Xho I 酶切位点。 0019 PCR反应体系如下 ： 1L T thermarum基因组DNA， 1L Tth-1， 1L Tth-2， 25L Premix ExTaq， 22L 超纯水。 0020 PCR 反应条件 ： 94变性 5min ； 94变性 30sec， 52退火 30sec， 72延伸 3min， 30 个循环， 72延伸 10min， 4保温。 0021 PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异， 并用 PCR 产物回收试剂盒进行纯 化 （BIOMIGA， 上海） 。 0022 实施例 3 重组克隆、 表达载体 。
15、pET-20b-Tth xyn10B的构建与验证 将纯化过的 PCR 产物 （实施例 2 制备） 、 pET-20b（Novagen） 用分别 Nde I 和 Xho I 双 酶切， 琼脂糖电泳回收酶切酶切 PCR 及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体， 经浓缩 加入 8L 无菌水重悬， 加入 8L 10Ligase Buffer 和 1L Ligase， 于 16连接过夜。 用连接反应产物转化大肠杆菌 pET-20b， 然后涂于含 100g/mL Amp（氨苄青霉素） 的培养 皿， 37培养 10-12 h。 说 明 书 CN 102864160 A 4 3/4 页 5 0023 从转化。
16、平板上挑取多个单菌落， 采用 BIOMIGA 的质粒小量提取试剂盒提取质粒。 对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示， pET-20b 载体中 插入了克隆的目的片段 （表达木聚糖酶 Tth xyn10B 的目的片段， 1032bp） ， 进而得到重组克 隆、 表达载体 pET-20b-Tth xyn10B， Tth xyn10B 的核苷酸如 SEQ NO ： 1 所示， 其编码的氨基 酸序列如 SEQ NO ： 2 所示， 将该蛋白命名为 Tth xyn10B。 0024 实施例 4 重组木聚糖酶 Tth xyn10B 的表达与纯化 将重组克隆、 表达载体 pET-20。
17、b-Tth xyn10B（实施例 3 制备） 电转至宿主菌E. coli BL21(DE3)（Novagen） ， 获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于 5 mL 含有 100g/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培养基， 在37温度下， 200 rpm震荡 培养8-12 h。 将上述4mL菌液接种于含400mL培养基的1000mL摇瓶中， 37温度下， 200rpm 震荡培养， 当吸光度达到 0.6-0.8 时， 加人 200L 的 1M IPTG， 并在 30温度下， 120rpm 诱 导表达 10-12h。用高速冷冻离心机将培养液在 4下以 13。
18、000rpm 离心 15min， 收集菌体。 用50mL超纯水洗涤并在4下以13000rpm离心15min， 回收菌体， 接着用20mL 1Binding Buffer 重悬 （0.5M NaCl， 20mM Tris-HCl， 5mM imidazole， pH7.9） ， 在冰水浴中， 用超声波 破碎机破碎细菌细胞， 并在 4下 13000rpm 离心 15min， 得到含木聚糖酶 Tth xyn10B 的粗 提液。 0025 粗提液先经 60加热处理 30min 的热处理， 除去不耐热的杂蛋白， 再用 Ni-NTA 亲 和层析柱进行纯化 （方法见 His-Bind Kits， Novag。
19、en） 。纯化酶纯度的鉴定和分子量的测定 采用 SDS-PAGE 方法进行， 结果见图 1， 1 即表示纯化过后的 Tth xyn10B 蛋白， 分子量约为 40kDa， 与理论值相近。 0026 实施例 5 重组木聚糖酶 Tth xyn10B 的酶学性质分析 酶活定义为 ： 1min 内催化榉木木聚糖 （sigma） 产生 1mol 木糖所需的酶量。 0027 （1） 最适温度 用pH值为6.0的0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施4中的纯酶液， 用稀释后 的酶液进行酶活测定。酶活测定反应体系为 200L， 由 1% 榉木木聚糖 100L， 90L 0.1M 咪唑 - 邻笨二甲酸氢钾缓。
20、冲液和 10L 稀释酶液组成 ； 反应体系的 pH 为 6.0。将反应体系 在 60-95温育 10min 后， 加入 300L DNS 试剂终止反应， 沸水浴 5min 后测定 550nm 的吸 光值。 实验设3次重复， 取平均值作图， 结果如图2所示， 研究结果表明在80时， 木聚糖具 有最高的酶活性， 为 35U/mg ； 将此温度下的酶活反应体系的吸光值最为相对活性 100%， 其 它温度下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值作为相对活性。其中， 在温 度 60-80的反应体系中酶活性较高。 0028 （2） 最适 pH 酶活性测定体系为 200L， 由 1% 榉木木聚糖 1。
