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1、(10)申请公布号 CN 102850453 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102850453 A *CN102850453A* (21)申请号 201210320174.7 (22)申请日 2012.09.03 C07K 16/02(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/18(2006.01) (71)申请人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人 马美湖 王丽英 (74)专利代理机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 代理人 樊戎 (54) 发。
2、明名称 一种从鸡蛋黄中提取分离免疫球蛋白 IgY 的 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种从鸡蛋黄中提取分离免疫 球蛋白 IgY 的方法， 该方法包括先用水稀释法获 得水溶性组分， 再用聚乙二醇沉淀法粗提免疫球 蛋白 IgY， 最后用层析法精制的步骤。采用本发明 提取分离得到的免疫球蛋白 IgY 收率和纯度高， 活性高， 而且提取分离的周期短， 蒸馏水消耗低， 步骤简单， 适合大规模高效率生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 1/1 页 2。
3、 1. 一种从鸡蛋黄中提取分离免疫球蛋白 IgY 的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： （1） 提取 ： 将蛋黄液用无菌水按体积稀释 6-10 倍， 调节 pH 值至 5.0-5.2， 4静置 8-12 小时， 离心后得上清液， 按上清液质量的 4-8% 向上清液中加入聚乙二醇 6000， 充分搅拌后 离心， 收集沉淀 ； （2） 精制 ： 对所得沉淀进行层析分离， 层析分离后将收集得到的溶液透析除盐， 冷冻 干燥， 所述层析分离中采用的填料是 DEAE-Toyopearl 650M 阴离子交换树脂， 采用的平 衡缓冲液是 pH 值为 7.0 的 0.05mol/L PBS 缓冲液， 采用的洗。
4、脱缓冲液是 pH 值为 7.0 的 0.075mol/L PBS 缓冲液。 2. 如权利要求 1 所述的从鸡蛋黄中提取分离免疫球蛋白 IgY 的方法， 其特征在于步骤 （1） 中将所述蛋黄液用无菌水按体积稀释 8 倍。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的从鸡蛋黄中提取分离免疫球蛋白 IgY 的方法， 其特征在于 所述聚乙二醇 6000 的用量为上清液质量的 6%。 权 利 要 求 书 CN 102850453 A 2 1/4 页 3 一种从鸡蛋黄中提取分离免疫球蛋白 IgY 的方法 技术领域 0001 本发明属于蛋白质分离纯化技术领域， 具体涉及一种从鸡蛋黄中提取分离免疫球 蛋白 IgY 的。
5、方法。 背景技术 0002 从鸡蛋中提取的生物活性物质价值极高， 在医药、 食品、 化工、 生物等诸方面具有 广泛的用途， 是我国近 20 年来蛋品科学研究开发中的热点。近年来， 随着蛋品研究的深 入和分离技术的提高， 人们开始对鸡蛋中各种蛋白质组分进行研究， 尤其卵黄球蛋白中的 - 卵黄免疫球蛋白 ( 简称 IgY)， 又称鸡卵黄抗体。卵黄球蛋白是蛋黄中的重要蛋白质之 一， 由于其与哺乳动物的 IgG 不同， 并且有许多免疫学的用途， 因此在疾病预防、 食品添加 剂和医学领域应用广泛。 0003 现有技术中通常采用水稀释法、 有机溶剂抽提沉淀法、 超滤、 超临界萃取、 盐析、 层 析等方法提。
6、取分离 IgY， 然而这些方法普遍存在着步骤多、 批量小、 试剂耗量大和回收率低 等问题。 发明内容 0004 本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷， 提供一种分离效果好， 产品纯度高的 鸡蛋黄免疫球蛋白 IgY 的提取分离方法。 0005 为了实现上述目的， 本发明所采用的技术方案为 ： 0006 一种从鸡蛋黄中提取分离免疫球蛋白 IgY 的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 0007 （1） 提取 ： 将新鲜蛋黄液用无菌水按体积稀释 6-10 倍， 调节 pH 值至 5.0-5.2， 4 静置 8-12 小时， 离心后得上清液， 按上清液质量的 4-8% 向上清液中加入聚乙二醇 6000，。
7、 充 分搅拌后离心， 收集沉淀 ； 0008 （2） 精制 ： 对所得沉淀进行层析分离， 层析分离后将收集所得的溶液透析除盐， 冷 冻干燥， 所述层析分离中采用的填料是 DEAE-Toyopearl 650M 阴离子交换树脂， 采用的平 衡缓冲液为 pH 值为 7.0 的 0.05mol/L PBS 缓冲液， 采用的洗脱缓冲液为 pH 值为 7.0 的 0.075mol/L PBS 缓冲液。 0009 优选的， 步骤 （1） 中将蛋黄液用无菌水按体积稀释 8 倍。 0010 优选的， 所述聚乙二醇 6000 的用量为上清液质量的 6%。 0011 与现有技术相比本方法具有以下优势 ： 0012。
8、 1、 采用本发明提取分离得到的免疫球蛋白IgY收率和纯度高， 收率可达60%以上， 纯度可达 90% 以上 ； 0013 2、 本发明提取、 分离的条件比较温和， 有利于保持免疫球蛋白 IgY 的天然构象和 生物活性， 提取分离得到的免疫球蛋白 IgY 活性较高 ； 0014 3、 提取分离的周期短， 蒸馏水消耗低， 步骤简单， 适合大规模高效率生产。 说 明 书 CN 102850453 A 3 2/4 页 4 附图说明 0015 图 1 为本发明的工艺流程示意图 ； 0016 图 2 为稀释倍数对免疫球蛋白 IgY 分离效果的影响曲线图 ； 0017 图 3 为溶液 pH 值对免疫球蛋白。
9、 IgY 分离效果的影响曲线图 ； 0018 图 4 为不同浓度的 PEG 对免疫球蛋白 IgY 的沉淀效果图 ； 0019 图 5 为不同 pH 值缓冲液的免疫球蛋白 IgY 层析分离图谱 ； 0020 图 6 为不同 pH 值缓冲液对免疫球蛋白 IgY 的层析纯化效果图。 具体实施方式 0021 实施例 1 0022 一种从鸡蛋黄中提取分离免疫球蛋白IgY的方法， 工艺流程如图1所示， 具体包括 以下步骤 ： 0023 1、 提取 0024 （1） 水稀释法获得水溶性组分 0025 取新鲜的鸡蛋， 使用蛋黄分离器分离得到蛋黄， 刺破蛋黄膜收集蛋黄液。 0026 取蛋黄液 200mL， 用无。
10、菌水按体积稀释 8 倍， 搅拌均匀， 调节 pH 值 5.0-5.2， 4静 置 10h， 5000 转 / 分钟离心 30min， 得上清液。 0027 在蛋黄中， 脂肪和脂蛋白不溶于水， 而免疫球蛋白 IgY 和其他蛋白质可以溶于水， 因此可以通过水稀释的方法对免疫球蛋白 IgY 进行初步分离。该步骤中， 蛋黄液的稀释倍 数和溶液的 pH 值对分离效果影响较大。 0028 稀释倍数对分离效果的影响见图 2。由图可知， 随着稀释倍数的增加， 上清液中蛋 白质的浓度逐渐增加， 脂肪的回收率逐渐降低， 而免疫球蛋白 IgY 的回收率呈降低趋势。当 稀释倍数在 6-10 倍的范围内时， 免疫球蛋白。
11、 IgY 的回收率处于较高水平， 而脂肪回收率处 于较低水平， 分离效果较好。此外， 稀释 8-10 倍时得到的上清液澄清， 稀释 6 倍时上清液稍 显浑浊， 2-4 倍时所得上清液呈黄色浑浊， 上清液浑浊表明其中含有脂质或脂蛋白， 因此， 8 倍体积稀释的效果最佳。 0029 溶液 pH 值对分离效果的影响见图 3， 由图可知， 随着 pH 值的上升， 免疫球蛋白 IgY 回收率先上升后下降， 而脂肪回收率则先下降后上升。当溶液 pH 值在 5.0-5.2 附近时， IgY 的回收率处于较高水平， 而脂肪回收率处于较低水平， 分离效果较好。 因此， 优选地， 稀释后 溶液的 pH 值调至 5。
12、.0-5.2 分离效果最佳。 0030 （2） 聚乙二醇沉淀法粗提免疫球蛋白 IgY 0031 向上述获得的上清液中边搅拌边加入聚乙二醇 6000， 至其质量分数达到 6%， 充分 搅拌后， 16000 转 / 分钟离心 5min， 收集沉淀， 即为免疫球蛋白 IgY 粗品。 0032 聚乙二醇为高分子多聚物， 在溶液中可以形成网状结构， 从而对蛋白质等大分子 产生体积排阻效应， 将蛋白质沉淀出来。蛋白质分子量越大、 浓度越高则越容易被沉淀。免 疫球蛋白 IgY 分子由两条重链和轻链组成， 重链分子量约为 70 kDa， 轻链分子量约为 20 kDa， 完整免疫球蛋白 IgY 的分子量约为 1。
13、80kDa， 在溶液中最大， 因此最容易被聚乙二醇沉 淀出来。聚乙二醇的浓度将影响分离的效果， 低浓度的聚乙二醇沉淀可得到高纯度的免疫 球蛋白 IgY， 但回收率不高， 而高浓度的聚乙二醇沉淀可得高回收率的免疫球蛋白 IgY， 但 说 明 书 CN 102850453 A 4 3/4 页 5 纯度相对低些。因此需要通过试验确定最佳的聚乙二醇沉淀浓度。 0033 聚乙二醇浓度对分离效果的影响如图 4 所示， 图中泳道 1 为上清液， 2 为分离上清 液后的沉淀， 3-7 依次为占上清液质量 4%、 6%、 8%、 10% 和 12% 的聚乙二醇浓度下的沉淀物。 由图可知， 当聚乙二醇占上清液质量。