21、00L， pH4.0-8.5 的 90L 0.1M 咪 唑 - 邻笨二甲酸氢钾缓冲液和 10L 稀释酶液组成。将反应体系在 95温育 10min 后， 加 入 300L DNS 试剂终止反应， 沸水浴 5min 后测定 550nm 的吸光值 . 实验设 3 次重复实验， 取平均值， 结果如图 3 所示， 研究结果表明， 在 pH 为 6.0 时， 木聚糖酶具有最高的酶活性， 为 35U/mg ； 将此 pH 值下的酶活反应体系的作为相对活性 100%， 其它 pH 值下酶活反应体系的 吸光值与此最高酶活性体系的吸光值的比值作为相对活性。在 pH5.5-6.5 的条件下， 酶活 较高。 说 明 。
22、书 CN 102864160 A 5 4/4 页 6 0029 （3） 重组酶热稳定性 用pH值为6.0的0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例4中的纯酶液， 用稀释 后的酶液进行酶活测定。将稀释酶液在 60、 65、 70、 75和 80和 85水浴 30 min、 60 min、 90 min 和 120 min， 测定酶的残存酶活。酶活测定反应体系中 pH 为 6.0， 测定温度 为 80。实验设 3 次重复， 取平均值。结果如图 4 所示， 研究结果显示， 65处理 2 h， 酶活 保持 80% 以上， 可见该木聚糖酶在 65条件下热稳定非常好， 适宜中温降解木聚糖。 说 明 书。
23、 CN 102864160 A 6 1/5 页 7 SEQUENCE LISTING 南京林业大学 一种木聚糖酶基因及表达蛋白和应用 100 4 PatentIn version 3.3 1 1032 DNA Thermotoga thermarum 1 atgggaccac agcccatgtc gtcacagata ccatccctta aggatgtttt tttgcaggat 60 ttcaaaatag gagtagcttt accagttaga gttttcagca attcgatgga tgtggagtta 120 attacgaagc actttaacag tatgacggct 。
24、gagaacgaga tgaaaccaga gagtatattg 180 agaagggatg cgagtgggaa gatttactat gattttacgg ttgcagacag gtacatagag 240 tttgcgcaga aacatgggat ggttgttagg ggtcatacac ttgtttggca cagtcagacg 300 ccggagtggt ttttcaagga tgagaagggc aatttattga gcagggaagc gatgatagag 360 aggatgcggg agtacataca cacagttgta ggcaggtata gaggcaagg。
25、t gtatgcgtgg 420 gatgtggtga acgaggcggt ggatgagaat cagcctgatg gtttgaggag gagtttgtgg 480 tatcaggtta tagggccgga ttacatagag cttgccttca aatttgctca cgaagcagat 540 ccagacgcct tactcttcta caacgattac aacgaatttt tccccaaaaa gcgagacatc 600 序 列 表 CN 102864160 A 7 2/5 页 8 atcttcaaat tggtaaaaga aatgagagaa aagggtgta。
26、c cgattcatgg tattggcatg 660 cagcaacatt taactcttgc agataacgta ggttggattg atattgctat tcaaaaattc 720 aagaccattt caggtataca aattcacata actgagcttg atgttagtgt ttacaaatca 780 cgcagtccat ctattatcta tcaaacgcca cccttggagg tgctcaagga gcaagcggaa 840 ttttaccgca agttgttcga aatctatagg aaacacactg acgtcataac caacgtt。
27、acc 900 ttctggggtt tgaaagatga ctattcgtgg ctaaggtttt tctttggtcg tagaaacgat 960 tggccgcttt tatttgacga aaattatcaa cccaaaccag ctttttggag tgtaatagaa 1020 tcagtttcca ag 1032 2 344 PRT Thermotoga thermarum 2 Met Gly Pro Gln Pro Met Ser Ser Gln Ile Pro Ser Leu Lys Asp Val 1 5 10 15 Phe Leu Gln Asp Phe Lys I。