14、为 4%-8% 时， 沉淀中杂蛋白含量较低， 而聚乙二醇为 8% 以上时， 沉淀中杂蛋白含量逐渐增加， 当聚乙二醇为 10% 以上时， 后续的层析已无法分离出 纯的免疫球蛋白 IgY。因次， 聚乙二醇沉淀浓度应为 4-8%， 进一步综合考虑免疫球蛋白 IgY 的纯度和回收率， 聚乙二醇沉淀浓度为 6% 最佳。 0034 2、 精制 0035 采用 DEAE-Toyopearl 650M 阴离子交换层析， 层析柱装填完成后先用浓度为 0.05mol/L、 pH 为 7.0 的 PBS 缓冲液进行平衡。将免疫球蛋白 IgY 粗品使用平衡缓冲液溶 解， 使蛋白浓度约为 20mg/mL， 每次上样约 。
15、200mL。上样后先用平衡缓冲液将未与填料结合 的杂蛋白洗脱下来， 然后再换浓度为 0.075mol/L、 pH 值为 7.0 的 PBS 缓冲液进行洗脱， 收集 洗脱峰， 透析脱盐后冷冻干燥， 即得免疫球蛋白 IgY 纯品。 0036 经过聚乙二醇沉淀初步分离得到的免疫球蛋白 IgY 粗品中含有少量的杂蛋白， 免 疫球蛋白 IgY 与杂蛋白具有不同的等电点， 因而与阴离子交换层析填料具有不同的结合 力， 可据此采用层析法对免疫球蛋白 IgY 进行纯化。在阴离子交换层析过程中， 缓冲液 pH 值对纯化效果影响较大， 因此对缓冲液 pH 值进行了优选。 0037 设定层析缓冲液的 pH 值分别为。
16、 6.0、 7.0、 8.0， 每种 pH 值条件下依次使用 0.05mol/L 的平衡缓冲液和 0.075mol/L 的洗脱缓冲液进行层析。层析图谱见图 5， 图中 A、 B、 C 分别为缓冲液 pH6.0、 7.0、 8.0 条件下的层析图， 由图可知， 不同 pH 值条件下均得到两 个峰。将所有洗脱峰进行 SDS-PAGE 电泳， 结果见图 6。图 6 中 A-1、 A-2、 B-1、 B-2、 C-1 和 C-2 为图 5 中相应的洗脱峰， D 为蛋白质标准分子量 marker。由图可知， 当 pH 为 6.0 时， 峰 A-1 主要为分子量为 80kDa 左右的 - 卵黄免疫球蛋白以。
17、及分子量为 45kDa 左右的 - 卵 黄免疫球蛋白， 峰 A-2 中除了主要成分免疫球蛋白 IgY 的重链 （分子量约 70kDa） 和轻链 （分 子量约 20kDa） 外， 还有部分的 - 卵黄免疫球蛋白 ； 当 pH 为 8.0 时， 峰 C-1 主要为 - 卵 黄免疫球蛋白， 峰C-2中除免疫球蛋白IgY的重链和轻链外还含有-卵黄免疫球蛋白 ； 当 pH 为 7.0 时， B-2 中仅含有免疫球蛋白 IgY 的重链和轻链， 杂蛋白的条带几乎没有。因此， 最佳层析过程中， 缓冲液的最佳 pH 为 7.0。 0038 实施例 2 纯度、 回收率及活性保持率测定 0039 免疫球蛋白 IgY。
18、 样品的纯度采用 Lab-Image 软件根据 SDS-PAGE 电泳图像进行计 算， 样品中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝试剂盒法测定， 由纯度和蛋白含量根据下列公式 计算回收率。 0040 0041 免疫球蛋白 IgY 活性采用酶联免疫方法 （ELISA） 检测。以一系列已知活性和浓度 的标准品的吸光值绘制标准曲线， 根据待测样品的吸光值计算样品中保持活性的免疫球蛋 白 IgY 含量， 根据样品中总蛋白含量和免疫球蛋白 IgY 纯度计算样品中免疫球蛋白 IgY 总 含量， 活性保持率根据下列公式进行计算。 说 明 书 CN 102850453 A 5 4/4 页 6 0042 0043 测定计。
19、算结果见表 1， 采用本发明方法分离纯化所得到的免疫球蛋白回收率较高， 最终纯度可达 95.020.77%、 活性保持率为 73.771.59%。 0044 表 1 提取分离后的 IgY 回收率、 纯度、 活性保持率计算结果 0045 步骤回收率 （%）纯度 （%）活性保持率 （%） 水稀释93.470.0316.110.2395.211.21 PEG 沉淀67.630.1681.450.1883.312.06 阴离子交换层析63.960.1295.020.7773.771.59 说 明 书 CN 102850453 A 6 1/3 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102850453 A 7 2/3 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102850453 A 8 3/3 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102850453 A 9 。