28、le Gly Val Ala Leu Pro Val Arg Val Phe 20 25 30 Ser Asn Ser Met Asp Val Glu Leu Ile Thr Lys His Phe Asn Ser Met 35 40 45 Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Pro Glu Ser Ile Leu Arg Arg Asp Ala 50 55 60 序 列 表 CN 102864160 A 8 3/5 页 9 Ser Gly Lys Ile Tyr Tyr Asp Phe Thr Val Ala Asp Arg Tyr Ile Glu 65 70 75 80。
29、 Phe Ala Gln Lys His Gly Met Val Val Arg Gly His Thr Leu Val Trp 85 90 95 His Ser Gln Thr Pro Glu Trp Phe Phe Lys Asp Glu Lys Gly Asn Leu 100 105 110 Leu Ser Arg Glu Ala Met Ile Glu Arg Met Arg Glu Tyr Ile His Thr 115 120 125 Val Val Gly Arg Tyr Arg Gly Lys Val Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn 130 135 14。
30、0 Glu Ala Val Asp Glu Asn Gln Pro Asp Gly Leu Arg Arg Ser Leu Trp 145 150 155 160 Tyr Gln Val Ile Gly Pro Asp Tyr Ile Glu Leu Ala Phe Lys Phe Ala 165 170 175 His Glu Ala Asp Pro Asp Ala Leu Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Asn Glu 180 185 190 Phe Phe Pro Lys Lys Arg Asp Ile Ile Phe Lys Leu Val Lys Glu Met 19。
31、5 200 205 Arg Glu Lys Gly Val Pro Ile His Gly Ile Gly Met Gln Gln His Leu 210 215 220 序 列 表 CN 102864160 A 9 4/5 页 10 Thr Leu Ala Asp Asn Val Gly Trp Ile Asp Ile Ala Ile Gln Lys Phe 225 230 235 240 Lys Thr Ile Ser Gly Ile Gln Ile His Ile Thr Glu Leu Asp Val Ser 245 250 255 Val Tyr Lys Ser Arg Ser Pr。
32、o Ser Ile Ile Tyr Gln Thr Pro Pro Leu 260 265 270 Glu Val Leu Lys Glu Gln Ala Glu Phe Tyr Arg Lys Leu Phe Glu Ile 275 280 285 Tyr Arg Lys His Thr Asp Val Ile Thr Asn Val Thr Phe Trp Gly Leu 290 295 300 Lys Asp Asp Tyr Ser Trp Leu Arg Phe Phe Phe Gly Arg Arg Asn Asp 305 310 315 320 Trp Pro Leu Leu Ph。
33、e Asp Glu Asn Tyr Gln Pro Lys Pro Ala Phe Trp 325 330 335 Ser Val Ile Glu Ser Val Ser Lys 340 3 33 DNA Artificial 序 列 表 CN 102864160 A 10 5/5 页 11 Tth-1 引物序列 3 ggaattccat atgggaccac agcccatgtc gtc 33 4 34 DNA Artificial Tth-2 引物序列 4 ccgctcgagc ttggaaactg attctattac actc 34 序 列 表 CN 102864160 A 11 1/2 页 12 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102864160 A 12 2/2 页 13 图 4 说 明 书 附 图 CN 102864160 A 13 。